II. Entwicklung eines zweidimensionalen, chromatograpischen
2.4 Enzymanalytik
Fixierer
50 % (v/v) Methanol 10 % (v/v) Essigsäure 10 % (v/v) Glyzerin
Entwickler
0,5 % (w/v) Silicowolframsäure Hydrat 0,1 % (w/v) AgNO3
0,1 % (w/v) NH4NO3 0,14 % (v/v) Formaldehyd 2,5 % (w/v) Na2CO3
Reaktionslösungen versetzt, die keine Substrate enthielten. Proben- und Standard-verdünnungen erfolgten in Reaktionslösung ohne Substrat mit 0,1 % BSA.
2.4.1 Alkoholdehydrogenase-Aktivität
Zur Bestimmung der Alkoholdehydrogenase-Aktivität in Proben wurde die Zunahme der Fluoreszenz beobachtet, die durch die Zunahme der β-NADH-Konzentration in der folgenden Reaktion verursacht wurde:
Ethanol + β-NAD+
→ → → →
Acetaldehyd + β-NADH + H+ (EC 1.1.1.1)Eine Einheit ist definiert als die Enzymmenge, die unter den Testbedingungen pro Minute ein Mikromol Ethanol in Acetaldehyd umsetzt.
Von jeder Probe wurden mindestens drei Verdünnungsstufen (1:2) hergestellt und diese in je drei Ansätzen bestimmt. Pro Ansatz wurden 25 µl in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte vorgelegt und die Reaktion durch Zugabe von 200 µl Reaktionslösung gestartet. Die Messung der Fluoreszenzzunahme in den ersten 4 min erfolgte mit einem Fluoreszenz-spektrometer bei 25°C. Die Anregungswellenlänge betrug 355 nm, die Emissionswellenlänge 480 nm. Streustrahlung wurde auf den Bereich oberhalb 435 nm begrenzt und die Verstärkung der Messsignale auf „hoch“ eingestellt.
Standard
Der verwendete Standard enthielt nach Sigma 3 750 U/ml Alkoholdehydrogenase. Zur Kontrolle der Enzymaktivität wurde der Standard in Verdünnungen von 1:100, 1:1 000 und 1:10 000 mit dem achtfachen Volumen Reaktionslösung versetzt und die Bildung von β-NADH in Quarzküvetten durch die Absorptionszunahme bei einer Wellenlänge von 340 nm und 25°C verfolgt. Die Berechnung der Aktivität erfolgte unter Zuhilfenahme des Gesetzes von Lambert-Beer (Schichtdicke 1cm,
ε
β-NADH; 340nm = 6,22 l * mmol-1 * cm-1). Die ermittelte Aktivität von 1 310 U/ml wurde als Ausgangswert bei allen Berechnungen verwendet.Die internen Standards auf den Mikrotiterplatten bestanden aus Verdünnungsreihen von 3 bis 0,047 U/ml in Doppelbestimmung.
Reaktionslösung
24,75 mM Natriumpyrophosphat (Na4P2O7) 7 % (v/v) Ethanol
8,43 mM β-NAD
pH 8,8 mit Phosphorsäure eingestellt
2.4.2 Aldehyddehydrogenase-Aktivität
Zur Bestimmung der Aldehyddehydrogenase-Aktivität in Proben wurde die Zunahme der Fluoreszenz beobachtet, die durch die Zunahme der β-NADH-Konzentration in der folgenden Reaktion verursacht wurde:
Acetaldehyd + β-NAD+
→ → → →
Essigsäure + β-NADH + H+ (EC 1.2.1.5)Eine Einheit ist definiert als die Enzymmenge, die unter den Testbedingungen pro Minute ein Mikromol Acetaldehyd in Essigsäure umsetzt.
Von jeder Probe wurden mindestens drei Verdünnungsstufen (1:2) hergestellt und diese in je drei Ansätzen bestimmt. Pro Ansatz wurden 25 µl in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte vorgelegt und die Reaktion durch Zugabe von 200 µl Reaktionslösung gestartet. Die Messung der Fluoreszenzzunahme in den ersten 4 min erfolgte mit einem Fluoreszenz-spektrometer bei 25°C. Die Anregungswellenlänge betrug 355 nm, die Emissionswellenlänge 480 nm. Streustrahlung wurde auf den Bereich oberhalb 435 nm begrenzt und die Verstärkung der Messsignale auf „hoch“ eingestellt.
Standard
Der verwendete Standard enthielt nach Sigma 25 U/ml Aldehyddehydrogenase. Zur Kontrolle der Enzymaktivität wurde der Standard in Verdünnungen von 1:100, 1:1 000 und 1:10 000 mit dem achtfachen Volumen Reaktionslösung versetzt und die Bildung von β-NADH in Quarzküvetten durch die Absorptionszunahme bei einer Wellenlänge von 340 nm und 25°C verfolgt. Die Berechnung der Aktivität erfolgte unter Zuhilfenahme des Gesetzes von Lambert-Beer (Schichtdicke 1cm,
ε
β-NADH; 340nm = 6,22 l * mmol-1 * cm-1). Die ermittelte Aktivität von 9,2 U/ml wurde als Ausgangswert bei allen Berechnungen verwendet.Die internen Standards auf den Mikrotiterplatten bestanden aus Verdünnungsreihen von 0,92 bis 0,014 U/ml in Doppelbestimmung.
Reaktionslösung
116 mM TrisCl
2,27 mM Acetaldehyd
112,5 mM KCl
0,079 % (v/v) β-Mercaptoethanol
753 µM β-NAD
pH 8,0
2.4.3 Glucose-6-phosphatdehydrogenase-Aktivität
Zur Bestimmung der Glucose-6-phosphatdehydrogenase-Aktivität in Proben wurde die Zunahme der Fluoreszenz beobachtet, die durch die Zunahme der β-NADPH-Konzentration in der folgenden Reaktion verursacht wurde:
D-Glucose-6-phosphat + β-NADP+
→ → → →
6-Phospho-D-gluconat + β-NADPH + H+ (EC 1.1.1.49)Eine Einheit ist definiert als die Enzymmenge, die unter den Testbedingungen pro Minute ein Mikromol D-Glucose-6-phosphat in 6-Phospho-D-gluconat umsetzt.
Von jeder Probe wurden mindestens drei Verdünnungsstufen (1:2) hergestellt und diese in je drei Ansätzen bestimmt. Pro Ansatz wurden 25 µl in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte vorgelegt und die Reaktion durch Zugabe von 200 µl Reaktionslösung gestartet. Die Messung der Fluoreszenzzunahme in den ersten 4 min erfolgte mit einem Fluoreszenz-spektrometer bei 25°C. Die Anregungswellenlänge betrug 355 nm, die Emissionswellenlänge 480 nm. Streustrahlung wurde auf den Bereich oberhalb 435 nm begrenzt und die Verstärkung der Messsignale auf „hoch“ eingestellt.
Standard
Der verwendete Standard enthielt nach Sigma 50 U/ml Aldehyddehydrogenase. Zur Kontrolle der Enzymaktivität wurde der Standard in Verdünnungen von 1:100, 1:1 000 und 1:10 000 mit dem achtfachen Volumen Reaktionslösung versetzt und die Bildung von β-NADPH in Quarzküvetten durch die Absorptionszunahme bei einer Wellenlänge von 340 nm und 25°C verfolgt. Die Berechnung der Aktivität erfolgte unter Zuhilfenahme des Gesetzes von Lambert-Beer (Schichtdicke 1cm,
ε
β-NADPH; 340nm = 6,22 l * mmol-1 * cm-1). Die ermittelte Aktivität von 43 U/ml wurde als Ausgangswert bei allen Berechnungen verwendet.Die internen Standards auf den Mikrotiterplatten bestanden aus Verdünnungsreihen von 86,0x10-3 bis 1,34x10-3 U/ml in Doppelbestimmung.
Reaktionslösung
40 mM TrisPO4 pH 7,4 0,02 % (w/v) NADP
0,085 % (w/v) G6P
10 mM MgCl2
2.4.4 Alkalische Phosphatase-Aktivität
Zur Bestimmung der alkalischen Phosphatase-Aktivität in Proben wurde die Zunahme der Absorption beobachtet, die durch die Zunahme der p-Nitrophenol-Konzentration in der folgenden Reaktion verursacht wurde:
p-Nitrophenylphosphat + H2O
→ → → →
p-Nitrophenol + Pi (EC 3.1.3.1)Eine Einheit ist definiert als die Enzymmenge, die unter den Testbedingungen pro Minute ein Mikromol p-Nitrophenylphosphat in p-Nitrophenol umsetzt.
Von jeder Probe wurden mindestens drei Verdünnungsstufen (1:2) hergestellt und diese in je drei Ansätzen bestimmt. Pro Ansatz wurden 25 µl in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte vorgelegt und die Reaktion durch Zugabe von 200 µl Reaktionslösung gestartet. Die Messung der Absorptionszunahme bei 405 nm und 37°C in den ersten 4 min erfolgte mit einem Mikrotiterplattenphotometer.
Standard
Der verwendete Standard enthielt nach Sigma 100 U/ml alkalische Phosphatase. Zur Kontrolle der Enzymaktivität wurde der Standard in Verdünnungen von 1:100, 1:1 000 und 1:10 000 mit dem achtfachen Volumen Reaktionslösung versetzt und die Zunahme der Absorption bei 405 nm verfolgt. Die Berechnung der Aktivität erfolgte unter Zuhilfenahme des Gesetzes von Lambert-Beer (Schichtdicke 1cm,
ε
p-Nitrophenol; 405nm = 18,5 l * mmol-1 * cm-1). Die ermittelte Aktivität von 218 U/ml wurde als Ausgangswert bei allen Berechnungen verwendet.Die internen Standards auf den Mikrotiterplatten bestanden aus Verdünnungsreihen von 1,36 bis 0,02 U/ml in Doppelbestimmung.
Reaktionslösung
1 M Diethanolamin
0,5 mM MgCl2
15,8 mM pNPP
pH 9,8 mit NaOH eingestellt
2.4.5 Peroxidase-Aktivität
Zur Bestimmung der Peroxidase-Aktivität in Proben wurde die Zunahme der Absorption beobachtet, die durch die Oxidation von ABTS in der folgenden Reaktion verursacht wurde:
ABTSreduziert + H2O2
→ → → →
ABTSoxidiert + 2 H2O(EC 1.11.1.7)
Eine Einheit ist definiert als die Enzymmenge, die unter den Testbedingungen pro Minute ein Mikromol ABTS oxidiert.
Von jeder Probe wurden mindestens drei Verdünnungsstufen (1:2) hergestellt und diese in je drei Ansätzen bestimmt. Pro Ansatz wurden 25 µl in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte vorgelegt und die Reaktion durch Zugabe von 200 µl Reaktionslösung gestartet. Die Messung der Absorptionszunahme bei 405 nm und 25°C in den ersten 4 min erfolgte mit einem Mikrotiterplattenphotometer.
Standard
Der verwendete Standard enthielt nach Sigma etwa 20 U/ml Peroxidase. Zur Kontrolle der Enzymaktivität wurde der Standard in Verdünnungen von 1:100, 1:1 000 und 1:10 000 mit dem achtfachen Volumen Reaktionslösung versetzt und die Zunahme der Absorption bei 405 nm verfolgt. Die Berechnung der Aktivität erfolgte unter Zuhilfenahme des Gesetzes von Lambert-Beer (Schichtdicke 1cm,
ε
oxidiertes ABTS; 405nm = 36,8 l * mmol-1 * cm-1). Die ermittelte Aktivität von 28 U/ml wurde als Ausgangswert bei allen Berechnungen verwendet.Die internen Standards auf den Mikrotiterplatten bestanden aus Verdünnungsreihen von 0,7 bis 0,01 U/ml in Doppelbestimmung.
Reaktionslösung
100 mM Kaliumphosphatpuffer pH 5,0
9,1 mM ABTS
0,0114 % (v/v) H2O2
2.4.6 ββββ-Galactosidase-Aktivität
Zur Bestimmung der β-Galactosidase-Aktivität in Proben wurde die Zunahme der Absorption beobachtet, die durch die Bildung von o-Nitrophenol in der folgenden Reaktion verursacht wurde:
o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid
→ → → →
o-Nitrophenol + D-Galactose (EC 3.2.1.23)Eine Einheit ist definiert als die Enzymmenge, die unter den Testbedingungen pro Minute ein Mikromol o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid zu o-Nitrophenol und D-Galactose hydrolysiert.
Von jeder Probe wurden mindestens drei Verdünnungsstufen (1:2) hergestellt und diese in je drei Ansätzen bestimmt. Pro Ansatz wurden 25 µl in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte vorgelegt, mit 100 µl Z-Puffer versetzt und 10 min bei 37°C äquilibriert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 µl Reaktionslösung gestartet und nach 30 min bei 37°C durch Zugabe von 100 µl Stop-Lösung beendet. Die Messung der Absorption bei 405 nm erfolgte mit einem Mikrotiterplattenphotometer.
Standard
Der verwendete Standard enthielt nach Sigma zu 10 U/ml β-Galactosidase. Zur Kontrolle der Enzymaktivität wurde der Standard in Verdünnungen von 1:100, 1:1 000 und 1:10 000 mit dem vierfachen Volumen Z-Puffer versetzt und bei 37°C äquilibriert. Die Reaktion wurde durch Zugabe des doppelten Probenvolumens Reaktionslösung gestartet und nach 30 min mit dem vierfachen Probenvolumen Stopp-Lösung beendet. Die Absorption bei 420 nm wurde bestimmt und die Aktivität unter Zuhilfenahme des Gesetzes von Lambert-Beer berechnet (Schichtdicke 1cm,
ε
oNP; 420nm = 4500 l *mol-1 * cm-1 ). Die ermittelte Aktivität von 28 U/ml wurde als Ausgangswert bei allen Berechnungen verwendet.Die internen Standards auf den Mikrotiterplatten bestanden aus Verdünnungsreihen von 2,8 bis 0,04 U/ml in Doppelbestimmung.
Z-Puffer
100 mM Na-Phosphat pH 7,0
10 mM KCl
1 mM MgSO4•7 H2O 0,05 M β-Mercaptoethanol
Stopp-Lösung 1 M Na2CO3
Reaktionslösung
0,233 % (w/v) ONPG in Z-Puffer