II. Entwicklung eines zweidimensionalen, chromatograpischen
2.5 Herstellung von Proteinextrakten
2.4.6 ββββ-Galactosidase-Aktivität
Zur Bestimmung der β-Galactosidase-Aktivität in Proben wurde die Zunahme der Absorption beobachtet, die durch die Bildung von o-Nitrophenol in der folgenden Reaktion verursacht wurde:
o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid
→ → → →
o-Nitrophenol + D-Galactose (EC 3.2.1.23)Eine Einheit ist definiert als die Enzymmenge, die unter den Testbedingungen pro Minute ein Mikromol o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid zu o-Nitrophenol und D-Galactose hydrolysiert.
Von jeder Probe wurden mindestens drei Verdünnungsstufen (1:2) hergestellt und diese in je drei Ansätzen bestimmt. Pro Ansatz wurden 25 µl in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte vorgelegt, mit 100 µl Z-Puffer versetzt und 10 min bei 37°C äquilibriert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 µl Reaktionslösung gestartet und nach 30 min bei 37°C durch Zugabe von 100 µl Stop-Lösung beendet. Die Messung der Absorption bei 405 nm erfolgte mit einem Mikrotiterplattenphotometer.
Standard
Der verwendete Standard enthielt nach Sigma zu 10 U/ml β-Galactosidase. Zur Kontrolle der Enzymaktivität wurde der Standard in Verdünnungen von 1:100, 1:1 000 und 1:10 000 mit dem vierfachen Volumen Z-Puffer versetzt und bei 37°C äquilibriert. Die Reaktion wurde durch Zugabe des doppelten Probenvolumens Reaktionslösung gestartet und nach 30 min mit dem vierfachen Probenvolumen Stopp-Lösung beendet. Die Absorption bei 420 nm wurde bestimmt und die Aktivität unter Zuhilfenahme des Gesetzes von Lambert-Beer berechnet (Schichtdicke 1cm,
ε
oNP; 420nm = 4500 l *mol-1 * cm-1 ). Die ermittelte Aktivität von 28 U/ml wurde als Ausgangswert bei allen Berechnungen verwendet.Die internen Standards auf den Mikrotiterplatten bestanden aus Verdünnungsreihen von 2,8 bis 0,04 U/ml in Doppelbestimmung.
Z-Puffer
100 mM Na-Phosphat pH 7,0
10 mM KCl
1 mM MgSO4•7 H2O 0,05 M β-Mercaptoethanol
Stopp-Lösung 1 M Na2CO3
Reaktionslösung
0,233 % (w/v) ONPG in Z-Puffer
zentrifugiert und der Überstand bei 4°C und 30 000 xg weitere 30 min zentrifugiert. Als Rohextrakt wurde der Überstand der zweiten Zentrifugation bezeichnet. Der Proteingehalt des Rohextraktes lag bei durchschnittlich 2,0 ± 0,3 mg/ml
Aufschlusspuffer
200 mM Phosphatpuffer pH 7,5
10 mM EGTA
1 mM PMSF
5 mM DTT
5 mM Aminohexan 1 mM Benzamid
1 mM Benzamidinhydrochlorid 1 µg/ml Antipain
1 µg/ml Leupeptin 1 µg/ml Aprotinin
2.5.2 Glasperlenaufschluss von Saccharomyces cerevisiae im Reagenzglas Der Aufschluss der Hefezellen erfolgte in Anlehnung an Naganuma et al. (1984). Die verwendete Biomasse ist haushaltübliche Bäckerhefe aus dem Lebensmittelhandel. Vor der Verwendung wurde diese in dem zehnfachen Volumen A. pur. suspendiert und bei 5 000 xg 10 min präzipitiert. Dieser Vorgang wurde einmal wiederholt. Das resultierende Präzipitat wurde in dem zweifachen Volumen A. pur. resuspendiert, erneut präzipitiert und bei -20°C gelagert.
Jeweils 1 g gewaschene Hefebiomasse wurde in 850 µl Aufschlusspuffer resuspendiert und zu 7 g Glasperlen (∅ 3 mm) in einem Reagenzglas gegeben. Das Reagenzglas wurde auf Eis abgekühlt und viermal je 1 min auf dem Reagenzglasschüttler geschüttelt. Zwischen den Intervallen wurde das Reagenzglas für etwa 5 min auf Eis gelagert. Der Rohaufschluss wurde abgesogen und die Glasperlen zweimal mit je 800 µl Aufschlusspuffer nach-gewaschen. Die Waschlösungen wurden mit dem Rohaufschluss vereinigt und 15 min bei 4°C und 20 000 xg zentrifugiert. Der Überstand wurde vollständig in ein neues Gefäß überführt und weitere 30 min zentrifugiert. Dieser zweite Überstand wurde ohne die Lipidschicht abgenommen und stellte den Rohextrakt dar. Die Proteinbestimmung in allen Rohextrakten nach Bradford (Abschnitt 2.2.2) ergab eine durchschnittliche Proteinkonzen-tration von 16,4 ± 2,3 mg/ml.
Aufschlusspuffer 50 mM TrisCl pH 7,9 1 % (w/v) DMSO
1 mM EGTA
1 mM EDTA
1 mM PMSF
1 mM Benzamidinhydrochlorid 1 µg/ml Leupeptin
3 µg/ml Pepstatin
2.5.3 Aufschluss von Saccharomyces cerevisiae in der Glaskugelmühle
Um dauerhaft einen einheitlichen Hefeextrakt zur Verfügung zu haben, wurden 504 g Bäckerhefe aus dem Lebensmittelhandel in der Glaskugelmühle aufgeschlossen und als Rohaufschluss bei –80°C gelagert.
Vor der Verwendung wurde die Hefe in je 1 l A. pur. und 1 l 20 mM MES-Puffer pH 6,6 gewaschen. Dazu wurde die Biomasse jeweils zunächst suspendiert und dann 20 min bei 5 000 xg in der Zentrifuge präzipitiert.
Das Präzipitat nach dem zweiten Waschschritt wurde in 250 ml Aufschlusspuffer suspendiert. Der Mahlbehälter der Kugelmühle (600 ml) wurde mit 520 ml Glasperlen (Schüttvolumen, ∅ 0,5 mm) befüllt und auf 4°C gekühlt. Das Volumen zwischen den Glasperlen betrug 40 % des Schüttvolumens. Während das Mahlwerkzeug mit 2 000 rpm rotierte wurde die Hefesuspension mit 167 ml/min durch den Mahlbehälter gepumpt. Nach drei Durchgängen durch die Kugelmühle ergab sich mikroskopisch eine Aufschlussrate von etwa 95 %. Der Mahlbehälter wurde bei drehendem Mahlwerkzeug zweimal mit 250 ml Aufschlusspuffer gespült, sodass insgesamt 1,206 l Hefesuspension resultierte. Diese wurde mit 134 ml Glyzerin versetzt und in Aliquots in flüssigem Stickstoff eingefroren, die dann bei –80°C gelagert wurden.
Die weitere Aufarbeitung erfolgte nach dem Auftauen des Rohextraktes wie unter Abschnitt2.5.2 beschrieben. Der Rohaufschluss wurde 15 min bei 4°C und 20 000 xg zentrifugiert, der Überstand vollständig in ein neues Gefäß überführt und weitere 30 min zentrifugiert. Dieser zweite Überstand wurde ohne die Lipidschicht abgenommen und stellte den Rohextrakt dar. Die Proteinbestimmung in allen Rohextrakten nach Bradford ergab eine durchschnittliche Proteinkonzentration von 28,6 ±2,1 mg/ml.
Aufschlusspuffer
200 mM MES-Puffer pH 6,6
1 mM PMSF
1 mM Benzamidinhydrochlorid 1 mM Benzamid
1 mM 6-Aminohexan
2.5.4 DNA-Fällung mit Polyethylenimin
Um die DNA aus den Rohextrakten zu entfernen und die Sedimentation von Zelltrümmern zu verbessern, wurde den Rohaufschlüssen zum Teil Polyethylenimin zugesetzt, welches aufgrund der hohen positiven Ladung die stark negativ geladene DNA bindet und mit dieser präzipitierbar ist.
Rohaufschlüsse von S. cerevisiae wurden mit einer 5%igen (v/v) PEI-Lösung zu End-konzentrationen von 0,05 bis 0,5 % PEI versetzt, gemischt und 10 min bei 4°C inkubiert.
Nach einer Zentrifugation von 30 min bei 4°C und 20 000 xg wurde das Präzipitat verworfen und der Überstand als Rohextrakt weiterverwendet.
2.6 Chromatographische Methoden
2.6.1 Allgemeines
Der allgemeine Aufbau des chromatographischen Systems ist in Abb. 2.1 (Abschnitt 2.1) dargestellt.
Die in der Chromatographie verwendeten Laufpuffer wurden vor dem Gebrauch durch 0,22 µm-Membranen gefiltert und im Vakuum einer Wasserstrahlpumpe entgast, bis keine Blasenbildung mehr zu beobachten war. Proben wurden mit Hilfe einer Einwegspritze und Vorsatzfiltern, Porengröße 0,22 µm, direkt vor dem Auftrag filtriert.
Die Temperatur während der Größenausschluss- und der Ionenaustauschchromatographie betrug 4°C. Die hydrophobe Interaktionschromatographie wurde bei Raumtemperatur durchgeführt.
2.6.2 Größenausschlusschromatographie
Die Größenausschlusschromatographie wurde zum Pufferwechsel bei der Proben-vorbereitung angewandt. Durch die Ausschlussgröße ergibt sich eine Gruppenseparation von Molekülen größer als 5 000-6 000 Da von solchen, die kleiner als etwa 1 000 Da sind.
Für Probenvolumina bis 750 µl wurden Fertigkartuschen verwendet, deren Spezifikationen in Tab. 2.1 dargestellt sind. Probenvolumina bis 2,25 ml wurden auf bis zu drei hintereinander geschaltete Kartuschen aufgetragen.
Tab. 2.1 Chromatographiekartuschen für die Gruppenseparation Econo-Pac® P6
Cartridge HiTrap™ Desalting
Volumen 5 ml 5 ml
Säulendimensionen 14 x 33 mm 16 x 25 mm
Matrix Bio-Gel P-6DG Sephadex G-25
Superfine
Partikeldurchmesser 90-180 µm 15–70 µm
Ausschlussgröße 6 000 Da 5 000 Da
Flussrate 1 ml/min 1 ml/min
Fließgeschwindigkeit 39 cm/h 30 cm/h
Totvolumen 1,8 ml 1,5 ml
Probenvolumen (max.) 750 µl 750 µl
Die Kartuschen wurden anstelle der Injektionsschleife an einem AV 7/3-Ventil angeschlossen und bei 4°C mit dem Puffer äquilibriert, in den die Probe überführt werden sollte. Die Injektion der Probe erfolgte mit einer Einwegspritze, wodurch sich die Probenverdünnung im Vergleich zur Verwendung einer Injektionschleife verringerte. Noch größere Probenvolumina wurden auf Säulen bearbeitet, die mit Bio-Gel P-6DG gepackt waren.
2.6.3 Ionenaustauschchromatographie
Die Durchführung der Ionenaustauschchromatographie richtete sich nach den Hersteller-angaben für die verschiedenen Säulenmatrizes und war außerdem abhängig von den Säulendimensionen. Vor dem Auftrag der Proben wurden die Säulen zunächst mit Laufpuffer äquilibriert, bis die Leitfähigkeit des Eluates der des Laufpuffers entsprach und ein stabiler UV-Absorptionswert erreicht war. Handelte es sich um die erste Verwendung der Matrix nach einer längeren Lagerung in 20 % Ethanol, so schloss sich an die Äquilibrierung mit dem Ladepuffer eine Äquilibrierung mit dem Elutionspuffer an, um zu kontrollieren ob Kontaminationen auf der Säule vorlagen. War dies der Fall, erkennbar an einem steigenden UV-Signal bei steigender Leitfähigkeit, so wurde die Matrix entsprechend den Herstellerangaben gereinigt. Nach der Reäquilibrierung der Matrix im Ladepuffer wurde die Probe mittels Umschalten des Injektionsventil aus der Probenschleife auf die Säule gespült (s. Abb. 2.1).
An den Auftrag der Probe schloss sich eine Waschphase an, während derer das UV-Signal im Normalfall wieder auf den Wert während der Äquilibrierung zurückging. Anschließend wurden die gebundenen Proteine durch eine stufenweise oder graduelle Umstellung des Laufpuffers von Lade- auf Elutionspuffer eluiert (von 0 auf 100 % Elutionspuffer). Im Vergleich zum Ladepuffer enthielt der Elutionspuffer zusätzlich 1 M NaCl und war ansonsten identisch mit ersterem. Das Eluat wurde bei Bedarf in Reaktionsgefäßen gesammelt.
Nach Abschluss der Elution wurde die Säulenmatrix durch Waschen mit mindestens 3 Säulenvolumina 2 M NaCl-Lösung regeneriert und dann für die nächste Trennung in Laufpuffer äquilibriert. Alle Matrizes wurden vor einer längeren Lagerung mit A. pur. gespült und dann in 20 % Ethanol bei 4°C gelagert.
2.6.4 Tandem-Ionenaustauschchromatographie
Im Vergleich mit der Ionenaustauschchromatographie nach Abschnitt 2.6.3, wurden bei der Tandem-IEX statt einer zwei IEX-Säulen gegensätzlicher Ladung eingesetzt. Durch zwei zusätzliche AV 7/3-Ventile konnten die Säulen jeweils einzeln oder gemeinsam in den Fluss geschaltet werden. Für Äquilibrierung und Beladung wurden die Säulen hintereinander geschaltet, sodass der Durchlauf der ersten Säule den Auftrag der zweiten Säule darstellte.
Zur Elution und Regenerierung wurden die Säulen einzeln und nacheinander in den Fluss geschaltet.
2.6.5 Hydrophobe Interaktionschromatographie
Die Durchführung der hydrophoben Interaktionschromatographie richtete sich nach den Herstellerangaben für die Säulenmatrizes und war außerdem abhängig von den Säulendimensionen. Vor dem Auftrag der Proben wurden die Säulen zunächst mit Laufpuffer äquilibriert, bis die Leitfähigkeit des Eluates der des Laufpuffers entsprach und ein stabiler UV-Absorptionswert erreicht war. Handelte es sich um die erste Verwendung der Matrix nach einer längeren Lagerung in 20 % Ethanol, so schloss sich an die Äquilibrierung mit dem Ladepuffer eine Äquilibrierung mit dem Elutionspuffer an, um zu kontrollieren ob Kontaminationen auf der Säule vorlagen. War dies der Fall, erkennbar an einem steigenden UV-Signal bei sinkender Leitfähigkeit, so wurde die Matrix entsprechend der Hersteller-angaben gereinigt.
Die Proben wurden vor der Aufgabe mit 4 M Ammoniumsulfatlösung versetzt, sodass sich eine Ammoniumsulfatkonzentration ergab, die derjenigen im Laufpuffer entsprach. Nach dem Befüllen der Injektionsschleife wurde die Probe durch Schalten des Injektionsventils aus der Schleife auf die Säule gespült.
An den Auftrag der Probe schloss sich eine Waschphase an, während derer das UV-Signal im Normalfall wieder auf den Wert während der Äquilibrierung zurückging. Anschließend wurden die gebundenen Proteine durch eine stufenweise oder graduelle Umstellung des Laufpuffers von Lade- auf Elutionspuffer eluiert. Im Vergleich zum Ladepuffer enthielt der Elutionspuffer kein Ammoniumsulfat. Das Eluat wurde bei Bedarf in Reaktionsgefäßen gesammelt.
Nach Abschluss der Elution wurde die Säulenmatrix durch Waschen mit mindestens 3 Säulenvolumina A. pur. regeneriert und dann für die nächste Trennung in Laufpuffer äquilibriert. Alle Matrizes wurden vor einer längeren Lagerung mit A. pur. gespült und dann in 20 % Ethanol bei 4°C gelagert.
2.6.6 Zweidimensionale Chromatographie
Die zweidimensionale chromatographische Trennung bestand aus einer Tandem-IEX in der ersten und einer zweistufigen HIC in der zweiten Dimension.
Erste Dimension
Der zu trennende Proteinextrakt wurde entsprechend Abschnitt 2.6.4 in einer Tandem-IEX fraktioniert. Dabei wurden die folgenden Säulen verwendet:
Erste Säule: 2,0 ml SP-Sepharose® FF in Bio-Scale MT 2 (7x52 mm) Zweite Säule: 6,6 ml Q HyperD® 20 in HR 10/10 (10x84 mm) Die Säulen wurden mit 20 mM MES-Puffer pH 6,6 äquilibriert und in Reihe mit 2,5 ml eines Hefeextraktes beladen, der entsprechend Abschnitt 2.5.3 ohne PEI-Fällung hergestellt und nach Abschnitt 2.6.2 in den Laufpuffer überführt worden war, sodass sich eine Proteinkonzentration von ca. 10 mg/ml ergab. Die Flussrate während der Tandem-IEX betrug 1 ml/min (156 cm/h KIEX, 76,4 cm/h AIEX), die Fraktionsgröße 3 ml. Um genügend Fraktionsvolumen für die folgenden Schritte zur Verfügung zu haben, wurde die Tandem-IEX zweimal durchgeführt und wurden gleiche Fraktionen vereinigt. Die Gesamtprobenmenge betrug somit 200 % im Vergleich zur angestrebten Proteinbeladung von 25 mg (=100 %).
Zweite Dimension
In der zweiten Dimension wurden ausgewählte Fraktionen der ersten Dimension in einer HIC nach Abschnitt 2.6.5 in zwei Stufen getrennt. Die Säule (HR 5/10, 5x10,2 mm) war mit 2 ml Source ISO gefüllt und wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 305,6 cm/h verwendet. Die Fraktionsgröße betrug in beiden Stufen 1 ml. Die Elution gebundener Proteine erfolgte durch graduelle Umstellung des Zulaufs auf A. pur..
Die Säule wurde in der ersten Stufe mit 100 mM MES-Puffer pH 6,6 / 1,33 M Ammonium-sulfatlösung äquilibriert und mit den Fraktionen der ersten Dimension beladen, deren Ammoniumsulfatkonzentration auf 1,33 M angehoben worden war. Das Probenvolumen für die erste Stufe wurde so bemessen, dass, verglichen mit dem Probenvolumen von 2,5 ml der ersten Dimension, 122 % der Probenmenge der ersten Dimension auf die erste Stufe der zweiten Dimension gelangten. Der Durchlauf der ersten Stufe der HIC wurde gesammelt und die Ammoniumsulfatkonzentration auf 2,25 M angehoben. Die Säule wurde in der zweiten Stufe mit 100 mM MES-Puffer pH 6,6 / 2,25 M Ammoniumsulfat äquilibriert und mit dem Durchlauf der ersten Stufe beladen. In die zweite Stufe der zweiten Dimension gelangten noch 91,4 % der Probenmenge der ersten Dimension.
3 Ergebnisse
In der vorliegenden Arbeit sollte ein automatisierbares chromatographisches Trennverfahren entwickelt werden, das mit nur zwei Trennmethoden ein komplexes Proteingemisch in Fraktionen mit deutlich niedrigerer Komplexität zerlegt, eine zweidimensionale Chromatographie. Dazu wurde im ersten Schritt die Ionenaustauschchromatographie und im zweiten die hydrophobe Interaktionschromatographie eingesetzt. In den folgenden Abschnitten wird zunächst die Anpassung der Parameter dieser beiden Methoden an das Trennziel dargestellt. Im Anschluss daran ist die Verbindung der beiden Dimensionen zur zweidimensionalen Chromatographie beschrieben.
Zur Beurteilung der Trennleistung und der Effizienz der verwendeten chromatographischen Methoden wurden drei wichtige Hilfsmittel angewandt: das Chromatogramm als unmittel-bares Abbild der Trennung, die SDS-PAGE, die die Komplexität der Probe sichtbar macht, und die Proteinbilanz. Als komplexes Proteingemisch diente ein Extrakt aus Saccharomyces cerevisiae, dessen Herstellung in Kapitel 2 beschrieben ist. Alternativ und ergänzend wurde neben dem Hefeextrakt ein Extrakt aus Catharanthus roseus verwendet.
Alle absoluten Proteinmengen in den folgenden Abschnitten beziehen sich auf die Proteinbestimmung nach Bradford (Abschnitt 2.2.2).
Die zweidimensionale Chromatographie erfordert in der hier vorgeschlagenen Konzeption eine Probenzusammensetzung, die strengen Kriterien genügen muss, um ein reproduzierbares Trennergebnis zu erhalten. Eine Vorkonditionierung der Probe innerhalb des Systems würde die Einhaltung dieser Kriterien vereinfachen, erforderte jedoch eine Vorstufe oder „nullte“ Dimension. Zwei Vorschläge zur integrierten Probenvorbereitung werden daher vor den eigentlichen Trennverfahren dargestellt.