Hannover 2018Anna Wagner
Immunhistochemische Phänotypisierung intestinaler Makrophagen bei Hunden mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Anna Wagner
Münster Hannover 2018
Deutschen Nationalbibliografie;
detaillierte bibliografische Daten sind im Internet abrufbar über http://dnb.ddb.de
© 2018 by Verlag:
Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen Printed in Germany
ISBN 978-3-86345-432-6 1. Auflage 2018
Verlag:
DVG Service GmbH Friedrichstraße 17 35392 Gießen Tel.: 0641/24466 info@dvg.de www.dvg.de
Immunhistochemische Phänotypisierung intestinaler Makrophagen bei Hunden mit chronisch-
entzündlichen Darmerkrankungen
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Anna Wagner
Münster
Hannover 2018
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachterin: Univ.-Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Ingo Nolte
Teilergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden bereits in Innate Immunity 2017, 23 (3) und Veterinary Immunology and Immunopathology 2018, 197 veröffentlicht.
Tag der mündlichen Prüfung: 09.05.2018
Meinem Großvater
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ... 1
1.1. Chronisch-entzündliche Darmerkrankungen des Hundes ... 1
1.1.1. Inflammatory bowel disease ... 1
1.1.2. Histiozytäre ulzerative Kolitis ... 5
1.2. Enterisches Immunsystem ... 7
1.2.1. Angeborene Immunität ... 8
1.2.2. Adaptive Immunität ... 10
1.3. Intestinale Makrophagen ... 11
1.3.1. Herkunft, Reifung und Verteilung... 11
1.3.2. Polarisation ... 16
1.3.3. Funktionen im Steady State ... 19
1.3.3.1. Phagozytose/Inflammatorische Anergie ... 20
1.3.3.2. Epithelbarriere ... 22
1.3.3.3. Immunologische Homöostase ... 23
1.3.3.4. Induktion adaptiver Immunantworten ... 25
1.3.4. Funktionen bei Entzündungen ... 26
1.3.4.1. Makrophagen bei humaner inflammatory bowel disease ... 31
1.3.5. Immunhistochemische Phänotypisierung kaniner intestinaler Makrophagen ... 32
2. Manuskripte ... 36
2.1. Immunohistochemical characterization of gastrointestinal macrophages/phagocytes in dogs with inflammatory bowel disease (IBD) and non-IBD dogs ... 36
2.2. Heterogeneity of macrophages in canine histiocytic ulcerative colitis ... 38
3. Diskussion ... 40
3.1. Makrophagen im kaninen Gastrointestinaltrakt im Steady State ... 40
3.2. Makrophagen bei kaniner inflammatory bowel disease... 44
3.3. Makrophagen bei kaniner histiozytärer Kolitis ... 47
3.4. Translationale Bedeutung kaniner chronisch-entzündlicher Enteropathien für die Humanmedizin ... 51
4. Zusammenfassung ... 54
5. Summary ... 57
6. Liste der Publikationen ... 60
7. Literaturverzeichnis ... 61
8. Danksagung ... 91
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Marker zum immunhistochemischen Nachweis von Makrophagen an kaninem, Formalin-fixiertem Gewebe ………35
Tabelle 2: Verschiedene Formen chronisch-entzündlicher Enteropathien bei Hunden und Menschen………53
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Multifaktorielle Pathogenese der inflammatory bowel disease………….2 Abbildung 2: „Monozyten-Wasserfall“……….14
Abbildung 3: Intestinale Makrophagen und ihre Funktionen im Steady State und bei Entzündungen………30
Abkürzungsverzeichnis
AIEC adhärente und invasive Escherichia coli
CCL C-C chemokine ligand
CCR C-C chemokine receptor
CD cluster of differentiation
CIBDAI Canine Inflammatory Bowel Disease
Activity Index
cMoP common monocyte progenitor
CSF colony-stimulating factor
CX3CR1 CX3 chemokine receptor 1
DNS Desoxyribonukleinsäure
DSS dextran sulfate sodium
EGE eosinophile Gastroenteritis
FAE follicle associated epithelium
Foxp3 forkhead box P3
GM-CSF granulocyte macrophage colony-
stimulating factor
hi high (hochgradige Expression in
Durchflusszytometrie)
HLA human leukocyte antigen
HUC histiocytic ulcerative colitis
Iba-1 ionized calcium-binding adapter
molecule-1
IBD inflammatory bowel disease
IFN Interferon
Ig Immunglobulin
IL Interleukin
ILC innate lymphoid cell
iNOS inducible nitric oxide synthase
int intermediate (mittelgradige Expression in
Durchflusszytometrie)
lo low (geringgradige Expression in
Durchflusszytometrie)
LPE lymphoplasmazelluläre Enteritis
LPS Lipopolysaccharide
Ly6C lymphocyte antigen 6 complex
MAdCAM-1 mucosal addressin cell-adhesion
molecule-1
M-CSF macrophage colony-stimulating factor
MDP monocyte-macrophage dendritic cell
progenitor
MHC major histocompatibility complex
MyD myeloid differentiation primary response
gene
NCF neutrophil cytosolic factor
NF nuclear factor
NOD nucleotide-binding oligomerization domain
P Population
PAS Periodic acid-Schiff
PGE2 Prostaglandin E2
PRR pattern recognition receptor
ROR retineic acid receptor-related orphan
nuclear receptor
TGF transforming growth factor
Th T helper cell
TLR Toll-like receptor
TNF Tumornekrosefaktor
Treg regulatorische T-Zelle
WSAVA World Small Animal Veterinary
Association
ZNS zentrales Nervensystem
1. Einleitung
1.1. Chronisch-entzündliche Darmerkrankungen des Hundes
1.1.1. Inflammatory bowel disease
Die inflammatory bowel disease (IBD) des Hundes stellt eine chronische Erkrankung des Gastrointestinaltraktes dar, deren Ursachen bislang noch nicht vollständig geklärt sind. Ähnlich wie bei der IBD des Menschen sollen auch beim Hund genetische Faktoren, das enterische Immunsystem sowie Umweltfaktoren eine Rolle in der Pathogenese spielen (GERMAN et al. 2003; JERGENS u. SIMPSON 2012) (siehe Abbildung 1). Da bestimmte Rassen, wie der Deutsche Schäferhund, eine Disposition für IBD aufweisen, liegt ein genetischer Einfluss auf die Pathogenese nahe (GERMAN et al. 2003). So wurde in einer Studie eine Assoziation von Polymorphismen in den Toll-like receptor (TLR)4- und TLR5-Genen mit IBD bei Deutschen Schäferhunden festgestellt (KATHRANI et al. 2010). Außerdem wurde eine erhöhte Expression von TLRs im Darm von Hunden mit IBD (BURGENER et al.
2008; ALLENSPACH et al. 2010; MCMAHON et al. 2010) nachgewiesen. Eine gesteigerte Immunantwort des angeborenen, enterischen Immunsystems auf kommensale Bakterien könnte somit eine Entzündungsreaktion in Abwesenheit pathogener Noxen auslösen (GERMAN et al. 2003; JERGENS u. SIMPSON 2012).
Alternativ könnte eine primäre Störung der Zusammensetzung der intestinalen Mikroflora (Dysbiose) zu einer übermäßigen Aktivierung des enterischen Immunsystems führen (XENOULIS et al. 2008; SUCHODOLSKI et al. 2010).
Abbildung 1: Multifaktorielle Pathogenese der inflammatory bowel disease Im Steady State herrscht in der Darmschleimhaut ein stabiles Gleichgewicht, an dessen Aufrechterhaltung Makrophagen mit anti-inflammatorischen Eigenschaften beteiligt sind. Bei Hunden und Menschen mit IBD führen genetische Einflüsse und Umweltfaktoren, wie z.B. eine Dysbiose, zu einer Störung dieses Gleichgewichtes und zu einer überschießenden Reaktion des enterischen Immunsystems auf Antigene (z.B. Kommensalen).
Bei einigen Hunderassen sind Sonderformen der kaninen IBD beschrieben. Dazu gehören die immunproliferative Enteropathie des Basenjis (BREITSCHWERDT et al.
1980), das Diarrhö-Syndrom des Lundehunds (FLESJÅ u. YRI 1977) sowie das enterale Proteinverlust-Syndrom des Soft Coated Wheaten Terriers (LITTMAN et al.
2000).
Es erkranken überwiegend Hunde mittleren Alters an IBD (JERGENS u. SIMPSON 2012). Das klinische Erscheinungsbild präsentiert sich typischerweise in chronischen
(länger als drei Wochen), persistenten oder rezidivierenden, gastrointestinalen Symptomen wie Erbrechen, Durchfall, Appetit- und Gewichtsverlust, wobei es zu spontanen Verbesserungen und Verschlechterungen kommen kann. Bei schweren Erkrankungsverläufen werden Komplikationen durch einen enteralen Proteinverlust und Kobalamin-Mangel beobachtet (JERGENS u. SIMPSON 2012). Um eine standardisierte Beurteilung des klinischen Erkrankungsgrades zu ermöglichen, wurde der sogenannte Canine Inflammatory Bowel Disease Activity Index (CIBDAI) eingeführt, der sechs klinische Parameter (Wohlbefinden/Aktivität, Appetit, Erbrechen, Kotkonsistenz, -frequenz, Gewichtsverlust) berücksichtigt (JERGENS et al. 2003). Der resultierende Score unterscheidet zwischen klinisch inapparenter Erkrankung sowie milder, mittelgradiger und schwerer Form der IBD.
Histologisch lassen sich anhand der überwiegend nachgewiesenen Zelltypen und betroffenen Darmabschnitte verschiedene Formen der kaninen IBD unterscheiden.
Die lymphoplasmazelluläre Enteritis (LPE) ist die häufigste Form der kaninen IBD (GERMAN et al. 2003) und zeichnet sich durch eine geringe bis starke Infiltration der intestinalen Lamina propria mucosae mit Lymphozyten und Plasmazellen aus (JERGENS et al. 1992). Eine weitere Form der kaninen IBD ist durch eine auffällige Infiltration von eosinophilen Granulozyten in der Magen- und Darmschleimhaut gekennzeichnet (eosinophile Gastroenteritis, EGE) und wird ebenfalls regelmäßig bei Hunden mit chronischer gastrointestinaler Symptomatik beobachtet (GERMAN et al.
2003; JERGENS u. SIMPSON 2012). Zusätzlich kommt es häufig zu einer Zerstörung der gewebetypischen Architektur, wie Verlust des Oberflächenepithels, Zottenatrophie und -fusion sowie Kryptendilatationen. Zur einheitlichen Beurteilung
der histologischen Veränderungen bei Entzündungen des Gastrointestinaltrakts bei Hunden wurde von der World Small Animal Veterinary Association (WSAVA) ein standardisiertes Untersuchungsschema veröffentlicht (DAY et al. 2008). Da es trotzdem zu erheblichen Unterschieden in der Beurteilung durch verschiedene Pathologen kam (WILLARD et al. 2010), wurde ein vereinfachtes Schema entwickelt (JERGENS et al. 2014). Für eine adäquate histopathologische Beurteilung von Gewebeproben aus dem Gastrointestinaltrakt spielt darüber hinaus deren Qualität eine entscheidende Rolle (WILLARD et al. 2008; JERGENS et al. 2016).
Da es sich bei der IBD definitionsgemäß um eine idiopathische Erkrankung handelt, müssen vor der Diagnose andere Erkrankungen (intestinale und nicht-intestinale), die zu einer Magen-Darm-assoziierten Symptomatik führen können, durch ausführliche klinische (inkl. bildgebender Verfahren) und labormedizinische Untersuchungen ausgeschlossen werden. Dazu gehören bakterielle oder parasitäre Infektionen, Antibiotika-responsive Enteropathien, Futtermittelallergien und neoplastische Erkrankungen (JERGENS u. SIMPSON 2012). Die Diagnose „kanine IBD“ kann somit nur unter folgenden Voraussetzungen gestellt werden: 1) der Patient zeigt seit über drei Wochen gastrointestinale Symptome; 2) bekannte enteropathogene Erreger und andere Ursachen gastrointestinaler Erkrankungen wurden ausgeschlossen; 3) in Gewebeproben wurden histopathologisch entsprechende entzündliche Veränderungen festgestellt (JERGENS u. SIMPSON 2012).
Für die Behandlung der kaninen IBD sind verschiedene therapeutische Ansätze beschrieben. Ein guter Erfolg (Remissionsrate über 80%) wird dabei durch die Gabe
von Kortikosteroiden allein oder in Kombination mit Antibiotika erzielt (JERGENS et al. 2010). Alternativ kann ein Behandlungserfolg durch die Gabe von Cyclosporin A erreicht werden (ALLENSPACH et al. 2006). Darüber hinaus wird einer Futterumstellung, z.B. auf hydrolisiertes Protein (MANDIGERS et al. 2010), sowie dem Einsatz von Prä- und Probiotika (WILLARD et al. 2000; SAUTER et al. 2005;
SAUTER et al. 2006) ein positiver Einfluss zugesprochen.
1.1.2. Histiozytäre ulzerative Kolitis
Die histiozytäre ulzerative Kolitis (histiocytic ulcerative colitis, HUC) ist, wie IBD, eine chronische Darmerkrankung des Hundes. Zunächst wurde sie ausschließlich bei Boxern beschrieben, so dass eine rassespezifische Erkrankung angenommen wurde (VAN KRUININGEN et al. 1965). Mittlerweile wurde HUC jedoch mehrfach bei Französischen Bulldoggen (VAN DER GAAG et al. 1978; TANAKA et al. 2003;
MANCHESTER et al. 2013) nachgewiesen. Des Weiteren gibt es Berichte über HUC bei Englischen Bulldoggen (HOSTUTLER et al. 2004), Mastiffs, Alaskan Malamutes, Dobermännern (STOKES et al. 2001) und Beagles (CARVALLO et al. 2014). Anders als bei IBD erkranken in erster Linie junge Hunde unter vier Jahren an HUC. Die klinische Symptomatik weist auf eine Dickdarm-assoziierte Erkrankung hin und äußert sich durch Durchfall mit blutigen und/oder schleimigen Beimengungen, Inappetenz und Gewichtsverlust (VAN KRUININGEN et al. 1965; CHURCHER u.
WATSON 1997).
Die makroskopischen Veränderungen bestehen im frühen Erkrankungsstadium aus punktförmigen Rötungen der Kolonschleimhaut (Erosionen). Histologisch zeichnen sich diese Veränderungen durch vakuolisierte Epithelzellen und eine Infiltration mit Makrophagen und neutrophilen Granulozyten aus (GOMEZ et al. 1977). Im weiteren Verlauf der Erkrankung kommt es zu progressiven Veränderungen der Kolonschleimhaut mit Epithel- und Becherzellverlusten und einer massiven Infiltration der Lamina propria mucosae mit einer auffällig großen Anzahl an Makrophagen, deren großes, schaumiges Zytoplasma sich durch die Periodic acid-Schiff (PAS)- Reaktion leuchtend pink färbt (VAN KRUININGEN et al. 1965; SANDER u.
LANGHAM 1968; GERMAN et al. 2000). Der Nachweis dieser PAS+-Makrophagen wird als pathognomonisch für die HUC des Hundes angesehen (VAN KRUININGEN et al. 1965; CRAVEN et al. 2011). Stellenweise erstrecken sich die histiozytären Infiltrate bis in die Submukosa und werden, insbesondere in Arealen mit einem vollständigen Epithelzellverlust, von einer variablen Anzahl an neutrophilen Granulozyten begleitet (VAN KRUININGEN et al. 1965). Aufgrund des durch Makrophagen geprägten Entzündungscharakters sprechen einige Autoren auch von einer granulomatösen Kolitis (CRAVEN et al. 2011). In der Erstbeschreibung der HUC bei Boxern diskutierten VAN KRUININGEN et al. (1965) eine Ähnlichkeit mit der Whipple-Krankheit des Menschen, bei der ebenfalls PAS+-Makrophagen nachweisbar sind. Die Whipple-Krankheit des Menschen wird jedoch, im Gegensatz zur kaninen HUC, durch das Bakterium Tropheryma whipplei verursacht (RELMAN et al. 1992).
Der Ursprung der PAS+-Makrophagen bei der kaninen HUC ist bisher unklar. Die Struktur des PAS+-Materials wurde in mehreren Studien histochemisch und elektronenmikroskopisch untersucht. Mittels verschiedener histochemischer Färbungen wurden (Phospho-)Lipide, Desoxyribonukleinsäure (DNS)-Fragmente und Mukopolysaccharide im Zytoplasma der PAS+-Makrophagen nachgewiesen und als Bestandteile von Mikroorganismen interpretiert (SANDER u. LANGHAM 1968).
Ultrastrukturell zeichneten sich die PAS+-Makrophagen durch zahlreiche, runde, von einer Membran begrenzte, reife Phagosomen im Zytoplasma aus, die z.T. bakterielle Strukturen enthielten (VAN KRUININGEN 1975).
Ursprünglich wurde die HUC als Unterform der IBD angesehen (GERMAN et al.
2003). Im Gegensatz zur idiopathischen IBD wurden bei der HUC jedoch adhärente und -invasive Escherichia coli (AIEC)-Stämme als auslösendes Agens nachgewiesen (VAN KRUININGEN et al. 2005; SIMPSON et al. 2006; MANCHESTER et al. 2013).
Eine antibiotische Therapie führt daher in den meisten Fällen zu einer vollständigen klinischen Remission (HOSTUTLER et al. 2004; MANSFIELD et al. 2009).
1.2. Enterisches Immunsystem
Der Darm stellt das Organ mit der höchsten immunologischen Aktivität im Körper dar (TIZARD 2013a). Im Darmlumen befindet sich eine Vielzahl an kommensalen Bakterien, die in friedlicher Symbiose mit dem Wirt leben. Die Ausbildung einer oralen Toleranz gegenüber der Vielzahl an Fremdantigenen im Darmlumen, zu denen neben Mikroorganismen auch Nahrungsmittelantigene zählen, bei
gleichzeitiger Abwehr krankheitserregender Noxen, dient der Aufrechterhaltung eines Gleichgewichtszustands (Homöostase, Steady State) und stellt eine der wichtigsten Aufgaben des enterischen Immunsystems dar (RESCIGNO et al. 2008). Die Darmschleimhaut ist Sitz einer immensen Anzahl verschiedener Immunzellen, die im Zusammenspiel mit dem Darmepithel die vorderste Front bei der Abwehr pathogener Erreger aus dem Darmlumen bilden (SANSONETTI 2004). Zusätzlich wird im Darm- assoziierten lymphatischen Gewebe (Peyer’sche Platten im Dünndarm, Lymphfollikel im Dickdarm) eine spezifische Immunantwort mit Immunglobulin (Ig)A- produzierenden Plasmazellen induziert.
1.2.1. Angeborene Immunität
Zu den angeborenen Mechanismen, die eine schnelle, unspezifische Erregerabwehr innerhalb des Darmtraktes ermöglichen, zählen die epitheliale Barriere, Mukusschicht, sekretorische Igs, anti-mikrobielle Peptide und Zellen des Immunsystems wie Monozyten, Makrophagen, Dendritische Zellen, neutrophile Granulozyten und innate lymphoid cells (ILCs) (SNYDER 2016).
Das Darmepithel besteht aus einer einlagigen Zellreihe, in der die einzelnen Zellen über tight junction-Proteine eng miteinander verbunden sind. Diese mechanische Barriere verhindert das Eindringen von Makromolekülen und Mikroorganismen und ermöglicht gleichzeitig den transepithelialen Transport von Wasser, Ionen und löslichen Nährstoffen (FRANCE u. TURNER 2017). Zudem finden sich Mukus- produzierende Becherzellen innerhalb der Epithelzellschicht, deren Anzahl von oral
nach aboral ansteigt. Somit ist auch die Dicke der Mukusschicht im Ileum und Kolon wesentlich größer als im Duodenum und Jejunum (JUGE 2012). Die Mukusschicht besteht aus zwei Anteilen. Außen findet sich eine locker aufliegende Schicht, die leicht abgespült werden kann und eine Vielzahl an Bakterien enthält (JUGE 2012).
Im Gegensatz dazu ist die innere Mukusschicht fest mit dem Darmepithel verbunden und frei von Bakterien (JOHANSSON et al. 2008), so dass der Kontakt von Mikroorganismen zur epithelialen Barriere und damit deren Eindringen in den Wirtsorganismus wirksam verhindert wird (BERGSTROM et al. 2010; HASNAIN et al.
2010). Darüber hinaus enthält die Mukusschicht große Mengen an sekretorischem IgA und anti-mikrobiellen Peptiden (beispielsweise Defensine), die von Plasmazellen bzw. Paneth-Zellen und intestinalen Epithelzellen produziert werden (SANSONETTI 2004; JOHANSEN u. KAETZEL 2011).
Sollte es Erregern dennoch gelingen die Barriere aus Epithelzellen und Mukus zu überwinden, stoßen sie auf eine Reihe abwehrbereiter Immunzellen. Von Epithelzellen produziertes Interleukin (IL)-8 führt zu einer Rekrutierung von neutrophilen Granulozyten in die Lamina propria mucosae (SANSONETTI 2004), wo sie zusammen mit Monozyten und Makrophagen an der Phagozytose der eingedrungenen Erreger beteiligt sind. Die speziellen Funktionen von Monozyten und intestinalen Makrophagen im Steady State und unter entzündlichen Bedingungen werden in den folgenden Kapiteln ausführlich beschrieben. Zahlreiche Dendritische Zellen befinden sich sowohl im darmassoziierten lymphatischen Gewebe als auch in der Lamina propria mucosae unmittelbar unterhalb des Darmepithels (IWASAKI 2007). Sie phagozytieren harmlose Antigene und transportieren diese in die
regionären mesenterialen Lymphknoten, wo eine immunologische Toleranz induziert wird (WORBS et al. 2006). Darüber hinaus vermitteln Dendritische Zellen im darmassoziierten lymphatischen Gewebe und in der Lamina propria mucosae unter dem Einfluss von Retinsäure und transforming growth factor (TGF)-β die Differenzierung von forkhead box P3 (Foxp3)+-regulatorischen T-Zellen (Tregs) (COOMBES et al. 2007). ILCs sind ebenfalls ein Teil des enterischen Immunsystems. Sie besitzen keinen Antigen-spezifischen Rezeptor und sind an der frühen Immunantwort beteiligt (GEREMIA u. ARANCIBIA-CARCAMO 2017).
Verschiede Studien weisen darauf hin, dass insbesondere ILC3s über die Produktion von IL-22 auch an der Entzündungsreaktion im murinen Kolitis-Modell und bei Menschen mit Morbus Crohn beteiligt sind (LONGMAN et al. 2014; MIZUNO et al.
2014).
1.2.2. Adaptive Immunität
Von Schleimhaut bedeckte Oberflächen in Nase, Rachen, Bronchien und Darm besitzen ihr eigenes (Schleimhaut-assoziiertes) lymphatisches Gewebe, um sich vor dem Eindringen schädlicher Noxen zu schützen. Das Darm-assoziierte lymphatische Gewebe besteht aus organisierten Strukturen wie den Peyer’schen Platten (Dünndarm) und Lymphfollikeln (Dickdarm) sowie den verstreut in der Lamina propria mucosae und dem Darmepithel liegenden Lymphozyten (TIZARD 2013a). Das oberhalb der lymphatischen Einrichtungen gelegene Epithel (follicle associated epithelium, FAE) zeichnet sich durch sogenannte M-Zellen aus. Dabei handelt es sich um spezialisierte Epithelzellen, die anstelle von Mikrovilli kleinste Falten
(microfolds) an ihrer Oberfläche besitzen (TIZARD 2013a). Diese Zellen nehmen intraluminale Antigene auf und schleusen sie mittels Transzytose durch das FAE in den subepithelial dome (MABBOTT et al. 2013). Dort lokalisierte Dendritische Zellen nehmen die Antigene auf, verarbeiten sie und induzieren eine Immunantwort, in dem sie naive B- und T-Zellen in den angrenzenden Lymphfollikeln der Peyerschen Platten sowie mesenterialen Lymphknoten sensibilisieren (FUKATSU u. KUDSK 2011; REBOLDI u. CYSTER 2016). Nach der Umwandlung von B-Zellen in IgA- produzierende Plasmazellen wandern diese „Effektorzellen“, vermittelt über bestimmte Oberflächenmoleküle (mucosal addressin cell-adhesion molecule-1, MAdCAM-1 und α4/β7-Integrine), wieder in die Darmschleimhaut ein (homing) (FUKATSU u. KUDSK 2011; TIZARD 2013a). Dimere IgA-Moleküle werden mittels Transzytose durch das Epithel in das Darmlumen transportiert, wo sie als sekretorisches IgA die Adhäsion von viralen und bakteriellen Erregern verhindern (immune exclusion) (FUKATSU u. KUDSK 2011; TIZARD 2013a).
1.3. Intestinale Makrophagen
1.3.1. Herkunft, Reifung und Verteilung
Hinsichtlich ihrer Herkunft können Makrophagen in zwei große Gruppen eingeteilt werden: 1) Abstammung von fetalen Vorläuferzellen aus dem Dottersack; 2) Abstammung von Monozyten aus dem Knochenmark (WYNN et al. 2013; ZIGMOND u. JUNG 2013; DAVIES u. TAYLOR 2015). Zur ersten Gruppe zählen die Mikroglia- Zellen des zentralen Nervensystems (ZNS), die Kupffer-Zellen der Leber, die
Alveolarmakrophagen der Lunge sowie ortsständige Makrophagenpopulationen aus Milz und Pankreas (WYNN et al. 2013; YONA et al. 2013). Diese Gewebemakrophagen zeichnen sich durch eine lange Lebensdauer und die Fähigkeit sich (in begrenztem Ausmaß) durch Teilung selbst zu erneuern aus.
Hierdurch wird eine weitgehend konstante Makrophagenanzahl in den Organen sichergestellt (GINHOUX et al. 2010; SCHULZ et al. 2012; YONA et al. 2013). Auch der Gastrointestinaltrakt von neonatalen Mäusen wird zunächst von embryonalen Vorläuferzellen besiedelt (BAIN et al. 2014). Nachfolgend werden diese Zellen jedoch, in einem von der sich entwickelnden Mikroflora des Darms gesteuerten Prozess, durch einwandernde monozytäre Zellen ersetzt (BAIN et al. 2014; VAROL et al. 2015). Die Monozyten differenzieren sich weiter zu ortsständigen Makrophagen, die eine relativ kurze Halbwertszeit von drei bis fünf Wochen aufweisen (JAENSSON et al. 2008; VAROL et al. 2009; VAROL et al. 2015). Das verleiht diesen Zellen ein hohes Maß an Anpassungsfähigkeit, die für die Wahrnehmung der vielseitigen Aufgaben von Makrophagen im Gastrointestinaltrakt von großer Bedeutung ist (ZIGMOND u. JUNG 2013).
Bei der Maus differenziert sich im Knochenmark eine monozytäre Vorstufe (common monocyte progenitor, cMoP) aus gemeinsamen Vorläuferzellen der monozytären und dendritischen Reihe (monocyte-macrophage dendritic cell progenitor, MDP) (HETTINGER et al. 2013). Hieraus gehen die „klassischen“ lymphocyte antigen 6 complex (Ly6C)hi-Monozyten hervor (ZIEGLER-HEITBROCK et al. 2010), die außerdem die Chemokinrezeptoren C-C chemokine receptor (CCR)2 und CX3 chemokine receptor 1 (CX3CR1) in hohem bzw. geringen Ausmaß exprimieren.
Dieser Prozess ist in vitro von dem Wachstumsfaktor granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) abhängig (HETTINGER et al. 2013). Die Ly6ChiCCR2+CX3CR1lo-Monozyten wandern in das Blutgefäßsystem aus und differenzieren sich zum einen weiter zu „nicht-klassischen“ Ly6Clo-Monozyten (ZIEGLER-HEITBROCK et al. 2010; YONA et al. 2013), denen eine Kontrollfunktion im Blutgefäßsystem zugesprochen wird (AUFFRAY et al. 2009). Zum anderen wandern sie, angelockt durch das u.a. von ortsständigen Makrophagen produzierte Chemokin C-C chemokine ligand (CCL)2, in die Lamina propria mucosae des Darms ein (SERBINA u. PAMER 2006; TAKADA et al. 2010; ZIGMOND et al. 2012).
In der intestinalen Lamina propria mucosae der Maus kommt es unter Steady State- Bedingungen über mehrere Zwischenstufen zu einer Differenzierung von Monozyten zu ortsständigen Makrophagen (TAMOUTOUNOUR et al. 2012; BAIN et al. 2013).
Die neu aus dem Blut eingewanderten Monozyten weisen einen Ly6Chimajor histocompatibility complex (MHC) II-cluster of differentiation (CD)64loCX3CR1int- Phänotypen auf und werden auch als Population (P)1 bezeichnet (TAMOUTOUNOUR et al. 2012). Im weiteren Verlauf der Differenzierung kommt es zu einer Abnahme der Ly6C-Expression, während die Expression von MHC II, CD64 und CX3CR1 immer weiter ansteigt. Reifende Monozyten (P2) zeichnen sich dementsprechend durch einen Ly6Cint-hiMHC II+CD64loCX3CR1int-Phänotyp aus und differenzieren sich weiter zu Ly6CloMHC II+CD64+CX3CR1int- Monozyten/Makrophagen (P3). Aus dieser Zwischenstufe gehen die terminal differenzierten, ortsständigen Ly6CloMHC II+CD64+CX3CR1hi-Makrophagen (P4) hervor, die durch ihr hohes phagozytotisches Potential, die Produktion von IL-10 und
ihre Unempfindlichkeit gegenüber einer TLR-Stimulation gekennzeichnet sind (BAIN et al. 2013). Aufgrund der charakteristischen Verteilung der verschiedenen Zellpopulationen (P1-4) in der Durchflusszytometrie wird in diesem Zusammenhang auch vom „Monozyten-Wasserfall“ gesprochen (TAMOUTOUNOUR et al. 2012) (siehe Abbildung 2).
Abbildung 2: „Monozyten-Wasserfall“ (modifiziert nach DE CALISTO et al. 2012) Während der Reifung von Monozyten zu Makrophagen nimmt die Expression von Ly6C ab, während CD64, MHC II und CX3CR1 vermehrt exprimiert werden. So entsteht ein typisches „Wasserfall-artiges“ Verteilungsmuster in der Durchflusszytometrie.
CD, cluster of differentiation; CX3CR1, CX3 chemokine receptor 1; Ly6C, lymphocyte antigen 6 complex; MHC, major histocompatibility complex; P, Population.
Bislang ist allerdings unklar, welche spezifischen Faktoren die Differenzierung von unreifen Monozyten zu reifen, ortsständigen Makrophagen beeinflussen (BAIN u.
MOWAT 2014). Es wird angenommen, dass der Signalweg über den colony- stimulating factor (CSF)1-Rezeptor hierbei eine große Rolle spielt (BAIN u. MOWAT 2014; GRAINGER et al. 2017). Dafür sprechen Studien mit transgenen Mäusen mit
einem Defekt im Csf1 Gen, die u.a. eine starke Reduzierung der Makrophagenanzahl im Dünndarm aufweisen (RYAN et al. 2001). Des Weiteren ist die Produktion von CSF1 durch Neurone des enterischen Nervensystems essentiell für die Entwicklung von Makrophagen in der Tunica muscularis, die für die Kontrolle der Darmperistaltik von großer Bedeutung sind (MULLER et al. 2014). Umstritten ist hingegen, ob die intestinale Mikroflora auch in adulten Individuen einen Einfluss auf die Makrophagen- Differenzierung hat (BAIN et al. 2014; GRAINGER et al. 2017). Es gibt Hinweise darauf, dass bereits die Vorläuferzellen im Knochenmark Signale aus dem Darm erhalten und die spätere Differenzierung somit schon frühzeitig beeinflusst wird (ASKENASE et al. 2015). Intestinale Makrophagen exprimieren im Gegensatz zu ortsständigen Makrophagen in anderen Geweben CX3CR1, der mit dem anti- inflammatorischen Phänotyp dieser Zellen assoziiert ist (BAIN u. MOWAT 2014). Die Expression von CX3CR1 wird durch lokale Faktoren, wie beispielsweise die Zytokine TGF-β (CHEN et al. 2002; SCHRIDDE et al. 2017) und IL-10 (SHOUVAL et al.
2014), positiv beeinflusst.
Vergleichbar mit den Prozessen bei der Maus kommt es im gesunden Darmtrakt des Menschen zu einer Einwanderung von Monozyten, die sich zu ortsständigen Makrophagen differenzieren. Dabei finden sich analog zu den murinen Phänotypen folgende Zellpopulationen: CD14hihuman leukocyte antigen (HLA)- DRloCD209loCD163lo (P1), CD14hiHLA-DRhiCD209loCD163lo (P2) und CD14hiHLA- DRhiCD209hiCD163hi (P3) (BAIN et al. 2013). Zellen mit einer geringen Expression von CD14 werden als das humane Gegenstück zu den CX3CR1hi-Makrophagen (P4) der Maus interpretiert (BAIN et al. 2013). Darüber hinaus entsprechen CD14+CD16--
Zellen den „klassischen“ und CD14loCD16+-Zellen den „nicht-klassischen“ Monozyten der Maus (GEISSMANN et al. 2003; INGERSOLL et al. 2010).
Die meisten Makrophagen sind in der Lamina propria nahe dem Oberflächenepithel lokalisiert (HUME et al. 1984), es finden sich aber auch einzelne Zellen in den glatten Muskelschichten des Darms (MIKKELSEN 1995), wo sie durch die Kommunikation mit enterischen Neuronen an der Regulation der Darmmotilität beteiligt sind (MULLER et al. 2014). Des Weiteren liegen Makrophagen auch im Darm- assoziierten lymphatischen Gewebe vor, allerdings in geringerer Anzahl als Dendritische Zellen (FARACHE et al. 2013). Bezüglich ihrer horizontalen Verteilung im Darmtrakt finden sich sowohl bei Menschen als auch bei Mäusen relativ größere Zahlen von Makrophagen im Dick- als im Dünndarm (NAGASHIMA et al. 1996;
DENNING et al. 2011).
1.3.2. Polarisation
In den letzten Jahrzehnten hat sich die Unterteilung von Makrophagen in zwei Kategorien (M1- oder „klassisch aktivierte“ bzw. M2- oder „alternativ aktivierte“
Makrophagen) ähnlich dem T helper cell (Th)1/Th2-System der adaptiven Immunantwort etabliert (MILLS et al. 2000). In den 1980er Jahren wurde in in vitro- Studien eine Aktivierung von murinen und humanen Makrophagen durch das hauptsächlich von Th1-Zellen produzierte Zytokin Interferon (IFN)-γ nachgewiesen (NATHAN et al. 1983; PACE et al. 1983; CELADA et al. 1984). Fast zehn Jahre später folgte die Beschreibung einer alternativen Makrophagen-Aktivierung
einhergehend mit einer erhöhten Aktivität des Mannose-Rezeptors (CD206) durch IL- 4 (STEIN et al. 1992). Mittlerweile ist bekannt, dass neben IFN-γ auch andere Substanzen wie Lipopolysaccharide (LPS) (BOLDRICK et al. 2002; NAU et al. 2002), und Tumornekrosefaktor (TNF)-α zu einer Aktivierung von Makrophagen und einem M1-Phänotyp beitragen (MANTOVANI et al. 2004). Diese auch als „pro- inflammatorische“ Makrophagen bezeichneten Zellen zeichnen sich durch die Produktion von IL-12, IL-23 (VERRECK et al. 2004), IL-1β sowie IL-6 aus und sind somit für die Abwehr von intrazellulären Erregern (insbesondere Bakterien) und Tumorzellen von großer Bedeutung (MURRAY et al. 2014; SICA et al. 2015).
Darüber hinaus sind sie über die Produktion von Chemokinen an der Rekrutierung und Differenzierung von Th1-Zellen beteiligt (MANTOVANI et al. 2004). Mittels Stimulation durch GM-CSF bzw. macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) gelang eine Differenzierung humaner Monozyten zu pro-inflammatorischen M1- bzw.
anti-inflammatorischen M2-Makrophagen in vitro (VERRECK et al. 2004). Je nach aktivierendem Stimulus unterteilen einige Autoren die M2-Makrophagen in weitere Untergruppen. Demnach resultiert eine in vitro-Stimulation durch IL-4 oder IL-13 in M2a-Makrophagen, die Stimulation durch Immunkomplexe in Kombination mit TLR- oder IL-1-Rezeptor-Agonisten in M2b-Makrophagen und die Stimulation durch IL-10 oder Glukokortikoide in M2c-Makrophagen (MANTOVANI et al. 2004). Andere Autoren bevorzugen jedoch eine leicht abweichende Nomenklatur, die den aktivierenden Stimulus miteinbezieht (MURRAY et al. 2014). Im Gegensatz zu pro- inflammatorischen M1-Makrophagen sind alternativ aktivierte M2-Makrophagen am Gewebeumbau (remodelling) während und nach der fetalen Entwicklung sowie an der Entzündungsbekämpfung und Wundheilung beteiligt (DAVIES et al. 2013;
MANTOVANI et al. 2013; NOVAK u. KOH 2013). Sie spielen eine Schlüsselrolle bei der Abwehr von parasitären Erregern sowie der Einleitung und Aufrechterhaltung einer Th2-Immunantwort (SICA et al. 2015). Des Weiteren werden sie mit der malignen Progression von Tumoren in Verbindung gebracht (OSTUNI et al. 2015).
Einschränkend sollte jedoch berücksichtigt werden, dass die strenge Unterteilung in M1- und M2-Makrophagen nur die zwei Extreme eines sehr viel komplexeren und vielseitigeren Differenzierungsprozesses abbildet (MANTOVANI et al. 2005;
MURRAY et al. 2014). Außerdem zeichnen sich Makrophagen durch eine hohe Plastizität aus und sind in der Lage ihren Phänotyp an veränderte Bedingungen anzupassen (MOSSER u. EDWARDS 2008).
In der aktuellen Literatur wird die M1/M2-Polarisierung kritisch diskutiert. Im Gegensatz zu T-Zellen findet bei Makrophagen keine klonale Vermehrung identischer Zellen statt, so dass im M1/M2-Modell nicht von homogenen Zellpopulationen ausgegangen werden kann. Dazu kommt, dass die Stimuli, die beispielsweise zu einer M1-Aktivierung von Makrophagen führen, sehr heterogen sind (IFN-ɣ, LPS, GM-CSF). Anders als in der Situation in vitro liegen diese Stimuli in vivo nicht isoliert vor und daher sind in vitro-Modelle nur begrenzt geeignet um die komplexen Verhältnisse im Gewebe abzubilden (MARTINEZ u. GORDON 2014;
DAVIES u. TAYLOR 2015). Verschiedene humanmedizinische Studien zeigen, dass bei bestimmten Erkrankungen (z.B. kutane Plattenepithelkarzinome und Multiple Sklerose) gemischte Makrophagen-Phänotypen vorliegen (PETTERSEN et al. 2011;
VOGEL et al. 2013).
In Bezug auf intestinale Makrophagen wird das M1/M2-Modell ebenfalls kritisch hinterfragt. Ortsständige Makrophagen in der Mukosa des Gastrointestinaltraktes weisen sowohl M1-assoziierte Merkmale, wie eine starke Expression von MHC II und kontinuierliche Produktion von TNF-α (WEBER et al. 2011; BAIN et al. 2013), als auch Kennzeichen einer M2-Aktivierung, wie die Expression von CD206, CD163 und die Synthese von IL-10 (BAIN et al. 2013), auf (BAIN u. MOWAT 2014). Im Gegensatz zu in vitro stimulierten M2-Makrophagen exprimieren sie jedoch keine Arginase (WEBER et al. 2011; BAIN et al. 2013). Darüber hinaus sind in der Darmschleimhaut im Steady State keine großen Mengen der Zytokine IL-4, IL-13 und IL-33 vorhanden, so dass eine M2-artige Polarisation, wie sie für andere Gewebemakrophagen beschrieben ist (DAVIES et al. 2013), bei intestinalen Makrophagen unwahrscheinlich erscheint (BAIN u. MOWAT 2011).
Zusammenfassend stellen ortsständige intestinale Makrophagen eine anpassungsfähige Zellpopulation dar, die sich nur bedingt durch das M1/M2-Modell beschreiben lässt (BAIN u. MOWAT 2011, 2014).
1.3.3. Funktionen im Steady State
Der Darm stellt ein herausforderndes Umfeld für das lokale Immunsystem dar:
Ausbildung einer Toleranz gegenüber Nahrungsmittelbestandteilen und kommensalen Bakterien, Bekämpfung und Elimination von pathogenen Erregern sowie die Aufrechterhaltung einer intakten Epithelbarriere trotz ständiger Erneuerung des Darmepithels durch Stammzellen aus den Krypten. Die im Darm in großer Anzahl vorhandenen Makrophagen tragen auf vielfältige Art und Weise zur
Aufrechterhaltung dieses Steady States bei. Sie unterscheiden schädliche Noxen von harmlosen Nahrungsmittelantigenen und kommensalen Bakterien und leiten eine entsprechende Immunantwort (Entzündung oder Toleranz) ein (BAIN u. MOWAT 2014) (siehe Abbildung 3).
1.3.3.1. Phagozytose/Inflammatorische Anergie
Eine der Hauptaufgaben intestinaler Makrophagen ist die Phagozytose von Bakterien, die durch die epitheliale Barriere in die Lamina propria mucosae eingedrungen sind. Darüber hinaus sind sie in der Lage, apoptotische Zellen (SAVILL et al. 1992; ORTIZ-MASIÁ et al. 2012) und Fremdmaterialien (SMITH et al.
2001) aufzunehmen. Trotz ihrer hohen phagozytotischen und bakteriziden Aktivität induzieren intestinale Makrophagen nach der Aufnahme von Bakterien bzw. nach Stimulation durch deren Bestandteile (z.B. LPS) keine pro-inflammatorische Immunantwort. Diese Eigenschaft wird als inflammatorische Anergie bezeichnet (SMYTHIES et al. 2005; BAIN et al. 2013) und unterscheidet intestinale Makrophagen von Monozyten und ortsständigen Makrophagen in anderen Organen.
So gelingt es, trotz der großen Mengen an potentiell entzündungsstimulierenden Antigenen in unmittelbarer Nähe der Darmschleimhaut, ein anti-entzündliches Milieu aufrechtzuerhalten. Ein Grund für diese Eigenschaft ist, dass humane intestinale Makrophagen u.a. keine Oberflächenrezeptoren für LPS (CD14) exprimieren (SMYTHIES et al. 2005). Darüber hinaus produzieren sie keine pro- inflammatorischen Zytokine wie IL-1, IL-6 oder TNF-α als Reaktion auf die Bindung von bakteriellen Produkten an TLRs oder intrazelluläre nucleotide-binding
oligomerization domain (NOD)-Rezeptoren (HEDL et al. 2007; SMYTHIES et al.
2010). Neu in die Darmschleimhaut eingewanderte Monozyten müssen die inflammatorische Anergie erst erwerben. Der Wachstumsfaktor TGF-β, der im Darm von Epithelzellen, Mastzellen und Stromazellen produziert wird, spielt hierbei eine große Rolle (SMYTHIES et al. 2010; MAHESHWARI et al. 2011). Stromales TGF-β induziert in Monozyten eine Runterregulation des Signalmoleküls myeloid differentiation primary response gene (MyD)88, das eine Schlüsselrolle für pattern recognition receptor (PRR)-assoziierte Signalwege spielt. Folglich unterbleibt die nuclear factor (NF)-κB-vermittelte Transkription von Genen, deren Produkte eine pro- inflammatorische Immunantwort auslösen würden (SMYTHIES et al. 2010).
Denselben Effekt hat die TGF-β-induzierte Aktivierung von Smad-Molekülen, die eine Hemmung von NF-κB durch das Inhibitormolekül IκBα zur Folge hat (SMYTHIES et al. 2010).
Um intraluminale Bakterien aufnehmen zu können, bilden murine intestinale CX3CR1+-Makrophagen transepitheliale Fortsätze aus (RESCIGNO et al. 2001;
NIESS et al. 2005). Nachdem CX3CR1+-Zellen lange Zeit als Dendritische Zellen angesehen wurden, zeigen aktuelle Studien mittels multiparametrischer Durchflusszytometrie, dass es sich bei diesen Zellen um ortsständige Makrophagen handelt (SCHULZ et al. 2009; REGOLI et al. 2017). Nach einer Reduzierung der kommensalen Flora durch Antibiotika kommt es zu einer signifikanten Abnahme der Anzahl transepithelialer Fortsätze in oralen Abschnitten des Dünndarms, während invasive und nicht-invasive Salmonella-Stämme eine Zunahme transepithelialer Fortsätze im terminalen Ileum induzieren (CHIEPPA et al. 2006). Die Ausbildung
transepithelialer Fortsätze von CX3CR1+ Makrophagen stellt also anscheinend eine Reaktion dieser Zellen auf exogene, bakterielle Stimuli dar. Die Studie von CHIEPPA et al. (2006) liefert Hinweise dafür, dass die Stimulation von epithelialen TLRs (beispielsweise Stimulation von TLR4 durch LPS) hieran maßgeblich beteiligt ist.
Darüber hinaus können CX3CR1+ Makrophagen die epitheliale Barriere des Dünndarms überwinden und in das Darmlumen einwandern (REGOLI et al. 2017).
Die transepitheliale Wanderung von CX3CR1+ Makrophagen in das Darmlumen wird durch an Salmonellen gebundenes Flagellin induziert, nicht aber durch die Bindung von löslichem Flagellin an TLR5 oder eine Stimulation von TLR4 durch LPS von nicht-pathogenen Escherichia coli (ARQUES et al. 2009). Im Darmlumen angelangt, phagozytieren die Makrophagen Bakterien und wandern anschließend nicht wieder in die Lamina propria mucosae zurück (ARQUES et al. 2009; NICOLETTI et al. 2010).
Dadurch wird die Anzahl pathogener Erreger im Darmlumen signifikant reduziert und der Wirt vor bakteriellen Infektionen geschützt (ARQUES et al. 2009; MAN et al.
2017).
1.3.3.2. Epithelbarriere
Zum Schutz vor schädlichen Noxen durchqueren intestinale Makrophagen die epitheliale Barriere nicht nur, sondern tragen auch aktiv zu deren Erhaltung bei. Die Darmepithelzellschicht erneuert sich alle vier bis fünf Tage durch Ausdifferenzierung von Stammzellen aus dem Kryptenbereich (VAN DER FLIER u. CLEVERS 2009).
Makrophagen befinden sich in großer Zahl unmittelbar unterhalb des Epithels und
phagozytieren beschädigte und apoptotische Epithelzellen (NAGASHIMA et al. 1996;
CUMMINGS et al. 2016). Somit tragen sie zur Regulierung der Epithelzellerneuerung bei, verhindern den Verlust wertvoller, zellulärer Bestandteile und beseitigen nachhaltig geschädigte Epithelzellen (NAGASHIMA et al. 1996). Darüber hinaus produzieren ortsständige intestinale Makrophagen verschiedene Mediatoren, die an der Regulation der Epithelzelldifferenzierung und –proliferation beteiligt sind (JOERIS et al. 2017). Hierzu gehören Prostaglandin E2 (PGE2) (PULL et al. 2005), Wnt- Liganden (COSÍN-ROGER et al. 2016) und hepatocyte growth factor (D'ANGELO et al. 2013).
1.3.3.3. Immunologische Homöostase
Nicht zuletzt spielt IL-10, das sowohl kontinuierlich als auch nach Stimulation von Makrophagen produziert wird (DENNING et al. 2007; TAKADA et al. 2010), eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der intestinalen Homöostase (ZIGMOND et al. 2014). Die Produktion von IL-10 durch intestinale Makrophagen ist abhängig von der kommensalen Mikroflora des Darms (UEDA et al. 2010). IL-10 ist ein anti- inflammatorisch wirkendes Zytokin (MOORE et al. 2001), das außerdem von T- und B-Zellen sowie nicht-hämatopoetischen Zellen gebildet wird (SARAIVA u. O'GARRA 2010) und die Synthese von pro-inflammatorischen Zytokinen wie IL-1, IL-6, IL-8 und TNF-α hemmt (DE WAAL MALEFYT et al. 1991). In verschiedenen Studien konnte nachgewiesen werden, dass von intestinalen Makrophagen produziertes IL-10 zusammen mit TGF-β die Expression von Foxp3 in Tregs des Darms stimuliert (DENNING et al. 2007; MURAI et al. 2009) und somit entscheidend zur Ausbildung
einer oralen Toleranz beiträgt (HADIS et al. 2011). Die entscheidende Rolle von IL- 10 bei der Aufrechterhaltung des anti-inflammatorischen Status intestinaler Makrophagen und damit der intestinalen Homöostase wird durch Studien mit IL-10- defizienten Mäusen belegt, die eine schwere Kolitis entwickeln (KÜHN et al. 1993).
Ein Mangel an IL-10 führt zu einer veränderten Chromatinstruktur in Makrophagen, die mit einer verminderten Toleranz gegenüber Bakterien assoziiert sein soll (SIMON et al. 2016). Andere Studien zeigen jedoch, dass insbesondere ein Fehlen des IL-10- Rezeptors auf intestinalen Makrophagen zur Entwicklung einer Entzündung des Darms führt (SHOUVAL et al. 2014; ZIGMOND et al. 2014), während IL-10 selbst zur Aufrechterhaltung der Homöostase auch aus anderen Quellen, wie z.B. Tregs, bezogen werden kann (RUBTSOV et al. 2008). Der anti-inflammatorische Effekt von IL-10 wurde in einer Studie von KRAUSE et al. (2015) auf die Hemmung der Synthese des pro-inflammatorischen Zytokins IL-23 durch intestinale Makrophagen zurückgeführt. Somit scheinen IL-10-produzierende Makrophagen über einen autokrinen Mechanismus ihre eigene Zytokinsynthese zu beeinflussen. Dadurch schränken sie die Immunantwort bei akuten bakteriellen Infektionen ein und schützen den Wirt vor Schäden durch eine exzessive Entzündungsreaktion (KRAUSE et al.
2015).
Durch den engen Kontakt mit der kommensalen Mikroflora regulieren intestinale Makrophagen ihre eigene Rekrutierung, Differenzierung und Funktion sowie die anderer Immunzellen. Von kommensalen Bakterien stammende Signale werden von intestinalen Makrophagen erkannt und führen zur Produktion von IL-1β (SHAW et al.
2012), das die Synthese von GM-CSF durch retineic acid receptor-related orphan
nuclear receptor (ROR)ɣt+-ILCs stimuliert (MORTHA et al. 2014). Das Zytokin GM- CSF ist der entscheidende Faktor bei der Differenzierung myeloider Zellen und reguliert die Funktion ortsständiger Makrophagen und Dendritischer Zellen (ZHAN et al. 2012; MORTHA et al. 2014). Des Weiteren wird die Entwicklung von RORɣt+- Th17-Zellen durch die Sekretion von IL-1β durch intestinale Makrophagen positiv beeinflusst (SHAW et al. 2012). RORɣt+-Th17-Zellen sind eine Subpopulation von CD4+-Th-Zellen, die in Abhängigkeit von der intestinalen Mikroflora in großer Zahl in der Darmschleimhaut vorkommen (IVANOV et al. 2008) und einen wichtigen Bestandteil der enteralen Immunabwehr darstellen (PANEA et al. 2015). Darüber hinaus regulieren ortsständige intestinale Makrophagen ihre eigene Rekrutierung über die Produktion von verschiedenen Chemokinen wie CCL2 und CCL7 (TAKADA et al. 2010).
1.3.3.4. Induktion adaptiver Immunantworten
In der intestinalen Mukosa kommt es zu einem engen Zusammenspiel von angeborener und adaptiver Immunität. Neuere Studien weisen auf eine indirekte Rolle intestinaler Makrophagen bei der Aktivierung von T-Zellen (und somit bei der Entstehung der oralen Toleranz) durch einen durch Connexin 43-vermittelten Transfer von löslichen Antigenen aus dem Lumen an benachbarte Dendritische Zellen hin (MAZZINI et al. 2014). Dendritische Zellen exprimieren den Chemokinrezeptor CCR7 und sind dadurch in der Lage in regionäre Lymphknoten einzuwandern. Dort präsentieren sie die im Darm aufgenommenen Antigene naiven T-Zellen und lösen somit eine spezifische Immunantwort aus (WORBS et al. 2006).
Allerdings zeigen Untersuchungen an antibiotisch behandelten Mäusen, dass eine Störung der intestinalen Mikroflora zur Einwanderung von CX3CR1+ Zellen in die mesenterialen Lymphknoten führt (DIEHL et al. 2013). Da diese Zellen darüber hinaus das kostimulatorische Molekül CD80 exprimieren, ist unter gewissen Umständen eine direkte Beteiligung intestinaler Makrophagen an der Entstehung spezifischer Immunantworten nicht vollständig auszuschließen (DIEHL et al. 2013;
REGOLI et al. 2017).
1.3.4. Funktionen bei Entzündungen
Eine Störung der Homöostase, beispielsweise durch das Eindringen pathogener Erreger durch die Epithelbarriere oder eine übersteigerte Immunantwort auf kommensale Bakterien, wie sie bei der IBD des Menschen angenommen wird (XAVIER u. PODOLSKY 2007), führt zu einer vermehrten Einwanderung von monozytären Zellen aus dem Blut, die sich in der Lamina propria mucosae zu pro- inflammatorischen Makrophagen differenzieren (BAIN et al. 2013) (siehe Abbildung 3). Die Hauptaufgaben dieser Zellen sind, neben der Produktion pro- inflammatorischer Zytokine, die Aufnahme und Beseitigung von bakteriellen (MÜLLER et al. 2012) und parasitären Infektionserregern (DUNAY et al. 2008).
In Mausmodellen mit dextran sulfate sodium (DSS)-induzierter Kolitis wurde gezeigt, dass unter pro-inflammatorischen Bedingungen die Reifung von Ly6Chi-Monozyten zu anti-inflammatorischen, ortsständigen Makrophagen gestört ist und es zu einer Ansammlung von unreifen, CX3CR1int-Makrophagen in der Lamina propria kommt
(WEBER et al. 2011; ZIGMOND et al. 2012; BAIN et al. 2013). Die Gründe für die ausbleibende Ausdifferenzierung von Makrophagen im entzündeten Gewebe sind bislang unklar, es werden jedoch eine beschränkte Lebensdauer der Zellen sowie ein Mangel an bestimmten Wachstumsfaktoren diskutiert (JOERIS et al. 2017). Die unreifen, CX3CR1int-Makrophagen zeichnen sich im Gegensatz zu den ortsständigen, reifen, CX3CR1hi-Zellen durch eine Expression von TLR2 und NOD2 aus (WEBER et al. 2011). Sie reagieren somit auf exogene Stimuli und produzieren ebenso wie ihre Vorläuferzellen, die neu eingewanderten Ly6Chi-Monozyten, pro- inflammatorische Zytokine, wie IL-1β, IL-6, und TNF-α, sowie inducible nitric oxide synthase (iNOS) (DUNAY et al. 2008; WEBER et al. 2011; ZIGMOND et al. 2012;
BAIN et al. 2013). Gerade die Sekretion von TNF-α durch Monozyten und Makrophagen scheint sowohl bei der humanen IBD als auch im Mausmodel eine bedeutende Rolle bei der Induktion und Aufrechterhaltung des Entzündungsprozesses zu spielen (REIMUND et al. 1996; STUCCHI et al. 2006;
VAROL et al. 2009). Darüber hinaus führen intestinale Makrophagen über die Produktion von IL-12 zu einer Th1-Polarisierung von T-Zellen und zur Produktion von IFN-γ bei Infektionen des Darms mit dem Bakterium Citrobacter rodentium (SCHREIBER et al. 2013). In einer anderen Studie mit diesem Erreger wurde demonstriert, dass pro-inflammatorische Makrophagen große Mengen an IL-1β synthetisieren und somit, über die Produktion von IL-22, zu einer frühen Erregerabwehr durch Th17-Zellen beitragen (ZHENG et al. 2008). Untersuchungen an Helicobacter hepaticus-infizierten Mäusen zeigen, dass auch die Produktion von IL-23 durch Makrophagen einen entscheidenden Einfluss auf die intestinale Entzündungsreaktion hat (ARNOLD et al. 2016). Es gibt Hinweise dafür, dass sich
dieser Einfluss nicht allein über eine IL-23-vermittelte Th17-Immunantwort, sondern auch durch die Stimulation myeloider Zellen durch GM-CSF manifestiert (GRISERI et al. 2012). Außerdem führen pro-inflammatorische Makrophagen über eine Reihe von Chemokinen (beispielsweise CCL8 und CCL11) zu einer Rekrutierung von weiteren Entzündungszellen, wie Monozyten und eosinophilen Granulozyten, in die entzündete Darmschleimhaut (WADDELL et al. 2011; ASANO et al. 2015). Durch eine geschädigte Epithelbarriere können neben pathogenen Erregern auch kommensale Bakterien in die Lamina propria mucosae gelangen. In dieser Situation sind monozytäre Zellen in der Lage, über die Produktion von PGE2 die gegen die Kommensalen gerichtete Entzündungsreaktion zu kontrollieren (GRAINGER et al.
2013). Bei intestinalen Nematodeninfektionen spielen Makrophagen eine entscheidende Rolle für die Induktion einer Th2-Immunantwort (KREIDER et al.
2007).
Neben der großen Anzahl an pro-inflammatorischen, unreifen Makrophagen finden sich in der entzündlich veränderten Lamina propria auch reife, ortsständige Makrophagen, die ihre anti-inflammatorischen Eigenschaften (insbesondere die Produktion von IL-10) beibehalten (WEBER et al. 2011; TAMOUTOUNOUR et al.
2012; BAIN et al. 2013). Diese Zellen stellen wahrscheinlich ausdifferenzierte Zellen dar, die für die rasche Wiederherstellung der intestinalen Homöostase von großer Bedeutung sind (BAIN u. MOWAT 2014) (siehe Abbildung 3).
Nach der Elimination eines entzündlichen Stimulus kommt es erneut zu Veränderungen in der Zusammensetzung der intestinalen Makrophagenpopulation, wobei die Anzahl der unreifen (pro-inflammatorischen), CX3CR1int-Makrophagen
abnimmt (ZIGMOND et al. 2012). Hierbei spielen verschiedene Mechanismen wie Apoptose und Phagozytose (GAUTIER et al. 2013) eine Rolle, aber auch eine Ausdifferenzierung dieser Zellen zu ortsständigen Makrophagen ist denkbar (GRAINGER et al. 2017).
Eine weitere wichtige Funktion intestinaler Makrophagen ist ihr Einfluss auf die Wundheilung im Anschluss an eine Schädigung der Darmschleimhaut. Im Kryptenbereich des Kolons lokalisierte, aktivierte Makrophagen geben von der Mikroflora und beschädigten Epithelzellen ausgehende Signale an epitheliale Vorläuferzellen weiter und leiten somit eine Epithelzellregeneration ein. Dafür nehmen Makrophagen über zytoplasmatische Fortsätze Kontakt mit den epithelialen Vorläuferzellen auf (PULL et al. 2005). Des Weiteren sezernieren Makrophagen Lipidmediatoren wie Lipoxine, die den Heilungsprozess durch eine gesteigerte Phagozytose von apoptotischen Zellen und deren Abtransport über das Lymphgefäßsystem fördern (SERHAN et al. 2008). Ein Verlust der funktionellen Regulation von intestinalen Makrophagen durch TGF-β führte im DSS-Kolitis-Modell zu einer eingeschränkten Regeneration, was die Bedeutung dieses Zytokins in der Heilungsphase intestinaler Entzündungen belegt (RANI et al. 2011). Ebenso spielt die MyD88-abhängige Signaltransduktion in myeloiden Zellen für die Heilung DSS- induzierter Epithelschäden eine Rolle (MALVIN et al. 2012).
Abbildung 3: Intestinale Makrophagen und ihre Funktionen im Steady State und bei Entzündungen (modifiziert nach BAIN u. MOWAT 2014)
Im Steady State differenzieren sich monozytäre Zellen in der Lamina propria mucosae zu Makrophagen mit anti-inflammatorischem Phänotyp, die vielfältige Aufgaben im Zusammenhang mit der Aufrechterhaltung der Homöostase wahrnehmen (grüne Kästchen). Hingegen kommt es in der entzündlich veränderten Darmschleimhaut zu einer Störung der Makrophagenreifung mit Akkumulation von Monozyten und Makrophagen mit einem pro-inflammatorischen Phänotyp. Diese Zellen tragen zur Entstehung und Aufrechterhaltung des Entzündungsprozesses bei (orangene Kästchen).
CCL, C-C chemokine ligand; IL, Interleukin; PGE2, Prostaglandin E2; TGF, transforming growth factor; Th, T helper cell; TNF, Tumornekrosefaktor.
1.3.4.1. Makrophagen bei humaner inflammatory bowel disease
IBD ist eine spontan auftretende, chronisch-entzündliche Darmerkrankung des Menschen unklarer Genese. Zum jetzigen Zeitpunkt wird ein Zusammenspiel verschiedener Faktoren angenommen. Neben der Genetik spielen vermutlich auch Umwelteinflüsse, das Immunsystem und die intestinale Mikroflora in der Pathogenese eine zentrale Rolle (ISIDRO u. APPLEYARD 2016). Beim Menschen werden zwei verschiedene Formen der IBD unterschieden, ulzerative Kolitis und Morbus Crohn. Die ulzerative Kolitis ist durch eine auf die oberflächlichen Anteile der Mukosa und Submukosa beschränkte Entzündung gekennzeichnet, während beim Morbus Crohn eine transmurale, granulomatöse Entzündung vor allem im terminalen Ileum, aber auch in anderen Lokalisationen des Gastrointestinaltraktes zu finden ist (ISIDRO u. APPLEYARD 2016).
Sowohl bei Patienten mit Morbus Crohn als auch ulzerativer Kolitis kommt es zu einer massiven Infiltration der Lamina propria mucosae des Ileums bzw. Kolons mit CD14hi-Makrophagen (KAMADA et al. 2008; BAIN et al. 2013; THIESEN et al. 2014;
MAGNUSSON et al. 2016). Diese Zellen stellen wahrscheinlich das Äquivalent zu den unreifen, CX3CR1int-Makrophagen der Maus dar (BAIN et al. 2013). Durch eine erhöhte Konzentration an Chemokinen (insbesondere CCL2 und CCL4) in der entzündeten Darmschleimhaut (SMITH et al. 2011) kommt es zu einer vermehrten Rekrutierung von Monozyten (RUGTVEIT et al. 1994; GRIMM et al. 1995), die sich, im Gegensatz zum Steady State, zu pro-inflammatorischen Makrophagen differenzieren (BAIN et al. 2013). Wie im Mausmodell zeichnen sich auch diese Zellen durch die Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen wie TNF-α und IL-1
(RUGTVEIT et al. 1997), die Expression des pro-inflammatorischen Rezeptormoleküls TREM-1 (SCHENK et al. 2007) und die Aktivität der NF-κB- Signaltransduktionskaskade (ROGLER et al. 1998) aus. Eine Ursache für die Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen durch Makrophagen bei IBD ist die gestörte Funktion von TGF-ß durch die Überexpression des inhibitorischen Smad7- Moleküls (MONTELEONE et al. 2001). Das pro-inflammatorische Potential dieser Zellen zeigt sich darüber hinaus in der erhöhten Produktion von Retinsäure, die in in vitro-Studien zu einer vermehrten Differenzierung von TNF-α-produzierenden Makrophagen führt (SANDERS et al. 2014). Des Weiteren tragen pro- inflammatorische Makrophagen bei Menschen mit IBD durch eine Störung von tight junction-Proteinen sowie die Induktion von Apoptosen zu einer Schädigung des Darmepithels bei (LISSNER et al. 2015).
Während die CD14hi-Makrophagen bei Morbus Crohn eindeutig einen pro- inflammatorischen Phänotyp aufweisen (ISIDRO u. APPLEYARD 2016), wurde bei der ulzerativen Kolitis mit zunehmender Chronizität eine steigende Anzahl an CD206+-Makrophagen nachgewiesen (COSÍN-ROGER et al. 2013).
1.3.5. Immunhistochemische Phänotypisierung kaniner intestinaler Makrophagen
Nur wenige Studien haben sich bislang mit der Phänotypisierung von kaninen intestinalen Makrophagen im gesunden und erkrankten Gewebe beschäftigt, wobei eine geringe Auswahl immunhistochemischer Marker zum Einsatz kam.
Ältere Studien untersuchten die Expression von MHC II und L1 Antigen im gesunden Hundedarm mittels immunhistochemischer Methoden, wobei eine größere Anzahl an MHC II+-Zellen in den Zottenspitzen als im Kryptbereich des Dünndarms nachgewiesen wurde (GERMAN et al. 1998). Hinsichtlich der horizontalen Verteilung von MHC II+-Zellen im Dünndarm werden keine Unterschiede zwischen Duodenum, Jejunum und Ileum festgestellt (GERMAN et al. 1999). L1 Antigen wird hingegen von einer signifikant größeren Zellzahl im Ileum und Kolon als im Duodenum exprimiert.
Des Weiteren finden sich signifikant mehr L1 Antigen+-Zellen an der Kryptenbasis als an der Zottenspitze des Dünndarms (GERMAN et al. 1999). Dieselben Autoren haben auch die Immunzellpopulationen, darunter MHC II+- und L1 Antigen+-Zellen, im Darm von Hunden mit IBD, Antibiotika-responsiver Enteropathie und Futtermittelallergie untersucht. Sie stellen signifikant höhere Zahlen für MHC II+- Zellen in der duodenalen Lamina propria mucosae bei allen Erkrankungsformen fest, während die Anzahl der L1-Antigen+-Zellen nur bei den an IBD erkrankten Tieren signifikant erhöht ist (GERMAN et al. 2001). Eine andere Studie beschäftigt sich mit altersabhängigen Veränderungen von Immunzellen im kaninen Darm und stellt ebenfalls eine größere Anzahl von L1 Antigen+-Zellen im Kryptenbereich von Dünn- und Dickdarm fest. Außerdem wird eine altersabhängige, signifikante Abnahme der Makrophagenanzahl beobachtet (KLEINSCHMIDT et al. 2008). Darüber hinaus wurden die Immunzellpopulationen bei Hunden mit HUC immunhistochemisch analysiert. Auch bei dieser Form der chronisch-entzündlichen Enteropathien des Hundes liegen erhöhte Zahlen von MHC II+- und L1-Antigen+-Zellen in der Dickdarmschleimhaut vor (GERMAN et al. 2000).
Weitere Marker, die von Makrophagen und z.T. auch anderen Zelltypen, beispielsweise Monozyten und Dendritischen Zellen, exprimiert werden, wurden bereits in immunhistochemischen Reaktionen an kaninem, Formalin-fixiertem Gewebe eingesetzt (Tabelle 1). Einige dieser Marker, insbesondere CD163, CD204 und ionized calcium-binding adapter molecule-1 (Iba-1), werden dabei für den Nachweis einer histiozytären Differenzierung von Tumorzellen benutzt (IDE et al.
2011; THONGTHARB et al. 2016). Im Gegensatz zu MHC II und L1 Antigen wurden diese Marker jedoch bisher nicht zur Untersuchung von Immunzellpopulationen im kaninen Gastrointestinaltrakt verwendet.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die systematische, immunhistochemische Untersuchung der Makrophagen-Phänotypen bei Hunden mit IBD und HUC mittels verschiedener Marker. Insbesondere wurde untersucht, ob es bei diesen chronisch- entzündlichen Darmerkrankungen des Hundes, analog zu den Erkrankungen des Menschen (Morbus Crohn und ulzerative Kolitis) bzw. entsprechenden Mausmodellen, zu Veränderungen in der intestinalen Makrophagenpopulation kommt. Aufgrund der Ähnlichkeit der Erkrankungen des Hundes mit der IBD bei Menschen wird der Hund als spontanes Tiermodell diskutiert (JERGENS u.
SIMPSON 2012), so dass die gewonnenen Erkenntnisse eine translationale Bedeutung für die Humanmedizin besitzen könnten.
Tabelle 1: Marker zum immunhistochemischen Nachweis von Makrophagen an kaninem, Formalin-fixiertem Gewebe
Antigen Gewebe Referenzen
CD64 Herz BIRDSALL et al. 1997
CD163 Herz, Lunge, Leber, Niere, Thymus, Milz, Lymphknoten, Pankreas, Dünn- und Dickdarm, Gehirn, Rückenmark, Haut, Knochenmark
ZENG et al. 1996; YAMATE et al. 2000; IDE et al. 2001;
IDE et al. 2011
CD204 Lunge, Leber, Niere, Milz, Lymphknoten, Ösophagus, Haut, Gehirn
TOMOKIYO et al. 2002; IDE et al. 2011; KATO et al. 2013 Iba-1 Speicheldrüse, Haut, Gehirn IDE et al. 2011; RAHMAN et
al. 2012; PIEREZAN et al.
2014
iNOS Leber, Lymphknoten, Haut, Rückenmark ZAFRA et al. 2008; OGAWA et al. 2011; VINCE et al. 2014 Lysozym u.a. Leber, Thymus, Niere, Milz,
Lymphknoten, Speicheldrüse, Pankreas, Magen, Dünn- und Dickdarm, Plazenta, Haut, Knochenmark
MOORE 1986; MUELLER et al. 2004; STEIGER et al.
2006; RAHMAN et al. 2012
CD, cluster of differentiation; Iba-1, ionized calcium-binding adapter molecule-1;
iNOS, inducible nitric oxide synthase; u.a., unter anderem
2. Manuskripte
2.1. Immunohistochemical characterization of gastrointestinal macrophages/phagocytes in dogs with inflammatory bowel disease (IBD) and non-IBD dogs
Anna Wagner, Johannes Junginger, Frederik Lemensieck, Marion Hewicker- Trautwein
Abstract
Intestinal Mφ play a pivotal role in the maintenance of gut homeostasis, but can also contribute to inflammation such as inflammatory bowel disease (IBD). In contrast to human tissues, little is known about phenotypes of Mφ in the canine gastrointestinal tract. Therefore, an immunohistochemical study was performed using Abs against Mφ-associated molecules (Cluster of differentiation (CD)64, CD163, CD204, ionized calcium-binding adaptor molecule 1, L1 Ag, and MHC II) on stomach, duodenum, jejunum, ileum and colon from non-IBD dogs. In addition, marker-expression in the stomach, duodenum and colon of the non-IBD dogs was compared to that in dogs with IBD. Results revealed predominance of resident Mφ displaying an anti- inflammatory phenotype represented by expression of CD163 as well as CD204 in the gut of non-IBD dogs with high Mφ numbers especially present in the small intestinal villus area. Compared to non-IBD tissue counterparts, stomach, duodenum, and colon from dogs with IBD showed reduced Mφ numbers with the exception of slightly increased numbers of CD64+ Mφ. Correlation analyses between marker- expression of Mφ and the Canine Inflammatory Bowel Disease Activity Index as well
as histological scores failed to reveal relevant relationships. The present study provides evidence of the canine steady state gastrointestinal tract being dominated by Mφ with anti-inflammatory properties maintaining gut homeostasis. A significant reduction in these resident Mφ may reflect disturbances in homeostatic capacity that could contribute to the development of canine IBD. In contrast to human IBD and murine disease models, infiltration of pro-inflammatory Mφ does not significantly contribute to the inflammatory process of canine IBD, which may illustrate possible species-specific differences in IBD pathogenesis.
Veterinary Immunology and Immunopathology 2018, 197, 49-57 DOI: 10.1016/j.vetimm.2018.01.011
