DNA-Fragmente im Plasma von Tumorpatienten
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
an der Universität Konstanz
Mathematisch-Naturwissenschaftliche Sektion Fachbereich Biologie
vorgelegt von
Sabine Jahr
Tag der mündlichen Prüfung: 9. Februar 2001 Referent: Prof. Dr. R. Knippers
Referent: Prof. Dr. R.-D. Hesch
Teilergebnisse der vorliegenden Arbeit sind in folgende Publikationen eingegangen:
• Jahr S*, Hentze H, Englisch S, Hardt D, Fackelmayer FO, Hesch RD, Knippers R, (2000), DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells, Cancer Res. (im Druck).
• Jahr S*, Czekelius P, Krause U, Hesch RD, Knippers R, (2001), Quantitation of tumor DNA in plasma of breast cancer patients and the effect of therapy, (in Vorbereitung).
i
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG...1
1.1 KREBS UND TUMORENTSTEHUNG...1
1.1.1 Molekulare Ursachen der Krebsentstehung ...1
1.1.2 Instabilität des Genoms ...2
1.2 TUMORAUSBREITUNG UND METASTASENBILDUNG...3
1.3 TUMORE UND ZELLULÄRE IMMUNANTWORT...4
1.4 VASKULARISIERUNG IM TUMORGEWEBE...5
1.4.1 In situ Karzinom...5
1.4.2 Invasiver Tumor ...5
1.5 APOPTOSE UND NEKROSE VON TUMORZELLEN...6
1.5.1 Hypoxie und Zelltod im Tumorgewebe...6
1.5.2 Apoptose-Resistenz und Nekrose im malignen Tumor ...6
1.5.3 Chemotherapie und Bestrahlung...7
1.6 IST EINE FREISETZUNG VON DNA INS BLUTPLASMA MÖGLICH?...7
1.7 DNA IM PLASMA VON TUMORPATIENTEN...7
1.7.1 Tumorpatienten weisen erhöhte Mengen an DNA im Plasma auf ...7
1.7.2 Tumor-DNA im Plasma von Tumorpatienten ...8
1.7.3 Ursprung der Plasma-DNA ...8
1.7.4 Mechanismus der Freisetzung der DNA ins Blut...9
2 ZIELSETZUNG... 10
3 MATERIAL UND METHODEN... 11
3.1 MATERIAL... 11
3.1.1 Tumorpatienten und Kontrollpersonen ... 11
3.1.2 Mäuse ... 11
3.2 METHODEN... 12
3.2.1 Isolierung von Plasma ... 12
3.2.2 DNA-Isolierung aus Patientenproben ... 12
3.2.2.1 Plasmaproben ... 12
3.2.2.2 Gewebeproben... 12
3.2.3 Quantifizierung der Plasma-DNA...13
3.2.3.1 Kompetitive PCR ... 13
3.2.3.2 Realtime-PCR ... 13
3.2.4 Detektion von Mutationen ...14
3.2.4.1 Mutationen in TP53 ... 14
3.2.4.2 K-ras-Mutationen ... 15
ii
3.2.5 Analyse des Methylierungsstatus von CDKN2A ...16
3.2.5.1 CpG-Methylierung der Positivkontrolle ... 16
3.2.5.2 Desaminierung der DNA durch Na-Bisulfit... 16
3.2.5.3 Methylierungs-spezifische PCR ... 16
3.2.6 Quantifizierung von Tumor-DNA im Plasma ... 17
3.2.6.1 Plasma-DNA-Aufreinigung und Desaminierung der DNA ... 17
3.2.6.2 Quantitative methylierungs-spezifische PCR ... 17
3.2.7 Nachweis von T-Lymphozyten-DNA im Plasma ...18
3.2.7.1 Nachweis von Endothelzell-DNA im Plasma ... 18
3.2.8 Fragmentlängen-Bestimmung...19
3.2.8.1 Radioaktive Endmarkierung der Plasma-DNA einer Kontrollperson... 19
3.2.8.2 Fragmentlängen-Bestimmung der Plasma-DNA von Tumorpatienten... 19
3.2.9 In vitro Apoptose und Nekrose von Jurkat-T-Lymphozyten ... 19
3.2.9.1 Isolierung der DNA aus dem Überstand... 20
3.2.9.2 Quantifizierung der DNA aus dem Überstand ... 20
3.2.9.3 Apoptose-Nachweis: SAF-A-Spaltung... 20
3.2.10In vivo Apoptose und Nekrose bei Mäusen... 20
3.2.10.1 Plasma-Gewinnung und DNA-Isolierung ... 21
3.2.10.2 Quantifizierung der Plasma-DNA... 21
3.2.10.3 Fragmentlängen-Bestimmung der freigesetzten DNA ... 21
4 ERGEBNISSE... 22
4.1 TUMORPATIENTEN HABEN ERHÖHTE MENGEN AN DNA IM BLUTPLASMA... 22
4.1.1 Quantifizierung der Plasma-DNA von Kontrollpersonen ... 23
4.1.2 Quantifizierung der DNA im Plasma von Tumorpatienten ... 24
4.2 TUMORZELLEN ALS QUELLE DER PLASMA-DNA VON TUMORPATIENTEN... 26
4.2.1 Mutationen im TP53 Tumorsuppressor-Gen ... 26
4.2.2 Mutationen im KRAS Onkogen ... 27
4.2.3 Hypermethylierung des CDKN2A Tumorsuppressor-Gen-Promotors... 29
4.3 QUANTIFIZIERUNG DER METHYLIERTEN DNA AUS TUMORZELLEN... 31
4.4 PLASMA-DNA STAMMT NUR IN WENIGEN FÄLLEN AUS T-ZELLEN... 34
4.5 PLASMA-DNA STAMMT NICHT AUS ENDOTHELZELLEN... 36
4.6 DNA-FRAGMENTE WEISEN MEIST MONONUKLEOSOMEN-GRÖßE AUF... 40
4.6.1 Größenbestimmung der Plasma-DNA einer Kontrollperson... 40
4.6.2 Fragmentlängen-Bestimmung der Plasma-DNA einiger Patienten...42
4.7 APOPTOTISCHE UND NEKROTISCHE ZELLEN SETZEN IN VITRO DNA FREI... 44
4.7.1 Quantifizierung der freigesetzten DNA ...45
4.7.2 Apoptose-Nachweis ...46
4.8 NACH INDUKTION VON APOPTOSE UND NEKROSE IN VIVO ERSCHEINEN DNA-FRAGMENTE UNTERSCHIEDLICHER GRÖßE IM BLUTPLASMA...47
4.8.1 Quantifizierung der freigesetzten Plasma-DNA ...47
4.8.1.1 Dosisabhängige Freisetzung von DNA ins Plasma bei Apoptose-Induktion... 48
4.8.1.2 Freisetzung von DNA ins Plasma nach Apoptose- und Nekrose-Induktion ... 49
iii
4.8.2 Fragmentlängen-Bestimmung der Plasma-DNA ...50
4.9 PLASMA-DNA IM THERAPIEVERLAUF VON BRUSTKREBS-PATIENTINNEN... 51
4.9.1 DNA-Mengen in präoperativen Plasmaproben der Patientinnen... 52
4.9.2 Plasma-DNA-Konzentrationen von gesunden Frauen ...54
4.9.3 Plasma-DNA der Brustkrebs-Patientinnen im Therapieverlauf ... 55
4.9.4 Anteil der Tumor-DNA im Plasma der Patientinnen im Therapieverlauf... 57
4.9.4.1 DNA aus dem Tumorgewebe ist nur präoperativ nachweisbar... 57
4.9.4.2 Anteil der Tumor-DNA im Plasma der Brustkrebs-Patientinnen... 59
4.9.5 Korrelation der Daten zur Plasma-DNA mit der Klinik der Patientinnen... 60
4.9.5.1 Patienten mit Karzinom weisen höhere DNA-Werte auf als die ohne Karzinom ... 61
4.9.5.2 Korrelation zwischen präoperativer DNA-Menge und Tumorgröße... 63
4.10 PLASMA-DNA BEI GESUNDEN FRAUEN... 64
4.10.1Während der Menstruation ist die Plasma-DNA-Menge erhöht ... 65
4.10.2Menge an DNA im Plasma scheint unabhängig von Östrogenexposition...66
5 DISKUSSION ... 68
5.1 KONZENTRATION DER DNA IM PLASMA... 68
5.2 URSPRUNG DER PLASMA-DNA: TUMORZELLEN...69
5.2.1 Detektion von Tumor-DNA im Plasma...70
5.2.2 Quantifizierung der Tumor-DNA im Plasma...71
5.3 URSPRUNG DER PLASMA-DNA: UMGEBENDE ZELLEN DES TUMORS... 74
5.4 URSPRUNG DER DNA BEI GESUNDEN KONTROLLPERSONEN... 75
5.5 MECHANISMUS DER FREISETZUNG DER DNA INS PLASMA... 76
5.6 GRÜNDE FÜR DIE ANWESENHEIT VON DNA IM PLASMA... 78
5.7 PLASMA-DNA: AUSBLICK UND POTENTIELLER MEDIZINISCHER NUTZEN... 79
6 ZUSAMMENFASSUNG ... 80
7 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ...81
8 ABBILDUNGSVERZEICHNIS... 82
9 TABELLENVERZEICHNIS ... 83
10 ANHANG ...84
11 LITERATURVERZEICHNIS ...85
Einleitung 1
1 Einleitung
1.1 Krebs und Tumorentstehung
Krebs ist nach Herz- und Kreislauferkrankungen mit einer Häufigkeit von 20% die zweit- häufigste Todesursache in den westlichen Industrieländern (Alberts et al., 1995). Man unterscheidet heute etwa 100 verschiedene Krebsarten, deren Einteilung sich hauptsächlich nach dem Gewebe richtet, in dem sie ursprünglich entstanden sind, und nach den Zelltypen, aus denen sie hervorgehen (Hanahan und Weinberg, 2000). Am häufigsten sind Karzinome, also bösartige Entartungen von Epithelzellen, z.B. der Lunge, des Brustgewebes oder des Dickdarms. Andere Tumoren entstehen aus Zellen des Bindegewebes oder Muskelzellen (Sarkome) oder wie bei Leukämie aus den blutbildenden Zellen des Knochenmarks und der Lymphknoten. Zu den häufigsten Krebsarten in Deutschland gehören Tumoren der Lunge, Darm, Prostata und Brust (Alberts et al., 1995).
Das Auftreten jeder Krebsart wird in unterschiedlicher Weise von Karzinogenen beeinflußt;
insbesondere von Umweltfaktoren. Darunter sind physikalische (verschiedene Strahlen wie beispielsweise UV-Strahlen), chemische (z.B. Asbest, Nickel, Chrom) und biologische Agenzien (Tumorviren). Diese Agentien bewirken DNA-Schädigungen in Form von Mutationen, Strangbrüchen, Translokationen oder Chromosomenbrüchen (Alberts et al., 1995). Ein Tumor entsteht allerdings erst dann, wenn sich über die Zeit innerhalb einer Zelllinie mehrere Mutationen in den verschiedenen Tumorsuppressor-Genen oder Onkogenen angesammelt haben, die zu einer ungehinderten Proliferation dieser Zellen führen (Nowell, 1976).
1.1.1 Molekulare Ursachen der Krebsentstehung
Bisher wurden verschiedene Mutationen entdeckt, die Onkogene mit dominantem Funktions- verlust oder Tumorsuppressor-Gene mit rezessivem Funktionsverlust erzeugen (Hanahan und Weinberg, 2000). Zu den Genen, die am häufigsten Mutationen aufweisen, gehört TP53, das Gen eines wichtigen zellulären Tumorsuppressors. Schätzungen gehen davon aus, dass bei über 50%
aller Krebsfälle Mutationen in diesem Gen vorliegen (Levine, 1997; Soussi, 2000a). TP53 fungiert in der Zelle als Tumorsuppressor, indem es sowohl Wachstumsarrest als auch apoptotischen Zelltod geschädigter Zellen induziert (Prives C, 1994; Yonish-Rouach et al., 1991). Ein weiteres Gen, das häufig von Mutationen betroffen ist, ist das Gen des K-ras Proto-
Einleitung 2
Onkogens (Minamoto et al., 2000). Bei Adeno-Karzinomen des Pankreas liegt die Häufigkeit bei über 90 Prozent; bei Colon-Karzinomen und Schilddrüsen-Tumoren bei 50% und bei Lungen- krebs bei 30% (Longnecker und Terhune, 1998; Bos, 1989). Das K-ras-Protein gehört zu der Familie der GTPasen und ist am Signalweg von der Zelloberfläche zum Zellkern beteiligt (Hernandez-Alcoceba et al., 2000). Neben TP53 und K-ras (KRAS) sind bisher über 160 verschiedene Gene bekannt, die in den Tumorzellen der verschiedenen Krebsarten verändert sein können (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/CGAP/hTGI/; Portal des Cancer Genome Anatomy Project).
Eine weitere Veränderung von Tumorsuppressor-Genen oder Proto-Onkogenen in Tumorzellen liegt in der Regulation ihrer Expression. So können Gene durch Hypermethylierung der CpG- Inseln in den Promotor-Bereichen vollständig stillgelegt werden (Baylin et al., 1998). Beispiele hierfür sind das Gen eines wichtigen Inhibitors cyclinabhängiger Kinasen, CDKN2A, oder das Gen ER des Östrogen-Rezeptors (Baylin et al., 1998; Liggett und Sidransky, 1998).
1.1.2 Instabilität des Genoms
Es sind mehrere genetische Veränderungen notwendig bis eine Zelle zur Krebszelle wird. Man vermutet, dass die meisten der weiteren Veränderungen in Tumorzellen direkt oder indirekt auf Veränderungen der Genome der Krebszellen selbst zurückzuführen sind; d.h. dass die Genome von Tumorzellen eine gesteigerte Mutationsfrequenz aufweisen. Für Tumorzellen mit einer solchen erhöhten Mutationsfrequenz wird die Bezeichnung „Mutator-Phänotyp“ verwendet (Loeb, 1991). Vermutlich ist diese gesteigerte Mutationshäufigkeit eine Folge von gestörten Funktionen spezifischer Wächter der Zelle; beispielsweise der Proteine der Mismatch-Repair- Proteine (Lengauer et al., 1998). Eine Folge davon ist eine Instabilität des Genoms, die sich meist auf der Chromosomen-Ebene zeigt; seltener auch auf dem Nukleotid-Level. Diese Genom- Instabilität äußert sich zum Beispiel in veränderten Chromosomenzahlen, Chromosomen- Translokationen, Gen-Amplifikationen oder Deletionen und Insertionen von Nukleotiden (Lengauer et al., 1998). Zu den Folgen des Mutator-Phänotyps gehören auch Veränderungen der Mikrosatelliten-Sequenzen wie das Auftreten von Deletionen ganzer Mikrosatelliten (loss of heterozygosity; LOH) oder Veränderungen der Mikrosatelliten-Längen (Yamasaki et al., 2000).
Einleitung 3
1.2 Tumorausbreitung und Metastasenbildung
Durch die Akkumulation genetischer Veränderungen in den Tumorzellen kommt es zu einer ungehinderten Proliferation der betroffenen Zellen, die schließlich zu der Bildung eines schnell wachsenden Tumors führt. Ob ein solcher Tumor aber gut- oder bösartig ist, hängt vor allem von der Fähigkeit der Tumorzellen zur Metastasenbildung ab. Für eine erfolgreiche Metastasierung müssen die Tumorzellen zahlreiche Eigenschaften aufweisen: sie müssen sich aktiv vom Primärtumor ablösen, in die Bindegewebsmatrix zwischen den Zellen eindringen und die Wand eines Blutgefäßes durchbrechen können (Abb. 1). Danach muss die metastasierende Tumorzelle die Passage im Blutstrom überstehen und an einer geeigneten Stelle wieder austreten, ohne vom Immunsystem erkannt zu werden (Hausen, 1992). Schließlich muss gewährleistet sein, dass sie das Wachstum neuer Blutgefäße veranlassen kann, die den neuen Tumor versorgen (Abb. 1; 1.4).
Abb. 1: Entstehung von Metastasen im Körper
Bei der Metastasierung lösen sich Zellen des Primärtumors ab, gelangen über den Blutstrom in andere Teile des Körpers und erzeugen dort einen Sekundärtumor. Für diese Schritte sind mehrere Fähigkeiten der Tumorzellen nötig: die Invasion in das umliegende Gewebe um den Primärtumor, die Penetration, also das Eindringen in eines der umliegenden Blutgefäße, und der Austritt der Tumorzelle durch die Endothelzellen eines Blutgefäßes.
Aus: Hausen, 1992.
Vergleichende Untersuchungen der Genexpressions-Profile zwischen metastasierenden und nicht-metastasierenden Tumorzellen haben gezeigt, dass einige Gene unterschiedlich exprimiert werden (Yokota J, 2000). Tumorzellen können beispielsweise nur dann die Basalmembran durchdringen, wenn sie geeignete Integrine exprimieren, die die Anheftung an die Basalmembran ermöglichen. Für den Abbau der Membran müssen die metastasierenden Tumorzellen spezielle Kollagenasen auf ihrer Oberfläche tragen (Hausen, 1992).
Einleitung 4
1.3 Tumore und zelluläre Immunantwort
Das Immunsystem hat die natürliche Fähigkeit, solche entarteten Zellen eines Tumors zu erkennen und zu zerstören. Diese zelluläre Immunantwort, die sich auch gegen körperfremde Gewebe und infizierte körpereigene Zellen richtet, wird von T-Lymphozyten vermittelt, einer Klasse der weißen Blutzellen. Es gibt verschiedene Arten von T-Lymphozyten: T-Helferzellen, die die Immunantwort fördern, und cytotoxische T-Zellen, die fremdartige Zellen abtöten. Wie die B-Zellen tragen auch die T-Zellen spezifische Rezeptoren auf ihrer Oberfläche. Wenn eine T-Zelle auf einer entarteten Zelle ihr eigenes Antigen erkennt und daran andockt (Abb. 2A), wird sie aktiviert, tötet die fremde Zelle ab (Abb. 2B) und kann sich selbst vermehren (Robins, 1986;
Alberts et al., 1995). Der Mechanismus, über den die T-Lymphozyten die Tumorzellen eliminieren, findet über eine Induktion des apoptotischen Zelltodes statt (Cotter et al., 1990). So beobachtet man in vielen Tumoren eine Akkumulation von T-Zellen, die man als tumor- infiltrierende Lymphozyten (TIL) bezeichnet (Kradin und Bhan, 1993; Halapi, 1998).
Abb. 2: Angriff eines T-Lymphozyten auf eine Krebszelle
A: Ein T-Lymphozyt (links) dockt an eine weit größere Tumorzelle (rechts) an.
B: Die entartete Zelle wird durch Substanzen der T-Zelle lysiert. Aus: Feldman und Eisenbach, 1988
Einige der Antigene, die Tumorzellen im Gegensatz zu gesunden Zellen auf ihrer Oberfläche tragen können und von den T-Lymphozyten erkannt werden, sind bereits bekannt. Bei Brustkrebs beispielsweise zeigt sich häufig eine Überexpression des HER-2/neu Proteins (Robbins und Kawakami, 1996). Nach der Immunisierung von Ratten mit HER-2/neu-Peptiden zeigte sich eine vermehrte Bildung von spezifischen T-Lymphozyten (Disis et al., 1996), so dass dieses Protein ein potentielles Target-Antigen für eine Immuntherapie bei Brustkrebspatienten darstellen könnte.
Einleitung 5
1.4 Vaskularisierung im Tumorgewebe
1.4.1 In situ Karzinom
Eine Ansammlung von malignen Zellen, die noch nicht die Fähigkeit zu rascher Proliferation und invasivem Wachstum erlangt hat, wird als In situ Karzinom bezeichnet. In diesem Stadium besitzt der Tumor noch kein eigenes Blutgefäßsystem, das ihn mit Nährstoffen und Sauerstoff versorgt. Da der Transport von Nährstoffen in diesem Stadium rein auf Diffusion angewiesen ist, kann ein solcher Tumor eine Größe von wenigen Millimetern nicht überschreiten. Es sterben in diesem Ruhestadium, das mehrere Jahre andauern kann, genauso viele Zellen ab wie neue gebildet werden (Folkman und Haudenschild, 1980).
1.4.2 Invasiver Tumor
Erst wenn der Tumor vaskularisiert, kann sich diese Ansammlung von ruhenden Tumorzellen in ein bösartiges, schnell wachsendes Geschwulst verwandeln. Dies geschieht, indem die Tumorzellen Tumor-Angiogenese-Faktoren (TAF) freisetzen, die nahegelegene Blutgefäße zur Bildung neuer Kapillaren anregen – ein Prozess der Angiogenese genannt wird. Wie diese Gefäßneubildung durch die Tumorzellen induziert wird, ist noch nicht völlig verstanden (Griffioen und Molema, 2000). Die Tumoren scheinen das Gleichgewicht von Angiogenese- Induktoren und -Inhibitoren zu verändern (Hanahan und Weinberg, 2000). Zum einen ist bekannt, daß Sauerstoffmangel (Hypoxie) zu Gefäßneubildung führen kann; zum anderen wird berichtet, dass bestimmte genetische Veränderungen in den Tumorzellen Angiogenese induzieren können (Rak et al., 1995). So kann beispielsweise eine Inaktivierung des Tumorsuppressors TP53 die antiangiogene Komponente Thrombospondin herunterregulieren (Dameron et al., 1994); und mutierte Ras-Onkogene sind in der Lage, die proangiogenen Faktoren TGF-α, TGF-β und VEGF hochzuregulieren (Rak et al., 1995; Okada et al., 1998). Die neuen Kapillaren wachsen bei diesem Prozess auf den Tumor zu und dringen schließlich in die Tumorzellkolonie ein (Folkman, 1985).
Diese Vaskularisierung eines Tumors ermöglicht infolge der so gewährleisteten guten Versorgung eine höhere Zellteilungsrate und beschleunigt so die Tumorprogression. Der Tumor kann in das benachbarte Gewebe einwachsen und es dadurch zerstören (Folkman, 1985). Nur ein solcher vaskularisierter Tumor ist bösartig und besitzt die Fähigkeit, Metastasen zu bilden, denn der Durchbruch eines Tumors durch die Basalmembran setzt eine Vaskularisierung des Tumors
Einleitung 6
voraus (Folkman, 1985). Ohne Vaskularisierung wäre eine Bildung makroskopischer Tumore nicht möglich (Hanahan und Weinberg, 2000); daher werden bei einigen Tumorarten bereits Angiogenese-Hemmer als Therapie eingesetzt.
1.5 Apoptose und Nekrose von Tumorzellen
1.5.1 Hypoxie und Zelltod im Tumorgewebe
Die Fähigkeit von Tumorzellen zum ungehinderten Wachstum wird nicht nur durch die Rate der Zellproliferation determiniert, sondern auch durch die Rate des Zelltodes. Im Falle eines In situ Karzinoms besitzt ein Tumor noch keine eigene Gefäßversorgung, so dass er auf die Versorgung über das bereits bestehende Blutgefäßsystem angewiesen ist (1.4.1). Da dies bei zunehmender Größe des Tumors nur über Diffusion geschehen kann, resultiert in vielen Regionen des Tumorgewebes Sauerstoffmangel (Hypoxie) und Nährstoffmangel, die Zelltod in Form von Apoptose oder Nekrose bewirken (Graeber et al., 1996). Aber auch bei bereits vaskularisierten Tumoren tritt häufig Sauerstoffmangel auf. Es konnte gezeigt werden, dass bei transformierten Zellen durch Hypoxie das Apoptose-Programm ausgelöst wird.
1.5.2 Apoptose-Resistenz und Nekrose im malignen Tumor
Bei einer weiteren Anhäufung genetischer Veränderungen, wie beispielsweise Mutationen im Gen des Tumorsuppressors TP53, zeigt sich allerdings eine Reduktion dieses hypoxie- induzierten Zelltodes (Graeber et al., 1996). Diese Suppression des apoptotischen Zelltodes wird durch Mutationen in regulatorischen Onkogenen und in Genen der Sensoren und Effektoren der Apoptose-Maschinerie verursacht. Beispiele hierfür sind die Gene von Bcl-2, c-myc und TP53 (Lipponen, 1999). Durch Veränderungen in einer oder mehrerer dieser apoptotischen Sensoren und Effektoren tritt eine Resistenz gegen Apoptose ein, die man häufig in Tumorgeweben beobachtet, so dass die entarteten Zellen trotz ihrer schwerwiegenden Schäden ungehindert proliferieren können. Diese schnell wachsenden Tumore weisen fast keine apoptotischen Zellen mehr auf (Symonds et al., 1994), dagegen wird aber häufiger nekrotischer Zelltod beobachtet (Churg et al., 2000).
Einleitung 7
1.5.3 Chemotherapie und Bestrahlung
Bei der Chemotherapie von Tumorerkrankungen wird apoptotischer Zelltod der Krebszellen ausgelöst (Cotter et al., 1990), und zwar zum einen über eine Induktion der Expression sogenannter Todesrezeptor-Liganden (z.B. Fas-Ligand; Nagata 1996, 1997) und zum anderen über eine Induktion einer Cytochrom C-Ausschüttung aus den Mitochondrien (Kaufmann und Earnshaw, 2000). Auch die Bestrahlung führt zu apoptotischem Zelltod der Tumorzellen (Ross, 1999). Allerdings wird die Sensitivität der Tumorzellen gegenüber Chemotherapie bzw.
Bestrahlungstherapie beispielsweise durch Mutationen in TP53 beeinflusst (Rosen et al., 1999;
Pirollo et al., 2000).
1.6 Ist eine Freisetzung von DNA ins Blutplasma möglich?
Der Inhalt von Zellen, die apoptotisch zugrunde gehen, wird in apoptotische Vesikel verpackt, die dann von den Makrophagen aufgenommen und abgebaut werden (Ren und Savill, 1998).
Auch der Zellinhalt nekrotischer Zellen wird von den Phagozyten versorgt (Green und Beere, 2000). Somit ist eine Freisetzung der DNA und der anderen Zellbestandteile in die Blut- zirkulation eigentlich unwahrscheinlich. Zudem gibt es im Blutplasma DNasen, die die DNA abbauen und katabolisieren (Napirei et al., 2000). Eine Freisetzung von DNA und vor allem deren Anwesenheit und Detektion im Blutplasma ist also eigentlich nur schwer vorstellbar.
1.7 DNA im Plasma von Tumorpatienten
Dennoch wurde bereits vor mehr als 50 Jahren frei zirkulierende DNA im Blutplasma von gesunden Menschen und von Patienten mit unterschiedlicher Krankheiten wie rheumatischen Erkrankungen und Autoimmunerkrankungen entdeckt (Mandel und Métais, 1948).
1.7.1 Tumorpatienten weisen erhöhte Mengen an DNA im Plasma auf
Einige Jahre später entdeckte Leon, dass Tumorpatienten im Vergleich gesunden Personen erhöhte Mengen an DNA im Serum aufweisen (Leon et al., 1975). Die Quantifizierung dieser freien DNA im Serum von Patienten verschiedener Tumorarten und gesunder Menschen über die indirekte Methode des Radioimmunassay mit anti-DNA-Antikörpern ergab, dass gesunde Kontrollpersonen im Mittel 13 ng DNA/ml Serum aufweisen, während es bei Tumorpatienten 180 ng/ml – also etwa zehnmal so viel – waren.
Einleitung 8
Es wurde zwar keine Korrelation zwischen den zirkulierenden DNA-Mengen und der Größe oder der Art des Primärtumors entdeckt, aber Patienten mit Metastasen wiesen signifikant höhere Mengen an DNA im Serum auf (Leon et al., 1977a). Andere Studien mit Lungenkrebs-Patienten konnten zeigen, dass Patienten mit fortgeschrittener Tumorerkrankung höhere Plasma-DNA Spiegel aufweisen (Maebo, 1990; Fournié et al., 1995) und dass Patienten mit maligner gastrointestinaler Erkrankung höhere DNA-Spiegel aufweisen als Patienten mit einer gutartigen Erkrankung (Shapiro et al., 1983).
1.7.2 Tumor-DNA im Plasma von Tumorpatienten
Analysen der biophysikalischen Eigenschaften dieser freien DNA bei Tumorpatienten zeigten, dass ein großer Teil der DNA aus den Tumorzellen stammt (Beljanski et al., 1981; Stroun et al., 1989). Zudem wurden in der Plasma-DNA von Patienten diverse Mutationen in Onkogenen und Tumorsuppressor-Genen gefunden, die aus dem Tumorgewebe stammen. Beispielsweise zeigten sich K-ras Mutationen in der Plasma-DNA von Pankreas-Karzinom-Patienten (Sorenson et al., 1994), oder Mikrosatelliten-Veränderungen im Plasma von Patienten mit Kopf-Hals-, Lungen- oder Nieren-Karzinomen (Nawroz et al., 1996; Chen et al., 1996; Goessl et al., 1998).
Mutationen und andere genetische Veränderungen wurden nicht nur in Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung gefunden, sondern auch in Patienten, die sich in einem frühen Stadium der Krankheit befinden (Anker et al., 1997; de Kok et al., 1997). Allerdings wurden in einer Studie mit Pankreas-Karzinom-Patienten deutlich mehr Mutationen in Patienten mit fortgeschrittener Tumorerkrankung detektiert (Yamada et al., 1998). Die genannten Daten belegen also, dass ein gewisser Anteil der DNA im Plasma von Tumorpatienten aus sterbenden Tumorzellen stammt.
1.7.3 Ursprung der Plasma-DNA
Es ist umstritten, ob die Tumor-DNA die Hauptkomponente der DNA im Plasma von Tumorpatienten darstellt, da einige Gruppen nur dann in der Lage sind Mutationen zu detektieren, wenn sie hoch sensitive Methoden für die Mutationssuche verwenden (Sorenson et al., 1994; Anker et al., 1997, 1999), während andere aber Mikrosatelliten-Veränderungen im Plasma detektieren können, was nur dann möglich ist, wenn keine DNA aus normalen Zellen das Ergebnis maskiert (Nawroz et al., 1996; Chen et al., 1996; Sanchez-Cespedes et al., 1998; Goessl et al., 1998). Jedoch war in allen bisherigen Studien stets ein gewisser Anteil an Wildtyp-DNA im Plasma vorhanden (Anker et al., 1999). Aus welchen Zellen diese Nicht-Tumor-DNA
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stammt, bzw. wie groß der Anteil der Tumor-DNA an der gesamten Plasma-DNA wirklich ist, ist bisher nicht genau analysiert worden.
1.7.4 Mechanismus der Freisetzung der DNA ins Blut
Ebensowenig wie der zelluläre Ursprung der DNA ist bisher der Mechanismus untersucht worden, über den die DNA in den Blutkreislauf gelangt. Die Hypothesen reichen von aktiver DNA-Freisetzung von Lymphozyten oder Tumorzellen bis hin zu Apoptose oder Nekrose der Tumorzellen (Anker et al., 1999), es wurden bisher aber keine Studien durchgeführt, um diese Fragen zu klären.
Zielsetzung 10
2 Zielsetzung
Seit mehr als 50 Jahren ist bekannt, dass beim Menschen frei zirkulierende DNA im Blutplasma vorkommt. Seitdem sind viele Arbeiten über dieses Thema erschienen, die sich zumeist mit der Suche nach Mutationen in der Plasma-DNA von Tumorpatienten beschäftigen. Tatsächlich wurden bei verschiedenen Tumorarten bereits Mutationen oder andere genetische Veränder- ungen in der freien DNA detektiert, die identisch mit denjenigen des Tumorgewebes waren. Es sind außerdem Studien erschienen, die versucht haben, die Menge der Plasma-DNA oder eine Detektion von Mutationen mit der klinischen Situation von Tumorpatienten zu korrelieren.
Bis heute sind jedoch kaum Untersuchungen zum Ursprung dieser frei zirkulierenden DNA gemacht worden. Zudem fehlen Studien, die sich mit einer genaueren Charakterisierung dieser DNA befassen. Daher sollten in der vorliegenden Arbeit an einer Gruppe unterschiedlicher Tumorpatienten Fragen zur Herkunft der DNA beantwortet werden. Zunächst sollte die Plasma- DNA-Menge der Patienten mittels quantitativer PCR ermittelt werden. Auf dieser Basis sollte dann eine Suche nach Mutationen im Plasma bzw. im Tumorgewebe erfolgen und eine nähere Charakterisierung der DNA durchgeführt werden.
Neben der Studie mit unterschiedlichen Tumorpatienten sollte in vitro und in vivo untersucht werden, ob eine Freisetzung von DNA aus sterbenden Zellen überhaupt möglich ist; bzw. ob man freie DNA nach Induktion von Apoptose und Nekrose im Überstand von sterbenden Zellen oder im Blutplasma von Mäusen mit Leberzell-Apoptose bzw. –Nekrose detektieren kann. Im Hinblick darauf war insbesondere die Frage interessant, ob die freie DNA im Plasma von Tumorpatienten aus apoptotischen oder nekrotischen Zellen des Tumorgewebes stammt.
An einer Studie mit 28 Brustkrebs-Patientinnen sollte die Frage geklärt werden, ob die Menge an Plasma-DNA bzw. die Menge an Tumor-DNA im Plasma mit der klinischen Situation der Patienten korreliert. Bei diesen Patientinnen, deren Klinik detailliert am Klinikum Konstanz dokumentiert wurde, sollte die Plasma-DNA im Verlauf der Therapie beobachtet werden.
Neben den Arbeiten an Tumorpatienten sollte auch die Frage der Herkunft der DNA im Plasma von Gesunden geklärt werden. Dafür sollte die DNA von mehreren Frauen im Verlauf des weiblichen Zyklus untersucht werden, um Anhaltspunkte für die Herkunft der DNA zu erhalten.
Zudem sollte der Effekt von Östrogenexposition auf die Menge an DNA im Plasma von Frauen untersucht werden.
Material und Methoden 11
3 Material und Methoden
3.1 Material
Alle verwendeten organischen und anorganischen Chemikalien hatten analytischen Reinheitsgrad und wurden von den Firmen Fluka, Gibco, Merck, Riedel de Haën, Roth, Serva und Sigma bezogen. Die CpG-Methylierung wurde mit der SssI Methylase von der Firma BioLabs durchgeführt. Blutproben wurden in EDTA-Monovetten der Firma Sarstedt gesammelt.
Lösungen und Puffer für die nachstehenden Methoden wurden nach Sambrook et al. (1989) angesetzt. H2O bedeutet im Folgenden immer doppelt destilliertes Wasser, soweit nicht anders erwähnt.
3.1.1 Tumorpatienten und Kontrollpersonen
Die Mehrzahl der Untersuchungen dieser Arbeit wurden an 30 Patienten mit verschiedenen Tumoren durchgeführt, die von Prof. Müller-Esch und Dr. Hardt, Zentrum für Innere Medizin, Klinikum Konstanz bereitgestellt wurden. Die 28 Patientinnen der Brustkrebs-Studie wurden von Prof. Czekelius, Frauenklinik, Klinikum Konstanz zur Verfügung gestellt. Das Tumorgewebe der Patienten stammte von Prof. Lesch und Dr. Kind, Pathologie, und von Prof. Roth, Chirurgie, Klinikum Konstanz, und wurde bei Resektionen entnommen.
Für die Studie wurden 14 gesunde Kontrollpersonen der AG Prof. Knippers, verwendet. Das Kontrollkollektiv von 54 gesunden Frauen für die Brustkrebs-Studie stammte aus der Praxis von Prof. Hesch, Konstanz.
Den Personen wurde je ca. 9 ml Blut abgenommen. Alle Patienten und Kontrollpersonen wurden vor der Blutabnahme über die folgenden Untersuchungen der Plasma-DNA informiert. Die Studie wurde von der Ethik-Kommission der Universität Konstanz genehmigt.
3.1.2 Mäuse
Für die in vivo Versuche wurden pathogen-freie männliche BALB/c Mäuse (ca. 25g) von der Tierforschungsanlage der Universität Konstanz verwendet. Alle Tiere wurden entsprechend den NIH Richtlinien und unter konstanten Bedingungen von 22°C, 55% Luftfeuchtigkeit und einem konstanten Tag/Nacht Zyklus von 12 h gehalten.
Material und Methoden 12
3.2 Methoden
Alle verwendeten Methoden werden, sofern nicht beschrieben, nach Sambrook et al. (1989) durchgeführt. Die PCR-Amplikation erfolgt, wenn nicht anders angegeben, mit Ready To Go PCR Beads der Firma Pharmacia in einem Gesamtvolumen von 25 µ l; für die PCR-Reaktion werden je 25 pmol von jedem Primer zugesetzt.
3.2.1 Isolierung von Plasma
Peripheres, venöses Blut der Kontrollpersonen und Tumorpatienten wird in Monovetten mit EDTA als Antikoagulans gesammelt. Die Trennung des Blutplasmas von den Blutzellen erfolgt durch einen 20 minütigen Zentrifugations-Schritt bei 3000 rpm. Das Plasma wird mit Hilfe einer Plastik-Pasteurpipette vorsichtig abgenommen ohne die zelluläre Fraktion zu berühren. Die Plasmaproben werden bis zur DNA-Isolierung bei – 20° C aufbewahrt.
3.2.2 DNA-Isolierung aus Patientenproben
3.2.2.1 Plasmaproben
Für die DNA-Aufreinigung aus Plasma wird der QIAamp Blood Kit der Firma Qiagen (Hilden;
Deutschland) verwendet. Dafür wird die DNA aus 2 bis 10 ml Plasma nach dem Protokoll für Blut- und Körperflüssigkeiten durch wiederholte Zentrifugationsschritte an eine Säule gebunden.
Die Elution der DNA erfolgt mit 50 µ l Elutionspuffer (AE). Die gewonnene DNA wird aliquotiert bei -20° C aufbewahrt.
3.2.2.2 Gewebeproben
Das Tumorgewebe der Krebspatienten wird bei der Resektion gesammelt und in 10%
gepuffertem Formalin fixiert. Da Formalin durch die Quervernetzung der Proteine an die DNA die PCR inhibiert, erfolgt ein Waschschritt von 3 h in PBS, um das Formalin zu entfernen.
Sodann wird die DNA des Gewebes mit Hilfe des DNeasy Tissue Kit (Qiagen) isoliert. Die Elution erfolgt in 100 µ l Elutionspuffer (AE). Die gewonnene DNA wird bis zur Verwendung bei –20° C aufbewahrt.
Material und Methoden 13
3.2.3 Quantifizierung der Plasma-DNA
3.2.3.1 Kompetitive PCR
Die Quantifizierung der DNA im Plasma von Kontrollpersonen und Tumorpatienten erfolgt zum Teil mittels kompetitiver PCR nach der Methode von Diviacco et al. (1992). Dabei wird ein Fragment des menschlichen LAMB2 Genlokus amplifiziert (Region B48; Biamonti et al., 1992), als typisches Beispiel für ein Einzelkopie-Gen. Die Herstellung des Kompetitor-Moleküls erfolgt mit Hilfe von drei PCR-Reaktionen, bei denen ein 20 bp langes Insert in ein DNA-Fragment eingebracht wird, das dieselben Primererkennungssequenzen besitzt wie die genomische DNA in dieser Region (Diviacco et al., 1992). Die Konzentration der Kompetitor-Moleküle wird nach Entfernung der PCR-Primer und der freien Nukleotide durch Verwendung des QIAquick PCR Purification Kit der Firma Qiagen über die optische Dichte bei 260 nm bestimmt. In der darauffolgenden kompetitiven PCR werden steigende Mengen an Kompetitor-Molekülen mit einer konstanten Menge aufgereinigter Plasma-DNA koamplifiziert. Für die Amplifikation der beiden Templates werden zwei neu entworfene, eingerückte Primer verwendet: 5’-TCCAAT- GATTTGTAATATAC-3’ (Q-EF) und 5’-ATCTTTCTTAGACATCCGCTT-3’ (Q-ER). Die PCR erfolgt in 40 Zyklen: 94°C 1 min, 52°C 1 min, 72°C 1 min. Nach der Amplifikation werden die beiden Produkte von 153 bp und 173 bp, die dem genomischen bzw. Kompetitor-Template entsprechen, auf einem 6% Polyacrylamid-Gel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid unter UV visualisiert. Eine gleiche Bandendicke der beiden Produkte läßt den Schluss zu, dass in diesem Ansatz zu Beginn gleiche Mengen an Kompetitor-Molekülen - wie an genomischem Template vorlagen. Die Plasma-DNA-Konzentration kann so über die ermittelten genomischen Einheiten errechnet werden. Eine genomische Einheit entspricht dabei 330 ng DNA. Die Ergebnisse der kompetitiven PCR konnten mit Hilfe der Quantifizierung über Realtime-PCR bestätigt werden.
3.2.3.2 Realtime-PCR
Die Quantifizierung der Plasma-DNA über Realtime-PCR wird im LightCycler-Gerät der Firma Roche Diagnostics durchgeführt. Für die Quantifizierung von Plasma-DNA wird der LightCycler Control Kit DNA verwendet, bei dem ein 110 bp großes Fragment des menschlichen β-Globin- Gens amplifiziert wird. Das Produkt wird während der Realtime-PCR durch Fluoreszenz detektiert, indem man entweder den doppelstrang-bindenden Farbstoff SYBR Green I oder ein spezifisches Paar Hybridisierungssonden (LCRed640) des Kits verwendet. In die Realtime-PCR werden bei einem Gesamtvolumen von 20 µ l jeweils 4µ l Plasma-DNA eingesetzt. Als Standard
Material und Methoden 14
wird eine Verdünnungsreihe von menschlicher genomischer DNA aus dem Kit bei jedem PCR- Lauf gleichzeitig mit den Plasma-DNA-Proben amplifiziert. Die PCR erfolgt in einem Gesamtvolumen von 10 µ l mit jeweils 2 µ l der gewonnenen Plasma-DNA-Lösung. Das PCR- Programm mit den jeweiligen Temperaturen der einzelnen Zyklen wird dem Vorschlag aus dem Kit entnommen. Die Auswertung der Quantifizierung erfolgt mit Hilfe der Software des LightCyclers, der die Konzentration der Standards gegen den Schnittpunkt ihrer logarithmischen Fluoreszenzkurven mit einer Basislinie (Crossing Point) aufträgt. Mit Hilfe dieser Standardgerade berechnet die Software des Gerätes die Anzahl der genomischen Einheiten bzw.
der eingesetzten Plasma-DNA.
3.2.4 Detektion von Mutationen
3.2.4.1 Mutationen in TP53
Die Suche nach Mutationen im TP53 Tumorsuppressor-Gen erfolgt über eine Sequenzierung des gesamten Hotspotbereiches, der sich von Codon 126 bis 307, also von Exon 5 bis einschließlich Exon 8 erstreckt. Dafür wird die aufgereinigte Plasma- bzw. Tumor-DNA der Patienten in 3 PCR-Ansätzen mit drei Primerpaaren amplifiziert: 5’-TATCTGTTCACTTGTGCCCT-3’
(p53-5F) und 5’-TGACAACCACCCTTAACCCCT-3’ (p53-5R) für die Amplifikation der Exons 5 und 6, 5’-TGCTTGCCACAGGTCTCCCCAA-3’ (p53-7F) und 5’-AGAGGCTGGG- GCACAGCA-3’ (p53-7R) für Exon 7 und 5’-TGATTTCCTTACTGCCTCTT-3’ (p53-8F) und 5’-AGGCATAACTGCACCCTTGGT-3’ (p53-8R) für Exon 8. Es werden je 35 PCR-Zyklen durchlaufen: 94°C 1 min, 62°C 1 min, 72°C 1 min (Exon 5, 6) bzw. 94°C 18 s, 53°C 12 s, 72°C 30 s (Exons 7 und 8). Die PCR-Produkte mit den Größen 483 bp, 222 bp und 235 bp werden vor der Sequenzreaktion mit dem QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) aufgereinigt.
Die Sequenzreaktion wird mit Hilfe des Thermo Sequenase Fluorescent Labelled Primer Cycle Sequencing Kit (Pharmacia) durchgeführt. Es werden jeweils etwa 100 ng des aufgereinigten PCR-Produktes eingesetzt. Die verwendeten Sequenzierungsprimer sind am 5’-Ende mit dem Fluoreszenz-Farbstoff Cy5 markiert: 5’-TGCCCTGACTTTCAACTC-3’ und 5’-TCCTCCCAG- AGACCCCAGTT-3’ (für Exons 5 und 6), 5’-TCCCCAAGGCGCACTGGCCT-3’ (Exon 7) und 5’-TCTTGCTTCTCTTTTCCT-3’ (Exon 8). Die Sequenzierung findet in einem automatischen Sequenzierer (ALFexpress) der Firma Pharmacia statt.
Material und Methoden 15
3.2.4.2 K-ras-Mutationen
Für die Suche nach Mutationen im K-ras (KRAS) Onkogen werden zwei Strategien verwendet:
Direkte Sequenzierung von PCR-Produkten und MASA (mutant allele specific amplification) der aufgereinigten Plasma- bzw. Tumor-DNA. Zunächst werden die Exons 1 und 2 von KRAS mit den folgenden Primern amplifiziert: 5’-GACTGAATATAAACTTGTGGTAGT-3’ (Kras- 1F) und 5’-CTATTGTTGGATCATATTCGTCC-3’ (Kras-1R) für Exon 1 und 5’-AGTA- ATTGATGGAGAAACCT-3’ (Kras-2F) und 5’-AACCCACCTATAATGGTGA-3’ (Kras-2R) für Exon 2. Es werden jeweils 35 PCR-Zylen durchlaufen (94°C 18 s, 53°C 12 s, 72°C 30 s). Die Produkte haben die Größen 107 bp bzw. 166 bp.
Für die Sequenzreaktion werden die beiden Produkte mit dem QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) aufgereinigt. Es werden jeweils etwa 100 ng des aufgereinigten PCR-Produktes in jede Sequenzreaktion eingesetzt. Die verwendeten Sequenzierungsprimer sind am 5’-Ende mit Cy5 fluoreszenzmarkiert: 5’-TGCCCTGACTTTCAACTC-3’ und 5’-TCCTCCCAGAGACCCC- AGTT-3’ (für die Exons 5 und 6), 5’-TCCCCAAGGCGCACTGGCCT-3’ (Exon 7) und 5’-TC- TTGCTTCTCTTTTCCT-3’ (Exon 8). Die Sequenzanalyse findet in einem automatischen Sequenzierer (ALFexpress) der Firma Pharmacia statt.
Bei der MASA-Methode, bei der mit Hilfe von mutationsspezifischen Primern selektiv mutierte DNA amplifiziert wird, wird das Codon 12 von KRAS auf Mutationen an Position 1 und 2 untersucht (Anker et al., 1997). Das PCR-Produkt von KRAS Exon 1 wird 1:106verdünnt. Von dieser Verdünnung werden je 5µ l für die zweite PCR eingesetzt: diese besteht aus 7 Ansätzen, die sich nur in dem mutationsspezifischen Vorwärtsprimer unterscheiden: 5’-ACTTGTGGTA- GTTGGAGCTGG-3’ (MASA-Wt), 5’-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3’ (MASA-1A), 5’- ACTTGTGGTAGTTGGAGCTT-3’ (MASA-1T), 5’-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTC-3’
(MASA-1C), 5’-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGA-3’ (MASA-2A), 5’-ACTTGTGGTAGTTG- GAGCTGT-3’ (MASA-2T) und 5’-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGC-3’ (MASA-2C). Als Rückwärtsprimer wird bei jedem der mutationsspezifischen Ansätze Kras-1R eingesetzt (siehe oben). Die PCR besteht aus 35 Zyklen: 94°C 30 s, 65°C 90 s, 72°C 30 s. Die Produkte weisen eine Größe von 95 bp auf und werden nach Auftrennung auf 6% Polyacrylamid-Gelen und Ethidiumbromid-Färbung sichtbar gemacht.
Material und Methoden 16
3.2.5 Analyse des Methylierungsstatus von CDKN2A
3.2.5.1 CpG-Methylierung der Positivkontrolle
Eine Positivkontrolle mit Hypermethylierung im Promotor-Bereich des CDKN2A Tumorsuppressor-Gens wird hergestellt, indem DNA von menschlichen Fibroblastenzellen (normal human dermal fibroblast cells, NHDF) in vitro mit der CpG Methylase der Firma New England BioLabs methyliert wird. Diese Methylase methyliert alle Cytosine in CpG- Dinukleotiden in der gesamten behandelten DNA.
3.2.5.2 Desaminierung der DNA durch Na-Bisulfit
Der Nachweis hypermethylierter CpG-Inseln in der Promoterregion des CDKN2A Tumorsuppressor-Gens erfolgt durch methylierungs-spezifische PCR nach Desaminierung der Plasma-DNA bzw. der Tumor-DNA durch Na-Bisulfit. Bei dieser Prozedur werden unmethylierte Cytosinreste zu Uracil desaminiert, methylierte Cytosine dagegen werden nicht desaminiert und bleiben Cytosine. Dafür wird der CpGenome DNA Modification Kit der Firma Intergen verwendet. Für die Untersuchungen im Laufe der Brustkrebsstudie wird die Desaminierung nach dem Rezept von Herman et al. (1996a) mit den folgenden Modifikationen durchgeführt: es wird zu der zu modifizierenden DNA 1 µg Fremd-DNA aus E.coli zugegeben, die Entfernung des Bisulfits nach der Inkubation bei 50°C über Nacht erfolgt mit Hilfe des QIAamp Blood Kit der Firma Qiagen und die Elution des DNA-Pellets nach Vollendung der Desaminierung erfolgt mit 50 µl 10 mM Tris pH 8.
3.2.5.3 Methylierungs-spezifische PCR
Die Plasma-DNA bzw. die DNA aus Tumorgewebe wird nach erfolgter Desaminierung mit Hilfe einer methylierungs-spezifischen PCR nach der Methode von Herman et al. (1996a) in zwei parallelen Ansätzen mit den beiden Primerpaaren p16-U und p16-M (Herman et al., 1996a) auf Hypermethylierung der Promotorregion des CDKN2A-Gens untersucht. Bei der Brustkrebs- Studie wird für die methylierte Reaktion ein anderes Primerpaar verwendet: 5’-GGTGGGGC- GGATCGC-3’ (P16-MF) und 5’-CCGAACCGCGACCGTAA-3’ (P16-MR).
Die PCR verläuft in 35 Zyklen (95°C 45 s, 65°C 45 s, 72°C 60 s). Die Produkte mit den Größen 151 bp (unmethyliertes Allel) bzw. 150 bp (methyliertes Allel) werden nach Elektrophorese auf einem 6% Polyacrylamid-Gel mit Ethidiumbromid unter UV sichtbar gemacht.
Material und Methoden 17
3.2.6 Quantifizierung von Tumor-DNA im Plasma
Bei den Tumorpatienten, die eine Hypermethylierung im Promotor-Bereich von CDKN2A im Tumorgewebe aufweisen, kann mit Hilfe einer entwickelten methylierungs-spezifischen Realtime-PCR der Anteil der Tumor-DNA an der gesamten DNA im Plasma bestimmt werden.
3.2.6.1 Plasma-DNA-Aufreinigung und Desaminierung der DNA
Die DNA der Patienten wird aus dem Plasma isoliert wie unter 3.2.2.1 beschrieben. Als Kontrolle für hypermethylierte CDKN2A-Sequenzen wurde DNA von Raji-Zellen verwendet (Burkitt-Lymphom-Zellen) bzw. in vitro methylierte DNA (3.2.5.1). Die Desaminierung der unmethylierten Cytosinreste erfolgt mit Natrium-Bisulfit, wie vor der normalen methylierungs- spezifischen PCR (3.2.5.3).
3.2.6.2 Quantitative methylierungs-spezifische PCR
Das Verhältnis zwischen DNA mit unmethylierter und hypermethylierter CDKN2A-Promotor- region im Plasma von Tumorpatienten wird mit methylierungs-spezifischer Quantifizierung im LightCycler System der Firma Roche Diagnostics durchgeführt. Für die Amplifizierung der unmethylierten DNA werden die Primer von Herman et al. (1996a) verwendet. Für die hypermethylierte p16-Region wird das folgende Set von PCR-Primern verwendet: 5’-GGT- GGGGCGGATCGC-3’ und 5’-CCGAACCGCGACCGTAA-3’. Für die Detektion der Realtime- PCR-Produkte werden LC-Red640 markierte Hybridisierungssonden verwendet, die ebenfalls methylierungs-spezifisch sind: Für die unmethylierte Reaktion 5’-CTCCCCACCACCCACTA- CCTACTCT-3’ (p16N FL) und 5’-CCCCTCTCCACAACCACCAAACAC-3’ (p16N LC), für die methylierte Reaktion 5’-CCGCCGCCCGCTACCTACTCT-3’ (p16M FL) und 5’-CCT- CTCCGCAACCGCCGAAC-3’ (p16M LC). Die PCR besteht aus 40 Zyklen (Denaturierung von 10 s bei 95°C, Annealing von 10 s bei 65°C bzw. 67°C, Extension von 10 s bei 72°C) und wird mit dem LightCycler FastStart DNA Master Hybridization Probes Kit von Roche Diagnostics durchgeführt. Es werden jeweils 4 µ l desaminierte Plasma-DNA in jedem PCR-Ansatz eingesetzt bei einem Gesamtvolumen von 20 µl. Für die Untersuchung der Proben der Brustkrebsstudie wird jeweils nur der halbe Ansatz verwendet, also 2 µl Plasma-DNA bei einem Gesamtvolumen von 10 µ l. Als Standards für die Quantifizierung der methylierten und unmethylierten CDKN2A-Region werden jeweils angegebene Mengen von desaminierter DNA aus Raji-Zellen (3.2.5.1) bzw. DNA aus normalen menschlichen Lymphozyten verwendet (3.2.6.1).
Material und Methoden 18
3.2.7 Nachweis von T-Lymphozyten-DNA im Plasma
Die Anwesenheit von T-Lymphozyten-DNA in den Plasmaproben der Tumorpatienten wird durch PCR-Amplifikation einer Region der beta-Kette des T-Zell-Rezeptors (TCR) untersucht, die ein somatisches Rearrangement durch VDJ-Rekombination aufweist (Zemlin et al., 1998).
Für die Amplifikation wird eine Mischung aus den beiden Vorwärtsprimern (Vßz5 und Vßz6) und einem Rückwärtsprimer (Jß1i) benutzt (Zemlin et al., 1998). Dies führt zur Amplifikation von DNA-Fragmenten definierter Größen (907, 767 und 155 bp), je nach rearrangiertem Jß- Element. DNA von Jurkat T-Lymphozyten, HeLa-Zellen und menschlichen Lymphozyten werden als interne PCR-Kontrollen verwendet. Die Germline-Konfiguration der TCR-Region, die alle Nicht-T-Lymphozyten aufweisen, wird ebenfalls mit spezifischen Primern amplifiziert:
5’-AATGATTCAACTCTACGGGA-3’ (G1F) und 5’-TGAGTCCTCCACTTGTGAG-3’ (G1R).
Bei der PCR ergibt sich ein Produkt von 250 bp. Bei beiden PCR-Reaktionen werden jeweils 100 ng DNA eingesetzt. Die PCR-Produkte werden mittels 6% Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und mit Ethidiumbromid unter UV visualisiert.
3.2.7.1 Nachweis von Endothelzell-DNA im Plasma
Um die Anwesenheit von Endothelzell-DNA im Plasma nachzuweisen, wird eine methylierungs- spezifische PCR-Methode etabliert. Nach Desaminierung der gereinigten Plasma-DNA durch Na-Bisulfit (CpGenome Modification Kit; Intergene; 3.2.5.2) wird eine methylierungs- spezifische PCR in der Promotorregion des Selectin E Gens (SELE) durchgeführt. Es werden zwei verschiedene Sets von Primern verwendet, die die unmethylierte von der hypermethylierten SELE Promotorregion unterscheiden. Für die Amplifikation der unmethylierten Allele werden die folgenden Primer verwendet: 5’-ATTTTAAGTATTGTGGATATTTTTG-3’ und 5’-CAA- AAACAACTAAACACTACTTCA-3’; für die Amplifikation der hypermethylierten Allele: 5’- TTTAAGTATCGTGGATATTTTCG-3’ und 5’-AAAAACAACTAAACACTACTTCG-3’. Die sequenzspezifischen Primer bedecken drei CpG-Inseln, von denen zwei am 3`-Ende der Primer liegen. Es werden 35 PCR-Zyklen durchgeführt (1 min 94°C, 1 min 50°C, und 1 min 72°C).
DNA von HeLa- bzw. HL60-Zellen und menschlichen Endothelzellen (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC) dienen als Negativ- bzw. Positivkontrollen. Die resultierenden PCR- Produkte mit einer Größe von 151 bp werden nach 6% Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Färbung mit Ethidiumbromid unter UV visualisiert.
Material und Methoden 19
3.2.8 Fragmentlängen-Bestimmung
Die Größenverteilung der Plasma-DNA-Fragmente wird untersucht, indem die DNA entweder markiert oder unmarkiert gelelektrophoretisch aufgetrennt und dann visualisiert wird.
3.2.8.1 Radioaktive Endmarkierung der Plasma-DNA einer Kontrollperson
Für die Bestimmung der Fragmente der Plasma-DNA einer gesunden Kontrollperson wird zunächst die freie DNA aus 600 µ l Plasma isoliert (3.2.2). Als Kontrolle wird genomische, zelluläre DNA derselben Person verwendet. Die DNA wird zunächst über Nacht bei 37°C dephosphoryliert, und nach einer Phenol-Chloroform-Extraktion über Nacht gefällt. Das Pellet wird in 24 µ l H2O gelöst. Für die Phosphorylierung der 5`-Enden wird die gesamte DNA in einem Endvolumen von 30 µl mit γ-ATP (P32) und T4 Polynukleotid-Kinase (8 Units/µ l) versetzt und 1 h bei 37°C inkubiert. Die freien radioaktiven Nukleotide werden durch Zentrifugation über Sephadex-Säulen entfernt. Die Analyse der Fragmente erfolgt über 1%
Agarose-Gelelektrophorese und darauffolgende Autoradiographie.
3.2.8.2 Fragmentlängen-Bestimmung der Plasma-DNA von Tumorpatienten
Die Bestimmung der Fragmentlängen von Plasma-DNA aus Tumorpatienten erfolgt ohne vorherige Markierung. 20 bis 30 µ l der Plasma-DNA werden nach der Extraktion (3.2.2) auf einem 6% Polyacrylamid-Gel aufgetrennt. Die Visualisierung der Fragmente erfolgt unter UV nach Färbung mit Ethidiumbromid.
3.2.9 In vitro Apoptose und Nekrose von Jurkat-T-Lymphozyten
Die Induktion von Apoptose und Nekrose in vitro erfolgt an Jurkat T-Lymphozyten. Die Zellen werden in RPMI1640-Medium mit 10% fetalem Kälberserum bei 37°C gezogen und werden alle 3 Tage durch 5-fache Verdünnung in frisches Medium umgesetzt. Vor der Induktion von Apoptose und Nekrose werden die Zellen durch Zentrifugation bei 190 g für 5 min pelletiert und zweimal in serumfreiem Medium (PBS pH 7,4) gewaschen. Nach dem zweiten Waschschritt werden die Zellen in serumfreiem Medium mit Zusatz von 2 mM Pyruvat resuspendiert. Jeder Ansatz enthält ca. 2 x 106 Zellen in 1 ml Volumen. Apoptose wird durch 1,2 µM Staurosporin ausgelöst; Nekrose durch 2,5 µM Oligomycin und 1,2 µM Staurosporin (Leist et al., 1997).
Zunächst werden die Zellen in PBS mit Pyruvat 30 min bei 37°C inkubiert, dann erfolgt die Zugabe von Oligomycin (Nekrose-Ansätze). Nach einer weiteren Inkubationszeit von 30 min
Material und Methoden 20
erfolgt dann die Zugabe von Staurosporin. Zu verschiedenen Zeiten nach Zugabe von Staurosporin werden die Zellen abgeschabt. Sodann wird der Überstand durch einen Zentrifugationsschritt bei 13 000 g für 2 min von den Zellen getrennt.
3.2.9.1 Isolierung der DNA aus dem Überstand
Die freigesetzte DNA der Überstände wird mit Hilfe des QIAamp Blood Kit der Firma Qiagen aufgereinigt wie die DNA aus Plasma (3.2.2). Die Elution erfolgt in je 60 µ l Elutionspuffer.
3.2.9.2 Quantifizierung der DNA aus dem Überstand
Die DNA-Konzentrationen in den verschiedenen Überständen werden mittels kompetitiver PCR quantifiziert (3.2.3.1). In jeden Ansatz werden 5µ l der eluierten DNA eingesetzt.
3.2.9.3 Apoptose-Nachweis: SAF-A-Spaltung
Die beiden unterschiedlichen Arten des Zelltodes werden bestätigt über Analyse der Spaltung des SAF-A (scaffold attachment factor) Proteins in den Proben, das nur während Apoptose, nicht aber während Nekrose durch die Caspase-3 gespalten wird (Göhring et al., 1997; Kipp et al., 2000). Dafür werden die Proteine der Zellen nach Abnahme des Überstandes für die DNA- Untersuchungen nach der Methode von Wessel und Flügge gefällt (Wessel und Flügge, 1984) und über ein 10% SDS-Polyacrylamid-Gel aufgetrennt (Lämmli, 1970). Nach einem Western- Transfer (Towbin et al., 1979) mit affinitäts-gereinigtem Antikörper und Peroxidase- gekoppeltem Sekundär-Antikörper (Sigma) erfolgt der Nachweis des SAF-A Proteins mit ECL (enhanced chemiluminescent detection) der Firma Amersham.
3.2.10 In vivo Apoptose und Nekrose bei Mäusen
Die Induktion von Leberzell-Apoptose wird durch intravenöse Injektion von 1 bzw. 2 µg anti- CD95 Antikörper (αCD95, Klon Jo-2 der Firma PharMingen) pro Tier erreicht. Die Injektion erfolgt in einem Volumen von 300 µ l endotoxin-freier Salzösung mit Zusatz von 0,1%
menschlichem Serum-Albumin (Ogasawara et al., 1993; Hentze et al., 2000).
Nekrose der Leberzellen wird induziert durch intraperitoneale Injektion von 250 mg/kg Acetaminophen (Firma EGA) in 300 µ l endotoxine-freier Saline (Hentze et al., 2000). Nach verschiedenen Zeitpunkten werden die Mäuse durch intravenöse Injektion von 150 mg/kg
Material und Methoden 21
Pentobarbital mit Zusatz von 1,2 mg/kg Na-Citrat als Antikoagulans narkotisiert. Durch Herzpunktion wird den Mäusen Blut entnommen.
Das Ausmaß des Leberschadens wird durch Messung der Alanin-Aminotransferase (ALT) Aktivität mit einem EPOS 5060 Gerät (Netheler & Hintz) nach der Methode von Bergmeyer ermittelt (1983).
3.2.10.1 Plasma-Gewinnung und DNA-Isolierung
Das Plasma der Mäuse wird durch einen Zentrifugations-Schritt (5 min, 14000 g, 4°C) von den Zellen getrennt. Die DNA aus ca. 50 µl Plasma wird mit Hilfe des QIAamp Blood Kit der Firma Qiagen isoliert. Die Elution erfolgt in 50 µl Elutionspuffer (3.2.2.1).
3.2.10.2 Quantifizierung der Plasma-DNA
Die Quantifizierung der ins Plasma freigesetzten DNA erfolgt über Realtime-PCR mit dem LightCycler der Firma Roche Diagnostics. Dabei wird ein Teil des Exons 3 des alpha-Aktin- Gens amplifiziert. Die verwendeten Primer 5’-TGAACATGGCATCATCACC-3’ (Aktin-mouse- F) und 5’-CTGGATAGCCACATACATG-3’ (Aktin-mouse-R) ergeben ein Produkt von 199 bp.
Die Realtime-Quantifizierung wird mit dem SYBR-Green I Reaktionsmix (Roche Diagnostics) durchgeführt. Es werden jeweils 4 µ l der eluierten DNA in jeden PCR-Ansatz eingesetzt. Die PCR wird in 40 PCR-Zyklen durchgeführt (1 s 95°C, 5 s 55°C, und 10 s 72°C).
3.2.10.3 Fragmentlängen-Bestimmung der freigesetzten DNA
Die Bestimmung der Fragmentlängen der DNA erfolgt wie unter 3.2.8.2 angegeben, jedoch werden zur Auftrennung der Fragmente 1% Agarose-Gele verwendet.
Ergebnisse 22
4 Ergebnisse
Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit stehen zwei wichtige Fragen: aus welchen Zellen stammt die DNA im Plasma von Tumorpatienten und wie gelangt diese DNA in den Blut- kreislauf? Die Frage nach dem zellulären Ursprung der DNA im Plasma sollte durch eine Untersuchung der Plasma-DNA verschiedener Tumorpatienten erfolgen. Dafür wurde zunächst die Plasma-DNA von 30 Tumorpatienten unterschiedlicher Krebsarten analysiert (4.1 bis 4.6), und darauf aufbauend die DNA im Plasma von 28 Brustkrebs-Patientinnen (4.9). Die Frage nach dem Mechanismus der Freisetzung dieser DNA in den Blutkreislauf sollte an in vitro und in vivo Modellen beantwortet werden (4.7 bzw. 4.8). Im letzten Kapitel sollte weiterhin noch die Frage der Herkunft der DNA im Plasma von gesunden Menschen geklärt werden (4.10).
4.1 Tumorpatienten haben erhöhte Mengen an DNA im Blutplasma
In einem ersten Schritt sollten die DNA-Mengen im Plasma von Tumorpatienten ermittelt werden. Da mit den bisher angewandten Methoden die Menge der DNA nicht quantifizierte werden konnte, wurde eine Methode entwickelt, mit deren Hilfe die DNA im Plasma nachweisbar und quantifizierbar ist: die kompetitive PCR. Bei dieser besonderen Form der quantitativen PCR wird die Plasma-DNA gemeinsam mit einer bekannten Menge an Kompetitor- Molekülen amplifiziert. Diese Kompetitor-Moleküle weisen dieselbe Sequenz auf wie die des genomischen Targets, tragen jedoch ein 20 bp langes Stück Fremd-DNA in der Mitte (Abb. 3A).
Die kompetitive PCR erfolgt mit Primern, die ein 153 bp großes Stück eines Einzelkopie-Genes amplifizieren (3.2.3.1; Abb. 3A). Nach der kompetitiven PCR läßt sich durch einen Vergleich der Bandenstärke der beiden unterschiedlichen Produkte (Plasma-DNA bzw. Kompetitor- Template; Abb. 3B) die Menge an eingesetzter Plasma-DNA berechnen. Vor der Quantifizierung wurde das Plasma von den zellulären Bestandteilen des Blutes getrennt (3.2.1) und die DNA- Fragmente aus dem Plasma isoliert (3.2.2.1). Die Ergebnisse, die mit der kompetitiven PCR erhalten wurden, konnten über Realtime-Quantifizierung mit dem LightCycler System der Firma Roche Diagnostics bestätigt werden (3.2.3.2), wobei die Abweichung der beiden Methoden etwa 11% beträgt.
Ergebnisse 23
Abb. 3: Kompetitive PCR
A: Die bei der kompetitiven PCR amplifizierte Region liegt zwischen den Genen LAMB2 und PPV1 (19p13.3). Das Kompetitor-Molekül trägt ein 20 bp Insert in der Mitte (hellgraue Balken).
B: Die PCR mit den Primern Q-EF und Q-ER ergibt Produkte von 153 bp (Plasma-DNA) bzw. 173 bp (Kompetitor-DNA). Bei einem Verhältnis der beiden Produkte von 50% (*) ist die eingesetzte Plasma-DNA-Menge gleich der des Kompetitors.
4.1.1 Quantifizierung der Plasma-DNA von Kontrollpersonen
Mit Hilfe dieser Methode erfolgte zunächst die Quantifizierung der frei zirkulierenden DNA im Plasma von gesunden Kontrollpersonen. Es zeigte sich, dass die Plasma-DNA-Mengen von 14 Kontrollpersonen einen Mittelwert von nur 3,14 ng DNA/ml Plasma aufweisen, wobei die meisten Personen keine nachweisbare DNA im Plasma aufweisen (Abb. 4). Die Nachweisgrenze der kompetitiven PCR liegt bei etwa 2 ng DNA/ml Plasma. Den höchsten Spiegel an Plasma- DNA zeigt Kontrollperson 7 mit 15 ng DNA/ml Plasma (Abb. 4).
Ergebnisse 24
Abb. 4: Plasma-DNA in gesunden Kontrollpersonen
Gezeigt sind die Plasma-DNA-Mengen von 14 Kontrollpersonen wie sie über kompetitive PCR ermittelt wurden. Die genauen Werte der einzelnen Personen sind in Tab. 4 im Anhang aufgelistet.
4.1.2 Quantifizierung der DNA im Plasma von Tumorpatienten
Die DNA-Mengen im Plasma von 30 Tumorpatienten mit unterschiedlichen Tumorarten (siehe Tab. 1 auf Seite 39), die sich ausnahmslos in einem sehr weit fortgeschrittenen Stadium der Krebserkrankung befinden und in der Mehrzahl bereits Fernmetastasen aufweisen, liegen im Mittel bei 219 ng DNA/ml Plasma. Dabei zeigen die ermittelten DNA-Werte eine starke Streuung in einem Bereich von 10 ng/ml bis 1200 ng/ml (siehe Abb. 5), sind aber – mit Ausnahme des einen Patienten mit Kopf-Hals-Tumor (C12) mit nur 10 ng/ml Plasma-DNA – stets höher als die der Kontrollpersonen (Abb. 4).
Abb. 5: Plasma-DNA-Quantifizierung der 30 Tumorpatienten
Über kompetitive PCR ermittelte Plasma-DNA-Mengen von 30 Tumorpatienten. Die genauen Werte der Plasma-DNA finden sich zusammen mit den klinischen Daten und den Code-Bezeichnungen der Patienten in Tab. 1 auf Seite 39.
Ergebnisse 25
Werden diese Ergebnisse nach Art des Primärtumors geordnet, so fällt auf, dass die Werte auch innerhalb einer Tumorart weit streuen (Abb. 6). Eine Korrelation zwischen den Konzentrationen der DNA im Plasma und der klinischen Situation der Patienten kann also nicht beobachtet werden. Beispielsweise weisen die Patienten C14 und C20, die beide an fortgeschrittenem Pankreas-Karzinom leiden, sehr unterschiedliche Mengen an DNA im Plasma auf: Patient C20 besitzt nur 48 ng DNA/ml, während bei Patient C14 1200 ng DNA/ml Plasma nachgewiesen wurden (Abb. 6; Tab. 1 auf Seite 39).
Abb. 6: DNA-Mengen im Plasma von Tumorpatienten geordnet nach Tumorart
Gezeigt sind die Plasma-DNA-Mengen von Tumorpatienten bzw.
Kontrollpersonen wie sie durch kompetitive PCR ermittelt wurden.
Die Tumorpatienten sind nach der jeweiligen Lage des Primärtumors geordnet. Kontrollen: 14 gesunde Kontrollpersonen.
Ergebnisse 26
Ein erhöhter Spiegel an DNA im Plasma ist also ein Charakteristikum der meisten, aber nicht aller Krebserkrankungen, wobei die Werte der einzelnen Individuen unabhängig von der Art des Primärtumors und der klinischen Situation stark streuen (Abb. 6).
4.2 Tumorzellen als Quelle der Plasma-DNA von Tumorpatienten
Patienten mit Tumorerkrankungen weisen erhöhte Mengen an DNA im Plasma auf (4.1.2, Leon et al., 1977a; Stroun et al., 1989; Silva et al., 1999). Eine Hypothese für dieses Phänomen besagt, daß die DNA aus Tumorzellen stammt, die infolge des Tumorwachstums zugrunde gehen (Anker et al., 1999). Wenn der Zellinhalt dieser Zellen teilweise in die Blutbahn gelangt, würde sich die Tumor-DNA im Plasma anreichern und wäre mit den üblichen Methoden der Mutationsdetektion nachweisbar. Aus diesem Grund wurde die Plasma-DNA der 30 Tumorpatienten im Folgenden auf genetische Veränderungen in den häufigsten Tumorsuppressor-Genen bzw. Proto- Onkogenen analysiert.
4.2.1 Mutationen im TP53 Tumorsuppressor-Gen
Zunächst wurde die Plasma-DNA der 30 verschiedenen Tumorpatienten auf Mutationen im p53 (TP53) Tumorsuppressor-Gen untersucht, da Mutationen in TP53 mit einer Häufigkeit von über 50 Prozent aller Krebsfälle die häufigsten genetischen Veränderungen menschlicher Tumoren darstellen (Soussi, 2000a). Das Gen kodiert für das Tumorsuppressor-Protein P53, das unter anderem eine wichtige Funktion bei der Apoptose-Induktion bzw. der Reparatur geschädigter Zellen besitzt (Yonish-Rouach et al., 1991). Die kodierende Region des TP53-Gens weist neben einigen häufig mutierten Codons wie Codon 175, 248 und 273 keine klar definierten Hotspots für Mutationen auf; allerdings liegt die Mehrzahl der bekannten Mutationen in der spezifischen DNA-Bindedomäne des Gens (Malkin, 1994; Soussi et al., 2000b). Daher wurde bei den Plasma- DNA-Proben der Tumorpatienten dieser gesamte Bereich des Gens, der sich von Exon 5 bis 8 erstreckt, mit Hilfe von PCR amplifiziert. Die erhaltenen drei PCR-Produkte wurden dann direkt sequenziert (3.2.4.1).
Es zeigte sich jedoch, dass bei keinem der 15 untersuchten Patienten durch direkte Sequenzierung der Plasma-DNA eine Mutation in TP53 nachgewiesen werden konnte (siehe Tab. 1 auf Seite 39). Das Tumorgewebe war nur von 6 Patienten vorhanden, daher konnte nur die DNA dieser Gewebeproben analysiert werden, die allerdings keine Mutation in TP53 aufweist. In einem Kontrollversuch, bei dem vor der PCR verschiedene Mengen DNA mit einer
Ergebnisse 27
definierten homozygoten Mutation mit normaler DNA versetzt wurden, konnte allerdings gezeigt werden, daß ein Drittel der eingesetzten DNA eine gegebene Mutation aufweisen muß, damit sie als solche bei der Auswertung erkannt wird. Es läßt sich also sagen, daß – unter anderem auf Grund der wenig sensitiven Methode des direkten Sequenzierens von PCR-Produkten – im Plasma von 15 Patienten keine Mutation in p53 nachweisbar ist.
4.2.2 Mutationen im KRAS Onkogen
Ein Gen, das ebenfalls sehr häufig bei verschiedenen Tumoren mutiert ist, stellt das KRAS (K- ras) Onkogen dar (Minamoto et al., 2000). Beim Pankreas-Karzinom liegt die Häufigkeit sogar bei über 90 Prozent (Longnecker und Terhune, 1998; Bos, 1989). Das K-ras-Protein, das zu der Familie der GTPasen gehört, ist an der Plasmamembran lokalisiert und hat eine wichtige Funktion innerhalb des Signalweges von der Zelloberfläche zum Zellkern (Hernandez-Alcoceba et al., 2000).
Wie bei TP53 (4.2.1) konnte auch in KRAS bei keinem der 25 untersuchten Tumorpatienten durch direkte Sequenzierung der Exons 1 und 2 eine Mutation nachgewiesen werden. Daher wurde im Folgenden eine hoch sensitive Methode verwendet, die MASA-PCR (mutant allele specific amplification; 3.2.4.2). Die Besonderheit dieser Methode ist die Verwendung mutations- spezifischer Primer, die selektiv nur mutierte Allele des KRAS Onkogens amplifizieren (Abb.
7A), sodass eine Mutation auch in Anwesenheit eines Überschusses an normaler DNA nachweisbar ist. Das K-ras-Onkogen besitzt einige klar definierte Hotspots für Mutationen:
Codons 12, 13, und 61. Von diesen finden sich bei vielen verschiedenen Tumorarten am häufig- sten Mutationen in Codon 12 (Bos, 1989). Deshalb wurde die Plasma-DNA der Tumorpatienten in sieben verschiedenen PCR-Ansätzen mit den sechs sequenzspezifischen Vorwärts-Primern für alle möglichen Mutationen an Position 1 oder 2 des Codons 12 und – als PCR-Kontrolle – mit dem Wildtyp-Vorwärtsprimer amplifiziert (Abb. 7A, B). Der Rückwärtsprimer der sieben Ansätze war jeweils identisch.
Ergebnisse 28
Abb. 7: Nachweis von Mutationen im KRAS Onkogen über MASA-PCR
A: Codon 12 (GGT) kann an Position 1 bzw. 2 (*) eine Mutation aufweisen. Die mutierte DNA wird selektiv mit mutationsspezifischen Vorwärts-Primern für die 1. oder die 2 Position amplifiziert. Wt, Wildtyp-Primer.
B: Alle MASA-Ansätze der Plasma-DNA von Patient C15 mit Colon-Karzinom. M, Größenmarker in bp.
C: MASA von Patient T1 mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (non small cell lung cancer, NSCLC). Gezeigt ist das Ergebnis der MASA mit Vorwärtsprimer 1C. Wt, Wildtyp-Primer. Ko, Lymphozyten-DNA einer Kontrollperson. Plasma / Tumor: DNA aus Plasma bzw. Tumorgewebe des Patienten.
Mit dieser Methode wurde die Plasma-DNA der 30 verschiedenen Tumorpatienten auf Mutationen in KRAS untersucht. Es konnte jedoch nur bei einem Patienten, T1, mit nicht- kleinzelligem Lungen-Karzinom (NSCLC) eine Mutation detektiert werden (Abb. 7C; Tab. 1 auf Seite 39). Dieser Patient weist sowohl in der Tumor-DNA als auch in der Plasma-DNA eine Mutation in Codon 12 von GGT nach CGT auf. In Abb. 7C ist das Ergebnis der MASA mit dem mutationsspezifischen Primer 1C gezeigt. Es resultiert bei Amplifikation der Tumor-DNA als auch der Plasma-DNA des Patienten ein PCR-Produkt von 95 bp. Der Basenaustausch bedingt einen Austausch von Glycin nach Valin in diesem Codon. Bei Lungenkrebs liegt die Inzidenz von KRAS-Mutationen bei 30% (Bos, 1989). Die Analyse dieses Patienten zeigt, daß ein Teil der Plasma-DNA aus dem Tumorgewebe stammt, da im Plasma die gleiche KRAS-Mutation detektiert wurde wie in den Tumorzellen.
Ergebnisse 29
4.2.3 Hypermethylierung des CDKN2A Tumorsuppressor-Gen-Promotors
Ein sehr häufiges genetisches Kennzeichen von Tumorzellen ist neben Mutationen in Proto- Onkogenen oder Tumorsuppressor-Genen die Stillegung ganzer Gene über eine Änderung des Methylierungsstatus. Ein Beispiel hierfür ist die Hypermethylierung der Promotorregion des CDKN2A Tumorsuppressor-Gens, die im Folgenden untersucht wurde. Das Gen CDKN2A kodiert für einen Inhibitor von Cyclin-abhängigen Kinasen, p16INK4A, und spielt eine wichtige regulatorische Funktion im Zellzyklus (Serrano et al., 1993). Es ist bekannt, daß der CDKN2A Genpromotor in einer großen Zahl von menschlichen Krebsarten hypermethyliert und somit inaktiviert ist (Merlo et al., 1995; Baylin et al., 1998; Liggett und Sidransky, 1998).
Der Methylierungsstatus des CDKN2A Promotors in der Plasma-DNA der Tumorpatienten wurde mittels methylierungs-spezifischer PCR (MSP) untersucht (3.2.5.3). Der Vorteil dieser Methode liegt darin, daß unmethylierte und hypermethylierte DNA nebeneinander nachgewiesen werden, so daß man bereits abschätzen kann, wie groß der Anteil der tumor-spezifischen DNA in den jeweiligen Plasma-DNA-Proben ist. Der erste Schritt der Prozedur ist eine Desaminierung aller Cytosin-, nicht aber 5-Methylcytosinreste durch Natrium-Bisulfit (Herman et al., 1996a, 3.2.5.2). Durch die Bisulfit-Behandlung erhalten unmethylierte CpG-Inseln stromaufwärts des CDKN2A Gens mehrere Uracilreste, während hypermethylierte Bereiche ihre 5-Methylcytosine behalten. In der darauffolgenden methylierungs-spezifischen PCR werden durch die Verwendung von spezifischen Primern entweder die unmethylierten oder die hypermethylierten Sequenzen des CDKN2A Gens amplifiziert (Herman et al., 1996a; 3.2.5.3).
Mit Hilfe dieser methylierungs-spezifischen PCR wurden 25 Plasma-DNA-Proben und teilweise Tumorgewebeproben verschiedener Tumorpatienten untersucht. Die Ergebnisse der methylierungs-spezifischen PCR einiger Patienten und Kontrollen sind in Abb. 8 gezeigt. Als Kontrollen für unmethylierte CDKN2A-Promotorsequenzen wurde DNA einer menschlichen Fibroblasten-Zellline (NHDF) verwendet. Diese DNA ergibt nur mit den Primern für die unmethylierte Promotorregion ein Produkt (Abb. 8A). Als Kontrolle für die methylierte CDKN2A-Promotorregion wurde in vitro methylierte Lymphozyten-DNA verwendet, die mit Hilfe einer CpG-Methylase hergestellt wurde (3.2.5.1). Diese methylierte DNA ergibt nur mit den Primern für die methylierte Promotorregion ein Produkt (Abb. 8A).
Bei 11 der 25 untersuchten Patienten mit unterschiedlichen Primärtumoren (44%) konnte eine Hypermethylierung der CDKN2A-Promotorregion im Plasma detektiert werden. Exemplarisch sind die Ergebnisse der methylierungs-spezifischen PCR der Patienten C11, C12 und T2 in Abb.
Ergebnisse 30
8B gezeigt. Die Plasma-DNA von Patient C11 weist nur in der unmethylierten Reaktion ein PCR-Produkt auf, nicht aber in der methylierten Reaktion (Abb. 8B). Es liegt bei diesem Patienten also keine CDKN2A-Hypermethylierung im Plasma vor. Patient C12 dagegen zeigt PCR-Produkte bei beiden Ansätzen, weist also zu einem gewissen Anteil der DNA Hypermethylierung des CDKN2A-Promotors auf (Abb. 8B). Von Patient T2 lag neben der Plasmaprobe noch ein Stück des Tumorgewebes vor. Sowohl die Plasma-DNA als auch die Tumor-DNA weist bei diesem Patienten eine Hypermethylierung von CDKN2A auf (Abb. 8B).
Alle positiven Plasma-DNA-Proben enthalten stets sowohl methylierte als auch unmethylierte CDKN2A-Promotor-Sequenzen, wie in Abb. 8B exemplarisch gezeigt.
Abb. 8: Detektion von Hypermethylierung des CDKN2A-Promotors über methylierungs-spezifische PCR A: Methylierungs-spezifische PCR von Kontrollen: NHDF, menschliche Fibroblasten-Zelllinie; HeLa-Zellen und in vitro methylierte DNA (3.2.5.1). U, M: unmethylierte bzw. methylierte PCR-Reaktion.
B: MSP einiger repräsentativer Plasma-DNA-Proben (Patienten-Codes siehe Tab. 1 auf Seite 39).
