In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Tumorpatienten erhöhte Mengen an DNA im Plasma aufweisen und dass die DNA-Menge im Plasma mit der Größe des Primärtumors korreliert. Allerdings ist die Anwesenheit einer gesteigerten DNA-Menge im Plasma kein Zeichen dafür, dass ein Tumor im Körper vorliegt, da auch Patienten mit anderen Erkrankungen wie Rheuma oder Autoimmunerkrankungen einen erhöhten Spiegel an DNA im Plasma aufweisen (Leon et al., 1975; Leon et al., 1977b; Raptis und Menard, 1980; Rumore und Steinman, 1990). Auf der anderen Seite ist aber auch ein niedriger Plasma-DNA-Wert kein Beweis dafür, dass kein Tumor vorliegt, da einige Patienten trotz fortgeschrittener Erkrankung keinen erhöhten DNA-Spiegel im Plasma aufweisen. Eine Detektion von Mutationen oder anderen genetischen Veränderungen in der DNA dagegen könnte für eine mögliche Frühdiagnose von Tumoren im Rahmen der Krebsvorsorge insbesondere familiär vorbelasteter Menschen von medizinischem Nutzen sein. Allerdings müsste dafür die Zahl der untersuchten Gene sehr hoch, und die Methode der Detektion genügend sensitiv sein, wie an der Studie mit den Brustkrebs-Patientinnen zu sehen ist, die weniger als 10% methylierte DNA aus dem Tumor in ihrem Plasma aufweisen. Die vorgestellte Quantifizierung von Tumor-DNA im Plasma könnte sich für eine Therapieverfolgung von Patienten als hilfreich erweisen, da ein Tumorrezidiv mit dieser Methode eventuell schneller erkennbar wäre als mit den herkömmlichen Methoden.
Allerdings müsste auch für diesen Zweck eine Vielzahl von Onkogenen oder Tumorsuppressor-Genen analysiert werden, um bei möglichst vielen Patienten genetische Veränderungen zu detektieren. Ungeachtet der aufgeführten methodischen Schwierigkeiten ist die Analyse der Plasma-DNA von primärem Interesse für die moderne Biomedizin, da nunmehr eine nicht invasive Methode verfügbar ist und somit bei vielen Menschen routinemäßig durchgeführt werden könnte. Darüber hinaus gibt es auch Bestrebungen, die fötale DNA, die sich im Plasma werdender Mütter findet (Lo et al., 1997), auf Gendefekte zu untersuchen, was ebenfalls nicht invasive Alternative zur Fruchtwasseruntersuchung darstellen würde. Aus diesen Gründen wird das Thema Plasma-DNA in der Zukunft, wenn noch mehr über dieses Thema bekannt ist, vielleicht eine wichtige Verwendung in der modernen medizinischen Diagnostik finden.
Zusammenfassung 80
6 Zusammenfassung
Im Blutplasma von Tumorpatienten zirkulieren DNA-Fragmente, von denen viele klinisch orien-tierte Studien berichten, aber von denen bisher keine genauere Charakterisierung erfolgt ist.
Besonders der Ursprung der Plasma-DNA oder der Mechanismus über den die DNA in die Blutzirkulation gelangt, waren bisher unbekannt. In der vorliegenden Arbeit konnte die DNA im Plasma von Tumorpatienten mit Hilfe von kompetitiver PCR und Realtime-PCR quantifiziert werden. Es stellte sich nicht nur heraus, dass Tumorpatienten im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen deutlich erhöhte Spiegel an DNA im Plasma aufweisen, sondern es zeigte sich zudem auch, dass Patienten mit weiter fortgeschrittener Erkrankung und Fernmetastasen größere DNA-Mengen aufweisen als Patienten ohne Metastasen. Des weiteren konnte an Brustkrebs-Patientinnen eine Korrelation zwischen der DNA-Konzentration im Plasma und der Größe des Primärtumors identifiziert werden. In einer Studie mit Brustkrebs-Patientinnen zeigte sich, dass die präoperativ erhöhten Plasma-DNA-Mengen 3 Monate nach Tumorresektion wieder auf normale Werte fielen. Die Plasma-DNA wurde zusätzlich im Verlauf bzw. die Menge an Tumor-DNA im Plasma mit der Klinik der Patienten korreliert. Bei diesen Patientinnen, deren Klinik im Detail bekannt ist, wurde die Plasma-DNA im Verlauf der Therapie beobachtet. Eine nähere Charakterisierung dieser DNA zeigte, dass sich genetische Veränderungen in der freien DNA finden, die identisch mit denjenigen des Tumorgewebes sind. Da sich neben der mutierten Tumor-DNA stets auch Wildtyp-DNA im Plasma befindet, wurde eine Methode etabliert, die es ermöglicht, den Anteil der Tumor-DNA an der gesamten Plasma-DNA zu quantifizieren. Hierbei zeigte sich, dass die Mengen an DNA aus dem Tumor individuell weit streuen, dass aber Patienten mit Fernmetastasen höhere Anteile an DNA aus dem Tumor aufweisen als Patienten mit weniger weit fortgeschrittener Erkrankung. Die Anwesenheit von Tumor-DNA im Plasma konnte nur präoperativ festgestellt werden; 7 Tage nach Tumorresektion war auch die DNA aus dem Tumor verschwunden. Daraufhin wurde die der zelluläre Ursprung der Nicht-Tumor-DNA untersucht, wobei sich herausstellte, dass diese DNA meist nicht aus T-Lymphozyten und nie aus Endothelzellen stammt. Neben den Arbeiten an verschiedenen Tumorpatienten konnte in vitro und in vivo gezeigt werden, dass apoptotische und nekrotische Zellen DNA freisetzen und dass sich die Fragmentgrößen dieser freigesetzten DNA je nach Art des Zelltodes deutlich voneinander unterscheiden. Der Vergleich dieser DNA-Fragmente mit denen der Tumor-patienten und Kontrollpersonen lässt den Schluss zu, dass die DNA im Plasma aus apoptotisch bzw. nekrotisch zugrunde gegangenen Zellen stammt.
Abkürzungsverzeichnis 81
7 Abkürzungsverzeichnis
Abb Abbildung n nano (10-9)
ALT Alanin-Aminotransferase N Lymphknotenmetastasen
ATP Adenosintriphosphat NHDF normal human
bp Basenpaare dermal fibroblast cells
BSA Rinderserumalbumin NSCLC non small cell lung cancer
°C Grad Celsius OD Optische Dichte
CIS Carcinoma in situ OP Operation
DNA Desoxyribonukleinsäure p pico (10-12)
DNase Desoxyribonuklease p16 CDKN2A-Tumorsuppressor
dNTP Desoxynukleotid- p53 TP53-Tumorsuppressor
Triphosphat PCR Polymerase-Kettenreaktion
ECL Enhanced Chemolumi- PBS phosphatgepufferte
nescence Salzlösung
EDTA Ethylendiamin- R Rückwärtsprimer
Tetraessigsäure rpm Umdrehungen pro Minute
F Vorwärtsprimer SCLC small cell lung cancer
g Erdbeschleunigung SELE Selectin E
g Gramm T Staging des Tumors
h Stunden nach Größe des Primärtumors
HCC hepatocellular carcinoma Tab Tabelle
HUVEC human umbilical vein TCR T-Zell-Rezeptor
endothelial cell TIL tumor-infiltrierende
Abbildungsverzeichnis 82
8 Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Entstehung von Metastasen im Körper ... 3
Abb. 2: Angriff eines T-Lymphozyten auf eine Krebszelle ... 4
Abb. 3: Kompetitive PCR ... 23
Abb. 4: Plasma-DNA in gesunden Kontrollpersonen ... 24
Abb. 5: Plasma-DNA-Quantifizierung der 30 Tumorpatienten... 24
Abb. 6: DNA-Mengen im Plasma von Tumorpatienten geordnet nach Tumorart... 25
Abb. 7: Nachweis von Mutationen im KRAS Onkogen über MASA-PCR ... 28
Abb. 8: Detektion von Hypermethylierung des CDKN2A-Promotors über methylierungs-spezifische PCR . 30 Abb. 9: Spezifität der methylierungs-spezifischen Realtime-PCR ... 32
Abb. 10: Quantifizierung der Tumor-DNA im Plasma von Tumorpatienten ... 33
Abb. 11: PCR-Nachweis der DNA von T-Lymphozyten... 35
Abb. 12: Methylierungs-spezifische PCR der Promotorregion des Selectin E Gens (SELE)... 38
Abb. 13: Plasma-DNA-Fragmente einer gesunden Kontrollperson... 41
Abb. 14: Größe der DNA-Fragmente im Plasma einiger Tumorpatienten... 43
Abb. 15: DNA-Freisetzung von Jurkat T-Lymphozyten nach Induktion von Apoptose bzw. Nekrose... 45
Abb. 16: Detektion der SAF-A-Spaltung ... 46
Abb. 17: Dosisabhängige DNA-Freisetzung ins Plasma nach Apoptose-Induktion durch antiCD95-Antikörper ... 48
Abb. 18: DNA-Freisetzung ins Plasma bei Induktion von Apoptose und Nekrose in vivo... 49
Abb. 19: Analyse der DNA-Fragmente nach in vivo Apoptose und Nekrose ... 50
Abb. 20: Zeitpunkte der Blutabnahmen für die Brustkrebs-Studie... 52
Abb. 21: Präoperative Plasma-DNA-Mengen von 28 Brustkrebs-Patientinnen ... 53
Abb. 22: Plasma-DNA von 54 gesunden Frauen ... 54
Abb. 23: DNA im Plasma von Brustkrebs-Patientinnen im Therapieverlauf... 56
Abb. 24: Detektion von methylierten CDKN2A-Sequenzen im Plasma von drei Patientinnen... 58
Abb. 25: Anteile der methylierten DNA an der gesamten DNA ... 59
Abb. 26: DNA-Mengen im Plasma von 8 Patienten ohne Karzinom und 20 Patienten mit Karzinom... 62
Abb. 27: Korrelation zwischen Tumorgröße und präoperativer Menge an Plasma-DNA... 63
Abb. 28: Plasma-DNA im Verlaufe des weiblichen Zyklus... 65
Abb. 29: Plasma-DNA von drei Frauen unter steigender Östrogenexposition... 66
Abb. 30: DNA-Mengen im Plasma beider Tumorpatientengruppen... 68
Abb. 31: Prozentuale Anteile der methylierten Tumor-DNA im Plasma der Tumorpatienten... 72
Tabellenverzeichnis 83
9 Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Klinik und Zusammenfassung der Ergebnisse der 30 verschiedenen Tumorpatienten ... 39
Tab. 2: Ergebnisse der Plasma-DNA-Quantifizierung der 28 Brustkrebs-Patientinnen ... 55
Tab. 3: Klinik der 28 Brustkrebs-Patientinnen ... 61
Tab. 4: Plasma-DNA-Mengen von 14 Kontrollpersonen. ... 84
Tab. 5: In vivo Apoptose mit 1 bzw. 2 µg anti-CD95 pro Maus... 84
Tab. 6: In vivo Apoptose und Nekrose ... 84
Anhang 84
Zeit [h] 1 µg anti-CD95 2 µg anti-CD95
0 0,000046 0,00004 0,0000065 0,00024 0,00013 0,00017 3 0,001102 0,001112 0,001838 0,001438 0,00023 0,0044 4 0,0001 0,00002 0,04405 0,00548 0,00534 0,001557
6 0,1728 2,421 1,423 7,845 0,5993 0,3672
8 1,381 1,443 15,458 70,583 48,525 93,083
Tab. 5: In vivo Apoptose mit 1 bzw. 2 µg anti-CD95 pro Maus
Gezeigt sind die Ergebnisse der Plasma-DNA-Quantifizierungen in µg DNA/ml Plasma. Je 3 Mäuse erhielten 1 µg bzw. 2 µg anti-CD95 pro Tier.
Zeit [h] Nekrose Nekrose MW
Tab. 6: In vivo Apoptose und Nekrose
Apoptose: je drei Mäusen wurde 2 µg anti-CD95-Antikörper injiziert;
Nekrose: je drei Mäusen wurde 250 mg/kg Acetaminophen injiziert.
Zu den angegebenen Zeiten erfolgte eine Blutentnahme und die Quantifizierung der ins Plasma freigesetzten DNA. MW: Mittelwert.
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