Tierärztliche Hochschule Hannover
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Bartonella henselae in Katzen, Hunden und Zecken in Deutschland
These
zur Erlangung des Grades DOCTOR OF PHILOSOPHY
-PhD-
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von Andreas Mietze
aus Hamm
Hannover 2010
Zentrum für Infektionsmedizin,
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Betreuungsgruppe: Prof. Dr. Ralph Goethe
Prof’in. Dr. Andrea Tipold
Klinik für Kleintiere
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Prof’in. Dr. Christine Josenhans Institut für Medizinisch Mikrobiologie und Krankenhaushygiene
Medizinische Hochschule Hannover
Externe Begutachtung: Prof. Dr. Max M. Wittenbrink
Institut für Veterinärbakteriologie,
Universität Zürich
Tag der mündlichen Prüfung: 15.11.2010
Meinen Eltern
1.1 Bakterien der Gattung Bartonella ... 7
1.2 Epidemiologie und Erkrankungen ... 8
1.3 Pathogenese ... 10
1.4 Wichtige zoonotische Bartonella Spezies und deren Vorkommen in Katze, Hund und Zecke... 13
1.4.1 Bartonella clarridgeiae ... 13
1.4.2 Bartonella henselae ... 13
1.4.2.1 Bartonella henselae Infektion der Katze ... 14
1.4.2.2 Bartonella henselae Infektion beim Hund ... 15
1.4.2.3 Bartonella henselae in Zecken... 16
1.4.3 Nachweis von Bartonella... 17
1.4.3.1 Anzucht von Bartonella... 17
1.4.3.2 Nachweis mittels PCR ... 17
1.4.3.3 Serologischer Nachweis ... 19
1.4.3.4 Typisierung und Genetische Variabilität von B. henselae- Isolaten ... 19
1.5 Problemstellung und Zielsetzung der Arbeit ... 21
2 Combined MLST and AFLP typing of Bartonella henselae isolated from cats reveals new sequence types and suggests clonal evolution ... 22
3 Molecular detection of Bartonella spp. in healthy and diseased dogs... 23
4 Occurrence of Bartonella henselae and Borrelia burgdorferi sensu lato co-infections in ticks collected from humans in Germany... 34
5 Diskussion ... 35
6 Zusammenfassung... 42
7 Summary ... 43
8 Literaturverzeichnis ... 44
1 Einleitung
1.1 Bakterien der Gattung Bartonella
Bartonella ist das einzige Genus der Familie der Bartonellaceae. Das Genus Bartonella wurde nach Dr. Alberto Barton benannt, der 1909 den intraerythrozytären Erreger Bartonella bacilliformis in Peru erstmals beschrieben hat. Bartonellen sind langsam wachsende, fakultativ intrazellulär liegende, aerobe gram-negative Stäbchen (Regnery et al., 1992a). Basierend auf der 16S rDNA-Sequenz gehören sie in die Gruppe der α2-Proteobakterien und sind phylogenetisch eng mit Brucella spp., Agrobacterium spp. und Rhizobium spp. verwandt. Die Gattung Bartonella umfasst auch Bakterien, die früher in die Gattungen Grahamella und Rochalimae eingeordnet waren.
In den letzten 20 Jahren ist die Zahl der Bartonella Spezies bzw. Subspezies, die aus Säugetieren isoliert wurden, gestiegen (Chomel et al., 2009). 14 Spezies bzw.
Subspezies sind pathogen für den Menschen oder stehen im Verdacht es zu sein, dazu zählen B. alsatica, B. bacilliformis, B. clarridgeiae, B. elizabethae, B. grahamii, B. henselae, B. koehlerae, B. melophagi, B. quintana, B. rochalimae, B. tamiae, B. vinsonii ssp. arupensis, B. vinsonii ssp. berkhoffii und B. washoensis. Von diesen 14 Spezies bzw. Subspezies sind vier bereits aus Katzen isoliert worden (Chomel et al., 2009).
Die pathogenen Bartonella spp. sind innerhalb der Säugetiere auf bestimmte Reservoirwirte spezialisiert, bei denen sie Endothelzellen und Erythrozyten besiedeln und zu einer lang anhaltenden, intraerythrozytären Bakteriämie führen (Dehio, 2001).
Bartonellen sind in der Lage, sowohl in immunkompetenten als auch in immungeschwächten Menschen oder Tieren, eine Vielzahl von Erkrankungen hervorzurufen. Die Übertragung erfolgt durch blutsaugende Arthropoden wie Flöhe, Läuse, Zecken und Sandmücken (Billeter et al., 2008). Neuere Untersuchungen lassen darauf schließen, dass Zecken ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Übertragung von Bartonella spp. zukommt (Eskow et al., 2001).
1.2 Epidemiologie und Erkrankungen
Bartonellen sind weltweit verbreitet. Durch das symptomlose Persistieren in verschiedenen Säugetieren und ihren Parasiten ist die Verbreitung und Erhaltung dieser potentiellen Infektionserreger gesichert. Die Koinfektion eines Wirtes mit mehreren Bartonella Spezies ist nachgewiesen worden (Maruyama et al., 2000).
Tabelle 1: Bartonella-Spezies, ihr natürliches Reservoir und Vektoren, und die resultierende Erkrankungen des Menschen
Bartonella
Spezies Reservoir Vektor Erkrankung des
Menschen Humanspezifische Spezies
B. bacilliformis Mensch Sandmücke
Carrionsche Krankheit:
Oroya Fieber, Verruga peruana
B. quintana Mensch Kopflaus
5 Tage Fieber (Schützengrabenfieber)
Bazilläre Angiomatose, Endokarditis Zoonotische Spezies
B. henselae Katze Katzenfloh
Katzenkratzkrankheit Endokarditis, Bazilläre Angiomatose, Peliosis hepatis, Neuroretinitis
B. clarridgeiae Katze Katzenfloh Katzenkratzkrankheit
B. elizabethae Ratte Rattenfloh Endokarditis
B. grahamii Maus, Vogel ? Erkrankungen des Auges
B. koehlerae Katze ? ?
B. vinsonii ssp.
arupensis Maus ? Fieber, Bakteriämie,
Endokarditis B. vinsonii ssp.
berkhoffii Hund Zecke? Endokarditis
B. tribocorum Ratte ? ?
Der wichtigste zoonotische Erreger ist B. henselae, der Erreger der Katzenkratzkrankheit (KKK), die sich wie folgt äußern kann: In 50-75 % der Fälle bildet sich an der Stelle des Katzenkratzers bzw. des Floh- oder Zeckenbisses nach vier bis sechs Tagen eine Papel oder Pustel aus. Nach 7-50 Tagen kommt es zu einer Lymphadenopathie oder Lymphadenitis der regionalen Lymphknoten (Bass et al., 1997). 80 % der befallenen Lymphknoten sind kranial, nuchal oder an der oberen Extremität gelegen (Wear et al., 1983; Zangwill et al., 1993; Wong et al., 1995). Bei der histologischen Untersuchung der Lymphknoten sind nekrotisierende, granulomatöse Entzündungsreaktionen mit lymphatischem Infiltrat und mehrkernigen Riesenzellen zu beobachten. Bei 15 % der Patienten kommt es zu einer Abszedierung der befallenen Lymphknoten (Wear et al., 1983; Maurin et al., 1994;
Anderson and Neuman, 1997). Bei der Hälfte aller Fälle bleibt die Lymphadenitis die einzige Manifestation. Bei der anderen Hälfte kann es zusätzlich zu Begleitsymptomen wie Fieber, Kopfschmerzen, Gelenk- und Muskelschmerzen, Übelkeit, Gewichtsverlust und Splenomegalie kommen. Schwerwiegende Komplikationen werden nur in 10% der Fälle beobachtet. Hierbei kann es zum so genannten Parinaud’schem okuloglandulären Syndrom (konjunktivales Granulom mit präaurikulärer Lymphadenopathie), Enzephalitis, zerebraler Arteritis, Myelitis, granulomatöser Hepatitis oder Splenitis kommen. Weitere Komplikationen können atypische Pneumonien, Pleuraergüsse, Osteomyelitis oder auch Erythema nodosum sein (Carithers, 1985; Margileth et al., 1987; Berger et al., 1989; Schwartzman, 1992;
Golden, 1993; Margileth, 1993; Wong et al., 1995; Windsor, 2001).
Bei immunsupprimierten Personen kommt es aufgrund der eingeschränkten zellulären Abwehr zu schwerwiegenderen Manifestationen der B. henselae-Infektion, die als Bazilläre Angiomatose (BA) oder Peliosis hepatis (PH) bezeichnet werden (Koehler et al., 1988; Regnery et al., 1992b; Stein and Raoult, 1995; Brenner et al., 1997). Bei der BA tritt entweder eine kutane Form auf, bei der es durch Angiogenese zu einzelnen oder multiplen rötlichen kutanen oder subkutanen Läsionen kommt, oder eine parenchymatöse Form, bei der ausschließlich innere Organe, wie Milz, Lymphknoten oder Knochenmark betroffen sind. Die PH hingegen ist eine durch
zystisch-gekammerte, blutgefüllte Endothelzell-Proliferationen gekennzeichnete Hepatopathie und wird als Sonderform der BA betrachtet (Koehler et al., 1988). In den USA wird von 22.000 bis 24.000 Fällen von KKK pro Jahr berichtet, von denen 2.000 einen Krankenhausaufenthalt erfordern. In Europa wird von 1.000 Fällen pro Jahr berichtet (Chomel et al., 2006). Die KKK wurde 1950 erstmals ausführlich beschrieben, allerdings konnte sie keinem Erreger zugeordnet werden (Debre et al., 1950). Ab 1993 war es dann möglich, B. henselae aus Lymphknoten zu isolieren, zu kultivieren und mittels PCR zu identifizieren (Dolan et al., 1993). Als natürliches Reservoir von B. henselae gilt die Katze (Rolain et al., 2001). Die Übertragung von Katze zu Katze findet durch den Katzenfloh statt, aber auch die Zecke wird diskutiert (Chomel et al., 1996; Anderson and Neuman, 1997; Cotte et al., 2008).
1.3 Pathogenese
Während der Bartonella spp.-Infektion der natürlichen Reservoirwirte kommt es zu einer Besiedlung der Endothelzellen und der Erythrozyten sowie zu einer lang anhaltenden, intraerythrozytären Bakteriämie (Dehio, 2001). Um die genaue Abfolge der Bartonelleninfektion im Reservoirwirt nachvollziehen zu können, sind bereits einige Tiermodelle etabliert worden (Guptill et al., 1997; Abbott et al., 1997; Kosoy et al., 1999; Kosoy et al., 2000; Koesling et al., 2001; Schulein et al., 2001; Boulouis et al., 2005). Der genaue Weg des erythrozytären Parasitismus wurde für B. tribocorum im Rattenmodell gezeigt (Schulein et al., 2001). Nach der intravenösen Infektion verschwindet das Bakterieninokulum sehr schnell aus dem Blutstrom. Über drei Tage hinweg sind Blutproben der infizierten Tiere steril. An Tag vier oder fünf nach der Infektion sind die Bakterien wieder im Blutstrom nachweisbar. Die primäre Nische, die es den Bartonellen erlaubt, sich in den ersten drei Tagen der Infektion zu replizieren, ist derzeit noch unbekannt. Es werden jedoch Endothelzellen (Seubert et al., 2002; Dehio, 2003; Seubert et al., 2003; Schmid et al., 2004) aber auch hämatopoetische Vorläuferzellen diskutiert (Mandle et al., 2005). Nach der Freisetzung aus der primären Nische binden die Bakterien an reife Erythrozyten und dringen in diese ein. Nach dem Eindringen vermehren sich die Bartonellen in einem membrangebundenen Kompartiment über eine Periode von mehreren Tagen. Für die gesamte Lebenszeit des Erythrozyten bleibt die bakterielle Zelldichte dann konstant.
Es können weitere Infektionswellen der Erythrozyten folgen, wenn nach weiteren fünf Tagen erneut Bakterien aus der primären Nische oder auch aus den Erythrozyten freigesetzt werden. Diese Form der lang anhaltenden erythrozytären Bakteriämie spiegelt die Adaptation an die Übertragung durch blutsaugende Arthropoden wieder.
Im B. tribocorum-Rattenmodel klingt die Infektion spontan nach acht bis zehn Wochen ab, hinterlässt jedoch hohe IgG-Antikörperspiegel (Koesling et al., 2001), so dass man von selbstlimitierenden Prozessen ausgehen kann.
Für B. henselae und einige andere Bartonella spp. ist gezeigt worden, dass die Invasion in Endothelzellen sowohl über den klassischen Invasionsprozess einer Bakterien vermittelten Endozytose (Dramsi and Cossart, 1998) als auch über die Aufnahme so genannter Invasome erfolgen kann (Brouqui and Raoult, 1996; Dehio et al., 1997; Verma et al., 2000). Die Invasom-Bildung ermöglicht durch Umstrukturierung des Aktinzytoskeletts die Internalisierung ganzer Bakterien- Aggregate (Dehio et al., 1997). In Endothelzellen internalisierte B. henselae replizieren wesentlich schneller, als auf unbelebten Standardnährböden (Kempf et al., 2000).
Um die Pathogenitätsstrategien von B. henselae genauer zu klären, sind durch molekulargenetische Untersuchungen, Proteomanalysen und Ratten- Infektionsmodelle einige Virulenzfaktoren beschrieben worden. Von diesen Virulenzfaktoren sind zwei bisher genauer untersucht: Das trimäre Autotransporter- Adhäsin Bartonella-Adhäsin A (BadA) (Riess et al., 2004) und das VirB/VirD4-Typ IV- Sekretionssystem (VirB/VirD4-TIVSS) (Schmid et al., 2004).
Die Trimeren Autotransporter-Adhäsine (TAA) stellen bedeutende Pathogenitätsfaktoren gram-negativer Bakterien dar und setzen sich aus einer charakteristischen Kopf-Stiel-Anker-Architektur zusammen (Batterman et al., 1995;
Hoiczyk et al., 2000; Linke et al., 2006). Das früher als „Pilus“ beschriebene Bartonella-Adhäsin A (BadA) gehört zur Gruppe der TAA. Es ist mit ca. 340 kDa ein außerordentlich großes Protein in der äußeren Membran von B. henselae und weist sequenzielle und strukturelle Homologien zu dem Yersinia-Adhäsin A (YadA) von Yersinia enterocolitica auf (Riess et al., 2004). BadA ist in der Lage, während des
Infektionsverlaufs Komponenten der extrazellulären Matrix zu binden (Fibronektin, Kollagen) und kann so die Interaktion des Bakteriums mit der Wirtszelle vermitteln.
B. henselae besitzt zwei verschiedene Typ IV Sekretionssysteme, wobei das VirB/VirD4-TIVSS zu dem von Agrobacterium tumefaciens homolog ist (Schmiederer and Anderson, 2000), das Trw-TIVSS ist hingegen mit dem Trw-Konjugationssystem von Escherichia coli verwandt (Seubert et al., 2003).
Das VirB/VirD4-TIVSS ist ein Komplex aus mehreren Proteinen, die zusammen einen nadelartigen Pilus bilden. Dieser Pilus stellt den anfänglichen Kontakt zur Wirtszelle her. Des Weiteren bilden diese Proteine auch einen kanalartigen Porenkomplex, welcher beide Membranen der bakteriellen Zellhülle durchspannt und schließlich in der Lage ist, die Bartonella-Effektorproteine Bep A-G in die Wirtszelle zu translozieren (Schulein et al., 2005). Diese Effektorproteine sind für eine Reihe von Endothelzell-Reaktionen im Infektionsverlauf verantwortlich. Dazu zählen zunächst die Umstrukturierung des Aktin-Zytoskeletts mit der Bildung der bakteriellen Aggregate und der Invasom-vermittelten Aufnahme von B. henselae in Endothelzellen (Schmid et al., 2004). Darauf folgen die Aktivierung der NF-ĸB- abhängigen proinflammatorischen Endothelzellantwort mit der verstärkten Expression der Adhäsionsmoleküle E-Selektin und ICAM-1 (intercellular adhesion melecule-1) auf der Endothelzelloberfläche (Fuhrmann et al., 2001) sowie der Sekretion diverser Zytokine (z.B. IL-8) und als weitere Reaktion die Apoptoseinhibition durch die Translokation des BepA, das die Caspase-3/-7- Aktivierung hemmt (Schmid et al., 2004).
Das Trw-TIVSS besitzt alle Komponenten eines TIVSS-Porenkomplexes, jedoch fehlt ein für die Translokation notwendiger Substratrezeptor (VirD4-Homolog). Soweit bekannt, transloziert Trw-TIVSS keine Effektorproteine, ist aber dennoch für die Invasion von B. henselae in Erythrozyten und die Ausbildung der intraerythrozytären Bakteriämie verantwortlich (Schulein and Dehio, 2002; Seubert et al., 2003).
1.4 Wichtige zoonotische Bartonella Spezies und deren Vorkommen in Katze, Hund und Zecke
1.4.1 Bartonella clarridgeiae
B. clarridgeiae wurde erstmals 1995 von Clarridge et al. (Clarridge et al., 1995) isoliert. Die genaue Charakterisierung erfolgte 1996 durch Lawson et al. (Lawson and Collins, 1996). Das Reservoir ist wie bei B. henselae die Katze. Der erste Fall einer durch B. clarridgeiae verursachten KKK wurde 1997 beobachtet (Kordick et al., 1997). Es handelte sich hierbei um einen Tierarzt, der nach einem Katzenbiss an Kopfschmerzen, Fieber und Lymphknotenschwellung erkrankte. Die serologische Untersuchung erbrachte den Nachweis von Antikörpern gegen B. clarridgeiae und negative Resultate gegen andere humanpathogene Bartonellenarten. Aus seiner Katze konnte B. clarridgeiae isoliert werden, besonders auffällig war die Flanellen- Bildung. Im Jahre 1998 beschrieben Margileth und Baehren einen weiteren Fall einer KKK, welche mit positivem Antikörpernachweis für B. clarridgeiae einherging (Margileth and Baehren, 1998). Der immunkompetente Patient litt über 3 Monate an einer schweren Erkrankung (Fieber, Kopfschmerzen, Gewichtsverlust).
1.4.2 Bartonella henselae
Das Bakterium B. henselae wurde 1990 erstmals anhand der 16S rRNA beschrieben (Relman et al., 1990; Relman et al., 1991). Ein Jahr später gelang die Kultur aus vaskuloproliferativen Läsionen von Patienten (Koehler et al., 1992; Welch et al., 1992). Seitdem gewinnt B. henselae zunehmend an Bedeutung und wird daher als
„new emerging pathogen“ bezeichnet (Koehler et al., 1992; Anderson and Neuman, 1997). 1992 erfolgte die genetische und biochemische Charakterisierung des Bakteriums und die Benennung nach der medizinisch-technischen Assistentin Diane Hensel (Regnery et al., 1992a). Der natürliche Reservoirwirt von B. henselae ist die Katze. In dieser verursacht der Erreger eine asymptomatische Bakteriämie (Koehler et al., 1994). Die Übertragung von B. henselae auf den „Fehlwirt“ Mensch erfolgt entweder indirekt durch den Katzenfloh (Rolain et al., 2001) oder direkt durch Kratz- und Bissverletzungen von infizierten Katzen (Chomel et al., 1996; Chomel et al.,
2004). Für den Krankheitsverlauf einer B. henselae-Infektion ist der Immunstatus des Patienten von entscheidender Bedeutung. Bei immunkompetenten Patienten äußert sich eine Infektion als zumeist selbstlimitierende KKK (Debre et al., 1950). Bei immunsupprimierten Patienten hingegen, wie beispielsweise HIV-Patienten, treten die schon beschriebenen schwerwiegenden Komplikationen auf (Koehler et al., 1988;
Regnery et al., 1992a; Stein and Raoult, 1995; Brenner et al., 1997).
Zudem wurde B. henselae neben B. quintana als eine Hauptursache für kulturnegative Endokarditis, insbesondere bei obdachlosen, alkoholkranken Menschen beschrieben. Es wird angenommen, dass Bartonella spp. für 3 - 4 % der Endokarditis - Fälle verantwortlich ist (Agan and Dolan, 2002; Chomel et al., 2003;
Lamas and Eykyn, 2003).
1.4.2.1 Bartonella henselae Infektion der Katze
Wie oben schon erwähnt, ist die Katze das natürliche Reservoir für B. henselae. Die Prävalenzen von B. henselae in Hauskatzen variieren von 0 % in Norwegen (Bergh et al., 2002) und 61 % auf den Philippinen (Chomel et al., 1999). Über Erkrankungen der mit B. henselae auf natürlichem Weg infizierten Katzen ist relativ wenig bekannt.
Dies liegt unter anderem auch daran, dass bei Katzen mit unspezifischem Krankheitsbild eine Infektion mit B. henselae nicht in Betracht gezogen wird.
Bartonellen-Infektionen der Katze sollen überwiegend asymptomatisch verlaufen, wobei auch Symptome wie Gingivitis, Stomatitis, Lymphadenitis und Erkrankungen der Harnwege im Zusammenhang beschrieben werden (Chomel et al., 2003). Die vorliegenden Erkenntnisse zum Krankheitsgeschehen bei der Katze basieren deshalb größtenteils auf experimentellen Untersuchungen.
Katzen entwickeln eine chronische Bakteriämie ohne relevante klinische Erscheinungen (Regnery et al., 1992a; Kordick et al., 1995; Chomel et al., 1996;
Yamamoto et al., 2002). Die bakteriämische Phase nach Infektion erstreckt sich je nach Infektionsweg und verwendetem Inokulum über 2,5 (Koehler et al., 1994) bis zu 22 Monaten (Kordick and Breitschwerdt, 1995). Der positive kulturelle Nachweis verläuft hierbei intermittierend (Abbott et al., 1997). Trotz bestehender Antikörpertiter wurden Fälle wiederkehrender Bakteriämien beschrieben (Chomel et al., 1996;
Kordick et al., 1997). Im Bezug auf das Alter existieren widersprüchliche Angaben.
Während es als gesichert scheint, dass junge Katzen (<1 Jahr) die Hauptansteckungsquelle für den Menschen darstellen und auch ein höheres Risiko besitzen, eine Bakteriämie auszubilden (Chomel et al., 1995; Demers et al., 1995;
Sander et al., 1997), finden sich kulturell positive Befunde sehr häufig auch bei alten Katzen (Ueno et al., 1995; Gurfield et al., 1997; Haimerl et al., 1999). Ohne Bedeutung sind Geschlecht, FIV- oder Toxoplasma-Infektionen, Rasse und Jagdverhalten (Ueno et al., 1995; Ueno et al., 1996; Haimerl et al., 1999). Dagegen hat die Haltungsform der Katze sehr wohl eine Bedeutung im Bezug auf die Exposition mit Flöhen. Katzen die ausschließlich in der Wohnung gehalten werden, kommen in geringerem Maße mit Flöhen in Kontakt, als beispielsweise streunende Katzen. Die Übertragung von Katze zu Katze durch den Katzenfloh ist experimentell gesichert (Chomel et al., 1996), aber auch eine Übertragung durch Zecken scheint möglich zu sein (Cotte et al., 2008). Nach 2-4 Wochen ist eine 11-12 Wochen andauernde Bakteriämie bei flohinfizierten Katzen nachweisbar.
1.4.2.2 Bartonella henselae Infektion beim Hund
Im Gegensatz zu der umfassenden Literatur über Bartonellen-Infektionen von Mensch und Katze sind die Informationen den Hund betreffend eher gering.
Allerdings wurde in letzter Zeit vor allem im amerikanischen Raum immer häufiger von Bartonellen-Infektionen bei Hunden berichtet (Breitschwerdt et al., 1995;
Breitschwerdt et al., 1999; Mexas et al., 2002; Breitschwerdt et al., 2003; Kelly et al., 2006; Saunders and Monroe, 2006; Duncan et al., 2007). Es sind Infektionen mit B.
henselae, B. elizabethae, B. quintana, B. vinsonii und B. clarridgeiae beschrieben. Im Gegensatz zur Katze scheint der Hund nicht nur ein Reservoir für Bartonellen zu sein, sondern entwickelt auch ähnlich schwere Erkrankungen wie der Mensch (Kitchell et al., 2000; Saunders and Monroe, 2006; Diniz et al., 2007; Diniz et al., 2009). So werden Endokarditiden und rezidivierende granulomatöse Lymphadenitiden, aber auch systemische granulomatöse Prozesse sowie Meningitiden mit Bartonellen-Infektionen in Verbindung gebracht (Breitschwerdt et al., 1995; Kordick et al., 1996; Breitschwerdt et al., 1999; Pappalardo et al., 2000;
Chomel et al., 2001; Breitschwerdt et al., 2003; Morales et al., 2007). In den USA wird von einer Seroprävalenz von 27,2 % bei Hunden berichtet (Solano-Gallego et
al., 2004). Als Infektionsquelle für den Hund werden ebenfalls blutsaugende Arthropoden wie Floh und Zecke vermutet (Billeter et al., 2008). In Deutschland wurden bisher noch keine ausführlichen Untersuchungen zur Prävalenz von Bartonellen in Hunden, weder mittels Serologie noch Direktnachweise, durchgeführt.
1.4.2.3 Bartonella henselae in Zecken
Durch ihre intraerythrozytäre Persistenz und ihr Vorkommen in unterschiedlichen Wirten können Bartonellen von vielen verschiedenen Arthropoden aufgenommen und übertragen werden. Einen gesicherten experimentellen Nachweis dieses Infektionsweges gibt es allerdings bisher nur für den Katzenfloh (Chomel et al., 1996;
Billeter et al., 2008). Durch ihre geringe Wirtspräferenz werden auch Zecken als Vektor für Bartonellen diskutiert. Zecken wurden daher in den letzten 15 Jahren immer wieder, meist mittels PCR–gestütztem Nachweis, untersucht (Holden et al., 2006). Hierdurch ergaben sich Hinweise, dass Bartonellen in Zecken oft mit anderen Erregern wie Borrelien oder Anaplasmen assoziiert sind (Eskow et al., 2001; Halos et al., 2005). In einigen in Europa durchgeführten Studien konnte B. henselae, aber auch andere, bisher nicht weiter charakterisierte Bartonellen, in Zecken vom Typ Ixodes ricinus nachgewiesen werden (Billeter et al., 2008). Durch neuere Fütterungsexperimente bei Zecken konnte die Möglichkeit der Übertragung von insbesondere B. henselae durch den Speichel der Zecken bewiesen werden (Cotte et al., 2008). In Polen sind 102 Zecken von Hauskatzen und Hunden vom Typ Ixodes ricinus untersucht worden, davon waren 4,9 % positiv für B. henselae (Podsiadly et al., 2007). In Nordfrankreich wurden 9,8 % der Zecken positiv für Bartonella spp.
getestet. In Italien sind in 1,48 % der Zecken von klinisch unauffälligen Menschen Bartonellen nachgewiesen worden (Sanogo et al., 2003; Halos et al., 2005). In Deutschland wurden erst kürzlich in zwei Wäldern Untersuchungen von Nymphen und adulten Zecken des Types Ixodes ricinus durchgeführt worden. Nymphen waren zu 11,8 % positiv auf B. henselae und Adulte zu 2,9 % (Dietrich et al., 2010).
1.4.3 Nachweis von Bartonella 1.4.3.1 Anzucht von Bartonella
Die Anzucht ist für den diagnostischen Nachweis weniger gut geeignet, da die Kultur von Bartonella spp. lange Inkubationszeiten erfordert, für Primärisolate sollten Kulturzeiten von bis zu 6 Wochen kalkuliert werden. Des Weiteren ist im Blut teilweise nur eine geringe Anzahl von Erregern zu finden. Auch die intraerythrozytäre Lage der Bakterien erschwert die Kultur. Darüber hinaus erweisen sich Bartonellen als empfindliche und anspruchsvolle Erreger, deren Anzucht besondere Bedingungen erfordert, die im folgenden noch genauer erläutert werden (Slater et al., 1990; Regnery et al., 1992a; Anderson and Neuman, 1997; La Scola et al., 2002).
Prinzipiell gelingt die Isolierung von Bartonellen aus Blut, aber auch aus verschiedenen Geweben wie Leber, Niere, Milz, Knochenmark, Lymphknoten und Haut. Ein verbessertes Anzuchtergebnis erhält man durch das Tieffrieren der erregerhaltigen Probe bei –70°C zur Erythrozytolyse und anschließendem Auftauen (Brenner et al., 1997; La Scola et al., 2002), aber auch durch die Lysis-centrifugation- Methode (Isolator® Wampole, Cranbury, NJ) (Brenner et al., 1997). Das beste Wachstum erreicht man mit frischen, festen bluthaltigen Nährböden. Beschrieben wurde die Verwendung von Trypticase-Soja-Agar, Hirn-Herz-Infus (Regnery et al., 1992a) und Columbia- oder Kochblut-Agar (Welch et al., 1992; Drancourt and Raoult, 1993), jeweils unter Zusatz von 5-10 % Schaf- oder Kaninchenblut. Die Nährböden werden dann bei 35-37°C, feuchter Atmosphäre und 5-10 % CO2 inkubiert. Eine weitere Anzuchtmöglichkeit ist die Flüssigkultur in supplementiertem Schneiders Medium (Riess et al., 2008). Hierbei werden die Bakterien in dem ursprünglich für Zellkulturen von Drosophila melanogaster-Zellen geeigneten Medium unter Zusatz von Saccharose und fetalem Kälberserum angezüchtet.
1.4.3.2 Nachweis mittels PCR
Eine schnelle und spezifische Nachweismethode für B. henselae ist die PCR. Mit Hilfe der PCR kann man Bartonella DNA in Blut- und Gewebeproben nachweisen, z.B. in einem befallenen Lymphknoten oder im papulösen Hautareal, das die Primärläsion bei KKK darstellt. Den ersten PCR-gestützten Nachweis entwickelte
Relman et al. (1990). Es sind bereits unterschiedliche Gene für den PCR Nachweis genutzt worden, allen gemein ist die gute diskriminierende Eigenschaft die sie besitzen, wobei einige der Gene zu hohe Ähnlichkeiten unter den Spezies besitzen, so dass eine klare Spezies-Differenzierung nur schwer möglich ist. Nach einer Studie von La Scola et al. (2003) eignen sich sowohl die RNA polymerase beta subunit als auch das Citrat Synthase Gen am besten zur Spezies Differenzierung (La Scola et al., 2003). Insgesamt ist die PCR, verglichen mit dem kulturellen Nachweis, eine wesentlich sensitivere Methode zum Nachweis von Bartonellen.
Tabelle 2. Gene, die zum Nachweis von Bartonella spp. genutzt werden
Gen Bemerkung Referenz
16S rRNA
nur Genus spezifisch mit Modifikationen
Kombination mit Dot Blot- / Southern- Hybridisierung zur Spezies Differenzierung
kombiniert mit RFLP
(Relman et al., 1990; Goral et al., 1994; Goldenberger
et al., 1996; Bergmans et al., 1996; Avidor et al., 1997; Matar et al., 1999) htrA
heat shock protein Nachweis von B. henselae und B. quintana,
Differenzierung mittels Hybridisierung (Anderson et al., 1994;
Goldenberger et al., 1996) ribC
Riboflavin Synthase nested PCR zur Unterscheidung von vier
Bartonella spp. (Bereswill et al., 1999)
16S23S intergenic
spacer region (ITS) Unterscheidung von sechs Bartonella spp.
(Jensen et al., 2000;
Birtles et al., 2000;
Houpikian and Raoult, 2001)
groEL 60kDa heat shock
protein
Spezies Differenzierung durch Sequenzierung
(Morozova et al., 2004; La et al., 2004; Aboudharam
et al., 2005) ftsZ
cell division protein
Spezies Differenzierung mittels
Sequenzierung (Zeaiter et al., 2002b) rpoB
RNA polymerase beta subunit
häufig genutzt, Spezies Differenzierung mit RFLP oder HRM real time PCR
(Renesto et al., 2001;
Morick et al., 2009) gltA
Citrat Synthase häufig genutzt, Spezies Differenzierung mit
RFLP (Norman et al., 1995; La
Scola et al., 2003)
1.4.3.3 Serologischer Nachweis
Antikörper gegen B. henselae können mit dem Immunfluoreszenztest (IFT) oder dem Enzymimmunoassay (ELISA) detektiert werden. Der IFT ist wegen seiner kommerziellen Verfügbarkeit und vergleichsweise einfachen Handhabung bisher am Weitesten verbreitet. Es gelten in der Regel Titer von > 1:64 für IgG als erhöht (Regnery et al., 1992b; Anderson and Neuman, 1997; Foley et al., 1998). Hier wird das B. henselae-Antigen zunächst mit Verozellen kultiviert und dann für den IFT eingesetzt. Die kommerziell verfügbaren Tests sind allerdings für humanes Serum etabliert. Auch die Verwendung von Enzymimmunoassays (EIA, ELISA) und Western-Blot ist beschrieben worden (Drancourt, 1996; Vermeulen et al., 2007;
Eberhardt et al., 2009).
1.4.3.4 Typisierung und genetische Variabilität von B. henselae-Isolaten
Ursachen für genetische Variabilität sind Mutation und Rekombination. Mutationen können z.B. durch Fehler bei der DNA-Replikation entstehen und durch mutagene Einflüsse induziert werden. Die Anwendung molekularbiologischer Typisierungsverfahren bei Bakterien ist insbesondere bei epidemiologischen Fragestellungen sinnvoll. Dabei ist es wichtig, die Verbreitung von Klonen oder eng verwandten Stämmen nachvollziehen zu können. Dazu müssen die eingesetzten Typisierungsverfahren ein hohes Diskriminierungspotential aufweisen (RILEY, 2004).
In der Regel werden deshalb Verfahren eingesetzt, die auf der Darstellung hypervariabler Regionen des Genoms basieren. Genotypische Analysen von B.
henselae Isolaten mit Hilfe von verschiedenen genomischen- oder Locus- spezifischen Typisierungsmethoden haben eine Zahl von genetischen Gruppen ergeben. Diese Untersuchungen wurden nicht nur zu Aufklärung von humanen B. henselae-Infektionen, sondern auch zur breiten Charakterisierung der Sammlung von felinen und humanen Isolaten durchgeführt. Diese Charakterisierungen zeigen eine limitierte Diversität der humanen Isolate (Bergmans et al., 1996; Arvand et al., 2001; Dillon et al., 2002). Verschiedene B. henselae-Gene und genetische Loci sind für die vergleichenden Untersuchungen herangezogen worden. Hierzu zählen die 16S und 23S ribosomale DNA, die 16S-23S intergenic spacer region und Fragmente von Protein-kodierenden Genen, wie gltA, ftsZ und pap31 (Birtles and Raoult, 1996;
Zeaiter et al., 2002a; Zeaiter et al., 2002b). Untersuchungen der 16S rRNA-kodierenden Gensequenz zeigen, dass B. henselae Isolate in zwei Typen unterschieden werden können (Bergmans et al., 1996). In Untersuchungen von Katzen in Freiburg konnten mittels 16S rRNA-Sequenzierung diese zwei verschiedenen Typen nachgewiesen werden, von denen Typ I dem Referenzstamm Houston-1 entsprach, der in Houston/USA von einem HIV-Patienten isoliert werden konnte (Sander et al., 1999). Die Mehrzahl der felinen Isolate jedoch entsprach Typ II.
Des Weiteren sind genomische Fingerprint-Methoden angewendet worden wie Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE), arbitrarily primed (AP)- PCR, enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC)-PCR und infrequent restriction site (IRS)- PCR, die nur unvollständige Korrelation mit den 16S rDNA-Typen aufwiesen, sich aber durchaus als diskriminierend eigneten (Sander et al., 1998; Arvand et al., 2001;
Dillon et al., 2002). Andere Studien bezeichnen die PFGE als eine Methode mit hohem Diskriminierungspotential zur Differenzierung innerhalb einer Spezies (Roux and Raoult, 1995; Sander et al., 1997). Des Weiteren wurde zur genetischen Charakterisierung von B. henselae das Multispacer typing von Li et al. beschrieben (Li et al., 2006). Hier wurde anhand von neun hoch variablen intergenic-spacer Regionen eine Charakterisierung vorgenommen. 126 B. henselae-Isolate konnten in 39 Genotypen eingeteilt werden. Des Weiteren war B. henselae genotypisch signifikant variabler als B. quintana. Eine Erklärung für die hohe genetische Diversität konnte jedoch nicht gegeben werden. Isolate aus Asien zeigten aber eine höhere Diversität als Isolate aus Europa oder Amerika. Monteil et al. 2007 nutzten zur genotypischen Charakterisierung von B. henselae-Isolaten die Multiple locus variable number tandem repeat Analyse. Hier wird eine variable Zahl von Tandemwiederholungen (Minisatelliten) mittels PCR bestimmt und zur Charakterisierung eingesetzt. Mit dieser Methode konnten 44 B. henselae Isolate in 35 Profile unterteilt werden (Monteil et al., 2007). Eine weitere Typisierungsmethode ist das Multilocus sequence typing, das Bakterien auf der Basis von Nukleinsäuresequenz-Unterschieden in Fragmenten von Haushaltsgenen (in der Regel 7 an der Zahl) vergleicht. Der Vorteil dieser Methode liegt darin, dass
Sequenzdaten eindeutig sind und in elektronischer Form zwischen verschiedenen Laboren ausgetauscht werden können. B. henselae-Isolate sind bereits mittels MLST charakterisiert worden. Es konnten 14 verschiedene so genannte Sequenztypen anhand der Sequenzunterschiede in acht verschiedenen Haushaltsgenen identifiziert werden (Iredell et al., 2003; Arvand et al., 2007), wobei eine kontinentale Häufung bestimmter Sequenztypen beobachtet werden konnte. Aber auch eine unterschiedliche Verteilung von Sequenztypen auf Katzen- und Human-Isolate konnte gezeigt werden (Arvand et al. 2007).
1.5 Problemstellung und Zielsetzung der Arbeit
Obwohl von einer relativ hohen Inzidenz ausgegangen werden muss, werden die von Bartonellen verursachten Erkrankungen in Deutschland bisher nur unzureichend diagnostiziert. Ebenso fehlt es an Untersuchungen zur Prävalenz von Bartonella-Arten in Haustieren und ihrer zoonotischen Relevanz. Daneben häufen sich zurzeit die Berichte über Bartonellen Infektionen von Hunden. In Deutschland existieren hierüber bisher ebenfalls keine Angaben über die Prävalenzen oder Fallberichte in der Hundepopulation. In dieser Arbeit sollen einerseits mittels klassischer mikrobiologischer Methoden und andererseits durch die Entwicklung und Anwendung neuer molekulargenetischer Nachweismethoden Bartonella-Infektionen in Katzen und Hunden identifiziert und charakterisiert werden. Die Übertragung von Bartonellen durch den Katzenfloh gilt als gesichert. Da aber immer häufiger auch Zecken als Überträger für Bartonellen diskutiert werden, aus diesem Grund wird in dieser Arbeit ebenso eine Zecken-DNA-Sammlung molekularbiologisch untersucht.
Mit den daraus resultierenden Ergebnissen können weitere Schlussfolgerungen auf die Übertragungswege von Bartonellen und den Einfluss als Krankheitserreger gezogen werden.
2 Combined MLST and AFLP typing of Bartonella henselae isolated from cats reveals new sequence types and suggests clonal evolution
A. Mietzea, D.Morickd, H.Köhlerc, S.Harrusd, C.Dehioe, I.Nolteb, R.Goethea*
a) Institut für Mikrobiologie,StiftungTierärztliche Hochschule Hannover, Germany, b) Klinik für Kleintiere,StiftungTierärztliche Hochschule Hannover, Germany, c) Institut für molekulare Pathogenese, FLI Jena, Germany, d) Koret School of Veterinary Medicine, Hebrew University of Jerusalem, Rehovot, Israel, e) Biozentrum, University of Basel, Switzerland
PII: S0378-1135(10)00384-6
DOI: doi:10.1016/j.vetmic.2010.08.012 Reference: VETMIC 4992
To appear in: VETMIC Received date: 26-4-2010 Revised date: 11-8-2010 Accepted date: 16-8-2010
Abstract
Bartonella species are Gram-negative, fastidious bacteria. Bartonella henselae is found in cats and transmitted to humans via cat scratches or bites causing cat-scratch disease, characterized by clinical symptoms with varying severity.The prevalence of bartonellosis among humans in Germany appears to be high, and severe clinical cases have been described.
However, epidemiological data of B. henselae in cats are rare.In this study we determined the detection rates of Bartonella ssp.in cats by culture and real-time PCR. Furthermore, B.
henselae isolates were genetically characterized by highly discriminatory amplified fragment length polymorphism (AFLP) and multi locus sequence typing (MLST). Bartonella spp. were isolated by culture from 11 (2.2 %) of 507 blood samples. Out of 169 blood samples additionally analyzed by PCR, 28 (16.6 %) were found positive for Bartonella spp., illustrating the advantage of PCR in Bartonella spp. detection. PCR-REA identified B.
henselae in 27 cats and Bartonella clarridgeiae in one cat. B. henselae isolates from different geographical regions in Germany were genetically characterized by AFLP and MLST. Both methods confirmed genetic diversity of B. henselae on the strain level. MLST identified 11 new sequence types, all of them assigned to three clonal complexes as determined by eBURST. AFLP typing revealed genetic relation among the B. henselae isolates from the same geographical region. Combining AFLP typing and MLST/eBURST analyses revealed that B. henselae of the same AFLP subcluster belonged to the same clonal complex.
Altogether these results indicate that B. henselae may evolve clonally.
3 Molecular detection of Bartonella spp. in healthy and diseased dogs A. Mietze1, M. Sack1, I. Nolte2, R. Goethe1*
Institute for Microbiology1, Clinic for small Animals2, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation
(in preparation)
Abstract
Bartonella species are being recognized as zoonotic pathogens with increasing importance in veterinary and human medicine. These bacteria can be transmitted by arthropods or alternatively by animal scratches or bites. In general, cats are associated with the transmission of Bartonella henselae to humans, typically resulting in cat scratch disease; however, there have also been sporadic reports of Bartonella transmission by dogs. In this study we analysed randomly collected EDTA-blood samples from dogs for Bartonella bacteraemia by detecting Bartonella DNA using real time PCR and PCR-REA. Out of 159 blood samples 50 show amplification in real time PCR. After species differentiation B. henselae were detected in 45 samples and B. elizabethae in 5 samples. Furthermore, we were able to detect 3 cases of clinical B. henselae infections in dogs with symptoms comparable to those occurring in Bartonella infection of humans. These are described in detail as case reports. In this study we were able to demonstrate a higher detection rate of Bartonella in dogs in comparison to the cat population. The role of Bartonella spp. in humans is not finally clarified.
Introduction:
Bacteria of the genus Bartonella are fastidious, gram-negative rod shaped bacteria encompassing more than 20 described species (Abbott et al., 1997; Chomel et al., 2003;
Chomel et al., 2004; Boulouis et al., 2005; Chomel et al., 2006). Bartonella are highly adapted to mammals as reservoir hosts, in which they commonly cause long-lasting intraerythrocytic bacteremia (Kordick and Breitschwerdt, 1995; Breitschwerdt and Kordick, 2000; Dehio, 2001; Jacomo et al., 2002). Bartonella spp. were first isolated from a dog in 1993 suffering from endocarditis (Breitschwerdt et al., 1995). Since the, several Bartonella species, including B. clarridgeiae, B. elizabethae, B. henselae, B. vinsonii subspecies
berkhoffii and B. washoensis have been shown to infect dogs. In contrast to clinical manifestation in cats, Bartonella may contribute to the pathogenesis of a wide spectrum of diseases in dogs, including polyarthritis, cutaneous vasculitis, endocarditis, myocarditis, epistaxis, pelisosis hepatis and granulomatous inflammatory disease (Breitschwerdt et al., 1995; Kordick et al., 1996; Breitschwerdt et al., 1999; Kitchell et al., 2000; Pappalardo et al., 2000; Chomel et al., 2001; Mexas et al., 2002; Gillespie et al., 2003). The transmission of B. henselae from dogs to humans has occasionally been suggested. Thus, B. henselae was found to be aetiological agent in a case of human osteomyelitis following a dog scratch (Keret et al., 1998). Furthermore, seroreactivity for B. henselae, and Bartonella spp has been described in a dog owner suffering from lymphadenopathy. Thereupon, DNA was amplified from gingival swabs of his dogs (Tsukahara et al., 1998). In Germany no study addresses the prevalence of Bartonella infection in the dog population. Therefore, we investigated the prevalence of Bartonella spp. in dogs in northern and western part of Germany. We were able to show that the prevalence of Bartonella infected dogs is high and that B. henselae is the most prevalent species.
Material and Methods
One hundred fifty nine EDTA blood samples were randomly collected from dogs with different clinical backgrounds in the small animal clinic of the University of Veterinary Medicine, Hannover. All EDTA blood samples were analysed by quantitative real time PCR.
Additionally, EDTA blood or lymph node aspirate was taken from four dogs with specific clinical symptoms, such as lymphadenopathy and granulomatous inflammatory diseases, potentially associated with Bartonella infection.
Genomic DNA was extracted from 125 µl of the deep frozen canine EDTA-anticoagulated blood after thawing using a DNA extraction kit (innuprep dna mini kit, Analytic Jena, Germany). DNA was eluted from the columns with 60 µl elution buffer.
Molecular detection of Bartonella spp. was performed by quantitative real time PCR analysis targeting the citrate synthase gene and species differentiation by restriction analysis of PCR (PCR-REA) (Mietze et al., 2010)
Immunohistochemistry was carried out with anti-B. henselae rabbit serum and the avidin- biotin-peroxidase complex method (Alldinger et al., 1996).
Results
We were able to detect Bartonella spp. in 50 of 159 blood samples, resulting in a prevalence of 31.4%. The species differentiation by PCR-REA showed the restriction pattern of B.
henselae (28.3%) in 45 samples and the pattern of B. elizabethae in 5 samples (3.1%).
Analyses of the clinical data showed no correlation between specific clinical signs and the detection of Bartonella DNA in the blood of the dogs.
Case1:
A four year old Welsh terrier showed recurrent febrile episodes of ambiguous nature as well as hyperesthesia. During the ultrasonographic examination, alterations of the abdominal organs were recognized. Therefore, a diagnostical laparotomy was performed and samples of the organs were taken for histpathological analysis. Histology revealed a purulent-necrotizing splenitis, a pyogranulomatous perihepatitis, a purulent hepatitis and purulent necrotizing pancreatitis. It was suggested, that the cause of these alteration could be a primary or secondary bacterial infection yet microbiological examination showed no aerobic or anaerobic agent content. Using a quantitative real time PCR from EDTA blood from this dog as well as PCR-REA we were able to detect B. henselae. In contrast, detection by culture from the EDTA blood was negative. In immunohistochemistry we were able to detect Bartonella spp.
in the liver tissue of the dog. The dog was treated with marbofloxacin, metamizol and prednisolon. After discharge the dog died suddenly.
Case2:
A seven year old Doberman was delivered to the clinic for small animals of our University with clinical symptoms of inappetence and apathy, and a body temperature of 40.5°C. The tentative diagnosis was an ileus. A diagnostic laparotomy was performed and identified an enlargement of the mesenteric lymph nodes caused by a purulent necrotizing lymphadenitis.
The fine needle biopsy confirmed the purulent necrotizing lymphadenitis and revealed bacterial colonisation. EDTA blood as well as an aspirate of the lymphatic tissue were used for the quantitative real time PCR for Bartonella spp.. After PCR-REA, both revealed the pattern of B. henselae. Unfortunately, the detection by culture was negative. The pathohistological examination identified a malignant lymphoma. The dog was treated with doxycyclin and metronidazol. After one week the dog was euthanized.
Case3:
A nine year old toy poodle was delivered to the clinic for small animals with hyperesthesia.
The abdominal ultrasound revealed a cyst within the pancreas. Bacteriological culture of an aspirate of the cyst showed moderate Clostridium perfringens and B. henselae colonisation.
Western blot analysis of the dog serum confirmed reactivity with surface proteins of B. henselae. The culture and PCR of the EDTA blood were negative. After antimicrobial treatment with amoxicillin the hyperesthesia declined. In a repeated puncture and culture of the cyst, two weeks later, no bacteria were detected and the diameter of the cyst was reduced.
Four weeks afterwards, hyperesthesia had reappeared in the animal. The cyst was then sugically removed in the clinic. Intraoperatively, strong adherences to the pancreas were observed. Until now the dog is under observation.
Discussion
The major reservoir host of B. henselae is the cat. Infections in cats often remain undetected, because infected animals do not display characteristic clinical symptoms. We previously found a detection rate of Bartonella DNA in cats of 16.6 % (Mietze et al., 2010). As only a few studies exist about the prevalence of the dog population (Bai et al., 2010), we analysed 159 canine blood samples. We were able to detect an infection with B. henselae or B.
elizabethae in 50 of 159 dogs. While commonly cats are regarded as the main zoonotic reservoir for B. henselae infection, this study demonstrates that the prevalence of Bartonella spp. in dogs in Germany is at the same level or even higher than in cats. We were able to detect B. henselae in 28.3 % of the analysed dogs and B. elizabethae in 3.1 % of the analysed dogs. In a comparable study conducted in Thailand, a prevalence of 31.3 % of Bartonella spp
was found in a stray dog population, yet none of these dogs was infected with B. henselae (Bai et al., 2010). The fact, that asymptomatic dogs were tested positive for Bartonella spp.
implies dogs may also act as zoonotic reservoir for Bartonella spp.. On the other hand, we were able to detect B. henselae in three out of four dogs suffering from symptoms which may be associated with Bartonella infection. However, only in one dog the symptoms improved after antimicrobial treatment. Interestingly, we exclusively detected B. henselae. Therefore it remains unclear, if dogs similar to cats are only reservoirs for Bartonella or if they are a non- reservoir host and develop the same manifestations of the diseases as humans. It may possibly depend upon the animals’ immune status, as immunocompetent dogs stay asymptomatic and immunocompromised dogs develop the different clinical symptoms. The clinical relevance derived from the microbiologic evaluation of the three cases is difficult to infer due to the small number of cases and it may be necessary to apply molecular Koch’s postulates to establish the pathogenicity of these highly adapted organisms. In comparison to the cat population where we were able to detect only B. henselae, except of one cat, described previously (Mietze et al., 2010), in the dog population we found also B. elizabethae.
B. elizabethae, of which rats are the reservoir and the transmission occurs though rat flea.
Thus, further investigation into the transmission should be carried out to clarify if vectors other than the cat flea, which are also often found on dogs (Just et al., 2008), are involved.
Specifically, ticks must be considered as vector for B. henselae (Mietze et al., 2010; Dietrich et al., 2010), while rat flea may execute the transmission of B. elizabethae. B. elizabethae is another recognized pathogen, causing endocarditis and other pathologies in both humans and dogs (Daly et al., 1993; Mexas et al., 2002). Although the extent to which dogs mediate the transmission of Bartonella spp. to humans is unclear, the obtained results suggest that dogs should be considered as potential source for Bartonella infections in humans.
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Tsukahara, M., Tsuneoka, H., Iino, H., Ohno, K., Murano, I., 1998. Bartonella henselae infection from a dog. Lancet 352, 1682.
Abb. 1.: IHC of the liver, case1 (A) and negative control (B) A)
B)
4 Occurrence of Bartonella henselae and Borrelia burgdorferi sensu lato co- infections in ticks collected from humans in Germany
A. Mietze1, C. Strube2, M. Beyerbach3, T. Schnieder2 and R. Goethe1
1) Institute for Microbiology, 2) Institute for Parasitology and 3) Institute for Biometry, Epidemiology and Information Processing, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, Hannover, Germany
DOI: 10.1111/j.1469-0691.2010.03363.x
To appear in: Clincal Microbiology and Infection Received Date: 06/07/2010
Revised Date: 19/08/2010 Accepted Date: 20/08/2010
Abstract:
Bartonella (B.) henselae is the zoonotic agent of cat scratch disease. B. henselae has been associated with therapy-resistant Lyme disease in humans suggesting that B. henselae and Borrelia burgdorferi sensu lato might be transmitted concurrently by ticks. In the present study we found that 16 (6.9 %) of 230 Ixodes ricinus collected from humans harboured DNA of Bartonella spp. Fifteen positive ticks were infected with B. henselae and one tick with B.
clarridgeiae. Twenty-five percent of the 16 Bartonella positive ticks were co-infected with Borrelia burgdorferi sensu lato. Our data show that B. henselae is present in Ixodes ricinus and that ticks may serve as source of infection for humans.
5 Diskussion
Die Gattung Bartonella umfasst gram-negative, fakultativ intrazelluläre Erreger, die in Erythrozyten und Endothelzellen von Säugern persistieren. Tiere sind das natürliche Reservoir und die Infektion des Menschen erfolgt häufig direkt durch das Tier (Hautkratzer, Biss) oder indirekt über Arthropoden (Flöhe, Läuse). Insbesondere bei immunsupprimierten Menschen verursachen Bartonellen, im speziellen B. henselae, teilweise schwere Erkrankungen, wie beispielsweise die KKK, bazilläre Angiomatose, Peliosis hepatis und Endokarditis. Obwohl von einer relativ hohen Inzidenz ausgegangen werden muss, werden die von Bartonellen verursachten Erkrankungen in Deutschland bislang noch unzureichend diagnostiziert. Für B. henselae, den Erreger der KKK, gelten Katzen als das natürliche Reservoir. In Katzen und anderen Säugetierspezies sind Infektionen mit B. henselae schwer zu diagnostizieren, weil sie meist ohne spezifische klinische Symptome auftreten (Chomel et al., 2003). Des Weiteren ist der kulturelle Nachweis aufgrund des langsamen und anspruchsvollen Wachstums von B. henselae problematisch (La Scola and Raoult, 1999).
Über die Prävalenzen von B. henselae in der Katzenpopulation in Deutschland ist nur wenig bekannt. Deshalb wurden in dieser Arbeit zunächst Katzenseren von Patienten der Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover mittels ELISA auf ihre Seroreaktivität gegen B. henselae Oberflächenantigene überprüft. Diese Untersuchungen zeigten eine große Anzahl positiver Katzen (68,7 %). Die Seroprävalenz ist mit den Angaben in der Literatur durchaus vergleichbar. In den Niederlanden wird von einer Seroprävalenz von 50,4 % berichtet (Bergmans et al., 1997). In einer dänischen Studie lag die Seroprävalenz bei 45,9 % (Chomel et al., 2002). Dies mag eine hohe Expositionsrate der Katzenpopulation mit dem Erreger widerspiegeln, wobei falsch positive Katzen aufgrund von Kreuzreaktionen nicht ausgeschlossen werden können.
Aufgrund der hohen Seroprävalenz wurden anschließend in dieser Arbeit Katzenblutproben, trotz des bekannt schwierigen Nachweises, zunächst kulturell auf B. henselae, untersucht. Daraus resultierte eine Prävalenz von 2,2 %. Im Vergleich mit anderen Studien ist diese Prävalenz als recht niedrig anzusehen. In einer Studie
in Freiburg wurden 100 Katzen beprobt, es konnte eine Prävalenz von 13 % festgestellt werden (Sander et al., 1997). In der zweiten Studie die bisher in Deutschland durchgeführt worden ist, wurde zwischen Hauskatzen und streunenden Katzen unterschieden, es ergab sich für 97 getestete Hauskatzen eine Prävalenz von 1 % und für 96 streunenden Katzen von 18,7 % (Arvand et al., 2001). Jedoch ist die Zahl der getesteten Katzen deutlich niedriger als in der vorliegenden Studie. Unsere Katzenpopulation setzte sich bis auf drei Ausnahmen (Fundkatzen) aus Hauskatzen zusammen.
Um den kulturellen Nachweis, der wie bereits beschrieben sehr anfällig sein kann, zu ergänzen, wurde eine neue quantitative real-time PCR zur Bartonellen Diagnostik etabliert. Diese PCR ist spezifisch für das Genus Bartonella. Zur Spezies Differenzierung muss eine Restriktionsanalyse des PCR Produktes folgen, hierzu modifizierten wir die Methode von Norman et al. (1995), um in der Lage zu sein, 8 verschiedene Bartonella Spezies zu unterscheiden. Die Kombination aus diesen beiden Methoden ergibt einen hoch sensitiven und hoch spezifischen Nachweis von Bartonellen. So konnte eine Nachweisrate von 16,2 % in der zuvor schon kulturell untersuchten Population erzielt werden. Da in den meisten Prävalenzstudien nur der kulturelle Nachweis durchgeführt wurde, ist hierzu ein direkter Vergleich schwierig.
Festzuhalten ist, dass die von uns etablierte PCR deutlich sensitiver ist als der kulturelle Nachweis. Ganz im Gegensatz zu einer Studie in den Niederlanden, wo ebenfalls Kultur, Serologie und ein molekulargenetischer Nachweis durchgeführt worden sind. Hier wurde eine Prävalenz von 22 % bei Katzen aus verschiedenen Tierheimen bestimmt, der serologische Nachweis ergab eine Prävalenz von 50,4 % und der molekulargenetische Nachweis mittels PCR nur 6,2 % (Bergmans et al., 1997). In den Niederlanden wurde also der Nachweis mittels PCR weniger erfolgreich durchgeführt.
In der Literatur wird oft eine gehäufte Bakteriämie von jungen Katzen beschrieben, so berichten Heller et al. (1997) eine um 30 % höhere Prävalenz der B. henselae Bakteriämie für Katzen mit einem Lebensalter unter einem Jahr (Heller et al., 1997);
in einer Studie aus Freiburg wird eine ca. dreimal höhere Prävalenz der B. henselae Bakteriämie beschrieben (Sander et al., 1997). Die Altersauswertung der positiv
getesteten Katzen in dieser Arbeit, kulturell und auch mittels PCR, ergab keine statistisch signifikante Disposition für Katzen < 1 Jahr für eine gehäuft auftretende Bartonellen-Infektion. Auch die Auswertung der Vorstellungsgründe in der Klinik brachte keinen Hinweis auf eine Verbindung zwischen der Bartonellen-Infektion und spezifischen klinischen Symptomen. Dies spricht, wie auch häufig in der Literatur beschrieben für eine symptomlose Infektion der Katzen, auch, wenn von Sykes et al.
(2010) von einer direkten Assoziation mit Gingivostomatitis und der Isolierung von Bartonella spp. berichtet wurde (Sykes et al., 2010). Per Anamnese wurde die Haltungsform der Katzen festgestellt, ob es sich um Freigänger-Katzen oder reine Wohnungskatzen handelt. Überraschenderweise konnten auch aus ausschließlich in der Wohnung gehaltenen Katzen Bartonellen isoliert werden. Möglicherweise können diese Katzen aber durch Vektoren, die auf anderen Wegen in den Haushalt, beispielsweise durch Tierarztbesuche, eingebracht worden sind, infiziert worden sein. Eine Rolle kann hier auch die Herkunft der Katze spielen und wie lange das Tier schon in der Wohnung gehalten wird.
An B. henselae Isolaten von Katzen und Menschen, sind bereits eine Vielzahl von Typisierungen durchgeführt worden. Alle Methoden wurden zur Typisierung für nützlich befunden. Sowohl Sequenzanalysen des 16S rRNA Gens, welches in zwei möglichen Varianten (I, II) auftreten kann, als auch ERIC-PCR, REP-PCR und AP- PCR als PCR basierende Typisierungsmethoden, sowie die Pulsfeldgelelektrophorese sind in der Lage, eine Charakterisierung der Isolate durchzuführen. Auch das „Multi-locus-sequence typing“ (MLST), eine der am stärksten diskriminierenden Methoden, ist bereits für B. henselae angewendet worden.
In dieser Arbeit wurde zur Genotypisierung zum ersten Mal der amplified fragment length polymorphism (AFLP) für B. henselae etabliert. AFLP ist eine ähnlich stark auflösende Methode wie die schon erwähnte Pulsfeldgelelektrophorese, aber in der Durchführung erheblich einfacher. Die AFLP hat sich auch für B. henselae als sehr gut diskriminierende Methode herausgestellt. Mit dieser Fingerprint-Methode waren wir zum ersten Mal in der Lage, eine Gruppierung von B. henselae-Isolaten der gleichen geographischen Region zu identifizieren. Um unsere epidemiologischen
Informationen noch zu erweitern, haben wir zusätzlich ein MLST durchgeführt. Das MLST wurde bereits für B. henselae Isolate angewendet, um Isolate aus verschiedenen Ländern zu vergleichen. Es wurden 14 Sequenztypen gefunden, von denen jedoch nur 4 von humanen Isolaten stammten (Arvand et al., 2007).
Überraschenderweise sind mit einer geringen Zahl an Isolaten erheblich mehr neue ST gefunden worden, im Gegensatz zu bisherigen MLST-Studien. Wir waren in der Lage, die Zahl der bisher gefundenen ST von 15 auf 26 zu erhöhen. Anhand der eBURST-Analyse ist es gelungen, die bereits bestehenden klonalen Komplexe zu erweitern. Die neuen ST sind auf alle drei klonalen Komplexe verteilt, es gibt keine Präferenz für einen der Komplexe. Vergleicht man die MLST-Daten bzw. die klonalen Komplexe mit den Daten der AFLP, so besteht keine direkte Korrelation zwischen den Clustern und den klonalen Komplexen. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die MLST Daten die bereits publizierte genetische Heterogenität der B.
henselae Isolate bestätigen. Es sieht allerdings so aus, dass die Population von B.
henselae in der Region um Freiburg relativ homogen ist im Vergleich zu der Population in der Region Hannover. Dies kann durch die unterschiedliche Katzenpopulation begründet sein. Möglicherweise sind diese Unterschiede auch durch den Zeitpunkt der Isolierung begründet. Denn zwischen den Isolaten aus Freiburg (1997) und den Isolaten aus der Region Hannover (2008-2009) liegen ca.
10 Jahre.
Da sich in der Literatur Berichte über Bartonellen Infektionen von Hunden häuften, haben wir die PCR Untersuchungen auch an Hundeblutproben mittels unserer PCR- REA-Methode auf Bartonellen DNA durchgeführt (Breitschwerdt et al., 1995; Kordick et al., 1996; Breitschwerdt et al., 1999; Kitchell et al., 2000; Pappalardo et al., 2000;
Chomel et al., 2001). Überraschenderweise ergab sich einer Prävalenz von 31,4 %, die damit sogar deutlich über der Prävalenz in Katzenblutproben lag. Die Ursache für die hohe Prävalenz in Hunden kann durch den Katzenfloh begründet sein oder aber es spielt ein anderer Vektor eine zusätzliche Rolle, wie beispielsweise die Zecke.
Nach der Spezies Differenzierung waren interessanterweise in den 47 positiven Proben 42-mal B. henselae und 5-mal B. elizabethae zu finden. B. elizabethae hat ihr Reservoir in der Ratte und ist in der Lage im Menschen Endokarditis oder auch
Neuroretinitis hervorzurufen (Daly et al., 1993). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Hundepopulation als „Fehlwirt“ oder auch als Reservoirwirt in Frage kommt.
Allerdings waren nach Auswertung der Krankengeschichten auch hier keine vermehrten Häufungen von spezifischen Krankheitssymptomen zu beobachten. In der Literatur werden bei Hunden Bartonellen assoziierte Erkrankungen beschrieben, die den Erkrankungen des Menschen ähneln. Dies spricht eher für den Hund als
„Fehlwirt“. Es besteht die Möglichkeit, dass beim Hund ebenfalls wie beim Menschen der Immunstatus eine Rolle spielt. Deshalb wurden in Absprache mit der Klinik für Kleintiere gezielt Hunde mit den beschriebenen Symptomen untersucht, und Blutproben wie auch Lymphknotenpunktat bzw. Zystenpunktat entnommen.
Tatsächlich waren wir in der Lage, sowohl in Blutproben als auch in Lymphknoten- oder auch Zystenpunktaten Bartonellen DNA aus drei erkrankten Hunden nachzuweisen, der kulturelle Nachweis war nur aus dem Zystenpunktat erfolgreich.
Es konnte lediglich bei einem Hund durch die antimikrobielle Therapie eine Besserung der Krankheitssymptome erzielt werden. Zusammenfassend muss man sagen, dass die Rolle von Bartonellen im Hund noch weiter verfolgt werden muss, um hier genauere Erkenntnisse über den Krankheitsverlauf zu bekommen. Durch die Fallberichte konnten Hinweise für Bartonellen als ätiologisches Agens für Krankheitserscheinungen beim Hund gefunden werden. Die hohe Nachweisrate in den Hunden spricht dafür, dass Hunde ebenfalls eine Infektionsquelle für den Menschen darstellen können.
Die Übertragung von B. henselae durch den Katzenfloh ist bereits gesichert.
Weiterhin stellt sich die Frage, ob der Katzenfloh der einzige blutsaugende Überträger für B. henselae in Deutschland ist oder auch andere blutsaugende Arthropoden für die Übertragung von Bartonellen verantwortlich sind. In Frankreich wurde durch Infektionsexperimente mit I. ricinus Zecken gezeigt, dass eine Übertragung von B. henselae durch die Zecke möglich ist (Cotte et al., 2008). Erst kürzlich wurden von Dietrich et al. (2010) in zwei unterschiedlichen Wäldern in Deutschland Prävalenzen von 11,8 % bzw. 2,9 % in Zecken festgestellt (Dietrich et al., 2010). Um dieser Fragestellung näher auf den Grund zu gehen, wurde von uns eine DNA-Sammlung von Zecken, die von Menschen abgesammelt wurden, mittels
