Entwicklung eines zweidimensionalen, chromatographischen Trennverfahrens zur automatisierten Proteinreinigung

Volltext

(1)Entwicklung eines zweidimensionalen, chromatographischen Trennverfahrens zur automatisierten Proteinreinigung. vorgelegt von Diplom-Biotechnologe Christoph Peter. Vom Fachbereich 15 – Lebensmittelwissenschaft und Biotechnologie der Technischen Universität Berlin zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Naturwissenschaften - Dr. rer. nat. –. genehmigte Dissertation. Promotionsausschuss: Vorsitzender: Berichter: Berichter: Berichter:. Prof. Dr. rer. nat. Roland Tressl Prof. Dr.-Ing. Ulf Stahl PD Dr. rer. nat. Jörg Thömmes Dr. rer. nat. Jürgen Frevert. Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 26. April 2000. Berlin 2000 D 83.

(2) ´ ʿ Παντα ρɛĩ. Alles fließt (Platon zugeschrieben durch Heraklit von Ephesus)..

(3) Meinen Eltern.

(4) Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Ulf Stahl für die Unterstützung beim Erstellen dieser Arbeit. Herrn PD Dr. Jörg Thömmes danke ich für seine Bereitschaft, die Arbeit zu begutachten und für viele unschätzbare Hinweise im Verlauf ihrer Entstehung, die zu ihrem Gelingen beigetragen haben. Meinem direkten Vorgesetzten bei der BioteCon GmbH, Herrn Dr. Jürgen Frevert, danke ich für die wissenschaftliche Betreuung und wohldosierte Einflussnahme bei der Durchführung der praktischen Arbeiten. Dank insbesondere für die Zeit und Mühe bei der kritischen Durchsicht des Manuskriptes. Ferner gilt mein Dank der Geschäftsleitung der BioteCon GmbH, Frau Dr. Kornelia Berghof und Herrn Dr. Lutz Müller-Kuhrt. Der experimentelle Teil dieser Arbeit wurde von November 1996 bis Dezember 1999 in den Räumen der BioteCon GmbH durchgeführt. Bei Herrn Dr. Volker Specht bedanke ich mich für die Korrektur der ersten Rohfassungen und für einige nützliche Tipps. Den Computer-Spezialisten Björn Seisselberg und Diplom-Ingenieur Douglas Friday danke ich für die Unterstützung bei der technischen Umsetzung der Arbeit. Durch ihre Hilfsbereitschaft sind mir einige graue Haare erspart geblieben. Ganz besonders danke ich allen Mitarbeitern der BioteCon GmbH, inklusive BioteCon Diagnostics, für ihre Hilfsbereitschaft und die außerordentlich angenehme Arbeitsatmosphäre im Labor und im Büro unter dem Dach. Es haben sich besondere Erwähnung verdient: Birgit, Claudia, Lisa, Martina, Rena, Douglas, Markus, Udo und der alte Mann.. Schließlich gilt meine besondere Dankbarkeit meinen Eltern, ohne deren Unterstützung und Rückhalt weder meine Ausbildung noch diese Arbeit möglich gewesen wären..

(5) Inhaltsverzeichnis Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen Verzeichnis der Abkürzungen. I.. Grundlagen und Konzepte der Proteintrennung. 1. Prinzipien der Proteintrennung.................................................................................... 1 1.1 Ladung ........................................................................................................................ 1 1.2 Hydrophobizität ........................................................................................................... 2 1.3 Molekulargewicht......................................................................................................... 3 1.4 Affinität ........................................................................................................................ 3. 2. Analytische und präparative Anwendungen............................................................... 4 2.1 Analytische Trennverfahren......................................................................................... 4 2.2 Präparative Proteinreinigung ....................................................................................... 4 2.2.1 Primäroperationen................................................................................................ 4 2.2.2 Isolierung ............................................................................................................. 5 2.2.3 Grobreinigung ...................................................................................................... 5 2.2.4 Feinreinigung ....................................................................................................... 6. 3. Mehrdimensionale Trennverfahren.............................................................................. 6 3.1 Mehrdimensionale Elektrophorese .............................................................................. 7 3.2 Mehrdimensionale Chromatographie........................................................................... 8. II.. 1. Entwicklung eines zweidimensionalen, chromatograpischen Trennverfahrens zur automatisierten Proteinreinigung Einleitung .................................................................................................................... 10. 1.1 Automatisierte Verfahren zur Proteinreinigung .......................................................... 12 1.2 Patente...................................................................................................................... 13 1.3 Ziel der Arbeit............................................................................................................ 14.

(6) 2. Material und Methoden............................................................................................... 17 2.1 Material ..................................................................................................................... 17 2.1.1 Bezugsquellen.................................................................................................... 17 2.1.2 Geräte und Computerprogramme....................................................................... 18 2.1.3 Säulenmaterial ................................................................................................... 18 2.1.4 Chromatographiesystem .................................................................................... 19 2.2 Proteinanalytik........................................................................................................... 20 2.2.1 Modifizierte Proteinbestimmung nach Lowry ...................................................... 20 2.2.2 Proteinbestimmung nach Bradford ..................................................................... 21 2.2.3 Proteinbestimmung mit BCA .............................................................................. 21 2.2.4 Proteinbestimmung durch Integration der Absorption bei 280 nm ...................... 22 2.2.5 Proteinfällung mit Ammoniumsulfat .................................................................... 22 2.2.6 Proteinfällung mit TCA/NaDOC .......................................................................... 22 2.2.7 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese ................................................................ 23 2.2.8 Zweidimensionale Gelelektrophorese................................................................. 23 2.2.9 Coomassiefärbung von Proteinen in Polyacrylamidgelen ................................... 24 2.2.10 Silberfärbung von Proteinen in Polyacrylamidgelen............................................ 24 2.3 DNA-Quantifizierung ................................................................................................. 25 2.4 Enzymanalytik ........................................................................................................... 25 2.4.1 Alkoholdehydrogenase-Aktivität ......................................................................... 26 2.4.2 Aldehyddehydrogenase-Aktivität ........................................................................ 26 2.4.3 Glucose-6-phosphatdehydrogenase-Aktivität ..................................................... 27 2.4.4 Alkalische Phosphatase-Aktivität........................................................................ 28 2.4.5 Peroxidase-Aktivität............................................................................................ 29 2.4.6 β-Galactosidase-Aktivität.................................................................................... 30 2.5 Herstellung von Proteinextrakten............................................................................... 30 2.5.1 Proteinextraktion aus Catharanthus roseus ........................................................ 30 2.5.2 Glasperlenaufschluss von Saccharomyces cerevisiae im Reagenzglas ............. 31 2.5.3 Aufschluss von Saccharomyces cerevisiae in der Glaskugelmühle .................... 32 2.5.4 DNA-Fällung mit Polyethylenimin ....................................................................... 32.

(7) 2.6 Chromatographische Methoden ................................................................................ 33 2.6.1 Allgemeines........................................................................................................ 33 2.6.2 Größenausschlusschromatographie................................................................... 33 2.6.3 Ionenaustauschchromatographie ....................................................................... 34 2.6.4 Tandem-Ionenaustauschchromatographie ......................................................... 34 2.6.5 Hydrophobe Interaktionschromatographie.......................................................... 34 2.6.6 Zweidimensionale Chromatographie .................................................................. 35 3. Ergebnisse .................................................................................................................. 36 3.1 Probenvorbereitung................................................................................................... 36 3.1.1 Gelfiltration ......................................................................................................... 36 3.1.2 Vorsäule............................................................................................................. 38 3.2 Ionenaustauschchromatographie .............................................................................. 40 3.2.1 Auswahl der Anionenaustauschermatrix............................................................. 40 3.2.2 Auswahl der Kationenaustauschermatrix............................................................ 43 3.2.3 Reihenfolge der Ionenaustauscher..................................................................... 45 3.2.4 Optimierung des Elutionsprofils eines Anionenaustausches............................... 48 3.2.5 Proteinverteilung zwischen Anionen- und Kationenaustauscher......................... 49 3.2.6 Kapazität der Anionenaustauschermatrix ........................................................... 50 3.2.7 Kapazität der Kationenaustauschermatrix .......................................................... 54 3.2.8 Peak-Kapazität der ersten Dimension ................................................................ 57 3.3 Hydrophobe Interaktionschromatographie ................................................................. 58 3.3.1 Auswahl der Chromatographiematrix.................................................................. 58 3.3.2 Ammoniumsulfatpräzipitation ............................................................................. 60 3.3.3 Proteinbindung bei stufenweiser Erhöhung der Ammoniumsulfatkonzentration.. 61 3.3.4 Präzipitation und Bindung im Vergleich .............................................................. 62 3.3.5 Bestimmung der Ammoniumsulfatkonzentrationen der ersten Stufe................... 64 3.3.6 Belastungstabilität der Source™ ISO-Matrix....................................................... 65 3.3.7 Peak-Kapazität der zweiten Dimension .............................................................. 67 3.4 Zweidimensionale Chromatographie ......................................................................... 67 3.4.1 Erste Dimension................................................................................................. 68 3.4.2 Zweite Dimension............................................................................................... 71.

(8) 3.4.3 Trennleistung ..................................................................................................... 74 3.4.4 Proteinbilanz ...................................................................................................... 76 3.4.5 Proteinzusammensetzung .................................................................................. 78 3.4.6 Peak-Kapazität der zweidimensionalen Chromatographie.................................. 81 3.4.7 Enzymverteilung................................................................................................. 81 4. Diskussion .................................................................................................................. 87 4.1 Probenvorbereitung................................................................................................... 87 4.2 Erste Dimension ........................................................................................................ 89 4.3 Zweite Dimension...................................................................................................... 94 4.4 Zweidimensionale Chromatographie ......................................................................... 97 4.5 Anwendungsmöglichkeiten und Limitierungen......................................................... 102 4.6 Ausblick................................................................................................................... 104. 5. Zusammenfassung ................................................................................................... 107. 6. Literatur ..................................................................................................................... 108. 7. Anhang ...................................................................................................................... 122 7.1 Proteinbestimmung anhand der UV-Absorption des Eluates ................................... 122 7.2 Erste Dimension: Ionenaustausch ........................................................................... 124 7.3 Zweite Dimension: Hydrophobe Interaktion ............................................................. 127 7.4 Zweidimensionale Chromatographie ....................................................................... 128.

(9) Verzeichnis der Abbildungen Abb. 1.1. Konzept der automatisierten, zweidimensionalen Proteinreinigung .................... 16. Abb. 2.1. Schematische Darstellung der Chromatographieanlage BioLogic HR ................ 20. Abb. 3.1. Gruppenseparation zur Probenvorbereitung....................................................... 37. Abb. 3.2. Proteinzusammensetzung der Fraktionen einer Gelfiltration............................... 38. Abb. 3.3. Bindungsverhalten von DNA und Proteinen auf einer Vorsäule .......................... 39. Abb. 3.4. Proteinzusammensetzung von Durchlauf und Eluat bei Verwendung einer Vorsäule ............................................................................................................ 39. Abb. 3.5. Vergleich dreier Anionenaustauschermatrizes.................................................... 42. Abb. 3.6. Vergleich zweier Kationenaustauschermatrizes ................................................. 44. Abb. 3.7. Tandem-Ionenaustausch mit alternativer Reihenfolge........................................ 46. Abb. 3.8. Ermittlung des optimalen Elutionsprofils eines Anionenaustauschers................. 48. Abb. 3.9. Tandem-Ionenaustausch eines Hefeextraktes.................................................... 49. Abb. 3.10 Proteinverteilung bei Tandem-Ionenaustauschchromatographie ........................ 50 Abb. 3.11 Proteinbilanz bei steigender Belastung eines Anionenaustauschers .................. 51 Abb. 3.12 Rechromatographie auf UNO™ Q1.................................................................... 53 Abb. 3.13 Rechromatographie auf UNO™ S1 .................................................................... 55 Abb. 3.14 Proteinbilanz bei steigender Belastung eines Kationenaustauschers ................. 57 Abb. 3.15 Proteinbilanz der ReSource-HIC-Medien............................................................ 59 Abb. 3.16 Fraktionierte Ammoniumsulfatfällung ................................................................. 61 Abb. 3.17 Proteinbindung bei serieller Erhöhung der Ammoniumsulfatkonzentration ......... 62 Abb. 3.18 Vergleich von Bindungs- und Präzipitationsverhalten eines Hefeextraktes......... 63 Abb. 3.19 Proteinbindung in Abhängigkeit von der Ammoniumsulfatkonzentration............. 64 Abb. 3.20 Vergleich paralleler und serieller Bindung .......................................................... 65 Abb. 3.21 Einfluss hoher Proteinbeladungen auf das Trennverhalten der HIC-Matrix......... 66 Abb. 3.22 Probenlauf in der 2D-Chromatographie .............................................................. 68 Abb. 3.23 Reproduzierbarkeit der ersten Dimension .......................................................... 69 Abb. 3.24 Erste Dimension einer 2D-Trennung .................................................................. 70 Abb. 3.25 Zweite Dimension: HIC des Durchlaufs der ersten Dimension und des Eluats KIEX .................................................................................................................. 72 Abb. 3.26 Zweite Dimension: HIC ausgewählter Fraktionen des Eluats AIEX..................... 73 Abb. 3.27 Proteinzusammensetzung der Fraktionen der zweiten Dimension I.................... 75 Abb. 3.28 Proteinzusammensetzung ausgesuchter Fraktionen der 2. Dimension............... 76.

(10) Abb. 3.29 Proteinbilanz einer zweidimensionalen Trennung............................................... 77 Abb. 3.30 Proteinzusammensetzung während der 2D-Chromatographie I.......................... 78 Abb. 3.31 Proteinzusammensetzung während der 2D-Chromatographie II......................... 80 Abb. 3.32 Verteilung der Enzyme in der ersten Dimension................................................. 82 Abb. 3.33 Bestimmung der Enzymaktivitäten in den Fraktionen der zweiten Dimension I: Aldehyddehydrogenase und Peroxidase............................................................ 84 Abb. 3.34 Bestimmung der Enzymaktivitäten in den Fraktionen der zweiten Dimension II: G-6-P-Dehydrogenase und β-Galactosidase ..................................................... 85 Abb. 3.35 Bestimmung der Enzymaktivitäten in den Fraktionen der zweiten Dimension III: Alkoholdehydrogenase und alkalische Phosphatase ......................................... 86 Abb. 4.1. Isoelektrische Punkte der ORFs im Genom von S. cerevisiae............................ 90. Abb. 4.2. Isoelektrische Punkte der ORFs im Genom von E. coli ...................................... 91. Abb. 4.3. Isoelektrische Punkte der ORFs im humanen Genom ........................................ 91. Abb. 4.4. Zweidimensionale Referenzgele S. cerevisiae und E. coli .................................. 92. Abb. 4.5. Fließschema des zweidimensionalen chromatographischen Verfahrens .......... 100. Abb. 7.1. Absorptionsspektrum ausgewählter Fraktionen der ersten Dimension.............. 122. Abb. 7.2. Zusammenhang zwischen UV-Absorption und Proteinkonzentration nach Lowry... ......................................................................................................................... 123. Abb. 7.3. Tandem-Ionenaustausch mit einem C. roseus-Extrakt: Chromatogramm......... 124. Abb. 7.4. Tandem-Ionenaustausch mit einem C. roseus-Extrakt: Proteinverteilung......... 125. Abb. 7.5. Elutionsprofile bei steigender Belastung eines Anionenaustauschers .............. 126. Abb. 7.6. Proteinbindung in Abhängigkeit von der Ammoniumsulfatkonzentration: Standardabweichung der Proteinbilanzen........................................................ 127. Abb. 7.7. Vergleich ausgewählter Elutionsprofile der ersten und zweiten 2D-Trennung I 128. Abb. 7.8. Vergleich ausgewählter Elutionsprofile der ersten und zweiten 2D-Trennung II..... ......................................................................................................................... 129. Abb. 7.9. Proteinzusammensetzung der Fraktionen der zweiten Dimension II................. 130. Abb. 7.10 Proteinzusammensetzung der Fraktionen der zweiten Dimension III................ 131 Abb. 7.11 Proteinbilanz einer zweidimensionalen Trennung: Standardabweichung.......... 132.

(11) Verzeichnis der Tabellen Tab. 2.1. Chromatographiekartuschen für die Gruppenseparation .................................... 33. Tab. 3.1. Trennparameter für den Vergleich dreier Anionenaustauschermatrizes ............. 41. Tab. 3.2. Trennparameter für den Vergleich zweier Kationenaustauschermatrizes ........... 44. Tab. 3.3. Proteinbilanz zweier Kationenaustauscher ......................................................... 45. Tab. 3.4. Flächenbilanz bei alternativer Anordung von Ionenaustauschern ....................... 47. Tab. 3.5. Proteinbilanz bei alternativer Anordnung von Ionenaustauschern ...................... 47. Tab. 3.6. Proteinbilanz der Rechromatographie auf einem Anionenaustauscher.............. 54. Tab. 3.7. Flächenbilanz der Rechromatographie von C. roseus auf UNO™ S1................. 56.

(12) Verzeichnis der Abkürzungen 2D. Zweidimensional. 2DE. Zweidimensionale Gelelektrophorese. ABTS. 2,2´-Azino-bis(3-Ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) Diammoniumsalz. ADH. Alkoholdehydrogenase. AIEX. Anionenaustausch. AldDH. Aldehyddehydrogenase. aPhos. Alkalische Phosphatase. APS. Ammoniumperoxydisulfat. A. pur.. Aqua purissima (Reinstwasser). BCA. Bicinchoninsäure (4,4´-Dicarboxy-2,2´-biquinolin). BSA. Rinderserumalbumin. CBB. Coomassie Brilliant Blau. CHAPS. 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propansulfonat Hydrat. DL. Durchlauf bei chromatographischen Trennungen. DMSO. Dimethylsulfoxid. DTT. Dithiothreitol. EDTA. Ethylendiamin-N,N,N´,N´-tetraessigsäure. EGTA. Ethylenglykol-bis-(2-aminoethylether)-N,N,N´,N´-tetraessigsäure. EL. Eluat bei chromatographischen Trennungen. G6P. Glucose-6-phosphat. G6PDH. Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase. βGal. β-Galactosidase. GF. Gelfiltration. HIC. hydrophobe Interaktionschromatographie. HIC 1 o. 2. erste oder zweite Stufe der hydrophoben Interaktionschromatographie. HPLC. Hochdruckflüssigkeitschromatographie (high pressure/performance liquid chromatography). KIEX. Kationenaustausch. MES. β-Morpholino-ethansulfonsäure Hydrat. β-NAD. β-Nikotinamidadenindinukleotid. NADP. β-Nikotinamidadenindinukleotidphosphat.

(13) pNPP. p-Nitrophenylphosphat-Di(cyclohexylammonium) Salz. ONPG. o-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranosid. ORF. offenes Leseraster (open reading frame). PEI. Polyethylenimin. Perox.. Peroxidase. Pi. anorganisches Phosphat. PMSF. Phenylmethylsulfonylfluorid. PVPP. Polyvinylpolypyrrolidon. RPLC. Umkehrphasenchromatographie (reversed phase liquid chromatography). RT. Raumtemperatur. SDS. Natriumdodecylsulfat. SDS-PAGE. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese. TEMED. N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin. Tris. Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan. TrisCl. Tris-Puffer, mit HCl auf den angegeben pH-Wert eingestellt. TrisPO4. Tris-Puffer, mit Phosphorsäure auf den angegebenen pH-Wert eingestellt. Tween® 20. Polyoxyethylen(20)-sorbitanmonolaurat.

(14) 1. I.. Grundlagen und Konzepte der Proteintrennung. Proteine spielen eine Schlüsselrolle in nahezu allen bekannten biologischen Prozessen. Die Bedeutung der Proteine wurde bereits im frühen 19. Jahrhundert erkannt, als Jöns Jakob Berzelius den Begriff aus dem griechischen Wort proteios („an erster Stelle“) ableitete. Für die Aufklärung von Struktur und Funktion von Proteinen, eine der Hauptaufgaben der Biochemie, müssen diese in möglichst reiner Form vorliegen. Insbesondere die Strukturaufklärung anhand der Röntgenbeugungsmuster kristallisierter Proteine erfordert hochreine Proteine in großen Mengen. Der Nachweis, dass Proteine präzise definierte Aminosäuresequenzen besitzen, konnte 1953 von Frederick Sanger erst anhand des zuvor gereinigten Insulins geführt werden. Die erstmalige Reinigung eines Proteins gelang Hofmeister 1890 mit der Kristallisation von Ovalbumin. Seither wurde eine Vielzahl verschiedener Methoden entwickelt, um Proteine aufzureinigen. Die Wahl der Trennmethoden ist dabei u.a. abhängig von den physiko-chemischen Eigenschaften und der angestrebten Verwendung des gereinigten Proteins. Für die Untersuchung einer katalytischen oder sonstigen biologischen Aktivität ist beispielsweise der Erhalt der nativen Konformation unabdingbar. Auch das Rohmaterial, aus dem das Protein isoliert werden soll, beeinflusst den Erfolg und die Auslegung der Trennung. Die Reinigung von Proteinen erfordert wegen der hohen Variationsbreite ihrer physikochemischen Eigenschaften und der meist sehr komplexen Zusammensetzung des Ausgangsmaterials eine zeitaufwändige, systematische Vorgehensweise bei der Entwicklung von Reinigungsprotokollen.. 1 Prinzipien der Proteintrennung 1.1. Ladung. Proteine bestehen aus Aminosäuren, die positive und/oder negative Ladungen tragen. Aus der Anzahl der postiven und negativen Ladungen bei einem bestimmten pH-Wert ergibt sich die Gesamtladung eines Proteins. Die Gesamtladung eines Proteins wird null, wenn die Anzahl der positiven Ladungen gleich der der negativen Ladungen wird. Der pH-Wert, bei dem dies der Fall ist, wird isoelektrischer Punkt genannt (pI). Der pI wird von zwei Trennverfahren genutzt, bei denen sich die Proteine in einem pH-Gradienten entsprechend ihres pI anordnen. Bei der isoelektrischen Fokussierung bewegen sich Proteine im elektrischen Feld solange, bis die Nettoladung des Proteins null wird. Die Chromatofokussierung wiederum profitiert davon, dass Proteine von einer schwachen Anionenaustauschermatrix eluieren, wenn der pH-Wert in ihrer Umgebung gleich ihrem pI wird und sie, mangels Ladung, nicht mehr an die Matrix binden (Liu & Anderson, 1997; Sluyterman & Elgersma, 1978). Proteine neigen jedoch an ihrem isoelektrischen Punkt wegen der Minimierung der elektrostatischen Abstoßungskräfte zur Aggregation und Präzipitation..

(15) I. Grundlagen. 2. Die elektrostatische Ladung von Proteinen ist nicht gleichmäßig über das Protein verteilt, sondern überwiegend an der Oberfläche angeordnet, die sich in positiv und negativ geladene Bereiche einteilen lässt. Dass diese Verteilung von Protein zu Protein variiert macht sich die Ionenaustauschchromatographie zunutze. In Abhängigkeit von der Anzahl und Verteilung der negativen oder positiven Ladungen an der Proteinoberfläche binden Proteine mehr oder weniger stark an Ionenaustauschermatrizes. Durch Erhöhen der Ionenstärke im Zulauf werden die Wechselwirkungen zwischen Proteinoberfläche und Matrix geschwächt und die Proteine in Abhängigkeit von ihrer Bindungsstärke von den Ionen verdrängt. Die Anzahl der vorhandenen Ladungen und somit die Stärke der Bindung lässt sich durch den pH-Wert des Laufmittels beeinflussen. Damit setzt sich die Selektivität einer Ionenaustauschermatrix aus der Art des Substituenten sowie der Art und dem pH-Wert des Laufmittels zusammen. Die daraus resultierende hohe Variabilität der Selektivität erklärt die häufige Anwendung von Ionenaustauschchromatographien bei der Aufreinigung von Proteinen (Bonnerjera et al., 1986).. 1.2. Hydrophobizität. Neben geladenen Aminosäuren enthalten Proteine auch ungeladene, hydrophobe Aminosäuren, die sich zumindest teilweise ebenfalls an der Oberfläche befinden (Jennissen, 1978; Hofstee & Ottillio, 1978). Durch die Zugabe bestimmter Salze wird die Interaktion hydrophober Bereiche auf der Proteinoberfläche mit hydrophoben Matrizes ermöglicht oder verstärkt (Tiselius, 1948). Die Bindung wird durch den Entropiegewinn angetrieben, der dadurch entsteht, dass die geordnete Grenzfläche zwischen Wassermolekülen und hydrophoben Bereichen durch die Interaktion der hydrophoben Bereiche untereinander reduziert wird (Porath et al., 1973; Hjertén, 1977; Porath, 1986). Die Stärkung hydrophober Wechselwirkungen bei steigender Salzkonzentration wird mit einer Zunahme der Oberflächenspannung durch strukturgebende Salze erklärt (von der Haar, 1976; Melander & Horvath, 1977). Ebenso wie bei der Ionenaustauschchromatographie führt die kontinuierliche Schwächung der hydrophoben Wechselwirkung zu einer Elution der Proteine entsprechend der Stärke dieser Wechselwirkung. Die Schwächung erfolgt durch Absenken der Salzkonzentration im Zulauf. Durch die stabilisierende Wirkung hoher Salzkonzentrationen auf die Konformation von Proteinen ist die hydrophobe Interaktionschromatographie eine sehr schonende Methode. Da es sich bei der hydrophoben Bindung um einen entropiegetriebenen Vorgang handelt, wird die hydrophobe Interaktionschromatographie meist bei Temperaturen oberhalb von 4°C durchgeführt. Bei der Umkehrphasen-Chromatographie (RPLC) werden Matrizes mit stark hydrophoben, unpolaren Oberflächen verwendet, während das Laufmittel polar ist. Die Wechselwirkung hydrophober Proteine mit diesen Oberflächen ist meist so stark, dass sie an der Matrix denaturieren und organische Lösungsmittel zu ihrer Elution notwendig sind (Benedek et al., 1984). Da RPLC-Matrizes außerdem nur eine geringe Kapazität aufweisen, wurden sie zunächst überwiegend bei analytischen Anwendungen oder für die Reinigung von kleinen robusten Proteinen (<30 kDa) eingesetzt. In letzter Zeit gewinnt die RPLC im industriellen Maßstab jedoch stark an Bedeutung. Im Gegensatz zur Ladung lässt sich die.

(16) I. Grundlagen. 3. Hydrophobizität von Proteinen nicht durch die Zusammensetzung des Laufmittels beeinflussen Neben der Interaktion hydrophober Oberflächenbereiche mit einer hydrophoben Matrix, können die entsprechenden Bereiche bei Erhöhung der Salzkonzentration auch untereinander wechselwirken. Dieser Effekt wird bei der Fällung von Proteinen mit hohen Salzkonzentrationen ausgenutzt. Da hydrophobe Aminosäuren bevorzugt im Inneren von Proteinen anzufinden sind, führt die Denaturierung von Proteinen dazu, dass es zu intermolekularen Wechselwirkungen zwischen den dann freiliegenden Bereichen und damit ebenfalls zu einer Aggregation kommt.. 1.3. Molekulargewicht. Bei der Trennung von Proteinen anhand ihres Molekulargewichts werden Unterschiede in ihrer Mobilität unter verschiedenen Bedingungen ausgenutzt. Bei der Gelfiltration bewegen sich Proteine mit einem Lösungsmittel durch eine poröse Matrix, deren Poren eine Ausschlussvolumenverteilung aufweisen. Dadurch steht größeren Molekülen ein geringeres Volumen zur Verfügung als kleinen, sodass sie schneller durch die Säule transportiert werden. Unter nativen Bedingungen ist die Mobilität noch von der Konformation der Proteine abhängig, während unter denaturierenden Bedingungen die Mobilität proportional dem Molekulargewicht ist (Barth et al., 1994). In der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE, Lämmli, 1970) werden die Proteine durch Zugabe von SDS mit einer negativen Ladung versehen, die häufig proportional ihrem Molekulargewicht ist. In einem elektrischen Feld bewegen sich die Proteine unterschiedlich schnell durch ein Polyacrylamidgel mit einer vorbestimmten Porengröße. Native gelelektrophoretische Methoden und Kapillarelektrophoresen nutzen dagegen die Eigenladung von Proteinen.. 1.4. Affinität. Fast alle biologischen Moleküle interagieren mit anderen Molekülen über spezifische Bindungsstellen. Dazu gehören Antigen/Antikörper-Bindungen, die Bindung von Substraten, Inhibitoren, Aktivatoren und Coenzymen an Enzyme oder die Bindung regulatorischer Proteine an ihre Rezeptoren. Die Affinitätschromatographie macht sich diese spezifischen Bindungen zunutze, indem einer der beiden Bindungspartner an einer chromatographischen Matrix immobilisiert ist. Bei der rekombinanten Expression lassen sich Proteine gezielt mit sogenannten „tags“ versehen, die eine definierte Affinität zu einem immobilisierten Bindungspartner aufweisen (zum Beispiel Avidin/Streptavidin, Immobilisierte Metallaffinitätschromatographie, Glutathion-S-Transferase/GST-bindendes Protein, Antigen/Antikörper, Cibacron-Blau/Albumin (Miller & Gemeiner, 1998))..

(17) I. Grundlagen. 4. 2 Analytische und präparative Anwendungen 2.1. Analytische Trennverfahren. Analytische Trennverfahren müssen in der Lage sein, einen Großteil der in einer Proteinmischung enthaltenen Proteine reproduzierbar voneinander zu trennen. Die am häufigsten verwendeten Methoden nutzen Unterschiede in Form und Molekulargewicht der Proteine im Zusammenhang mit deren physikochemischen Eigenschaften. Dazu gehören insbesondere die diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgelektrophorese nach Lämmli (1970), die Kapillarelektrophorese und die isoelektrische Fokussierung. Neben den elektrophoretischen Methoden wird im analytischen Bereich noch die Gelfiltrations- und die Umkehrphasenchromatographie in Verbindung mit leistungsfähigen Trennsäulen und Detektoren in HPLCSystemen verwendet. Die analytischen Verfahren ergeben ein Abbild des Proteingemisches in dem die relativen Mengen der im Gemisch enthaltenen Proteine erkennbar ist. Ein etwas anderer Ansatz wird mit der Affinitätschromatographie verfolgt. Über die Wechselwirkung mit einem Affinitätsliganden wird zunächst der Analyt, meist zusammen mit einer Reihe kontaminierender Proteine, isoliert und dann analysiert (z.Bsp. Antigen/Antikörper-Affinität).. 2.2. Präparative Proteinreinigung. Im Gegensatz zu den analytischen zielen präparative Trennverfahren darauf ab, den Anteil eines Proteins im Gemisch solange zu erhöhen, und alle anderen Bestandteile zu entfernen, bis das Zielprotein in der benötigten Reinheit vorliegt. Wegen der hohen Trennleistung, den schonenden Trennbedingungen und der Vielfalt der Anwendungsmöglichkeiten werden überwiegend chromatographische Trennverfahren bei der Proteinreinigung eingesetzt. Die verschiedenen Verfahren werden so kombiniert, dass sich für das Zielprotein eine schnelle und schonende Aufreinigungsmethode ergibt. Anschließend an die Proteinextraktion setzen sich die meisten Protokolle aus vier Schritten zusammen: 1.. Primäroperationen. 2.. Isolierung („Capture“). 3.. Grobreinigung. 4.. Feinreinigung („Polishing“). Die Stabilität des gereinigten Proteins wird durch Zugabe stabilisierender Substanzen vor der Lagerung gewährleistet. Die Zusammensetzung der Proteinpräparation wird als Formulierung bezeichnet. 2.2.1. Primäroperationen. Nach der Abtrennung etwaiger Feststoffe aus der Extraktionslösung durch Zentrifugation oder Filtration ist meist ein Zwischenschritt notwendig, der den Extrakt für die nachfolgenden Aufreinigungsstufen vorbereitet. Zu den Verfahren der Probenvorbereitung gehören im Wesentlichen solche, die das Zielprotein lediglich konzentrieren, jedoch kaum Anreichern und solche, die das Zielprotein weder anreichern noch konzentrieren, sondern lediglich Begleitsubstanzen entfernen..

(18) I. Grundlagen. 5. In der Ultrafiltration und der Diafiltration werden Proteine über Membranen filtriert, die Größenausschlussvolumina zwischen etwa 10 und 100 kDa aufweisen. Wegen der sehr breiten Größenausschlussverteilung solcher Membranen werden sie meist nur zur Abtrennung von niedermolekularen Substanzen und zur Konzentrierung von Proteinlösungen eingesetzt. Die Präzipitation von Proteinen mit Neutralsalzen, wie z.B. Ammoniumsulfat, organischen Lösungsmitteln oder anderen Substanzen hat dagegen einen höheren Anreicherungseffekt und wird außer zur Konzentrierung auch zu einer Voranreicherung eingesetzt. Ebenfalls zur Probenvorbereitung gehören Verfahren, die lediglich störende Substanzen aus dem Extrakt entfernen, wie zum Beispiel die Fällung von DNA mit Polyethylenimin, welches gleichzeitig die Abtrennung von Zelltrümmern durch Zentrifugation vereinfacht (Burgess, 1991; Clarkson et al., 1993; Milburn et al., 1990). Den gleichen Effekt hat die Verwendung von auf Zellulose basierenden Anionenaustauschern. Die Dialyse und die Gruppenseparation, als Spezialfall der Gelfiltration, entfernen niedermolekulare Substanzen aus der Probe und werden auch im Lauf der Aufreinigung verwendet, um die Pufferverhältnisse für die folgende Aufreinigunsstufe anzupassen. 2.2.2. Isolierung. Ziel der Isolierung ist die Konzentrierung des Zielmoleküls und die Abtrennung eines Großteils der sonstigen Probenbestandteile. Zur Anwendung kommen meist Präzipitationen mit Neutralsalzen (s.o.) oder chromatographische Verfahren mit einfachen Ionenaustauschern auf Zellulosebasis. Die Verwendung chromatographischer Matrizes mit einer hohen Auflösung oder Effizienz ist in diesem Schritt nicht angebracht, da die Proteinlösung noch zahlreiche Verunreinigungen enthält, die das Trennergebnis verschlechtern. Eine Kombination von Probenvorbereitung und Voranreicherung ergibt sich bei der Adsorption des Zielproteins an poröse Partikel im Wirbelschichtverfahren (Thömmes, 1997). Die Adsorption kann direkt aus Rohhomogenaten erfolgen, da Zelltrümmer und andere Partikel nach der Adsorption ausgespült werden und die Elution eine konzentrierte und klare Proteinlösung liefert. Der Nutzen dieses Verfahrens liegt insbesondere in der Zeitersparnis durch die Reduktion der erforderlichen Einzelschritte, was sich besonders bei labilen Proteinen positiv auf die Ausbeute auswirkt. Dies gilt gleichermaßen für die Extraktion mit flüssigen Zweiphasen-Systemen, da bei Flüssig-Flüssig-Trennungen die Adsorption an eine Matrix entfällt (Liu et al., 1998; Truust & Johanson, 1998; Merchuk et al., 1998; Walter et al., 1991). 2.2.3. Grobreinigung. Die eigentliche Reinigung besteht meist aus zwei und mehr hochauflösenden chromatograpischen Trennungen in denen ein Reinheitsgrad von bis zu 99 % (gewöhnlich 95-98 %) erreicht wird (Asenjo & Patrick, 1990). Für jedes Zielprotein muss die optimale Kombination der Trennschritte durch systematische Untersuchungen bestimmt werden. Es werden alle in Kapitel 1 genannten Verfahren eingesetzt. Bei der Auswahl der aufeinander folgenden Reinigungsschritte werden meist unabhängige Proteineigenschaften ausgenutzt, um ein Höchstmaß an Selektivität zu erreichen. Diese kann sowohl positiv als auch negativ sein (Berkowitz, 1989), je nachdem, ob das Zielprotein an der Matrix bindet oder nicht..

(19) I. Grundlagen. 6. Voraussetzung für diese Einteilung ist jedoch, dass es sich bei den verwendeten Trennverfahren um binäre Systeme handelt. Dies sind solche Systeme, bei denen die Bindung des Zielproteins, oder der Begleitsubstanzen, durch die Zusammensetzung des Laufpuffers beeinflusst werden kann. Das ist beispielsweise der Fall bei Ionenaustausch-, hydrophober Interaktions-, Umkehrphasen- oder Affinitätschromatographie. 2.2.4. Feinreinigung. Nach der Grobreinigung kann eine weitere Reinigung notwendig sein, um Präparationen mit extrem hoher Reinheit zu erhalten. Dies ist insbesondere bei Proteinen notwendig, die für eine Röntgenstrukturanalyse kristallisiert werden sollen, oder deren Aminosäuresequenz bestimmt werden soll. Besondere Auflagen bezüglich der Reinheit müssen Proteinpräparationen erfüllen, die für eine pharmazeutische Verwendung vorgesehen sind (z.Bsp. Insulin >99,99 %). Für die Feinreinigung („polishing“) wird meist eine Gelfiltration angewendet, da am Ende einer Aufreinigungsstrategie das Zielprotein in Form einer konzentrierten Lösung vorliegt. Diese ist notwendig, da das Probenvolumen in der Gelfiltration einen starken Einfluss auf die Trennleistung hat. Auch sind meist ausser dem Molekulargewicht am Ende einer Aufreinigung bereits alle anderen physiko-chemischen Eigenschaften ausgenutzt worden, sodass deren erneute Verwendung nur zu einer geringen weiteren Reinigung führen würde.. 3 Mehrdimensionale Trennverfahren Unter mehrdimensionalen Trennverfahren werden Kombinationen von meist zwei bis drei Verfahren zur Proteintrennung verstanden, die auf unterschiedlichen Trennprinzipien beruhen (Berkowitz, 1989; Samain, 1989). Diese Prinzipien werden als orthogonal bezeichnet, wenn die Moleküleigenschaften, auf denen sie beruhen, voneinander unabhängig sind (Giddings, 1984). Genau genommen handelt es sich bei jeder Proteinaufreinigung um eine mehrdimensionale Trennung, in der je nach Aufgabenstellung verschiedene Verfahren miteinander kombiniert werden (Kopaciewicz & Regnier, 1983a). Die Aufreinigung eines einzelnen Proteins wird bei automatisierten Verfahren auch als Ziel-Modus oder „heart-cutting“ bezeichnet (Regnier & Huang, 1996). Das Zielprotein wird noch während der Trennung lokalisiert und zusammen mit noch vorhandenen Begleitproteinen in die nächste Reinigungsstufe eingespeist. Alle übrigen Proteine werden verworfen. Meist beruht wenigstens eine Trennung auf einem hochselektiven Mechanismus, um den gewünschten Reinigungseffekt zu erzielen. Dabei wird häufig die Affinität des Zielproteins zu einer molekularen Struktur ausgenutzt (de Frutos & Regnier, 1993; Janis & Regnier,1989; McCarthy et al., 1996; Nadler et al., 1994; Yates et al., 1999; Smigol et al., 1994;). Systeme die nach dem Ziel-Modus arbeiten dienen fast ausschließlich dem Nachweis von einzelnen und bereits charakterisierten Proteinen oder der Aufreinigung einer Gruppe von Proteinen, die sich durch die Affinität zu einem gemeinsamen Bindungspartner auszeichnet. Im Folgenden sollen nur solche mehrdimensionale Verfahren betrachtet werden, die nach dem Profil-Modus arbeiten. Gruppenspezifische Methoden, wie die Multiaffinitätschromatographie nach Porath & Hansen (1991), werden nicht berücksichtigt. Im Gegensatz.

(20) I. Grundlagen. 7. zum Ziel-Modus werden im Profil-Modus auf alle Proteine einer komplexen Mischung, eines vollständigen oder vorfraktionierten Rohextraktes die gleichen Trennmethoden angewendet. Nach der Trennung mit der ersten Methode werden alle Probenbestandteile unter Aufrechterhaltung des Trennergebnisses mit einer zweiten, und bei Bedarf einer dritten, Methode weiter aufgetrennt. Mit Hilfe eines geeigneten Proteinnachweises ergibt sich so ein mehr oder weniger vollständiges Bild von der ursprünglichen Zusammensetzung der Mischung. Spezielle Proteine werden erst nach der erfolgten Trennung nachgewiesen.. 3.1. Mehrdimensionale Elektrophorese. Die Trennmethode mit der bislang höchsten Auflösung ist die zweidimensionale Gelelektrophorese (2DE), die als Standardverfahren in der Proteomforschung (s.u.) eingesetzt wird. Bei der 2DE werden die Proteine komplexer Mischungen in zwei Schritten getrennt (O´Farrel, 1975; Klose, 1975): zunächst anhand ihrer Ladung in einer isoelektrischen Fokussierung (IEF), dann anhand ihres Molekulargewichts in einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE). Die Proteine treten nach einer Färbung als mehr oder weniger eng begrenzte Flecken (Spots) in einem rechteckigen Trennbereich auf. Die theoretische Trennleistung oder Kapazität der 2DE liegt bei etwa 30 000 Spots auf Gelen mit einer Größe von 300 x 400 mm, wenn ein Spotdurchmesser von 2 mm angenommen wird. Da die Proteine nicht gleichmäßig über den gesamten Trennbereich verteilt sind und zusätzlich Streifenbildung auftritt, liegt die praktisch erreichbare „Spot-Kapazität“ bei maximal 10 000 Spots pro Gel (Klose, 1999). Die 2DE wird wegen der hohen Trennleistung und hohen Sensitiviät vorwiegend analytisch eingesetzt und ist für die Proteomforschung die Methode der Wahl. Wegen der Größe der verwendeten Gele und der verwendeten Nachweismethoden ist die 2DE mit einem relativ hohen Arbeits- und Zeitaufwand verbunden, der durch Automatisierung nur begrenzt reduziert werden kann. Des Weiteren bietet die Trennmethode nur eine geringe Proteinkapazität und eingeschränkte Reproduzierbarkeit, die sich meist auf die durchführende Arbeitsgruppe beschränkt. Die Identifizierung von Proteinen ist allein anhand der Position im Gel nur bedingt möglich, da die Bestimmung des Molekulargewichts und des isoelektrischen Punktes nur zu etwa ±10 % genau ist (Patterson & Aebersold, 1995). Nach der 2DE liegen die Proteine zudem denaturiert vor, sodass eine katalytische Aktivität nicht mehr nachweisbar ist. Eine Kombination aus nativer Gelelektrophorese und Umkehrphasenchromatographie (nGE/RPLC) wurde von Rose & Opiteck (1994) beschrieben. In der ersten Dimension werden die Proteine in ihrer nativen Konfiguration elektrophoretisch über einen Gelzylinder getrennt, an dessen Ende die eluierenden Proteine von einem Lösungsmittelstrom erfasst und alternierend auf zwei RPLC-Säulen aufgetragen und getrennt werden. In der ersten Dimension sind Proteinbeladungen bis zu 1 mg möglich, die in der zweiten Dimension auf insgesamt 340 Fraktionen aufgeteilt werden. Die Gelzylinder verschleißen jedoch schnell und sind nur eingeschränkt reproduzierbar herzustellen. Wegen der nativen Durchführung werden stark basische Proteine im ersten Schritt bei der üblichen Laufrichtung von der Kathode zur Anode nicht aufgetrennt. Die zweite Dimension bietet mit der RPLC zwar eine reproduzierbare und hochauflösende Trennung, allerdings binden die meisten Proteine sehr stark an die unpolare Matrix und neigen deswegen zur Denaturierung..

(21) I. Grundlagen. 8. Mehrdimensionale Trennverfahren, die gelelektrophoretische Methoden anwenden, weisen eine hohe Trennleistung auf. Gleichzeitig sind sie mit einem hohen Arbeitsaufwand und geringer Reproduzierbarkeit verbunden, da die Matrix, das Gel selbst, für jede Trennung neu hergestellt werden muss und keine zwei Trennungen unter exakt gleichen Bedingungen durchgeführt werden können.. 3.2. Mehrdimensionale Chromatographie. Im Vergleich zu den gelelekrophoretischen Verfahren bietet die Kombination chromatographischer Verfahren einige bedeutsame Vorteile (Lee et al., 1988). Trennsäulen für die hochauflösende Flüssigkeitschromatographie (HPLC) sind in gleichbleibend hoher Qualität kommerziell erhältlich und liefern über viele Anwendungen hinweg reproduzierbare Ergebnisse. Die meisten HPLC-Systeme sind mit einfachen Mitteln automatisierbar und können unbeaufsichtigt arbeiten. Proteine und Peptide werden fast ausschließlich über die Absorption aromatischer Aminosäuren bei 280 nm oder die Absorption der Peptidbindung bei 215 nm nachgewiesen, womit eine schnelle und sensitive Nachweismethode zur Verfügung steht, die über mehr als drei Größenordnungen linear ist (Ingle & Crouch, 1988). Die Proteine liegen nach der Trennung in gelöster Form vor und können direkt weiterverarbeitet werden. Ähnlich wie die Spot-Kapazität in der 2DE wird die theoretisch maximale Auflösung bei mehrdimensionalen chromatographischen Trennungen als Peak-Kapazität bezeichnet (Giddings, 1967). Diese ist für eindimensionale Trennungen definiert als die höchstmögliche Anzahl von Komponenten, die bei einer vorgegebenen Auflösung nebeneinander auf das zur Verfügung stehende Trennvolumen verteilt werden können und dem analytischen Ziel gerecht werden (Giddings, 1981). Moderne eindimensionale HPLC-Systeme erreichen theoretische Peak-Kapazitäten von 100-300 (Cortes, 1992). Da sich die Komponenten einer komplexen Mischung normalerweise nicht gleichmäßig verteilen und es zu Überlappungen der einzelnen Peaks kommt, beträgt die tatsächliche Peak-Kapazität nur etwa 18 und 37 % der theoretischen Kapazität (Cortes, 1992; Davis & Giddings, 1983). Bei zweidimensionalen Trennungen ergibt sich die Peak-Kapazität durch Multiplikation der einzelnen Kapazitäten, wenn zwei unterschiedliche, d.h. voneinander unabhängige (orthogonale) Trennmechanismen verwendet werden (Giddings, 1987). Dies entspricht einer Multiplikation der theoretischen Trennstufenzahl der eindimensionalen Trennungen (Regnier & Huang, 1996). Um die Peak-Kapazität der 2DC vollständig auszunutzen, darf beim Übergang von der ersten in die zweite Dimension die in der ersten Dimension erzielte Auflösung nicht verloren gehen. Dazu ist es erforderlich, dass jeder Peak der ersten Dimension mindestens dreimal in der zweiten Dimension aufgetrennt wird (Murphy et al., 1998; Holland & Jorgenson, 1995). Demnach richtet sich die Probennahmerate nach der Breite des schmalsten Peaks und sollte weniger als die halbe Peak-Breite betragen. Damit wird vermieden, dass Substanzen, die in der ersten Dimension bereits getrennt waren, durch die Fraktionierung wieder vermischt werden. Die meisten bisher veröffentlichten, mehrdimensionalen chromatographischen Systeme bestehen aus zwei Trennverfahren. Viele davon kombinieren die Trennung nach dem Molekulargewicht mit einer Trennung nach den hydrophoben Eigenschaften von Proteinen.

(22) I. Grundlagen. 9. oder Peptiden. Von Opiteck & Jorgenson (1997) wurde ein System beschrieben, das mit einer Gelfiltration (SEC) in der ersten und einer Umkehrphasenchromatographie (RPLC) in der zweiten Dimension die Peptide von Proteinen nach einem Trypsinverdau in 160 min auftrennt. Der Volumenstrom der SEC wird in der ersten Hälfte eines Zyklus alternierend auf zwei RPLC-Säulen aufgetragen und in der zweiten Hälfte eluiert. Die theoretische Peak-Kapazität des Systems beträgt 495, wenn eine gleichmäßige Verteilung der Peaks angenommen wird. Die einzelnen Peptide wurden mit Hilfe der Massenspektrometrie direkt analysiert. Eine Weiterentwicklung dieses Systems (Opiteck et al., 1998) besteht aus der Verlängerung der ersten Dimension von sechs SEC-Säulen von je 30 cm Länge auf acht Säulen und einer Verlängerung der Säulen der zweiten Dimension (RPLC) um das Dreifache. Die theoretische Peak-Kapazität wird mit ~1 500 angegeben. Die Auftrennung eines Escherichia coli-Extraktes resultierte in 450 Peaks und nahm 6 h in Anspruch. Ein dreidimensionales System zur vollständigen Auftrennung tryptischer Peptide wurde von Moore & Jorgenson (1995) durch Kombination von SEC/RPLC mit der KapillarZonenelektrophorese (CZE) erreicht, die Peptide anhand ihrer Mobilität im elektrischen Feld trennt. Die theoretischen Peak-Kapazitäten der einzelnen Trennstufen werden mit 5, 23 und 24 (SEC, RPLC bzw. CZE) angegeben, womit sich eine Gesamtkapazität von etwa 2800 ergibt. Multiparallele Systeme, die nur die RPLC/CZE-Kombination verwenden, sind u.a. von Isaaq et al. (1999), Larmann et al. (1993) und Moore et al. (1996) beschrieben worden. Von Takahashi et al. (1985) wurde die Kombination einer Anionenaustauschchromatographie (AIEX) mit der RPLC zur Trennung der Peptide eines tryptisch verdauten Proteins eingesetzt. Innerhalb von 16 h wurden etwa 260 Peaks detektiert, wobei durch die stufenweise Elution des Anionenaustauschers einige Peptide in der zweiten Dimension doppelt nachgewiesen wurden. Das Verfahren wurde zur Peptidkartierung von vier genetischen Varianten humanen Serumalbumins angewendet (Takahashi et al., 1986). Holland & Jorgenson (1995) zerlegten mit einer AIEX/RPLC-Kombination die Peptide von tryptisch verdautem Thyroglobulin in 150 Peaks. Theoretisch waren 211 Fragmente möglich, die theoretische Peak-Kapazität betrug 1400 bei einer Gesamtdauer von 30 h. Eine Anwendung der Kombination AIEX/RPLC auf die Trennung von Proteinen aus Rinderhirn (Isobe et al., 1991) resultierte in bis zu 280 Peaks, bei einer Gesamtdauer von ca. 6 h. Ein Verfahren, das ohne die Verwendung der RPLC arbeitet besteht aus einer Kombination von Kationenaustausch (KIEX) und SEC (Bushey & Jorgenson, 1990). Der Vorteil dieser Kombination ist, dass in der zweiten Dimension konstante Trennbedingungen vorliegen. Damit ist eine Regeneration der Matrix nicht erforderlich und Beginn und Ende der Trennung der zweiten Dimension sind genau festgelegt. Die Notwendigkeit eines reproduzierbaren Elutionsgradienten besteht daher nur für die erste Dimension..

(23) 10. II.. Entwicklung eines zweidimensionalen, chromatograpischen Trennverfahrens zur automatisierten Proteinreinigung. 1 Einleitung Eine der Hauptaufgaben der Biochemie ist die Aufklärung des Zusammenhangs zwischen der Sequenz, der Struktur und der Funktion von Proteinen. Dazu werden Proteine, zumeist Enzyme, die eine interessante biologische Aktivität aufweisen, zunächst mit Hilfe einer Vielzahl verschiedener Trennmethoden in reiner Form dargestellt. Erst die isolierten Proteinen lassen sich eindeutig charakterisieren. Nach der Entdeckung der Nukleinsäuren als Träger der Erbinformation (Avery et al., 1944) und der Entwicklung der Methoden der Molekularbiologie Mitte der 70er Jahre des zwanzigsten Jahrhunderts, verlagerte sich das Hauptinteresse der Biochemie auf die Aufklärung der zugrundeliegenden „Baupläne des Lebens“, den Genen. Die meisten dieser Untersuchungen gehen von einem abweichenden Erscheinungsbild, oder Phänotyp, der untersuchten Organismen aus, die durch zufällige oder induzierte Mutationen, d.h. Veränderungen der Desoxyribonukleinsäuresequenz (DNA), hervorgerufen werden. Durch die Korrektur des mutierten Gens oder Genabschnittes mit unmutierten DNA-Sequenzen kann der Ort der Mutation, und damit das für den Phänotyp verantwortliche Gen, identifiziert und sequenziert werden. Ein Großteil der so gefundenen Gene enthält die Information für die Biosynthese von Proteinen. Diese ist in sogenannten offenen Leserastern (ORF) organisiert, DNA-Sequenzen die sich in eine Aminosäuresequenz übersetzen lassen. Mit einer Vielzahl von Expressionssystemen ist es möglich, diesen Übersetzungsprozess in Wirtsorganismen ablaufen zu lassen und das Genprodukt in großen Mengen zu produzieren (heterologe Expression). Dadurch stehen die betreffenden Proteine theoretisch in beliebiger Menge für biochemische Untersuchungen zur Verfügung. Mit der vollständigen Sequenzierung der Gesamtheit der genetischen Information eines Organismus, des Genoms, ergibt sich ein weiterer, direkter Zugang zu proteinkodierenden Genen. Bislang sind mindestens 18 Organismen vollständig sequenziert worden (James, 1997). Funktionen lassen sich durch Homologiebetrachtungen in vielen Fällen aus der DNA-Sequenz ableiten. Mit der ständig wachsenden Zahl bekannter Genome wurde jedoch deutlich, dass die Gensequenz nur einen Teil der Information liefern kann, die zum Verständnis der Funktion einzelner Proteine und deren Zusammenspiel notwendig sind. So lassen sich nur für etwa 40 bis 60 % der offenen Leseraster (ORF) der bisher vollständig sequenzierten Genome Funktionen aufgrund von Homologien vorhersagen (Mewes et al., 1998). Hinzu kommt, dass homologe Proteine in unterschiedlichen Organismen zum Teil vollständig andere Funktionen ausüben und zum Beispiel posttranslationale Modifikationen nicht in der Gensequenz festgelegt sind (James, 1997). Allein die Existenz eines ORFs gibt keinen Hinweis darauf, in welcher Form das Genprodukt in der Zelle exprimiert wird oder in.

(24) 1 Einleitung. 11. welchem Zusammenhang diese Expression mit anderen Ereignissen steht (Anderson & Seilhamer, 1997; Gygi et al., 1999; Humphery-Smith et al., 1997). Dies führte zu der Formierung einer neuen Teildisziplin der Biochemie, der Proteomforschung (Wasinger et al., 1995). In Analogie zum Genom wird unter dem Proteom die Proteinzusammensetzung einer Zelle oder eines Gewebes zu einem bestimmten Zeitpunkt unter bestimmten Bedingungen verstanden (Blackstock & Weir, 1999). Die Kenntnis der Zusammensetzung des Proteoms einer Zelle soll Aufschluss darüber geben, ob und wann welche Gene exprimiert werden, wie hoch die relativen Konzentrationen der Genprodukte sind und welche posttranslationalen Modifikationen vorgenommen werden (Dove, 1999; Humphery-Smith et al., 1997). Dazu werden Veränderungen in der Proteinzusammensetzung phänotypisch auffälliger Zellen untersucht, die auf Proteine oder Proteingruppen hinweisen, deren Expression ursächlich für den Phänotyp ist. Bei vollständig sequenzierten Genomen erfolgt die Identifizierung dieser Proteine durch den sogenannten „Peptidmassen-Fingerabdruck“. Dazu werden die Proteine chemisch oder enzymatisch gespalten und die Peptidmassen mit Hilfe der Massenspektrometrie bestimmt. Der Vergleich der Massen mit denen der theoretischen Fragmente, die sich aus dem Genom des betrachteten Organismus ergeben, führt zu dem entsprechenden Gen (Blackstock & Weir, 1999; Dancik et al., 1999; Geng & Regnier, 2000; McCormack et al., 1997; Shevchenko et al., 1997). Bei unbekannten Genomen kann die Gensequenz des Proteins über deren Aminosäureabfolge bestimmt werden. Dazu werden DNA-Sonden mit einer degenerierten Sequenz abgeleitet, mit denen in verschiedenen molekularbiologischen Verfahren das entsprechende Gen isoliert werden kann. Selbst mit den Ergebnissen der Proteomforschung lassen sich nur unvollständige Informationen zu den Funktionen einzelner Proteine erhalten. Ähnlich wie bei der erwähnten Mutationsanalyse wird einem Phänotyp ein bestimmtes Expressionsmuster zugeordnet, das zwar die vermutlich verantwortlichen Gene identifiziert, über die konkrete Aktivität des Proteins jedoch keine Aussagen erlaubt. Eingehendere Charakterisierungen erfordern die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur durch die Röntgenstrukturanalyse kristallisierter Proteine. Die Kristallisation ist ein komplizierter Vorgang und erfordert relativ hohe Mengen hochreinen Proteins (Krafft, 1999). Die Ableitung der dreidimensionalen Struktur aus der Aminosäuresequenz ist wegen der Komplexität der zu berücksichtigenden Kräfte auf der molekularen Ebene und dem Einfluss der Zellumgebung auf die Proteinfaltung in vivo außerordentlich schwierig und in vielen Fällen nur begrenzt aussagekräftig (Koppensteiner et al., 2000; Attwood, 2000). Bislang wurde nur etwa 10 % der Proteine aller bekannten ORFs auf diese Weise eine dreidimensionale Struktur zugeordnet (Mewes et al. 1998). Der direkte Zugang zu Proteinen mit biologischen Funktionen ergibt sich dagegen, wenn die katalytische Aktivität oder funktionelle Eigenschaft bekannt ist. Dieses Vorgehen ist besonders dann von Bedeutung, wenn gezielt nach bestimmten Funktionen gesucht wird, sei es, dass es sich um einzelne Proteine (z.B. Enzyme, Hormone) oder um den Aufbau ganzer Stoffwechselwege handelt. Die Kenntnis der Gensequenz ist dabei zunächst nicht erforderlich, was diesen Ansatz besonders für die Untersuchung vieler Organismen auf eine interessante Funktion hin interessant macht, deren Genom nicht bekannt ist. Anhand entsprechender Nachweissysteme lassen sich Proteine während einer Aufreinigung verfolgen, an deren Ende das gereinigte Protein für weitere biochemische Untersuchungen.

(25) 1 Einleitung. 12. zur Verfügung steht. Dazu gehören insbesondere die Bestimmung der Aminosäuresequenz und die Identifizierung des zugehörigen Gens (s.o.), sowie die Strukturaufklärung anhand der Röntgenbeugungsmuster kristallisierter Proteine. Viele interessante Proteine liegen unter normalen Bedingungen nur in sehr geringen Mengen in der Zelle vor und sind daher nur schwer aufzureinigen. Dennoch ist in vielen Fällen die direkte Aufreinigung der heterologen Expression vorzuziehen, da nur so gewährleistet ist, dass das Protein korrekt gefaltet und mit allen posttranslationalen Modifikationen versehen vorliegt. Die verbreitetste Vorgehensweise bei der Entwicklung von Aufreinigungsprotokollen beruht auf der Anpassung bereits veröffentlichter Strategien, der Erfahrung des Experimentators sowie auf Versuch, Irrtum und guten Ratschlägen. Seit einiger Zeit werden vermehrt Expertensysteme eingesetzt, um auf Grundlage der physikochemischen Eigenschaften des Zielproteins, wie pI oder Molekulargewicht, Reinigungsstrategien zu entwerfen. Diese Eigenschaften sind jedoch in vielen Fällen nicht bekannt. Die zunehmende Zahl diagnostisch und therapeutisch interessanter Proteine erfordert jedoch schnelle und effiziente Verfahren zu deren Isolierung. Dies legt die Entwicklung einer möglichst universell anwendbaren Methode zur Proteinreinigung nahe, die auf Trennprinzipien beruht, die allen Proteine zu eigen sind. Dazu gehören das Molekulargewicht, die Ladung und die Hydropobizität. Die Automatisierung eines solchen Verfahrens könnte in kürzester Zeit und mit einem Minimum an manuellen Eingriffen von einem Rohextrakt zu vorfraktionierten oder reinen Proteinen führen. Da die Identifizierung der aktiven Fraktionen erst am Ende der Reinigung durchgeführt werden kann, müssen zunächst alle Fraktionen gleichermaßen aufgetrennt werden. Insbesondere bei Hochdurchsatzuntersuchungen vieler verschiedener Organismen auf eine bestimmte Funktion hin wäre ein solches Verfahren nützlich, solange entsprechende Nachweissysteme zur Verfügung stehen. Da die Reinigung eines Proteins meist nur der erste, und wissenschaftlich uninteressanteste, Schritt bei der Aufklärung neuer Eigenschaften und Zusammenhänge darstellt, könnte ein allgemein anwendbares Protokoll viel Zeit, Arbeitskraft und Frustration einsparen.. 1.1 Automatisierte Verfahren zur Proteinreinigung Neben einer Vielzahl von automatisierten Verfahren zur Aufreinigung bekannter Proteine, die auf bestehenden Protokollen aufbauen (Berkowitz, 1989), sind bislang nur wenige Verfahren beschrieben worden, die eine umfassende Auftrennung eines komplexen Extraktes ermöglichen. Die meisten dieser Verfahren beruhen auf der Kombination von zwei und mehr chromatographischen Methoden. Ansätze wie die zweidimensionale Elektrophorese werden vorwiegend analytisch eingesetzt (siehe Kapitel I). Der Grund für die Bevorzugung chromatographischer Methoden liegt in der einfachen Automatisierbarkeit und der hohen Reproduzierbarkeit. Für die umfassende Auftrennung komplexer Proteinmischungen wurden bisher Kombinationen von Gelfiltration (SEC/RPLC; Opiteck et al., 1998) und Anionenaustausch mit der Umkehrphasenchromatographie (AIEX/RPLC; Isobe et al., 1991), sowie die Verbindung von Kationenaustausch und Gelfiltration (KIEX/SEC; Bushey & Jorgenson, 1990) eingesetzt. Die höchste Proteinbeladung bietet das Verfahren nach Isobe et al. (1991) mit 10 mg. Dies entspricht einer Belastung pro Säulenvolumen von 3 mg/ml in der ersten und bei 20 Zyklen.

(26) 1 Einleitung. 13. etwa 0,4 mg/ml in der zweiten Dimension. In der Kombination SEC/RPLC (Opiteck et al., 1998) konnten maximal 2 mg Gesamtprotein aufgegeben werden, in der Kombination KIEX/SEC (Bushey & Jorgenson, 1990) lediglich 10 µg, was einer Belastung von 50 µg/ml entspricht. Die erzielten Peak-Kapazitäten liegen bei diesen drei Verfahren etwa in den gleichen Größenordnungen (450, 280 und unbestimmt bei SEC/RPLC AIEX/RPLC, bzw. KIEX/SEC). Die verwendeten Trennmethoden führen zu Einschränkungen bei der generellen Anwendung der zweidimensionalen Kombinationen. Für semipräparative Trennungen ist in der ersten Dimension eine hohe Proteinbeladung notwendig, ebenso bei Trennungen, in denen Proteine nachgewiesen werden sollen, die in der Probe nur in niedrigen Konzentrationen vorkommen. Dies ist bei den genannten Verfahren nur mit der Kombination AIEX/RPLC möglich. Eine Maßstabsvergrößerung der SEC in der ersten Dimension ist nur bedingt durchführbar, da Probenvolumen und –viskosität enge Grenzen setzen. Problematisch bei den Verfahren, die die RPLC anwenden, ist, dass viele Proteine sehr stark und zum Teil irreversibel an die unpolare Matrix binden und dabei denaturieren. Da die Hydrophobizität in gewissen Grenzen mit dem Molekulargewicht ansteigt (Isobe et al., 1991), werden insbesondere große Proteine nur schlecht bis gar nicht mit der RPLC getrennt. In den zwei Arbeiten, die diese Methode anwenden, sind folgerichtig auch nur Proteine mit einem Molekulargewicht kleiner als 60 kDa nachgewiesen worden. Proteine und Peptide, die von einer RPLC-Säule eluieren, können zwar direkt in der Massenspektrometrie und anderen analytischen Methoden eingesetzt werden, die Untersuchung einer biologischen oder katalytischen Aktivität ist jedoch meist nicht mehr möglich.. 1.2 Patente Trotz der hohen Trennleistung und den Vorteilen, die eine automatisierte Verknüpfung chromatographischer Verfahren bietet (Fulton et al., 1992), sind bislang nur sehr wenige mehrdimensionale Verfahren patentiert worden oder werden kommerziell vertrieben. Eine Vielzahl von Patenten wurde auf die Kombination von Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Kapillarelektrophorese erteilt (Jorgenson & Bushey, 1992; Jorgenson & Bushey, 1993; Jorgenson & Lemmo, 1995; Jorgenson & Lemmo, 1996). Aus den Patentschriften geht die Trennmethode, die in der HPLC angewendet wird, nicht hervor. Andere Arbeiten dieser Arbeitsgruppe lassen allerdings auf die Verwendung der RPLC schließen. Ebenso ist der Verwendungszweck unklar. Weitere Patente wurden für die Kombination von Größenausschlusschromatographie (SEC) mit der Gaschromatographie (GC, Cortes et al., 1993) und der Kombination GC/GC (Strunk & Bechthold, 1996) vergeben. Die pauschalierte Patentierung aller mehrdimensionalen chromatographischen Verfahren zur Trennung komplexer Gemische könnte aus Phillips & Liu (1993) abgeleitet werden, die sich allerdings auf die Trennung von Chemikalien beziehen. Systeme, die in der Lage sind, komplexe Proben weitestgehend in ihre Einzelbestandteile aufzutrennen sind bisher nur für niedermolekulare Substanzen erhältlich. Die SEPBOX®-Technologie (Analyticon AG, Berlin) fraktioniert Naturstoffe aufgrund ihrer Polarität in zwei gekoppelten RPLC/SPE (Festphasenextraktions)-Schritten. Diese Trenntechnik ist für Moleküle mit Molekulargewichten bis zu 1 500 Da geeignet..

(27) 1 Einleitung. 14. Die automatisierte Trennung von Proteinen ist hingegen nur sehr eingeschränkt mit kommerziell erhältlichen HPLC-Anlagen möglich. Das fortgeschrittenste System ermöglicht zwar die Koppelung zweier Säulen und die Reinjektion von Fraktionen vorangegangener Trennungen, ist jedoch nicht für eine vollständige und kontinuierliche Trennung ausgelegt und nicht erweiterbar (BioCad™, Perseptive Biosystems).. 1.3 Ziel der Arbeit Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung eines universell einsetzbaren Protokolls zur nativen Proteinreinigung aus komplexen Gemischen, das eine weitgehende Automatisierung erlaubt. Mit einem solchen Verfahren wäre es möglich, den hohen zeitlichen und finanziellen Aufwand bei der Entwicklung von Aufreinigungsstrategien für eine Vielzahl von Proteinen deutlich zu reduzieren. Das zu entwickelnde Protokoll soll in der Lage sein, im Profil-Modus einen Rohextrakt binnen 24 h möglichst weitgehend in seine Einzelkomponenten zu zerlegen. Dabei muss die native Konformation der Proteine aufrechterhalten werden, um die Fraktionen auf das gesuchte Protein oder die gesuchte katalytische Funktion hin untersuchen zu können. Die interessanten Fraktionen sollen direkt oder nach maximal einem weiteren Trennschritt für die Identifizierung zur Verfügung stehen. Diese könnte mit den Methoden der Massenspektrometrie, wie sie in der Proteomforschung bereits eingesetzt werden (Fey et al., 1997; Jensen et al., 1997; Jensen et al., 1999), oder durch chemische Sequenzierung mit dem Edman-Abbau durchgeführt werden. Die Auslegung des Systems erfolgt unter Verwendung eines Modellextraktes aus Saccharomyces cerevisiae und einer Proteinbeladung von 25 mg. Für die komplexe Trennaufgabe kommen unter Berücksichtigung der geforderten Automatisierung und Zeitvorgabe lediglich chromatographische Methoden in Betracht. Um die erforderliche Trennleistung zu erzielen, ist darüber hinaus die Kombination von mindestens zwei Trennprinzipien erforderlich, sodass sich eine zweidimensionale Chromatographie (2DC) ergibt. Die verwendeten Trennverfahren müssen kompatibel sein und dürfen nur ein Minimum an Konditionierung zwischen den einzelnen Schritten erfordern. Von den unter Kapitel I.1 genannten Trennprinzipien sind die Ladung, die Hydrophobizität und das Molekulargewicht universell anwendbare Eigenschaften. Die Affinität zu bestimmten Zielstrukturen ist dagegen keine universelle Proteineigenschaft. Die Gelfiltration erfordert niedrige Probenvolumina bei niedriger Probenviskosität und bietet daher keine ausreichende Proteinkapazität. Die Ionenaustauschchromatographie bietet dagegen eine hohe Kapazität sowie die Möglichkeit, mit der Zusammensetzung des Laufpuffers die Selektivität der Matrizes zu beeinflussen. Die Chromatofokussierung trennt ebenfalls anhand der elektrostatischen Ladung, hat aber den Nachteil, dass Proteine in der Nähe ihres isoelektrischen Punktes zur Präzipitation neigen. Eine Kombination mit der Ionenaustauschchromatographie (IEX) ist auch deshalb nicht sinnvoll, weil es sich nicht um orthogonale Trennmethoden handelt. Die Trennung anhand der Hydrophobizität stellt dagegen eine orthogonale Methode dar und wird in der zweiten Stufe verwendet. Da die meisten Proteine unter den Trennbedingungen der Umkehrphasenchromatographie (RPLC) zur Denaturierung neigen, wird die schonendere hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) verwendet. Die Reihenfolge der beiden Trennverfahren ergibt sich aus den Bedingungen, unter denen.

(28) 1 Einleitung. 15. Proteine an die entsprechenden Matrizes binden. Während für die Bindung auf Ionenaustauschermatrizes eine niedrige und für die Elution eine steigende Ionenstärke notwendig ist, verhält es sich bei der HIC genau umgekehrt (Kennedy et al., 1986). Zwischen den zwei Dimensionen ist in der Kombination IEX/HIC also lediglich die Zudosierung einer hochkonzentrierten Salzlösung notwendig. In der Kombination HIC/IEX müsste die hohe Leitfähigkeit dagegen umständlich durch Dialyse oder Gruppenseparation gesenkt werden. Wegen der Konzentrierung der Proteine im oberen Bereich der Trennsäulen ist die Probenverdünnung durch die Zumischung eines Lösungsmittelstromes unproblematisch. Eine Bandenverbreiterung beim Übergang von der ersten in die zweite Dimension findet nicht statt. In Abb. 1.1 ist das geplante Verfahren noch einmal schematisch im Zusammenhang dargestellt..

(29) 1 Einleitung. 16. Komplexer Proteinextrakt enthält interessante biologische Aktivität oder Funktion. Automatisierbares, zweidimensionales Verfahren zur Primärfraktionierung. Ionenaustausch. Probenaufgabe. Hydrophobe Interaktion. Fraktionierung. Vorfraktionierte, präparative Mengen nativer Proteine. Funktionsanalyse. - weitere Aufreinigung (Feinreinigung) - zweidimensionale Gelektrophorese. Abb. 1.1. - chemische Analyse (Edman-Abbau) - Röntgenstrukturanalyse - Massenspektrometrie. Konzept der automatisierten, zweidimensionalen Proteinreinigung.

(30) 17. 2 Material und Methoden 2.1 Material Alle Puffer und Lösungen wurden mit Reinstwasser (A. pur.) aus der Reinstwasseranlage Super Q™ der Firma Millipore hergestellt.. 2.1.1 Bezugsquellen Biomasse Saccharomyces cerevisiae. Bäckerhefe (Schwalben-Hefe, R. Stechmann & Co.). Catharanthus roseus. Botanischer Garten Berlin-Dahlem. Chemikalien Die verwendeten Chemikalien stammten, sofern nicht anders angegeben, von den Firmen Sigma, Fluka, Aldrich, Roth und Merck, und lagen im Reinheitsgrad p.a. vor. Rinderserumalbumin. Fraktion V. Sigma A-7906. SDS-PAGE Größenmarker I. Combithek 1317474 (Boehringer Mannheim). SDS-PAGE Größenmarker II. Sigmamarker High Range. Sigma M-3788. Aldehyddehydrogenase. Saccharomyces cerevisiae. Sigma A-6338. Alkalische Phosphatase. bovine Eingeweideschleimhaut. Sigma P-7640. Alkoholdehydrogenase. Saccharomyces cerevisiae. Sigma A-7011. β-Galactosidase. Aspergillus oryzae. Sigma G-5160. Saccharomyces cerevisiae. Sigma G-6378. Meerrettich. Sigma P-8250. Enzyme. Glucose-6-phosphatdehydrogenase Peroxidase Nachweissysteme Bio-Rad Protein Assay. Reagenz zur Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford (1976) (BioRad Laboratories). Fluorescent DNA Quantitation Kit. Reagenzien zur Bestimmung der Konzentration doppelsträngiger DNA nach Cesarone et al. (1979) (BioRad Laboratories). Verbrauchsmaterial Dialyseschlauch. Visking Typ 37/32 (12-14 kDa, Roth). Spritzenvorsatzfilter. 0,22 µm Cellulose Acetat (Nalgene). Membranen für Filtrationseinheit. 0,2 µm Cellulose Nitrat (Sartorius). Immobiline™ DryStrip/IPG Buffer. pH 3-10 L, 11 cm (Amersham Pharmacia Biotech).

(31) 2 Material und Methoden. 18. 2.1.2 Geräte und Computerprogramme Geräte Elektrophoresekammer. Mini PROTEAN® II (Bio-Rad Laboratories).. Glaskugelmühle. DynaMill (Fa. Helmut Clauss, Abt. Anwendungstechnik). Homogenisator. Ultra-Turrax Typ 18/10; 20 000 min-1; ∅ 1,8 cm (IKA Labortechnik, Jahnke & Kunkel GmbH). Mikrotiterplatten-Photometer. ThermoMAX (Molecular Devices). Mikrotiterplatten-Fluorometer. SpectraMAX Gemini (Molecular Devices). Photodokumentation. E.A.S.Y. 429K (Herolab). Photometer. Uvikon 933 Double Beam Spectrophotometer (Biotek Kontron). Zentrifuge. Eppendorf 5403 15 000 rpm Festwinkelrotor (20 000 xg). Software Softmax PRO 2.6.1. Steuerung von SpectraMAX und ThermoMAX und Auswertung des Datenmaterials (Molecular Devices). Microsoft® Word 97 SR-2. Textverarbeitungsprogramm (Microsoft Corporation). Microsoft® Excel 97 SR-2. Tabellenkalkulationsprogramm (Microsoft Corporation). 2.1.3 Säulenmaterial Säulenmatrizes Bio-Gel® P Polyacrylamid Gel. Bio-Rad Laboratories. DE 52. Whatman. Q Ceramic HyperD®. Biosepra. Source™ PHE/ISO/ETH. Pharmacia Biotech. SP-Sepharose® Fast Flow. Pharmacia Biotech. Fertigsäulen Econo-Pac® P6 Cartridge. Bio-Rad Laboratories. HiTrap™ Desalting. Pharmacia Biotech. Resource™ 1ml Testkit. Pharmacia Biotech. UNO™ Q1/S1. Bio-Rad Laboratories. Leersäulen Bio-Scale MT 2. Bio-Rad Laboratories. HR 5/10 & 10/10. Pharmacia Biotech. XK 26. Pharmacia Biotech. Das Packen der Matrizes in Leersäulen erfolgte entsprechend der Herstellerempfehlungen..