II. Entwicklung eines zweidimensionalen, chromatograpischen
3.3 Hydrophobe Interaktionschromatographie
Die Trennmethode, die in der zweiten Dimension angewendet wurde, ist die hydrophobe Interaktionschromatographie. Die Proteinbindung an HIC-Matrizes wird durch hohe Salzkon-zentrationen im Laufpuffer vermittelt, die aufgrund des sogenannten Aussalzeffektes die Wechselwirkung hydrophober Oberflächenbereiche mit der Matrix ermöglichen oder verstärken. Da dabei auch die Neigung zur Eigenaggregation zunimmt, kann ein komplexes Proteingemisch u. Ust. nicht mit einer einzigen Ammoniumsulfatkonzentration auf einer HIC-Matrix gebunden und anschließend eluiert werden. Neben der Variation der Ammonium-sulfatkonzentration besteht noch die Möglichkeit, die Hydrophobizität der Matrix zu erhöhen, um alle Proteine der Probe bei einer niedrigen Ammoniumsulfatkonzentration zu binden.
Diese beiden Aspekte werden im folgenden Abschnitt untersucht. Auf die Untersuchung anderer Salze als Ammoniumsulfat wurde verzichtet, da Ammoniumsulfat die höchste antichaotrope Wirkung der üblicherweise verwendeten Salze aufweist.
Die Untersuchungen zur Festlegung der Parameter für die zweite Dimension wurden mit einem Hefeextrakt durchgeführt, der nach Abschnitt 2.5.2, ohne PEI-Fällung, hergestellt und nach Abschnitt 2.6.2 in den Laufpuffer umgepuffert worden war. Die Ammoniumsulfat-konzentration wurde durch Verdünnung des Extraktes mit 4 M Ammoniumsulfatlösung eingestellt. Die Verwendung eines Vollextraktes entsprach insofern nicht den realen Bedingungen der 2D-Chromatographie, als die Komplexität des Extraktes höher ist, als die der letztendlich eingesetzten Fraktionen aus der ersten Dimension. Da es im folgenden Abschnitt jedoch nicht um eine Beurteilung der Trennleistung, sondern um die Protein-verteilung auf mehrere Stufen ging, war die Verwendung des Vollextraktes zulässig.
Bei den dargestellten Bilanzen ist generell zu unterscheiden, ob es sich um eine aufsummierte Proteinverteilung über eine Reihe von Trennungen handelt, oder ob die Bilanz nur über eine einzelne Trennung aufgestellt wurde.
3.3.1 Auswahl der Chromatographiematrix
Für die zweite Dimension wurde ein Trägermaterial verwendet, das eine hohe Trennleistung erwarten ließ, hohe Fließgeschwindigkeiten erlaubte und in drei Oberflächensubstitutionen mit unterschiedlichen hydrophoben Eigenschaften erhältlich war. Auf eine experimentelle Beurteilung der Matrizes verschiedener Hersteller wurde verzichtet, da die Auswahl vergleichbarer Produkte sehr begrenzt war.
Zunächst sollte untersucht werden, ob das Ziel, alle Proteine in der hydrophoben Inter-aktionschromatographie zu binden, besser mit funktionellen Gruppen steigender Hydrophobizität, oder mit steigenden Ammoniumsulfatkonzentrationen erreicht werden konnte. Dazu wurden die drei vorgepackten Säulen mit einem Hefeextrakt beladen, der kein Ammoniumsulfat enthielt. Die Säulen wurden eluiert und die Proteinkonzentration in Durchlauf und Eluat bestimmt. Nach der Regeneration wurde der Durchlauf der ersten Trennung erneut aufgetragen, nachdem die Ammoniumsulfatkonzentration um 1 M erhöht worden war. Dieser Vorgang wurde wiederholt, bis eine Ammoniumsulfatkonzentration von 3 M in Probe und Laufpuffer erreicht war.
77%
21% 16%
86% 83%
10% 6%
62%
17%
1%
1%
40%
42%
1%
40% 44% 20%
25% 26%
22%
39% 42%
13% 13%
50% 50%
34%
63%
73% 73%
90%
2%
4%
1% 4%
9%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
0 ETH
1 2 3 0
ISO
1 2 3 0
PHE
1 2 3
Ammoniumsulfatkonzentration [M]
Proteinverteilung
Verlust Eluat Durchlauf
Abb. 3.15 Proteinbilanz der ReSource-HIC-Medien
Vorgepackte Resource-Säulen (PHE, ISO, ETH) wurden mit 5 ±0,5 mg eines Hefe-extraktes beladen und mit A. pur. eluiert. Ungebundene Proteine wurden mit Ammoniumsulfat in steigenden Konzentrationen versetzt (1, 2 und 3 M) und erneut auf die entsprechend reäquilibrierten Säulen aufgegeben. Proteinkonzentrationen in Eluat und Überstand wurden nach Bradford bestimmt (Abschnitt 2.2.2). Dargestellt ist die aufsummierte Verteilung der aufgegebenen Proteinmenge auf die drei Fraktionen.
Laufpuffer: 20 mM Phosphat pH 7,0. Fließgeschwindigkeit: 190 cm/h.
Die Darstellung der summierten Bilanzen zeigt (Abb. 3.15), dass die drei Matrizes sich am stärksten in der Höhe der Verluste unterscheiden, die mit der Stärke der hydrophoben Matrix zunimmt. Die PHE-Matrix weist mit 73 % die höchsten Verluste, allerdings auch die niedrigste Proteinmenge im Durchlauf auf. Dieses Verhältnis ist bei der ETH-Matrix umgekehrt, während die ISO-Matrix eine Zwischenstellung einnimmt. Bei allen drei Matrizes treten die größten Verluste dann auf, wenn auch die stärkste Bindung auftritt. Bei der ETH-und der ISO-Matrix ist dies der Fall beim Übergang von 1 M auf 2 M Ammoniumsulfat, bei der PHE-Matrix bereits beim Übergang von 0 M auf 1 M Ammoniumsulfat.
Eine mögliche Ursache für die hohen Verluste könnte eine Überladung der Säulen in der ersten Trennung sein. Dadurch wären Proteine in die nächste Konzentrationsstufe gelangt, die unter den dort vorliegenden Bedingungen präzipitiert oder irreversibel an die Matrix gebunden haben und damit in der Bilanz fehlen könnten. Dafür spräche auch, dass die in den nachfolgenden Konzentrationsstufen auftretenden Verluste, sowie die Menge der zusätzlich bindenden Proteine, eher unbedeutend sind.
Insgesamt sind die Unterschiede zwischen den Matrizes nicht groß genug, um bei nur einer Ammoniumsulfatkonzentration und mit drei Matrizes unterschiedlicher Hydrophobizität alle Proteine eines Extraktes zu binden und anschließend auch zu eluieren. Daher wurde im weiteren Verlauf dieser Arbeit nur eine Säule verwendet und die Proteinverteilung auf die Säulen der zweiten Dimension über die Ammoniumsulfatkonzentration reguliert, die einen deutlicheren Einfluss auf die Proteinbindung zu haben scheint. Von den drei Matrizes kommt die PHE-Matrix als alleinige Säule nicht in Betracht, weil bereits im ersten Schritt sehr hohe Verluste auftreten. Wegen des niedrigeren Gesamtdurchlaufs der ISO-Matrix und den niedrigeren Verlusten bei 1 M Ammoniumsulfat wird diese der ETH-Matrix vorgezogen, obwohl diese einen niedrigeren Proteinverlust aufweist. Die Zahl der benötigten Säulen oder Konzentrationsstufen ist von dem Bindungs- und Präzipitationsverhalten der Proteine abhängig und wird in den folgenden Abschnitten untersucht.
3.3.2 Ammoniumsulfatpräzipitation
Bevor der Einfluss der Ammoniumsulfatkonzentration auf die Proteinbindung näher bestimmt werden konnte, sollte die Proteinpräzipitation durch Ammoniumsulfat an dem Modellextrakt untersucht werden. Daraus sollten sich Anhaltspunkte ergeben, wann mit der Präzipitation von Proteinen zu rechnen ist und mit welcher Ammoniumsulfatkonzentration die erste Stufe beladen werden kann, ohne zu hohe Verluste zu verursachen.
Das Fällungsverhalten eines Hefeextraktes ist in Abb. 3.16 anhand der Proteinbilanz von Ammoniumsulfatpräzipitationen (Abschnitt 2.2.5) bei steigenden Ammoniumsulfat-konzentrationen dargestellt. Daraus geht hervor, dass eine signifikante Präzipitation erst bei Konzentrationen oberhalb 1,0 M Ammoniumsulfat beginnt und dann gleichmäßig fort-schreitet, bis bei 3 M nur noch etwa 10 % der Proteine im Überstand verbleiben. Die Wiederfindungsrate betrug durchschnittlich 94 ±4,4 %.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
0 0.75 1 1.25 1.5 1.75 2 2.25 2.5 2.75 3
Ammoniumsulfatkonzentration [M]
Proteinverteilung
Verlust [%]
Pellet [%]
Üst [%]
Abb. 3.16 Fraktionierte Ammoniumsulfatfällung
Ein Hefeextrakt wurde mit 3 M Ammoniumsulfatlösung in 100 mM MES pH 6,6 versetzt (ab 2,5 M mit 4 M Ammoniumsulfatlösung), sodass sich die angegebenen Ammonium-sulfatkonzentrationen sowie eine Proteinkonzentration von 4 mg/ml ergaben. Nach 1 h bei 4°C wurde zentrifugiert und der Proteingehalt von Überstand und Präzipitat nach Lowry und Bradford (Abschnitt 2.2.1 und 2.2.2) bestimmt und die Ergebnisse gemittelt.
3.3.3 Proteinbindung bei stufenweiser Erhöhung der Ammoniumsulfat-konzentration
Wenn im Laufe der Trennung alle Proteine eines Hefeextraktes an die ISO-Matrix gebunden und mit möglichst hoher Effizienz auch wieder eluiert werden sollen, muss das Verhalten des Extraktes auf der ISO-Matrix bei steigenden Ammoniumsulfatkonzentrationen untersucht werden. Dazu wurden 2 ml der ISO-Matrix mit einem Hefeextrakt beladen und mit A. pur.
eluiert. Der Durchlauf wurde mit Ammoniumsulfat versetzt und auf die entsprechend reäquilibrierte Säule aufgetragen. Diese Steigerung der Ammoniumsulfatkonzentration wurde in Schritten von 0,25 M solange wiederholt, bis eine Konzentration von 3 M in Probe und Laufpuffer erreicht war. In Abb. 3.17 sind die Proteinbilanzen der einzelnen Trennungen dargestellt.
79%
50%
61%
52%
34%
19% 22%
14% 12% 17% 17%
0%
1%
17%
38%
59% 57%
47% 49%
53% 46%
21%
49%
35% 31% 28% 22% 21%
39% 39% 30%
37%
4%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
0 0.75 1 1.25 1.5 1.75 2 2.25 2.5 2.75 3
Ammoniumsulfatkonzentration [M]
Proteinverteilung
Durchlauf Eluat Verlust
Abb. 3.17 Proteinbindung bei serieller Erhöhung der Ammoniumsulfatkonzentration 2 ml Source™ ISO wurden mit 4 mg eines Hefeextraktes beladen und mit A. pur. eluiert.
Nach Erhöhung der AS-Konzentration im Durchlauf (0,75-3,0 M), wurde dieser erneut auf eine entsprechend äquilibrierte Säule aufgetragen. Laufpuffer: 100 mM MES pH 6,6.
Fließgeschwindigkeit: 305 cm/h. Proteinbestimmung nach Lowry (Abschnitt 2.2.1 und 2.2.6). Bilanz der einzelnen Schritte.
Auch hier fallen zunächst die hohen Proteinverluste von 32 ±8,5 % auf, die hier jedoch nicht wie in Abschnitt 3.3.2 (s.o.) auf eine Überladung zurückgeführt werden können, da sie in jedem Einzelschritt auftraten. Es gibt auch keine Zunahme der Verluste bei höheren Ammoniumsulfatkonzentrationen, sodass angenommen werden kann, dass es sich zumindest teilweise entweder um einen systematischen Fehler bei der Versuchs-durchführung oder um Adsorptions- und Verdünnungverluste handelt. Des Weiteren konnten auch mit bis zu 30 % Ethylenglykol keine Proteine von den benutzten Säulen eluiert werden, sodass eine unvollständige Elution oder Präzipitation auf der Säule ausgeschlossen werden kann. Ein Einfluss der Ammoniumsulfatkonzentration auf die Proteinbestimmungsmethode kann ausgeschlossen werden, da alle Proben zunächst nach Abschnitt 2.2.6 gefällt worden waren.
Eine signifikante Bindung von Proteinen an die ISO-Matrix beginnt erst bei konzentrationen von mehr als 0,75 M, nimmt stark zu bis zu einer Ammoniumsulfat-konzentration von 1,75 M und bleibt dann relativ konstant bei 52 ±4,9 % der aufgetragenen Proteinmenge, wenn die Erhöhung der Ammoniumsulfatkonzentration 0,25 M in jedem Schritt beträgt. Die Gründe für die Entscheidung über die Auslegung der Stufen der zweiten Dimension werden in Abschnitt 3.3.4 dargelegt.
3.3.4 Präzipitation und Bindung im Vergleich
In den Abschnitten 3.3.2 und 3.3.3 ist das Verhalten des Hefeextraktes bei schrittweiser Erhöhung der Ammoniumsulfatkonzentration in Bezug auf Präzipitation bzw. Bindung an eine HIC-Matrix untersucht worden. In Abb. 3.18 sind die präzipitierten bzw. gebundenen
Proteine als Anteil der insgesamt wiedergefundenen Proteinmenge dargestellt. Verluste werden aus den oben genannten Gründen vernachlässigt. Die präzipitierte Proteinmenge bei 0 M Ammoniumsulfat ist nicht eingetragen, da es sich bei diesem Wert, wie auch bei 1,25 M, sehr wahrscheinlich um eine Fehlbestimmung handelt. Der vermutete Verlauf der Präzipitationskurve im Bereich von 1,25 M Ammoniumsulfat ist in Abb. 3.18 angedeutet.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
Ammoniumsulfatkonzentration [M]
Proteinverteilung
Präzipitat Eluat
A B
Abb. 3.18 Vergleich von Bindungs- und Präzipitationsverhalten eines Hefeextraktes Darstellung der Proteinmengen, die bis zu den dargestellten Ammoniumsulfat-konzentrationen präzipitieren oder an eine Source ISO-Matrix binden, wenn die Konzentrationen in 0,25 M-Schritten erhöht werden (s. Abb. 3.16, bzw. Abb. 3.17, Abschnitt 3.3.2 und 3.3.3).
Der Abstand der beiden Kurven in Abb. 3.18 beträgt zwischen 0,75 und 1,25 M Ammonium-sulfat. Dies entspricht der maximal möglichen Erhöhung der Ammoniumsulfatkonzentration beim Übergang von einer Konzentration zur nächsten und gibt so die Zahl und Konzentration der Stufen vor, die mindestens erforderlich sind, um alle Proteine eines Extraktes zu binden, ohne deren Präzipitation auszulösen. Nach Abb. 3.18 sind bei einem Hefeextrakt und einer ISO-Matrix lediglich zwei Stufen notwendig, um dieses Ziel zu erreichen. Bei einer gleichmäßigen Verteilung auf zwei Säulen ergeben sich aus Abb. 3.18 eine Ammonium-sulfatkonzentration von 1,38 M für die erste und 2,25 M für die zweite Stufe der zweiten Dimension. Bei 1,38 M Ammoniumsulfat (Punkt A, Abb. 3.18) binden 50 % der Proteine, während etwa 5 % präzipitieren (vermuteter Verlauf der Kurve, Abb. 3.18). Da Verluste durch Präzipitation möglichst vermieden werden sollten, wurde die Ammoniumsulfatkonzentration der ersten Stufe im nachfolgenden Abschnitt nochmals eingehend bestimmt. Bei der Ammoniumsulfatkonzentration in der zweiten Stufe wird davon ausgegangen, dass der Teil der Proteine, der bei mehr als 2,25 M Ammoniumsulfat präzipitieren würde, bereits in der ersten Stufe aus den Fraktionen entfernt worden ist, und der verbliebene Teil an die Matrix bindet (Punkt B, Abb. 3.18). Damit sollten mehr als 95 % der aufgetragenen Proteine an die ISO-Matrix gebunden und während der anschließenden Elution getrennt werden können.
3.3.5 Bestimmung der Ammoniumsulfatkonzentrationen der ersten Stufe
Im vorhergehenden Abschnitt war die Ammoniumsulfatkonzentration der ersten Stufe auf 1,38 M bei 50 % Proteinbindung festgelegt worden. Dieser Wert war jedoch mit einem seriellen Versuchsaufbau ermittelt worden, d.h. dem Durchlauf bei einer niedrigen Ammoniumsulfatkonzentration wurde Ammoniumsulfat zugesetzt und dieser dann unter Verwendung eines entsprechend höher konzentrierten Laufpuffers erneut aufgetragen. Bei der ersten Stufe der zweiten Dimension würden die Fraktionen aus der ersten Dimension dagegen direkt mit 1,38 M Ammoniumsulfat versetzt werden. Wie aus Abb. 3.18 hervorgeht, tritt bei dieser Konzentration jedoch eine Präzipitation von etwa 5 % der eingesetzten Proteine auf. Die genauere Untersuchung der ersten Stufe der HIC wurde daher unter Verwendung eines parallelen Ansatzes durchgeführt, bei dem der Modellextrakt direkt mit Ammoniumsulfat versetzt und auf die ISO-Matrix aufgetragen wurde.
96% 88%
57% 59%
42%
30% 26%
23%
35%
34%
48% 61%
7%
20%
6%
24% 22% 16%
4%
4%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
0 1 1.2 1.25 1.3 1.4 1.5
Ammoniumsulfatkonzentration [M]
Proteinverteilung
Verlust Eluat Durchlauf
Abb. 3.19 Proteinbindung in Abhängigkeit von der Ammoniumsulfatkonzentration 2 ml Source™ ISO wurden mit 5 ±0,5 mg eines Hefeextraktes beladen, der zuvor mit der angegebenen Menge Ammoniumsulfat versetzt worden war. Doppelbestimmung.
Stufenelution mit A. pur.. Laufpuffer: 100 mM MES pH 6,6 inklusive der angegebenen Ammoniumsulfatkonzentration. Fließgeschwindigkeit: 305 cm/h. Proteinbestimmung nach Bradford (Abschnitt 2.2.2).
In Abb. 3.19 sind die Proteinbilanzen verschiedener paralleler Versuche zusammengefasst, wobei jede Ammoniumsulfatkonzentration mindestens zweimal untersucht wurde. Die auftretenden Proteinverluste schwanken stark und lassen die Zunahme der Verluste, die aufgrund der Präzipitationszunahme (s. Abb. 3.16, Abschnitt 3.3.2) zu erwarten war, beim Übergang zu höheren Ammoniumsulfatkonzentrationen nicht erkennen. Die Standardabweichungen der Proteinverluste bei unterschiedlichen Startkonzentrationen weichen stark voneinander ab und betragen im Mittel 6,1 % der Proteinmenge (max. 12 % bei 1,5 M Ammoniumsulfat, Abb. 7.6, Abschnitt 7.3). Dagegen variiert die Proteinverteilung auf Durchlauf und Eluat im Durchschnitt nur um 2,5 % (±1,3 %). Die fehlende Zunahme der Verluste mit steigender Ammoniumsulfatkonzentration und die großen Schwankungen bei einem gleichbleibenden Verhältnis zwischen Durchlauf und Eluat lassen vermuten, dass die
aufgetretenen Verluste im Wesentlichen nicht durch Präzipitation entstehen. Vielmehr wird angenommen, dass es sich um unspezifische Verluste handelt, die durch die Proben-handhabung, Verdünnung oder Adsorption an benetzte Oberflächen entstehen.
Ein Vergleich der Proteinverteilungen aus den parallelen Versuchen mit denen der seriellen Versuche aus Abschnitt 3.3.3 (Abb. 3.17) in Abb. 3.20 zeigt, dass die Werte sehr gut übereinstimmen. Die Proteinbindung bei der parallelen Vorgehensweise ist nur wenig stärker als bei der seriellen Bindung. Die gute Übereinstimmung der beiden Kurven ist ein weiteres Argument für die These, dass die beobachteten Verluste unspezifischer Natur sind und nur wenig mit der Zugabe von Ammoniumsulfat zu tun haben.
1.33 M 0%
25%
50%
75%
100%
0 0.5 1 1.5 2 2.5
Ammoniumsulfatkonzentration Proteinverteilung Durchlauf seriell
Eluat seriell Durchlauf parallel Eluat parallel
Abb. 3.20 Vergleich paralleler und serieller Bindung
Zusammenfassung der Werte aus den Abb. 3.17 und Abb. 3.19 (Abschnitt 3.3.3 und 3.3.5). Dargestellt ist nur die Verteilung der Proteine auf Durchlauf und Eluat, Verluste sind nicht berücksichtigt. Bei den Eluaten der seriellen Bindung handelt es sich um summierte Werte.
Da in der zweiten Dimension mit mindestens zwei Stufen gearbeitet werden soll, wird für die erste Stufe der zweiten Dimension eine Ammoniumsulfatkonzentration von 1,33 M festgelegt. Damit sollten etwa 50 % der Proteine an die Matrix gebunden werden. In der zweiten Stufe werden dann 2,25 M Ammoniumsulfat verwendet, um die restliche Protein-menge zu binden (s. Abschnitt 3.3.4).
3.3.6 Belastungstabilität der Source™ ISO-Matrix
Die in den vorangegangenen Abschnitten aufgetretenen Proteinverluste wurden bereits weit-gehend als Verluste erkannt, die nicht auf der Trennsäule entstehen. Dennoch sollte die ISO-Matrix hinsichtlich einer eventuellen Präzipitation innerhalb der Matrix untersucht werden. Eine solche Präzipitation müsste, da sie die Kapazität der Matrix verringert, auch die Trennleistung der Säule reduzieren. Dazu wurde eine Säule mit hohen Proteinmengen beladen und die Trennleistung vor, zwischen und nach zwei solcher Belastungstrennungen
verglichen. Die Referenztrennungen wurden mit 10 % der Proteinmenge durchgeführt, die für die Belastungsläufe verwendet worden war.
A
11% 16% 14%
47%
67%
60%
42%
18% 25%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Referenz 1 Überladung 1 Referenz 3
Proteinverteilung
Verlust Eluat Durchlauf
B
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
35 40 45 50 55 60 65 70
Zeit [min]
Absorption [A280nm]
-1 0 1 2 3 4 5 6 7
Leitfähigkeit [mS/cm]
Referenz 1 [A280nm]
Referenz 3 [A280nm]
Leitfähigkeit [mS/cm]
Abb. 3.21 Einfluss hoher Proteinbeladungen auf das Trennverhalten der HIC-Matrix 2 ml Source™-ISO wurden ohne Regenerierung in 5 Trennungen abwechselnd mit 4,1 mg und 41,4 mg eines Hefeextraktes beladen, der 2 M AS enthielt (Referenz 1-3, bzw. Überladung 1+2). Die Elution erfolgte mit einem Gradienten von 2-0,7 M AS, sowie einer Stufe auf A. pur.. Dargestellt sind die Proteinbilanzen der ersten und letzten Referenz- sowie der ersten Überladungstrennung (A). In B sind die Elutionsprofile der ersten und der letzten Referenztrennung überlagert. Laufpuffer: 20 mM Phosphat pH 7,0 / 2 M Ammoniumsulfat. Fließgeschwindigkeit: 305 cm/h. Proteinbestimmung nach Abschnitt 2.2.3 und 2.2.4.
In Abb. 3.21A sind die Proteinbilanzen der ersten und dritten Referenz- und der ersten Belastungstrennung dargestellt, während in Abb. 3.21B die Chromatogramme der ersten und dritten Referenz überlagert worden sind. Zunächst fallen wieder die stark unterschiedlichen Verluste zwischen den drei Proteinbilanzen auf. Der geringste Verlust tritt mit 18 % bei dem
Belastungslauf auf. Bei allen drei Proteinbilanzen ist jedoch das Verhältnis zwischen Durchlauf und Eluat gleich: 81 % der wiedergefundenen Proteinmenge befindet sich im Eluat, 19 % im Durchlauf (Standardabweichung 1,5 %).
Ein Vergleich der Gesamtflächen unter den Chromatogrammen ergibt für die drei Referenzläufe nur eine Abweichung von ±3,1%, für die Belastungsläufe eine Abweichung von 0,8 %. Dies widerspricht deutlich den Unterschieden in der Proteinwiederfindung in Abb. 3.21A und belegt, zusammen mit der konstanten Verteilung der Proteine auf Durchlauf und Eluat, dass es sich bei den auftretenden Verlusten größtenteils um Handhabungsverluste handelt. Auch eine signifikante Präzipitation zwischen oder in den Adsorberpartikeln findet nicht statt, wie Abb. 3.21B zeigt. Die Trennleistung nach wiederholter Belastung mit hohen Proteinkonzentrationen (Referenz 3) ist gegenüber der ersten Referenztrennung nicht gesunken.
3.3.7 Peak-Kapazität der zweiten Dimension
Die Peak-Kapazität der Source™ ISO-Matrix wird aus Abb. 3.21 (Abschnitt 3.3.6) für die hier verwendete 2 ml Säule abgeleitet. Der Peak bei t ≈ 61 min wird als hinreichend getrennt definiert. Dieser nimmt ein Elutionsfenster von etwa 3 min ein. Bei einer Gesamtelutions-dauer von 30 min ergibt sich eine Peak-Kapazität von etwa 8 bei einem Ammoniumsulfat-gradienten von 2 bis 0,7 M.