II. Entwicklung eines zweidimensionalen, chromatograpischen
3.4 Zweidimensionale Chromatographie
3.4.2 Zweite Dimension
komplexe Proteinmischung, deren Zusammensetzung sich zum Teil deutlich von derjenigen in Fraktion 26 unterscheidet.
Die Zahl der Fraktionen, auf die die einzelnen Proteine verteilt werden ist recht unterschiedlich. Einige treten nur in einer einzigen Fraktion auf (#18 ~90 kDa, #9 ~23 kDa,
#17 ~18k Da, Abb. 3.24B). Andere wiederum verteilen sich auf bis zu fünf Fraktionen (z.B.
#15-19, ~35 kDa oder #17-20 ~50 kDa). Bei dominanten Proteinen lässt sich diese Verteilung deutlich anhand der UV-Profile in der HIC nachvollziehen ((#15)#17-19 HIC 1 und
#17-20 HIC 2, Abb. 3.26). Im Molekulargewichtsbereich von etwa 50 kDa findet sich in Fraktion 3, dem Durchlauf, eine starke Doppelbande, die auch in Fraktion 8 (Eluat KIEX) und in den ersten Elutionsfraktionen des Anionenaustauschers (#15-18) vorhanden zu sein scheint. Da in Abb. 3.24B allerdings jeweils gleiche Proteinmengen aufgetragen sind, ist die Beurteilung, ob es sich bei Banden gleichen Molekulargewichts auch tatsächlich um dieselben Proteine handelt, nur bedingt möglich. Die weitere Auftrennung der Fraktionen in der zweiten Dimension könnte darüber Aufschluss geben, ob es sich bei der erwähnten Doppelbande, oder bei anderen einander ähnlichen, Proteinbanden, um identische Proteine handelt (vergl. Abb. 3.28, Abschnitt 3.4.3).
# 3
# 8
# 9
#10
x 0.5 x 0.5 x 4
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4
13 18 23 28 33
Zeit [min]
Absorption [A280nm]
Abb. 3.25 Zweite Dimension: HIC des Durchlaufs der ersten Dimension und des Eluats KIEX
Fraktionen der ersten Dimension (s. Abb. 3.24) wurden in der zweiten Dimension entsprechend Abb. 3.22 weiter aufgetrennt. Dargestellt sind die UV-Signale während der Elution der Fraktionen aus der Elution des KIEX und des Durchlaufs (HIC 1 13-23 min, HIC 2 24-36 min). Die Zeitachse für HIC 2 wurde für die Darstellung angepasst. Einige UV-Profile wurden über Verstärkungsfaktoren an die Darstellung angepasst.
In Abschnitt 3.4.1 waren Differenzen in den Elutionsprofilen der ersten Dimension (Abb. 3.23) mit Abweichungen in der Probenvorbereitung begründet worden, also mit einer unterschiedlichen Probenzusammensetzung. Diese Unterschiede sind auch bei dem Vergleich der Elutionsprofile der zweiten Dimension der ersten und zweiten 2D-Chromato-graphie im Anhang zu erkennen (Abb. 7.7 und 7.8, Abschnitt 7.4).
a
b
HIC 1 HIC 2
x 4
#17 x 0.5
#18
#19
#20
#21
#22
#23
#27
x 0.5 x 4 x 0.5
0.00 0.15 0.30 0.45 0.60 0.75 0.90 1.05 1.20
13 18 23 28 33
Zeit [min]
Absorption [A280nm]
Abb. 3.26 Zweite Dimension: HIC ausgewählter Fraktionen des Eluats AIEX
Fraktionen der ersten Dimension (s. Abb. 3.24) wurden in der zweiten Dimension entsprechend Abb. 3.22 weiter aufgetrennt. Dargestellt sind die UV-Signale während der Elution ausgewählter Fraktionen aus der Elution des AIEX (HIC 1 13-23 min, HIC 2 24-36 min). Die Zeitachse für HIC 2 wurde für die Darstellung angepasst. Einige UV-Profile wurden über Verstärkungsfaktoren angepasst.
Insgesamt werden etwa 31 unterscheidbare Peaks beobachtet. Davon treten etwa 75 % in beiden 2D-Trennungen auf. Dies kann als Indiz für eine gute Reproduzierbarkeit des Verfahrens genommen werden. Von den übrigen Peaks verschwinden einige im zweiten
HIC 1 HIC 2
a
b
c d
Lauf jedoch vollständig (a und b, Abb. 7.7; a, Abb. 7.8), während andere erst hinzukommen (d, Abb. 7.7 und 7.8). In einigen Fällen verschieben sich die Peakintensitäten zueinander (c, Abb. 7.7; b und c Abb. 7.8). Diese Abweichungen betreffen nur einige wenige Peaks pro Fraktion der ersten Dimension, während andere Peaks der gleichen Fraktion mit der gleichen Retentionszeit eluieren. Dies bestätigt die Vermutung, dass die Unterschiede zwischen den Trennungen in der zweiten Dimension der ersten und zweiten 2D-Chromatographie durch eine abweichende Proteinzusammensetzung der Proben verursacht wurden (vergl. Abb. 3.23, Abschnitt 3.4.1).
3.4.3 Trennleistung
Zur Beurteilung der Trennleistung der zweiten Dimension wurde die Proteinzusammen-setzung der HIC 1- und HIC 2-Fraktionen für die Fraktionen 3, 8 und 18 der ersten Dimension mittels SDS-PAGE untersucht (Abb. 3.27B sowie Abbildungen 7.9B und 7.10B, Abschnitt 7.4). Wie schon bei der ersten Dimension (Abb. 3.24C) verteilen sich einige Proteine auf bis zu drei Fraktionen, einige sind auf eine Fraktion begrenzt. Im Vergleich zur ersten Dimension hat die Komplexität der Fraktionen wie erwartet deutlich abgenommen.
Teilweise machen nur ein bis drei Proteine mehr als 70 % der aufgetragenen Proteinmenge aus (#15, #19, #22, Abb. 3.27B; #22 Abb. 7.9B; #18-20, #22-24, Abb. 7.10B). Dies stellt eine gute Aufspreizung der Proteine des Modellextraktes dar. Auffällig ist, dass im Durchlauf der HIC 2 zu den Fraktionen 3, 8 und 18 IEX keine Proteine nachgewiesen werden konnten.
Möglicherweise besteht der Durchlauf im Wesentlichen aus Peptiden. Diese würden sowohl in den Proteinbestimmungen nach Lowry und Bradford reagieren, als auch die beobachtete UV-Absorption verursachen (Abb. 3.27). Selbst wenn die Peptide bei der Probenvorbereitung für die SDS-PAGE mittels TCA (Abschnitt 2.2.6) präzipitiert worden wären, so hätten sie auf dem 12%igen Polyacrylamidgel bei Molekulargewichten kleiner als etwa 10 kDa nicht mehr dargestellt werden können.
A
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45
DL1 15 16 17 18 19 20
Fraktion
Absorption [A280nm]
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45
0 2 4 6 8 10Zeit [min]12 14 16 18 20 22
Absorptionsmittel [A280nm]
Absorption [A280nm]
B
C
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45
DL2 21 22 23 24 25
Fraktion
Absorption [A280nm]
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45
2 4 6 8 10 12 14Zeit [min]16 18 20 22 24 26 28
Absorptionsmittel [A280nm]
Absorption [A280nm]
Abb. 3.27 Proteinzusammensetzung der Fraktionen der zweiten Dimension I
Die Durchlauffraktion der ersten Dimension einer zweidimensionalen Trennung (#3, Abb. 3.24) wurde in zwei Schritten mittels HIC aufgetrennt. A Chromatogramm der Trennung bei 1,33 M AS. C Chromatogramm der Trennung bei 2,25 M AS. Die mit Säulen gekennzeichneten Fraktionen wurden zu je 10 µg Protein mittels einer 12%igen SDS-PAGE getrennt (B, Silberfärbung). Ungebundene Proteine der ersten Trennung (#2-9 HIC 1 = DL1) stellen den Auftrag in der zweiten Trennung dar.
In Fraktion 3 war nach der gelelektrischen Auftrennung im Molekulargewichtsbereich von etwa 50 kDa eine starke Doppelbande im SDS-Gel aufgetreten, die auch in den Fraktionen 8 und 15 bis 18 vorhanden zu sein schien (Abb. 3.24B, Abschnitt 3.4.1). Wenn es sich dabei um dieselben Proteine handelte, sollten auch in der zweiten Dimension Proteine mit entsprechenden Molekulargewichten nachweisbar sein. In Abb. 3.28 sind die Fraktionen 22 der HIC 2 für die Fraktionen 3, 8 und 18 der ersten Dimension nach einer SDS-PAGE dargestellt. Die untersuchten Fraktionen zeigen nach der gelelektrophoretischen Auftrennung sehr ähnliche Bandenmuster mit dem erwarteten Molekulargewicht. Eine mögliche Erklärung für die Verteilung dieser 6-8 Proteine auf Durchlauf, KIEX und AIEX der ersten Dimension und deren Zusammenbleiben in der zweiten Dimension wäre ein Proteinkomplex. Dieser hätte eine große Oberfläche mit Möglichkeiten zur Interaktion mit beiden Ionenaustauschern, wäre aufgrund des Durchmessers aber auf die Bindung an den äußeren Partikeloberflächen angewiesen, sodass die Kapazität für seine vollständige Bindung auf dem Kationenaus-tauscher unter Umständen nicht ausreichte. Mit den gezeigten Fraktionen 22 der HIC 2 lägen damit fast reine Komplexpräparationen vor. Andere Proteinverteilungen dieser Art sind sehr wahrscheinlich, allerdings ohne eine Möglickeit zur Identifikation einzelner Banden nur schwer nachweisbar.
Abb. 3.28 Proteinzusammensetzung ausgesuchter Fraktionen der 2. Dimension
Ausschnitte aus Abb. 3.27B, Abb. 7.9B und Abb. 7.10B, Abschnitt 7.4. Fraktion 22 HIC 2 der Fraktionen 3, 8 und 18 der ersten Dimension (M = Marker). 12%ige SDS-PAGE.
3.4.4 Proteinbilanz
In den Abschnitten 3.2 und 3.3 wurden die Proteinbilanzen für die einzelnen Stufen der zwei Dimensionen erstellt, ohne eine Beeinflussung der zweiten Dimension durch die erste zu berücksichtigen. Für die zweidimensionalen Trennungen wurden die Proteinkonzentrationen in den Fraktionen nach Abschnitt 2.2.1 bestimmt und anhand der integrierten UV-Absorptionen korrigiert (s. Abschnitt 2.2.4 und 7.1). Die Mittelwerte aus beiden durchgeführten Trennungen sind in Abb. 3.29 dargestellt. Die Standardabweichungen der bestimmten Proteinmengen sind in Abb. 7.11 (Abschnitt 7.4) in einer entsprechenden Darstellung eingezeichnet.
11% 10%
33%
24% 24%
1%
19% 19%
12% 12% 12%
10% 44%
KIEX 66%
AIEX
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
IEX HIC 1 HIC 2
Proteinverteilung
Verlust Eluat Durchlauf
Abb. 3.29 Proteinbilanz einer zweidimensionalen Trennung
Die Proteinmengen in den Fraktionen zweier 2D-Trennungen wurden in die Kategorien Durchlauf, Eluat und Verlust eingeteilt und die Daten gemittelt. Dargestellt ist die Summierung der Proteinmengen dieser Kategorien im Verlauf der Trennung.
Proteinbestimmung in den Fraktionen nach Abschnitt 2.2.1 und 2.2.2, ergänzt durch Ergebnisse nach 2.2.4.
Die Proteinbilanz der ersten Dimension weist Verluste in Höhe von 12 % auf. Ein Teil dieser Verluste wurde wahrscheinlich durch Handhabung und Adsorption (Abschnitt 3.2) verursacht. Der andere Teil resultiert vermutlich aus einer unvollständigen Elution der Ionen-austauscher, die auch die Abnahme der Trennleistung bei der Wiederholung der Trennung verursachte (Abb. 3.23, Abschnitt 3.4.1). Die Verteilung der gebundenen Proteine auf Kationen- (13 %) und Anionenaustauscher (87 %) entspricht jedoch derjenigen, die in Abb. 3.9 (Abschnitt 3.2.5) für den Tandem-Ionenaustausch gefunden worden war, für den die Extrakte mit PEI behandelt worden waren.
Die Proteinverluste beim Übergang von der ersten Dimension in die erste Stufe der zweiten Dimension (HIC 1) betragen 19 %, was in etwa den Verlusten entspricht, die in Abschnitt 3.3.5 für diesen Schritt ermittelt worden war (Abb. 3.19). Im Gegensatz dazu entspricht die Verteilung der Proteine auf Eluat und Durchlauf mit 35 % zu 65 % nicht der nach Abschnitt 3.3.5 erwarteten 50 % zu 50 % Verteilung. Eine mögliche Ursache könnte in der abweichenden Probenbehandlung liegen. Durch die PEI-Präzipitation werden nicht nur DNA und einige die daran gebundene Proteine, sondern u.U. weitere negativ geladene Proteine entfernt. Für die 2D-Trennungen war jedoch auf die PEI-Präzipitation verzichtet worden, um die Komplexität des Extraktes zu erhalten. Dadurch war möglicherweise der Anteil geladener Proteine im Modellextrakt höher, was den hohen Durchlauf in der ersten Stufe der zweiten Dimension verursacht haben könnte.
Die zusätzlichen Proteinverluste, die durch die zweite Stufe der zweiten Dimension (HIC 2) verursacht werden, sind geringer als erwartet (Abschnitt 3.3.4, Abb. 3.17). Auch hier werden statt der vollständigen Bindung der aufgetragenen Proteine nur 75 % gebunden, während 25 % im Durchlauf auftreten. Dies könnte mit der oben geschilderten, geänderten Probenzusammensetzung zusammenhängen. Bei der Erstellung der Bilanzen wurden die Proteinkonzentrationen im Wesentlichen nach Abschnitt 2.2.1 bestimmt. Konzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze wurden anhand der UV-Absorption (Abschnitt 2.2.4) und Vergleich mit anderen Fraktionen berechnet. Dies betraf insbesondere alle Durchlauf-fraktionen der HIC 2. In diesen Fraktionen konnten mit der SDS-PAGE (Abb. 3.27C, Abb 7.9C und 7.10C) jedoch keine Proteine nachgewiesen werden, obwohl theoretisch eine ausreichende Proteinmenge aufgetragen worden war. Dies lässt vermuten, dass die Proteinmenge im Durchlauf der HIC 2 überbewertet worden ist (Peptide, s.o.). Die entsprechende Proteinmenge müsste dann jedoch den Proteinverlusten zugerechnet werden.