II. Entwicklung eines zweidimensionalen, chromatograpischen
3.1 Probenvorbereitung
3 Ergebnisse
In der vorliegenden Arbeit sollte ein automatisierbares chromatographisches Trennverfahren entwickelt werden, das mit nur zwei Trennmethoden ein komplexes Proteingemisch in Fraktionen mit deutlich niedrigerer Komplexität zerlegt, eine zweidimensionale Chromatographie. Dazu wurde im ersten Schritt die Ionenaustauschchromatographie und im zweiten die hydrophobe Interaktionschromatographie eingesetzt. In den folgenden Abschnitten wird zunächst die Anpassung der Parameter dieser beiden Methoden an das Trennziel dargestellt. Im Anschluss daran ist die Verbindung der beiden Dimensionen zur zweidimensionalen Chromatographie beschrieben.
Zur Beurteilung der Trennleistung und der Effizienz der verwendeten chromatographischen Methoden wurden drei wichtige Hilfsmittel angewandt: das Chromatogramm als unmittel-bares Abbild der Trennung, die SDS-PAGE, die die Komplexität der Probe sichtbar macht, und die Proteinbilanz. Als komplexes Proteingemisch diente ein Extrakt aus Saccharomyces cerevisiae, dessen Herstellung in Kapitel 2 beschrieben ist. Alternativ und ergänzend wurde neben dem Hefeextrakt ein Extrakt aus Catharanthus roseus verwendet.
Alle absoluten Proteinmengen in den folgenden Abschnitten beziehen sich auf die Proteinbestimmung nach Bradford (Abschnitt 2.2.2).
Die zweidimensionale Chromatographie erfordert in der hier vorgeschlagenen Konzeption eine Probenzusammensetzung, die strengen Kriterien genügen muss, um ein reproduzierbares Trennergebnis zu erhalten. Eine Vorkonditionierung der Probe innerhalb des Systems würde die Einhaltung dieser Kriterien vereinfachen, erforderte jedoch eine Vorstufe oder „nullte“ Dimension. Zwei Vorschläge zur integrierten Probenvorbereitung werden daher vor den eigentlichen Trennverfahren dargestellt.
Die Gelfiltration eines Aliquots des Modellextraktes auf einer Econo-Pac® P6 Cartridge nach Abschnitt 2.6.2 ist in Abb. 3.1A anhand des resultierenden Chromatogramms dargestellt.
Dieses zeigt zwei UV-Peaks (Durchlauf, DL und Nachlauf, NL), von denen der zweite mit dem Leitfähigkeitspeak zusammenfällt, welcher durch den ausgetauschten Puffer verursacht wurde.
A
NL DL
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0
0 1 2 3 4 5 6 7
Zeit [min]
Absorption [A280nm]
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20
Leitfähigkeit [mS/cm]
UV [A280nm]
Leitfähigkeit [mS/cm]
B
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0
0 1 2 3 4 5 6 7
Zeit [min]
Absorption [A280nm]
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20
Leitfähigkeit [mS/cm]
UV [A280nm]
Leitfähigkeit [mS/cm]
C
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0
0 1 2 3 4 5 6 7
Zeit [min]
Absorption [A280nm]
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20
Leitfähigkeit [mS/cm]
UV [A280nm]
Leitfähigkeit [mS/cm]
Abb. 3.1 Gruppenseparation zur Probenvorbereitung Eine Econo-Pac® P6 Cartridge wurde mit 750 µl eines Hefe-extraktes (22,71 mg/ml) beladen (s. Abschnitt 2.6.2) (A). Der Durchlaufpeak (DL) wurde mit NaCl auf die Ausgangsleitfähigkeit gebracht und erneut auf die Säule aufgetragen (B). 600 µl des Nachlaufpeaks aus A (NL) wurden unter den gleichen Be-dingungen aufgetragen (C).
Laufpuffer: 20 mM MES pH 6,6. Fließgeschwindigkeit:
39 cm/h.
Der erste Peak (DL) enthielt 79 %, der zweite Peak (NL) 7 % der aufgegebenen Proteinmenge (Bradford, Abschnitt 2.2.2). Die den beiden Peaks entsprechenden Fraktionen wurden erneut auf die Gelfiltration aufgetragen, es ergab sich jedoch in der Rechromato-graphie nur jeweils ein Peak (Abb. 3.1B und C). Der NL-Peak bewegte sich erneut zusammen mit der erhöhten Leitfähigkeit des Probenpuffers. Daraus kann geschlossen werden, dass die Abtrennung der den Nachlaufpeak verursachenden Proteine quantitativ ist und es sich bei dem, spezifischen, Retentionsmechanismus um ionische Wechselwirkungen handelt.
Die Untersuchung der Proteinzusammensetzung mittels SDS-PAGE (Abb. 3.2) ergab, dass sich die Zusammensetzung der Proteine des Nachlaufpeaks (NL) von der des
Durchlaufpeaks (DL) unterscheidet. Auffällig ist, dass die Molekulargewichtsverteilung der Proteine im Nachlauf über den dargestellten Bereich von 200 bis 20 kDa in Bezug auf die relativen Mengen mehr oder weniger gleichmäßig ist. Es besteht eine leichte Häufung von Proteinen mit Molekulargewichten größer als 85 kDa. Im Gegensatz dazu sind im Rohextrakt und im Durchlauf der Gelfiltration Proteine vorherrschend, die ein Molekulargewicht im Bereich von 85-26 kDa haben. Eine mögliche Erklärung für die Anreicherung großer Proteine im Nachlauf könnte sein, dass große Proteine über mehrere geladene Bereiche ihrer Oberfläche mit der Oberfläche der Matrix interagieren könnten und somit bevorzugt binden.
Abb. 3.2 Proteinzusammensetzung der Fraktionen einer Gelfiltration 12%ige SDS-PAGE der Fraktionen einer Gruppenseparation. Eine Econo-Pac® P6 Cartridge wurde mit 750 µl eines Hefeextraktes (22,71 mg/ml) beladen (s. Abb. 3.1A). Aufgetragen sind mit je 10 µg Protein pro Bahn der Extrakt (Ex), der Durchlaufpeak (DL) und der Nach-laufpeak (NL). Die Proteine wurden mit Silberfärbung sichtbar gemacht.
3.1.2 Vorsäule
Neben niedermolekularen Nicht-Proteinbestandteilen sind es insbesondere Nukleinsäuren, die bei dem in der ersten Dimension gewählten Trennverfahren problematisch sind.
Einerseits ergibt sich beim Zellaufschluss ein Gemisch aus Nukleinsäuren mit einer breiten Molekulargewichtsverteilung, das bei einer Gruppenseparation nicht vollständig von den Proteinen getrennt werden kann. Andererseits sind Nukleinsäuren höher negativ geladen als die meisten Proteine, sodass sie durch die stärkere Bindung an AIEX-Matrizes deren Bindungskapazität für Proteine reduzieren und die Trennleistung negativ beeinflussen.
Die im Vergleich mit Proteinen stärkere Bindung von DNA an eine AIEX-Matrix könnte in Form einer Vorsäule zur Abtrennung der DNA aus dem Modellextrakt genutzt werden, indem der Extrakt mit einer erhöhten Leitfähigkeit einen Anionenaustauscher durchfließt, bevor in der Gelfiltration die Pufferverhältnisse für die erste Dimension eingestellt werden. Das Ergebnis eines entsprechenden Versuchs ist in Abb. 3.3 anhand der gebundenen Protein-und DNA-Mengen in Abhängigkeit von der Salzkonzentration im Modellextrakt dargestellt.
Die Wiederfindungsrate der Proteinmenge betrug 96 % mit einem Standardfehler von 6 %, die der Gesamt-DNA 100 % mit einem Standardfehler von 8 %.
0%
25%
50%
75%
100%
0 0.1 0.2 0.3 0.4
NaCl-Konzentration im Laufpuffer [M]
Protein/DNA-Menge im Durchlauf
Protein DNA
Abb. 3.3 Bindungsverhalten von DNA und Proteinen auf einer Vorsäule
5 ml DE 52 (10 x 64 mm) wurden mit 11 mg Hefeprotein (160 µg DNA) in Laufpuffer (100 mM MES-Puffer pH 6,6, 0-0,4 M NaCl) beladen und mit 2,5 M NaCl eluiert.
Fließgeschwindigkeit 76,4 cm/h. Proteinbestimmung nach Bradford (Abschnitt 2.2.2), DNA-Quantifizierung nach Abschnitt 2.3.
Abb. 3.4 Proteinzusammensetzung von Durchlauf und Eluat bei Verwendung einer Vorsäule
12%ige SDS-PAGE der Durchlauf- und Eluatfraktionen bei Beladung einer Vorsäule mit 11 mg Hefeextrakt (vergl. Abb. 3.3, DL bzw. EL, A = Auftrag). 10 µg Gesamtprotein pro Bahn. Silberfärbung.
Die Proteinmenge im Durchlauf steigt mit der NaCl-Konzentration im Laufpuffer an und macht bereits bei 0,3 M NaCl 99 % der aufgegebenen Menge aus (Abb. 3.3). Hingegen bleibt die DNA-Menge im Durchfluss zunächst relativ konstant und erreicht bei 0,3 M nur 63 % der aufgegebenen Menge. Erst bei 0,4 M NaCl fließt die gesamte aufgegebene DNA-Menge durch den schwachen Anionenaustauscher.
Die in Abb. 3.4 dargestellte Proteinzusammensetzung der Durchlauf- und Eluatfraktionen zeigt die Angleichung der Zusammensetzung des Durchlaufes an die des Auftrages (Bahnen DL bzw. A, Abb. 3.4). Auffällig ist, dass Proteine mit einem Molekulargewicht größer 85 kDa bereits bei 0,2 M NaCl aus dem Eluat verschwinden, also nicht mehr an die Matrix binden.
Die Zusammensetzung der kleineren Proteine ändert sich hingegen nur sehr wenig im Bereich von 0-0,3 M NaCl (EL, Abb. 3.4), die Proteinbanden werden lediglich intensiver. Erst bei 0,4 M NaCl laufen auch diese Proteine vollständig durch die Säule. Wegen der starken Bindung müssen die kleinen Proteine entweder sehr stark negativ geladen sein, oder es handelt sich um basische Proteine, zum Beispiel Histone (11,3-21,0 kDa), die an der DNA gebunden sind und erst mit dieser eluieren.
Die Abtrennung der DNA aus einem Rohextrakt ist mit der Vorsäule nur teilweise, zu etwa 37 % möglich, wenn die aufgetragene Proteinmenge zu 99 % wiedergewonnen werden soll (Abb. 3.3, 0,3 NaCl). Immerhin 70 % der DNA ließe sich abtrennen, wenn auf 26 % der Proteine verzichtet werden könnte (Abb. 3.3, 0,2 NaCl). Der verbliebene Proteinanteil könnte auch eluiert und direkt in der zweiten Dimension aufgetrennt werden. Wegen der hohen Ammoniumsulfatkonzentration, die für die Bindung der Proteine in der hydrophoben Inter-aktionschromatographie notwendig ist, werden störende elektrostatische Wechselwirkungen zwischen DNA und Proteinen minimiert.