Sowohl nekrotischer als auch apoptotischer Zelltod in vitro bewirkt, dass DNA aus den sterbenden Zellen in die Umgebung abgegeben wird (4.7). Ob dies auch für die in vivo Situation gilt, d.h. ob zugrunde gehende Zellen im Organismus DNA freisetzen, die sich dann auch im Blutkreislauf wiederfindet, wurde an etablierten Mausmodellen untersucht. Dabei läßt sich Apoptose oder Nekrose der Leberzellen durch Injektion von anti-CD95 Antikörper (αCD95) bzw. Acetaminophen (Paracetamol) induzieren (Ogasawara et al., 1993; Leist et al., 1998;
Hentze et al., 2000). Der anti-CD95-Antikörper bindet an den Apoptose-Rezeptor CD95, der sich auf der Oberfläche der meisten Zellen befindet und induziert dadurch die Apoptose-Kaskade in der Zelle. Paracetamol dagegen bewirkt nekrotischen Tod von Leberzellen (Hentze et al., 2000).
4.8.1 Quantifizierung der freigesetzten Plasma-DNA
Nach Induktion von Apoptose bzw. Nekrose durch Injektion von anti-CD95 Antikörper bzw.
Acetaminophen wurde den Mäusen zu verschiedenen Zeitpunkten Blut entnommen (3.2.10).
Nach der Gewinnung von Plasma und darauffolgender Aufreinigung der Plasma-DNA (3.2.10.1) erfolgte die Quantifizierung der DNA über Realtime-PCR mit dem LightCycler System. In der Realtime-Reaktion wurden Primer verwendet, die ein 199 bp großes Stück des alpha-Aktin Gens der Maus amplifizieren (3.2.10.2).
Ergebnisse 48
4.8.1.1 Dosisabhängige Freisetzung von DNA ins Plasma bei Apoptose-Induktion
In einem ersten Versuch wurde bei sechs Mäusen Apoptose ausgelöst: eine Dreiergruppe erhielt eine Dosis von 1 µg αCD95, die andere von 2 µg pro Tier. Nach 0, 3, 4, 6 und 8 Stunden wurde den Mäusen Blut entnommen und die Plasma-DNA im LightCycler quantifiziert (3.2.10.2). Die Mittelwerte der Plasma-DNA-Konzentrationen beider Mäusegruppen über die Zeit sind in Abb.
17 gezeigt. Die genauen Messwerte befinden sich in Tab. 5 im Anhang.
Abb. 17: Dosisabhängige DNA-Freisetzung ins Plasma nach Apoptose-Induktion durch antiCD95-Antikörper
Gezeigt sind die Mittelwerte der Plasma-DNA-Konzentrationen von je 3 Mäusen nach Induktion von Apoptose mit 1 bzw. 2 µg antiCD95-Antikörper zu den angegebenen Zeitpunkten. Die Quantifizierung erfolgte über Realtime-PCR.
Die Ergebnisse der Quantifizierung nach Apoptose-Induktion zeigt, daß bei allen Mäusen nach etwa 4 Stunden eine dramatische Freisetzung der DNA ins Plasma stattfindet. Dabei ist eine klare Abhängigkeit der DNA-Freisetzung von der injizierten Dosis αCD95-Antikörper erkennbar. Nach 8 Stunden liegt der Mittelwert der Gruppe mit 1 µg αCD95 pro Individuum bei 6,1 µg DNA/ml Plasma, während er bei den Mäusen mit 2 µg αCD95 bei dem Zehnfachen, also bei 71 µg DNA/ml Plasma liegt. Parallel zum Anstieg der DNA im Plasma der Mäuse verlief
Ergebnisse 49
auch eine zunehmende Gewebeschädigung der Tiere, die von Hannes Hentze (AG Wendel;
Universität Konstanz) anhand einer Messung der Plasma-ALT-Mengen analysiert wurde.
4.8.1.2 Freisetzung von DNA ins Plasma nach Apoptose- und Nekrose-Induktion
Das Erscheinen von DNA im Plasma wurde daraufhin parallel zur Apoptose auch bei der Nekrose untersucht. Dafür wurde bei 3 Mäusen Nekrose der Leberzellen durch Injektion von 250 mg/kg Acetaminophen induziert, während 3 weiteren Mäusen für die Apoptose-Induktion je 2 µg αCD95-Antikörper pro Tier injiziert wurden (3.2.10). Nach 0, 3, 4, 6 und 8 h wurde den Apoptose-Mäusen Blut entnommen; bei den Nekrose-Mäusen nach 0, 3, 4 und 6 h. Die DNA wurde dann aus dem Plasma isoliert (3.2.10.1) und über Realtime-PCR quantifiziert (3.2.10.2).
Die Ergebnisse der Quantifizierung der einzelnen Mäuse sind in Tab. 6 im Anhang aufgeführt;
die Mittelwerte der Plasma-DNA-Konzentrationen der beiden Gruppen über die Zeit zeigt Abb.
18:
Abb. 18: DNA-Freisetzung ins Plasma bei Induktion von Apoptose und Nekrose in vivo
Gezeigt sind die Mittelwerte der DNA-Mengen im Plasma von je 3 Mäusen nach Apoptose- bzw. Nekrose-Induktion mittels antiCD95-Antikörper bzw. Acetaminophen zu den angegebenen Zeitpunkten nach Nekrose-Induktion des Zelltodes. Die DNA wurde mit Realtime-PCR quantifiziert.
Wie in Abb. 18 gezeigt, konnte ein deutlicher Anstieg der DNA im Plasma der mit αCD95 behandelten Mäuse verzeichnet werden. Das Erscheinen der Plasma-DNA 3 Stunden nach Apoptose-Induktion verlief parallel mit einem Ansteigen des Leberschadens gemessen anhand der von Hannes Hentze bestimmten Alanin-Aminotransferase (ALT) Aktivität im Plasma (3.2.10). Die Ergebnisse der Plasma-DNA-Quantifizierung der Mäuse nach Injektion von Acetaminophen sind ebenfalls in Abb. 18 gezeigt. In diesem Nekrose-Modell verläuft der Anstieg der Plasma-DNA mit ähnlicher Kinetik wie bei der des Apoptose-Modells, erreicht aber
Ergebnisse 50
deutlich höhere DNA-Werte. So werden 6 h nach Nekrose-Induktion über 150 µg DNA/ml Plasma gemessen, während es bei dem Apoptose-Modell zu dieser Zeit nur 12 µg DNA/ml Plasma sind.
4.8.2 Fragmentlängen-Bestimmung der Plasma-DNA
Ein Anteil der DNA der durch Apoptose oder Nekrose zugrunde gegangenen Leberzellen der Mäuse erscheint also im Blutkreislauf. Um diese DNA näher zu charakterisieren, wurde eine Analyse der Fragmentlängen dieser ins Plasma freigesetzten DNA durchgeführt (3.2.10.3).
Aufgrund der hohen DNA-Konzentrationen konnte die DNA ohne vorhergehende Markierung analysiert werden. Die DNA aus 25-50 µ l Plasma des vorherigen Versuches (4.8.1.2) wurde zu diesem Zweck isoliert (3.2.10.1), auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid angefärbt (3.2.10.3). Die Fragmentlängen der Plasma-DNA der Mäuse nach Apoptose- bzw.
Nekrose-Induktion sind in der folgenden Abbildung gezeigt (Abb. 19).
Abb. 19: Analyse der DNA-Fragmente nach in vivo Apoptose und Nekrose
Fragmente der freigesetzten DNA zu den angegebenen Zeitpunkten nach Induktion von Leberzell-Apoptose (links) bzw. Leberzell-Nekrose (rechts). M: Größenstandard in bp. Mo, Di: Mono- bzw. Dinukleosomale DNA-Fragmente.
Ergebnisse 51
Im Plasma der Mäuse, bei denen Apoptose der Leberzellen induziert wurde, sind über die Zeit steigende Mengen an DNA-Fragmenten im Plasma erkennbar, die die Größe von mono- bzw.
dinukleosomaler DNA aufweisen (Abb. 19, links). Im Gegensatz dazu findet sich im Plasma der Mäuse mit Leberzell-Nekrose ein ebenfalls zeitabhängiger Anstieg von DNA-Fragmenten, die größer sind als 10 000 bp. (Abb. 19, rechts). Es findet also sowohl bei apoptotischem als auch bei nekrotischem Zelltod eine dramatische Zunahme von frei zirkulierender DNA im Plasma statt, deren Fragmentlängen sich jedoch deutlich voneinander unterscheiden.