II. Entwicklung eines zweidimensionalen, chromatograpischen
2.2 Proteinanalytik
Abb. 2.1 Schematische Darstellung der Chromatographieanlage BioLogic HR
Messwerte nach Lowry von Fraktionen chromatographischer Trennungen wurden teilweise durch Korrelation der Proteinkonzentration mit dem UV-Mittelwert der Fraktion (Abschnitt 2.2.4) korrigiert (Lowry (UV)), wenn die zu bestimmende Proteinkonzentration unterhalb der Nachweisgrenze lag. Der Zusammenhang zwischen der Proteinkonzentration nach Lowry und der UV-Absorption bei 280 nm ist in Abb. 7.2 (Abschnitt 7.1) dargestellt.
Lösung A Lösung B
1 mM CuSO4
2,125 mM KNaTartrat •4 H2O
200 mM NaOH
2,5 % (w/v) Na2CO3 2,5 % (w/v) SDS
16,7 % (v/v) Folin-Ciocalteus-Reagenz
2.2.2 Proteinbestimmung nach Bradford
Die Proteinbestimmung nach Bradford et al. (1976) erfolgte, indem 800 µl der nötigenfalls verdünnten Probe mit 200 µl Bradford-Reagenz versetzt wurden und nach 10 min die Absorption bei 595 nm gemessen wurde. Nach Abzug eines Blindwertes, der statt der Probe 800 µl A. pur. enthielt, ergab sich durch Vergleich der Absorption mit einer Kalibriergeraden die Proteinkonzentration in der Probe. Als Vergleichsprotein diente Rinderserumalbumin im Bereich von 1-16 µg pro Ansatz. Sowohl die Proben als auch die Werte für die Kalibriergeraden wurden in dreifacher Ausführung bestimmt.
Lag die Standardabweichung der drei Absorptionswerte vor Abzug des Blindwertes über 5 % wurden die Werte verworfen und die Ansätze wiederholt. Die Kalibriergerade wurde akzeptiert, wenn der Korrelationskoeffizient größer als 0,995 war.
Der Assay ist kompatibel mit 25 mM Ammoniumsulfat, 125 mM NaCl, 25 mM Phosphat, 50 mM Tris und 17,5 mM MES im Ansatz. Die Grenzwerte für diese Chemikalien wurden bei den betroffenen Proteinbestimmungen unterschritten.
2.2.3 Proteinbestimmung mit BCA
Die Proteinbestimmung mit BCA wurde in Mikrotiterplatten ausgeführt. Von jeder Probe wurden in drei Vertiefungen je 100 µl vorgelegt und mit 100 µl Reaktionslösung versetzt.
Nach 30 min Inkubation bei 37°C wurde die Extinktion der Reaktionslösungen in einem Mikrotiterplatten-Photometer bei einer Wellenlänge von 550 nm bestimmt. Nach Abzug eines Blindwertes, der anstelle der Probe 100 µl A. pur. enthielt, ergab sich durch Vergleich der Absorption mit einer Kalibriergeraden die Proteinkonzentration in der Probe. Als Vergleichsprotein diente Rinderserumalbumin im Bereich von 0,5-20 µg pro Vertiefung. Die Kalibriergerade wurde bei jeder Messung auf der Mikrotiterplatte mitgeführt.
Sowohl die Proben als auch die Werte für die Kalibriergeraden wurden in dreifacher Ausführung bestimmt. Die Steuerung des Mikrotiterplatten-Photometers und die Auswertung der Extinktionen wurde mit der Steuerungs-Software Softmax PRO durchgeführt Lag die Standardabweichung der drei Absorptionswerte vor Abzug des Blindwertes über 5 % wurden die Werte verworfen und neu bestimmt. Die Kalibriergerade wurde akzeptiert, wenn der Korrelationskoeffizient größer als 0,995 war.
Der Assay ist kompatibel mit 0,5 M Ammoniumsulfat und 100 mM Phosphat im Ansatz (Smith et al., 1985). Die Grenzwerte für diese Chemikalien wurden bei allen betroffenen Proteinbestimmungen unterschritten.
Reaktionslösung
4 % (w/v) Na2CO3• H2O (pH 11,25 mit NaHCO3) 0,8 % (w/v) NaOH
0,8 % (w/v) Na2-Tartrat 2 % (w/v) BCA (Na2-Salz) 0,08 % (w/v) CuSO4• 5H2O
2.2.4 Proteinbestimmung durch Integration der Absorption bei 280 nm
Während der chromatographischen Trennung wurde mit der in Abschnitt 2.1.4 beschriebenen UV-Messzelle die Absorption des Eluates bei einer Wellenlänge von 280 nm aufgezeichnet. Um die Proteinkonzentration im Eluat abzuschätzen, wurde die Fläche unter der Kurve der UV-Absorption berechnet.
Die UV-Absorptionsdaten einer Trennung wurden mit mindestens einem Wert pro Sekunde mit Hilfe der BioLogic-Software in ein Tabellenkalkulationsprogramm exportiert. Die UV-Absorptionen wurden in 100 µl-Schritten gemittelt und diese Mittelwerte innerhalb der Fraktionen summiert. Durch den Vergleich dieser Werte mit denen anderer Protein-bestimmungsmethoden ergaben sich Proteinkonzentrationen auch für die Teile des Eluats, die mit keiner anderen Methode zugänglich waren. Des Weiteren wurden diese
„UV-Konzentrationen“ genutzt, um eigenständige Bilanzen zu erstellen, Messbereiche für die Proteinbestimmungen festzulegen und „Ausreißer“ bei anderen Proteinbestimmungs-methoden zu korrigieren. Die Korrelation zwischen Proteinkonzentrationen und dem UV-Mittelwert ist in Abb. 7.2 (Abschnitt 7.1) dargestellt.
2.2.5 Proteinfällung mit Ammoniumsulfat
Die Fällung von Proteinen mit Ammoniumsulfat diente der Vorbereitung von Extrakten für die hydrophobe Interaktionschromatographie bzw. zur Bestimmung des Verhaltens von Proteinen unter den Trennbedingungen der HIC.
Proteinextrakte wurden mit A. pur. und 4 M Ammoniumsulfatlösung (pH 8,0) oder 3 M Ammoniumsulfatlösung in 100 mM MES (pH 6,6) so verdünnt, dass die angestrebte Protein-konzentration und AmmoniumsulfatProtein-konzentrationen von 0-3 M erreicht wurden. Die Proben wurden 1 h auf Eis inkubiert und anschließend bei 20 000 xg und 4°C 30 min zentrifugiert.
Der Überstand wurde abgenommen und für die HIC oder zur Proteinbestimmung weiterverwendet. Das Präzipitat wurde mit einem Volumen einer entsprechend konzentrierten Ammoniumsulfatlösung gewaschen. Nach einer zweiten Zentrifugation wurde die Waschlösung verworfen und das Präzipitat für Proteinbestimmungen in einem Volumen A. pur. gelöst.
2.2.6 Proteinfällung mit TCA/NaDOC
Die Fällung von Proteinen diente der Konzentrierung verdünnter Proteinlösungen zum Auftrag in der SDS-Polyacrylamidgelektrophorese oder der Entfernung störender Substanzen vor der Proteinbestimmung nach Lowry.
Die Proteinlösung wurde mit A. pur. auf ein Volumen von 1 ml aufgefüllt, mit 100 µl 0,15 % (w/v) Natriumdeoxycholat versetzt und 5 min bei RT inkubiert. Nach Zugabe von 100 µl 72 % (w/v) TCA wurde gemischt und für 10 min bei 4°C inkubiert. Die Ansätze wurden 15 min bei 4°C und 20 000 xg zentrifugiert und der Überstand verworfen. Enthielten die Proben Ammoniumsulfat und waren die Proben für die Proteinbestimmung nach Lowry
bestimmt, so wurde das Präzipitat mit 1 ml 6 % (w/v) TCA gewaschen und erneut wie oben zentrifugiert. Auch dieser Überstand wurde verworfen. Die resultierenden Präzipitate wurden bei Bedarf bei –20°C gelagert.
2.2.7 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
Die Zusammensetzung von Proteingemischen wurde mit Hilfe der SDS-Polyacrylamidgel-elektrophorese nach Lämmli (1970) untersucht. Diese trennt Proteine unter denaturierenden Bedingungen anhand ihrer Mobilität im elektrischen Feld, die proportional zum Molekulargewicht ist.
Der Zusammenbau der Gelkammer, die Polymerisation der 0,75 mm dicken Gele und die Trennung selbst erfolgten nach den Angaben des Herstellers (Bio-Rad Laboratories). Proben wurden entweder direkt mit mindestens einem Volumen Probenpuffer versetzt oder entsprechend Abschnitt 2.2.6 gefällt und das Präzipitat in Probenpuffer aufgenommen. Alle Proben wurden 3 min auf 95°C erhitzt und bei 20 000 xg 5 min zentrifugiert.
Elektrodenpuffer
25 mM Tris
192 mM Glycin
0,1 % (w/v) SDS
Acrylamidlösung (30%)
0,8 % (w/v) N,N´-Methylenbisacrylamid 29,2 % (w/v) Acrylamid
(entspricht 37,5:1 oder T=30 C=2,67) Probenpuffer
125 mM TrisCl pH6,8
4 % (w/v) SDS
4 % (v/v) β-Mercaptoethanol 30 % (v/v) Glyzerin
0,05 % (w/v) Bromphenol Blau
Trenngellösung
375 mM TrisCl pH 8,8 0,1 % (w/v) SDS
10-12 % (w/v) Acrylamid 0,1 % (w/v) APS 0,04 % (v/v) TEMED Sammelgellösung
125 mM TrisCl pH 6,8 0,1 % (w/v) SDS
4 % (w/v) Acrylamid 0,1 % (w/v) APS 0,1 % (v/v) TEMED
2.2.8 Zweidimensionale Gelelektrophorese
Die Trennung von Proteingemischen mit der zweidimensionalen Gelelektrophorese erfolgte unter Verwendung der Immobiline™ DryStrip-Technik von Amersham Pharmacia Biotech und der entsprechenden Produktanweisung.
Erste Dimension
Von den Proben wurden jeweils etwa 270 µg nach Abschnitt 2.2.6 gefällt, allerdings mit 10 % TCA und ohne Zugabe von NaDOC. Die Präzipitate wurden einmal mit 10 % TCA/0,28 % DTT und zweimal mit einem Volumen Aceton gewaschen, dann in je 100 µl Lyse-Puffer gelöst und die Proteinkonzentration nach Bradford bestimmt. Die Proben in Lysepuffer wurden mit Rehydrierungspuffer so verdünnt, dass sich 200 µl Rehydrierungs-lösung mit einer Proteinkonzentration von 250 µg/ml ergaben, in der Immobiline™ DryStrips
pH 3-10L (11 cm) bei 4°C 14 h rehydriert wurden. Die DryStrips wurden bei 20°C und 3 000 V 12 000 Vh fokussiert und anschließend 15 min in je 10 ml SDS-Äquilibrierungspuffer inkubiert.
Lyse-Puffer
48 % (w/v) Harnstoff 4 % (v/v) Triton® X-100 0,49 % (w/v) Tris
0,28 % (w/v) DTT SDS-Äquilibrierungspuffer 50 mM TrisCl pH 8,8
6 M Harnstoff
30 % (v/v) Glyzerin
2 % (w/v) SDS
0,05 % (w/v) Bromphenol Blau
Rehydrierungspuffer 48 % (w/v) Harnstoff 2 % (v/v) Triton® X-100 0,49 % (w/v) Tris
0,28 % (w/v) DTT
2 % (v/v) IPG Stock Buffer pH 3-10L 0,05 % (w/v) Bromphenol Blau
Zweite Dimension
Die äquilibrierten Streifen wurden auf ein 12%iges Trenngel (Abschnitt 2.2.7) gelegt und entsprechend weiterbehandelt.
2.2.9 Coomassiefärbung von Proteinen in Polyacrylamidgelen
Für die Färbung von Proteinen in Polyacrylamidgelen mit Coomassie Brilliant Blau wurden die Gele zunächst in etwa fünf Gelvolumen Färbelösung bei RT und leichtem Schütteln 45 min inkubiert. Danach wurden die Gele in mindestens 10 Gelvolumen Entfärber für mehrere Stunden oder über Nacht entfärbt, bis die Hintergrundfärbung verschwunden war.
Färbelösung
10 % (w/v) TCA 50 % (v/v) Methanol
0,1 % (w/v) Coomassie Brilliant Blau R 250
Entfärber
7,5 % (v/v) Essigsäure 25 % (v/v) Methanol
2.2.10 Silberfärbung von Proteinen in Polyacrylamidgelen
Die Färbung von Proteinen in Polyacrylamidgelen durch kolloidales Silber erfolgte in Anlehnung an Merril et al. (1981). Gele wurden zunächst 20 min in mindestens fünf Gelvolumina Fixierer inkubiert. Anschließend wurde zweimal 10 min in A. pur. gewaschen.
Die Entwicklung der Gele erfolgte in mindestens 50 ml Entwickler pro Gel. Die Entwicklung wurde durch Inkubation in 10%iger (v/v) Essigsäure gestoppt, wenn die Proteinbanden im Vergleich zum Hintergrund optimal gefärbt waren.
Fixierer
50 % (v/v) Methanol 10 % (v/v) Essigsäure 10 % (v/v) Glyzerin
Entwickler
0,5 % (w/v) Silicowolframsäure Hydrat 0,1 % (w/v) AgNO3
0,1 % (w/v) NH4NO3 0,14 % (v/v) Formaldehyd 2,5 % (w/v) Na2CO3