Alle verwendeten Methoden werden, sofern nicht beschrieben, nach Sambrook et al. (1989) durchgeführt. Die PCR-Amplikation erfolgt, wenn nicht anders angegeben, mit Ready To Go PCR Beads der Firma Pharmacia in einem Gesamtvolumen von 25 µ l; für die PCR-Reaktion werden je 25 pmol von jedem Primer zugesetzt.
3.2.1 Isolierung von Plasma
Peripheres, venöses Blut der Kontrollpersonen und Tumorpatienten wird in Monovetten mit EDTA als Antikoagulans gesammelt. Die Trennung des Blutplasmas von den Blutzellen erfolgt durch einen 20 minütigen Zentrifugations-Schritt bei 3000 rpm. Das Plasma wird mit Hilfe einer Plastik-Pasteurpipette vorsichtig abgenommen ohne die zelluläre Fraktion zu berühren. Die Plasmaproben werden bis zur DNA-Isolierung bei – 20° C aufbewahrt.
3.2.2 DNA-Isolierung aus Patientenproben
3.2.2.1 Plasmaproben
Für die DNA-Aufreinigung aus Plasma wird der QIAamp Blood Kit der Firma Qiagen (Hilden;
Deutschland) verwendet. Dafür wird die DNA aus 2 bis 10 ml Plasma nach dem Protokoll für Blut- und Körperflüssigkeiten durch wiederholte Zentrifugationsschritte an eine Säule gebunden.
Die Elution der DNA erfolgt mit 50 µ l Elutionspuffer (AE). Die gewonnene DNA wird aliquotiert bei -20° C aufbewahrt.
3.2.2.2 Gewebeproben
Das Tumorgewebe der Krebspatienten wird bei der Resektion gesammelt und in 10%
gepuffertem Formalin fixiert. Da Formalin durch die Quervernetzung der Proteine an die DNA die PCR inhibiert, erfolgt ein Waschschritt von 3 h in PBS, um das Formalin zu entfernen.
Sodann wird die DNA des Gewebes mit Hilfe des DNeasy Tissue Kit (Qiagen) isoliert. Die Elution erfolgt in 100 µ l Elutionspuffer (AE). Die gewonnene DNA wird bis zur Verwendung bei –20° C aufbewahrt.
Material und Methoden 13
3.2.3 Quantifizierung der Plasma-DNA
3.2.3.1 Kompetitive PCR
Die Quantifizierung der DNA im Plasma von Kontrollpersonen und Tumorpatienten erfolgt zum Teil mittels kompetitiver PCR nach der Methode von Diviacco et al. (1992). Dabei wird ein Fragment des menschlichen LAMB2 Genlokus amplifiziert (Region B48; Biamonti et al., 1992), als typisches Beispiel für ein Einzelkopie-Gen. Die Herstellung des Kompetitor-Moleküls erfolgt mit Hilfe von drei PCR-Reaktionen, bei denen ein 20 bp langes Insert in ein DNA-Fragment eingebracht wird, das dieselben Primererkennungssequenzen besitzt wie die genomische DNA in dieser Region (Diviacco et al., 1992). Die Konzentration der Kompetitor-Moleküle wird nach Entfernung der PCR-Primer und der freien Nukleotide durch Verwendung des QIAquick PCR Purification Kit der Firma Qiagen über die optische Dichte bei 260 nm bestimmt. In der darauffolgenden kompetitiven PCR werden steigende Mengen an Kompetitor-Molekülen mit einer konstanten Menge aufgereinigter Plasma-DNA koamplifiziert. Für die Amplifikation der beiden Templates werden zwei neu entworfene, eingerückte Primer verwendet: 5’-TCCAAT-GATTTGTAATATAC-3’ (Q-EF) und 5’-ATCTTTCTTAGACATCCGCTT-3’ (Q-ER). Die PCR erfolgt in 40 Zyklen: 94°C 1 min, 52°C 1 min, 72°C 1 min. Nach der Amplifikation werden die beiden Produkte von 153 bp und 173 bp, die dem genomischen bzw. Kompetitor-Template entsprechen, auf einem 6% Polyacrylamid-Gel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid unter UV visualisiert. Eine gleiche Bandendicke der beiden Produkte läßt den Schluss zu, dass in diesem Ansatz zu Beginn gleiche Mengen an Kompetitor-Molekülen - wie an genomischem Template vorlagen. Die Plasma-DNA-Konzentration kann so über die ermittelten genomischen Einheiten errechnet werden. Eine genomische Einheit entspricht dabei 330 ng DNA. Die Ergebnisse der kompetitiven PCR konnten mit Hilfe der Quantifizierung über Realtime-PCR bestätigt werden.
3.2.3.2 Realtime-PCR
Die Quantifizierung der Plasma-DNA über Realtime-PCR wird im LightCycler-Gerät der Firma Roche Diagnostics durchgeführt. Für die Quantifizierung von Plasma-DNA wird der LightCycler Control Kit DNA verwendet, bei dem ein 110 bp großes Fragment des menschlichen β-Globin-Gens amplifiziert wird. Das Produkt wird während der Realtime-PCR durch Fluoreszenz detektiert, indem man entweder den doppelstrang-bindenden Farbstoff SYBR Green I oder ein spezifisches Paar Hybridisierungssonden (LCRed640) des Kits verwendet. In die Realtime-PCR werden bei einem Gesamtvolumen von 20 µ l jeweils 4µ l Plasma-DNA eingesetzt. Als Standard
Material und Methoden 14
wird eine Verdünnungsreihe von menschlicher genomischer DNA aus dem Kit bei jedem PCR-Lauf gleichzeitig mit den Plasma-DNA-Proben amplifiziert. Die PCR erfolgt in einem Gesamtvolumen von 10 µ l mit jeweils 2 µ l der gewonnenen Plasma-DNA-Lösung. Das PCR-Programm mit den jeweiligen Temperaturen der einzelnen Zyklen wird dem Vorschlag aus dem Kit entnommen. Die Auswertung der Quantifizierung erfolgt mit Hilfe der Software des LightCyclers, der die Konzentration der Standards gegen den Schnittpunkt ihrer logarithmischen Fluoreszenzkurven mit einer Basislinie (Crossing Point) aufträgt. Mit Hilfe dieser Standardgerade berechnet die Software des Gerätes die Anzahl der genomischen Einheiten bzw.
der eingesetzten Plasma-DNA.
3.2.4 Detektion von Mutationen
3.2.4.1 Mutationen in TP53
Die Suche nach Mutationen im TP53 Tumorsuppressor-Gen erfolgt über eine Sequenzierung des gesamten Hotspotbereiches, der sich von Codon 126 bis 307, also von Exon 5 bis einschließlich Exon 8 erstreckt. Dafür wird die aufgereinigte Plasma- bzw. Tumor-DNA der Patienten in 3 PCR-Ansätzen mit drei Primerpaaren amplifiziert: 5’-TATCTGTTCACTTGTGCCCT-3’
(p53-5F) und 5’-TGACAACCACCCTTAACCCCT-3’ (p53-5R) für die Amplifikation der Exons 5 und 6, 5’-TGCTTGCCACAGGTCTCCCCAA-3’ (p53-7F) und 5’-AGAGGCTGGG-GCACAGCA-3’ (p53-7R) für Exon 7 und 5’-TGATTTCCTTACTGCCTCTT-3’ (p53-8F) und 5’-AGGCATAACTGCACCCTTGGT-3’ (p53-8R) für Exon 8. Es werden je 35 PCR-Zyklen durchlaufen: 94°C 1 min, 62°C 1 min, 72°C 1 min (Exon 5, 6) bzw. 94°C 18 s, 53°C 12 s, 72°C 30 s (Exons 7 und 8). Die PCR-Produkte mit den Größen 483 bp, 222 bp und 235 bp werden vor der Sequenzreaktion mit dem QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) aufgereinigt.
Die Sequenzreaktion wird mit Hilfe des Thermo Sequenase Fluorescent Labelled Primer Cycle Sequencing Kit (Pharmacia) durchgeführt. Es werden jeweils etwa 100 ng des aufgereinigten PCR-Produktes eingesetzt. Die verwendeten Sequenzierungsprimer sind am 5’-Ende mit dem Fluoreszenz-Farbstoff Cy5 markiert: 5’-TGCCCTGACTTTCAACTC-3’ und 5’-TCCTCCCAG-AGACCCCAGTT-3’ (für Exons 5 und 6), 5’-TCCCCAAGGCGCACTGGCCT-3’ (Exon 7) und 5’-TCTTGCTTCTCTTTTCCT-3’ (Exon 8). Die Sequenzierung findet in einem automatischen Sequenzierer (ALFexpress) der Firma Pharmacia statt.
Material und Methoden 15
3.2.4.2 K-ras-Mutationen
Für die Suche nach Mutationen im K-ras (KRAS) Onkogen werden zwei Strategien verwendet:
Direkte Sequenzierung von PCR-Produkten und MASA (mutant allele specific amplification) der aufgereinigten Plasma- bzw. Tumor-DNA. Zunächst werden die Exons 1 und 2 von KRAS mit den folgenden Primern amplifiziert: 5’-GACTGAATATAAACTTGTGGTAGT-3’ (Kras-1F) und 5’-CTATTGTTGGATCATATTCGTCC-3’ (Kras-1R) für Exon 1 und 5’-AGTA-ATTGATGGAGAAACCT-3’ (Kras-2F) und 5’-AACCCACCTATAATGGTGA-3’ (Kras-2R) für Exon 2. Es werden jeweils 35 PCR-Zylen durchlaufen (94°C 18 s, 53°C 12 s, 72°C 30 s). Die Produkte haben die Größen 107 bp bzw. 166 bp.
Für die Sequenzreaktion werden die beiden Produkte mit dem QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) aufgereinigt. Es werden jeweils etwa 100 ng des aufgereinigten PCR-Produktes in jede Sequenzreaktion eingesetzt. Die verwendeten Sequenzierungsprimer sind am 5’-Ende mit Cy5 fluoreszenzmarkiert: 5’-TGCCCTGACTTTCAACTC-3’ und 5’-TCCTCCCAGAGACCCC-AGTT-3’ (für die Exons 5 und 6), 5’-TCCCCAAGGCGCACTGGCCT-3’ (Exon 7) und 5’-TC-TTGCTTCTCTTTTCCT-3’ (Exon 8). Die Sequenzanalyse findet in einem automatischen Sequenzierer (ALFexpress) der Firma Pharmacia statt.
Bei der MASA-Methode, bei der mit Hilfe von mutationsspezifischen Primern selektiv mutierte DNA amplifiziert wird, wird das Codon 12 von KRAS auf Mutationen an Position 1 und 2 untersucht (Anker et al., 1997). Das PCR-Produkt von KRAS Exon 1 wird 1:106verdünnt. Von dieser Verdünnung werden je 5µ l für die zweite PCR eingesetzt: diese besteht aus 7 Ansätzen, die sich nur in dem mutationsspezifischen Vorwärtsprimer unterscheiden: ACTTGTGGTA-GTTGGAGCTGG-3’ (MASA-Wt), ACTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3’ (MASA-1A), 5’-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTT-3’ (MASA-1T), 5’-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTC-3’
(MASA-1C), 5’-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGA-3’ (MASA-2A), 5’-ACTTGTGGTAGTTG-GAGCTGT-3’ (MASA-2T) und 5’-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGC-3’ (MASA-2C). Als Rückwärtsprimer wird bei jedem der mutationsspezifischen Ansätze Kras-1R eingesetzt (siehe oben). Die PCR besteht aus 35 Zyklen: 94°C 30 s, 65°C 90 s, 72°C 30 s. Die Produkte weisen eine Größe von 95 bp auf und werden nach Auftrennung auf 6% Polyacrylamid-Gelen und Ethidiumbromid-Färbung sichtbar gemacht.
Material und Methoden 16
3.2.5 Analyse des Methylierungsstatus von CDKN2A
3.2.5.1 CpG-Methylierung der Positivkontrolle
Eine Positivkontrolle mit Hypermethylierung im Promotor-Bereich des CDKN2A Tumorsuppressor-Gens wird hergestellt, indem DNA von menschlichen Fibroblastenzellen (normal human dermal fibroblast cells, NHDF) in vitro mit der CpG Methylase der Firma New England BioLabs methyliert wird. Diese Methylase methyliert alle Cytosine in CpG-Dinukleotiden in der gesamten behandelten DNA.
3.2.5.2 Desaminierung der DNA durch Na-Bisulfit
Der Nachweis hypermethylierter CpG-Inseln in der Promoterregion des CDKN2A Tumorsuppressor-Gens erfolgt durch methylierungs-spezifische PCR nach Desaminierung der Plasma-DNA bzw. der Tumor-DNA durch Na-Bisulfit. Bei dieser Prozedur werden unmethylierte Cytosinreste zu Uracil desaminiert, methylierte Cytosine dagegen werden nicht desaminiert und bleiben Cytosine. Dafür wird der CpGenome DNA Modification Kit der Firma Intergen verwendet. Für die Untersuchungen im Laufe der Brustkrebsstudie wird die Desaminierung nach dem Rezept von Herman et al. (1996a) mit den folgenden Modifikationen durchgeführt: es wird zu der zu modifizierenden DNA 1 µg Fremd-DNA aus E.coli zugegeben, die Entfernung des Bisulfits nach der Inkubation bei 50°C über Nacht erfolgt mit Hilfe des QIAamp Blood Kit der Firma Qiagen und die Elution des DNA-Pellets nach Vollendung der Desaminierung erfolgt mit 50 µl 10 mM Tris pH 8.
3.2.5.3 Methylierungs-spezifische PCR
Die Plasma-DNA bzw. die DNA aus Tumorgewebe wird nach erfolgter Desaminierung mit Hilfe einer methylierungs-spezifischen PCR nach der Methode von Herman et al. (1996a) in zwei parallelen Ansätzen mit den beiden Primerpaaren p16-U und p16-M (Herman et al., 1996a) auf Hypermethylierung der Promotorregion des CDKN2A-Gens untersucht. Bei der Brustkrebs-Studie wird für die methylierte Reaktion ein anderes Primerpaar verwendet: 5’-GGTGGGGC-GGATCGC-3’ (P16-MF) und 5’-CCGAACCGCGACCGTAA-3’ (P16-MR).
Die PCR verläuft in 35 Zyklen (95°C 45 s, 65°C 45 s, 72°C 60 s). Die Produkte mit den Größen 151 bp (unmethyliertes Allel) bzw. 150 bp (methyliertes Allel) werden nach Elektrophorese auf einem 6% Polyacrylamid-Gel mit Ethidiumbromid unter UV sichtbar gemacht.
Material und Methoden 17
3.2.6 Quantifizierung von Tumor-DNA im Plasma
Bei den Tumorpatienten, die eine Hypermethylierung im Promotor-Bereich von CDKN2A im Tumorgewebe aufweisen, kann mit Hilfe einer entwickelten methylierungs-spezifischen Realtime-PCR der Anteil der Tumor-DNA an der gesamten DNA im Plasma bestimmt werden.
3.2.6.1 Plasma-DNA-Aufreinigung und Desaminierung der DNA
Die DNA der Patienten wird aus dem Plasma isoliert wie unter 3.2.2.1 beschrieben. Als Kontrolle für hypermethylierte CDKN2A-Sequenzen wurde DNA von Raji-Zellen verwendet (Burkitt-Lymphom-Zellen) bzw. in vitro methylierte DNA (3.2.5.1). Die Desaminierung der unmethylierten Cytosinreste erfolgt mit Natrium-Bisulfit, wie vor der normalen methylierungs-spezifischen PCR (3.2.5.3).
3.2.6.2 Quantitative methylierungs-spezifische PCR
Das Verhältnis zwischen DNA mit unmethylierter und hypermethylierter CDKN2A-Promotor-region im Plasma von Tumorpatienten wird mit methylierungs-spezifischer Quantifizierung im LightCycler System der Firma Roche Diagnostics durchgeführt. Für die Amplifizierung der unmethylierten DNA werden die Primer von Herman et al. (1996a) verwendet. Für die hypermethylierte p16-Region wird das folgende Set von PCR-Primern verwendet: 5’-GGT-GGGGCGGATCGC-3’ und 5’-CCGAACCGCGACCGTAA-3’. Für die Detektion der Realtime-PCR-Produkte werden LC-Red640 markierte Hybridisierungssonden verwendet, die ebenfalls methylierungs-spezifisch sind: Für die unmethylierte Reaktion 5’-CTCCCCACCACCCACTA-CCTACTCT-3’ (p16N FL) und 5’-CCCCTCTCCACAACCACCAAACAC-3’ (p16N LC), für die methylierte Reaktion 5’-CCGCCGCCCGCTACCTACTCT-3’ (p16M FL) und 5’-CCT-CTCCGCAACCGCCGAAC-3’ (p16M LC). Die PCR besteht aus 40 Zyklen (Denaturierung von 10 s bei 95°C, Annealing von 10 s bei 65°C bzw. 67°C, Extension von 10 s bei 72°C) und wird mit dem LightCycler FastStart DNA Master Hybridization Probes Kit von Roche Diagnostics durchgeführt. Es werden jeweils 4 µ l desaminierte Plasma-DNA in jedem PCR-Ansatz eingesetzt bei einem Gesamtvolumen von 20 µl. Für die Untersuchung der Proben der Brustkrebsstudie wird jeweils nur der halbe Ansatz verwendet, also 2 µl Plasma-DNA bei einem Gesamtvolumen von 10 µ l. Als Standards für die Quantifizierung der methylierten und unmethylierten CDKN2A-Region werden jeweils angegebene Mengen von desaminierter DNA aus Raji-Zellen (3.2.5.1) bzw. DNA aus normalen menschlichen Lymphozyten verwendet (3.2.6.1).
Material und Methoden 18
3.2.7 Nachweis von T-Lymphozyten-DNA im Plasma
Die Anwesenheit von T-Lymphozyten-DNA in den Plasmaproben der Tumorpatienten wird durch PCR-Amplifikation einer Region der beta-Kette des T-Zell-Rezeptors (TCR) untersucht, die ein somatisches Rearrangement durch VDJ-Rekombination aufweist (Zemlin et al., 1998).
Für die Amplifikation wird eine Mischung aus den beiden Vorwärtsprimern (Vßz5 und Vßz6) und einem Rückwärtsprimer (Jß1i) benutzt (Zemlin et al., 1998). Dies führt zur Amplifikation von DNA-Fragmenten definierter Größen (907, 767 und 155 bp), je nach rearrangiertem Jß-Element. DNA von Jurkat T-Lymphozyten, HeLa-Zellen und menschlichen Lymphozyten werden als interne PCR-Kontrollen verwendet. Die Germline-Konfiguration der TCR-Region, die alle Nicht-T-Lymphozyten aufweisen, wird ebenfalls mit spezifischen Primern amplifiziert:
5’-AATGATTCAACTCTACGGGA-3’ (G1F) und 5’-TGAGTCCTCCACTTGTGAG-3’ (G1R).
Bei der PCR ergibt sich ein Produkt von 250 bp. Bei beiden PCR-Reaktionen werden jeweils 100 ng DNA eingesetzt. Die PCR-Produkte werden mittels 6% Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und mit Ethidiumbromid unter UV visualisiert.
3.2.7.1 Nachweis von Endothelzell-DNA im Plasma
Um die Anwesenheit von Endothelzell-DNA im Plasma nachzuweisen, wird eine methylierungs-spezifische PCR-Methode etabliert. Nach Desaminierung der gereinigten Plasma-DNA durch Na-Bisulfit (CpGenome Modification Kit; Intergene; 3.2.5.2) wird eine methylierungs-spezifische PCR in der Promotorregion des Selectin E Gens (SELE) durchgeführt. Es werden zwei verschiedene Sets von Primern verwendet, die die unmethylierte von der hypermethylierten SELE Promotorregion unterscheiden. Für die Amplifikation der unmethylierten Allele werden die folgenden Primer verwendet: 5’-ATTTTAAGTATTGTGGATATTTTTG-3’ und CAA-AAACAACTAAACACTACTTCA-3’; für die Amplifikation der hypermethylierten Allele: 5’-TTTAAGTATCGTGGATATTTTCG-3’ und 5’-AAAAACAACTAAACACTACTTCG-3’. Die sequenzspezifischen Primer bedecken drei CpG-Inseln, von denen zwei am 3`-Ende der Primer liegen. Es werden 35 PCR-Zyklen durchgeführt (1 min 94°C, 1 min 50°C, und 1 min 72°C).
DNA von HeLa- bzw. HL60-Zellen und menschlichen Endothelzellen (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC) dienen als Negativ- bzw. Positivkontrollen. Die resultierenden PCR-Produkte mit einer Größe von 151 bp werden nach 6% Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Färbung mit Ethidiumbromid unter UV visualisiert.
Material und Methoden 19
3.2.8 Fragmentlängen-Bestimmung
Die Größenverteilung der Plasma-DNA-Fragmente wird untersucht, indem die DNA entweder markiert oder unmarkiert gelelektrophoretisch aufgetrennt und dann visualisiert wird.
3.2.8.1 Radioaktive Endmarkierung der Plasma-DNA einer Kontrollperson
Für die Bestimmung der Fragmente der Plasma-DNA einer gesunden Kontrollperson wird zunächst die freie DNA aus 600 µ l Plasma isoliert (3.2.2). Als Kontrolle wird genomische, zelluläre DNA derselben Person verwendet. Die DNA wird zunächst über Nacht bei 37°C dephosphoryliert, und nach einer Phenol-Chloroform-Extraktion über Nacht gefällt. Das Pellet wird in 24 µ l H2O gelöst. Für die Phosphorylierung der 5`-Enden wird die gesamte DNA in einem Endvolumen von 30 µl mit γ-ATP (P32) und T4 Polynukleotid-Kinase (8 Units/µ l) versetzt und 1 h bei 37°C inkubiert. Die freien radioaktiven Nukleotide werden durch Zentrifugation über Sephadex-Säulen entfernt. Die Analyse der Fragmente erfolgt über 1%
Agarose-Gelelektrophorese und darauffolgende Autoradiographie.
3.2.8.2 Fragmentlängen-Bestimmung der Plasma-DNA von Tumorpatienten
Die Bestimmung der Fragmentlängen von Plasma-DNA aus Tumorpatienten erfolgt ohne vorherige Markierung. 20 bis 30 µ l der Plasma-DNA werden nach der Extraktion (3.2.2) auf einem 6% Polyacrylamid-Gel aufgetrennt. Die Visualisierung der Fragmente erfolgt unter UV nach Färbung mit Ethidiumbromid.
3.2.9 In vitro Apoptose und Nekrose von Jurkat-T-Lymphozyten
Die Induktion von Apoptose und Nekrose in vitro erfolgt an Jurkat T-Lymphozyten. Die Zellen werden in RPMI1640-Medium mit 10% fetalem Kälberserum bei 37°C gezogen und werden alle 3 Tage durch 5-fache Verdünnung in frisches Medium umgesetzt. Vor der Induktion von Apoptose und Nekrose werden die Zellen durch Zentrifugation bei 190 g für 5 min pelletiert und zweimal in serumfreiem Medium (PBS pH 7,4) gewaschen. Nach dem zweiten Waschschritt werden die Zellen in serumfreiem Medium mit Zusatz von 2 mM Pyruvat resuspendiert. Jeder Ansatz enthält ca. 2 x 106 Zellen in 1 ml Volumen. Apoptose wird durch 1,2 µM Staurosporin ausgelöst; Nekrose durch 2,5 µM Oligomycin und 1,2 µM Staurosporin (Leist et al., 1997).
Zunächst werden die Zellen in PBS mit Pyruvat 30 min bei 37°C inkubiert, dann erfolgt die Zugabe von Oligomycin (Nekrose-Ansätze). Nach einer weiteren Inkubationszeit von 30 min
Material und Methoden 20
erfolgt dann die Zugabe von Staurosporin. Zu verschiedenen Zeiten nach Zugabe von Staurosporin werden die Zellen abgeschabt. Sodann wird der Überstand durch einen Zentrifugationsschritt bei 13 000 g für 2 min von den Zellen getrennt.
3.2.9.1 Isolierung der DNA aus dem Überstand
Die freigesetzte DNA der Überstände wird mit Hilfe des QIAamp Blood Kit der Firma Qiagen aufgereinigt wie die DNA aus Plasma (3.2.2). Die Elution erfolgt in je 60 µ l Elutionspuffer.
3.2.9.2 Quantifizierung der DNA aus dem Überstand
Die DNA-Konzentrationen in den verschiedenen Überständen werden mittels kompetitiver PCR quantifiziert (3.2.3.1). In jeden Ansatz werden 5µ l der eluierten DNA eingesetzt.
3.2.9.3 Apoptose-Nachweis: SAF-A-Spaltung
Die beiden unterschiedlichen Arten des Zelltodes werden bestätigt über Analyse der Spaltung des SAF-A (scaffold attachment factor) Proteins in den Proben, das nur während Apoptose, nicht aber während Nekrose durch die Caspase-3 gespalten wird (Göhring et al., 1997; Kipp et al., 2000). Dafür werden die Proteine der Zellen nach Abnahme des Überstandes für die DNA-Untersuchungen nach der Methode von Wessel und Flügge gefällt (Wessel und Flügge, 1984) und über ein 10% SDS-Polyacrylamid-Gel aufgetrennt (Lämmli, 1970). Nach einem Western-Transfer (Towbin et al., 1979) mit affinitäts-gereinigtem Antikörper und Peroxidase-gekoppeltem Sekundär-Antikörper (Sigma) erfolgt der Nachweis des SAF-A Proteins mit ECL (enhanced chemiluminescent detection) der Firma Amersham.
3.2.10 In vivo Apoptose und Nekrose bei Mäusen
Die Induktion von Leberzell-Apoptose wird durch intravenöse Injektion von 1 bzw. 2 µg anti-CD95 Antikörper (αanti-CD95, Klon Jo-2 der Firma PharMingen) pro Tier erreicht. Die Injektion erfolgt in einem Volumen von 300 µ l endotoxin-freier Salzösung mit Zusatz von 0,1%
menschlichem Serum-Albumin (Ogasawara et al., 1993; Hentze et al., 2000).
Nekrose der Leberzellen wird induziert durch intraperitoneale Injektion von 250 mg/kg Acetaminophen (Firma EGA) in 300 µ l endotoxine-freier Saline (Hentze et al., 2000). Nach verschiedenen Zeitpunkten werden die Mäuse durch intravenöse Injektion von 150 mg/kg
Material und Methoden 21
Pentobarbital mit Zusatz von 1,2 mg/kg Na-Citrat als Antikoagulans narkotisiert. Durch Herzpunktion wird den Mäusen Blut entnommen.
Das Ausmaß des Leberschadens wird durch Messung der Alanin-Aminotransferase (ALT) Aktivität mit einem EPOS 5060 Gerät (Netheler & Hintz) nach der Methode von Bergmeyer ermittelt (1983).
3.2.10.1 Plasma-Gewinnung und DNA-Isolierung
Das Plasma der Mäuse wird durch einen Zentrifugations-Schritt (5 min, 14000 g, 4°C) von den Zellen getrennt. Die DNA aus ca. 50 µl Plasma wird mit Hilfe des QIAamp Blood Kit der Firma Qiagen isoliert. Die Elution erfolgt in 50 µl Elutionspuffer (3.2.2.1).
3.2.10.2 Quantifizierung der Plasma-DNA
Die Quantifizierung der ins Plasma freigesetzten DNA erfolgt über Realtime-PCR mit dem LightCycler der Firma Roche Diagnostics. Dabei wird ein Teil des Exons 3 des alpha-Aktin-Gens amplifiziert. Die verwendeten Primer 5’-TGAACATGGCATCATCACC-3’ (Aktin-mouse-F) und 5’-CTGGATAGCCACATACATG-3’ (Aktin-mouse-R) ergeben ein Produkt von 199 bp.
Die Realtime-Quantifizierung wird mit dem SYBR-Green I Reaktionsmix (Roche Diagnostics) durchgeführt. Es werden jeweils 4 µ l der eluierten DNA in jeden PCR-Ansatz eingesetzt. Die PCR wird in 40 PCR-Zyklen durchgeführt (1 s 95°C, 5 s 55°C, und 10 s 72°C).
3.2.10.3 Fragmentlängen-Bestimmung der freigesetzten DNA
Die Bestimmung der Fragmentlängen der DNA erfolgt wie unter 3.2.8.2 angegeben, jedoch werden zur Auftrennung der Fragmente 1% Agarose-Gele verwendet.
Ergebnisse 22
4 Ergebnisse
Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit stehen zwei wichtige Fragen: aus welchen Zellen stammt die DNA im Plasma von Tumorpatienten und wie gelangt diese DNA in den Blut-kreislauf? Die Frage nach dem zellulären Ursprung der DNA im Plasma sollte durch eine Untersuchung der Plasma-DNA verschiedener Tumorpatienten erfolgen. Dafür wurde zunächst die Plasma-DNA von 30 Tumorpatienten unterschiedlicher Krebsarten analysiert (4.1 bis 4.6), und darauf aufbauend die DNA im Plasma von 28 Brustkrebs-Patientinnen (4.9). Die Frage nach dem Mechanismus der Freisetzung dieser DNA in den Blutkreislauf sollte an in vitro und in vivo Modellen beantwortet werden (4.7 bzw. 4.8). Im letzten Kapitel sollte weiterhin noch die Frage der Herkunft der DNA im Plasma von gesunden Menschen geklärt werden (4.10).