Zweite Dimension

Proteasen im Extrakt bei niedrigeren Temperaturen deutlich vermindert (Kaufmann, 1997).

Auch sind einige Proteine durch die Bindung an der Ionenaustauschermatrix Konformations-änderungen unterworfen, die neben dem pH-Wert und der mobilen Phase auch von der Temperatur abhängig sind (Parente & Wetlaufer, 1984; Wu et al. 1986a + b).

Der Einfluss der Fließgeschwindigkeit auf die Auflösung kann in der ersten Dimension aus zwei Gründen vernachlässigt werden. Erstens erlauben die ausgewählten Matrizes hohe Flussraten bei gleichbleibender Auflösung. Zweitens soll die Elution der ersten Dimension nicht schneller ablaufen als die Fraktionen in der zweiten Dimension getrennt werden können, da eine Zwischenlagerung von Fraktionen vermieden werden soll. Somit stellt die zweite und nicht die erste Dimension den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt dar.

Ein besonderes Problem besteht im Verlust von etwa 12 % der aufgetragenen Proteine, der in der Ionenaustauschchromatographie auftritt (Abb. 3.29, Abschnitt 3.4.4). Zum Teil lässt sich dieser Verlust auf die Adsorption von Proteinen an Probengefäßen nach der chromatographischen Trennung und auf Ungenauigkeiten durch die manuelle Probenverarbeitung zurückführen. Diese Annahme wird durch die Abnahme der Verluste bei steigender Proteinbeladung unterstützt (Abschnitt 3.2.6 und 3.2.7). In Abb 3.31 (Abschnitt 3.4.5) war jedoch zusätzlich das Fehlen einer Gruppe sehr kleiner (<25 kDa), saurer Proteine aufgefallen. Um diese Proteine während einer Trennung zu eluieren, müsste der Natriumchloridgradient über die hier verwendete Endkonzentration von 1 M hinaus erweitert werden.

Eine weitere Ursache für die Proteinverluste könnte die Präzipitation von Proteinen an ihrem isoelektrischen Punkt sein. Besonders bei Salzkonzentrationen zwischen null und dem physiologischen Wert (0,15–0,2 M) können sich Präzipitate bilden, weil die abstoßenden Kräfte zwischen den Proteinen zu gering sind (Kaufmann, 1997). Dieser Vorgang wird auch als isoelektrische Präzipitation bezeichnet (Scopes, 1994; Harris & Angal, 1989). Im Vergleich mit dem Rohextrakt liegt die Ionenstärke des Laufpuffers mit 20 mM MES um den Faktor 10 niedriger, sodass die Präzipitation während der Gruppenseparation kurz vor Beginn der Trennung auf der ersten Dimension aufgetreten sein könnte. Diese Präzipitate würden dann auf der ersten Säule festgehalten und führten zu den beobachteten Verlusten.

Da kein eindeutiger Zusammenhang zwischen den Proteinverlusten der ersten Dimension und dem pH-Wert des Laufpuffers festgestellt wurde (vergl. Abschnitt 3.2.5), wird davon ausgegangen, dass eine Änderung des pH-Wertes diesen Effekt nicht oder nur unwesentlich beeinflusst.

Konformation im Wesentlichen erhalten bleibt. Die Hydrophobizität einer Oberfläche entspricht in etwa der Summe der Hydrophobizitäten der exponierten Aminosäuren (Janson & Rydén, 1989). Das Bindungsverhalten wird allerdings von der Anordnung der hydrophoben Aminosäuren in hydrophoben Oberflächenbereichen bestimmt. Das Kernproblem bei der Auslegung der zweiten Dimension bestand darin, die Bindungsstärke so zu beeinflussen, dass einerseits möglichst alle Proteine gebunden wurden, andererseits aber stark hydrophobe Proteine weder präzipitieren noch an der Matrix denaturieren.

Die Stärke der hydrophoben Wechselwirkung zwischen einer Proteinoberfläche und einer Matrix, und damit die Selektivität einer Trennung, lässt sich beeinflussen durch die Art und Dichte des Liganden, die Temperatur, den pH-Wert des Laufpuffers sowie die Art und Konzentration des antichaotropen Salzes (Arakawa & Narhi, 1991; Gooding et al., 1986;

Josic et al., 1986; Schmuck et al., 1986; Perkins et al., 1997). Der pH-Wert des Laufpuffers hat, verglichen mit anderen Parametern, nur einen geringen Einfluss auf die Stärke der hydrophoben Wechselwirkung (Gooding et al., 1986). Wenn der isoelektrische Punkt eines Proteins gleich dem pH-Wert des Laufpuffers ist, sind wegen der fehlenden Nettoladung die Abstoßungskräfte minimal und die hydrophobe Interaktion ist begünstigt. Generell wäre die Optimierung des pH-Wertes eine Möglichkeit, die Selektivität einer Matrix für ein bestimmtes Protein zu erhöhen. Die Fraktionen der ersten Dimension enthalten jedoch noch eine Vielzahl von Proteinen mit einer breiten pI-Verteilung. Daher ist eine Optimierung des pH-Wertes für die zweite Dimension, die außerdem für jeden Extrakt neu durchgeführt werden müsste, nicht sinnvoll. Auch wäre der Pufferwechsel zwischen der ersten und zweiten Dimension apparativ sehr aufwändig. Möglich wäre jedoch die Anhebung des pH-Wertes durch Zumischung einer entsprechend gepufferten Ammoniumsulfatlösung. Bei pH-Werten oberhalb von etwa 7,5 ungeladen ist und damit die hydrophobe Interaktion verstärkt wird.

Einen deutlich größeren Einfluss hat die Konzentration des antichaotropen Salzes, welches über die Steigerung der Oberflächenspannung der mobilen Phase die Ausbildung hydro-phober Wechselwirkungen energetisch begünstigt (Huddleston et al., 1996; Melander

& Horváth, 1977; von der Haar, 1976). Beim Überschreiten einer bestimmten Konzentration kommt es jedoch zur Interaktion der Proteine untereinander und damit zur Präzipitation. Die Fähigkeit von Salzen, hydrophobe Wechselwirkungen zu verstärken, wird im Wesentlichen durch das Anion bestimmt. Das Kation spielt nur eine untergeordnete Rolle (Collins et al., 1985). Die antichaotrope Wirkung der Anionen nimmt entsprechend der lyotropen oder Hofmeister-Reihe in der Reihenfolge SCN ^-, ClO₄^-, NO₃^-, Br ^-, CH₃COO ^-, SO₄^2- und PO₄^3- zu.

Das Phosphatanion liegt jedoch bei neutralen pH-Werten protoniert vor, sodass das Sulfation in Form von Ammoniumsulfat bei den Trennungen der zweiten Dimension eingesetzt wurde.

Eine Untersuchung anderer oder die Kombination mehrerer antichaotroper Salze war aufgrund des ungerichteten Effekts auf die Selektivität und wegen der Komplexität der zu trennenden Fraktionen nicht sinnvoll (el Rassi et al., 1990).

Um die Präzipitation von Proteinen durch zu hohe Salzkonzentrationen zu vermeiden, wurde zunächst versucht, die Proteine eines Extraktes bei einer niedrigen Ammoniumsulfat-konzentration auf Matrizes mit zunehmender Hydrophobizität zu binden. Diese nimmt mit der Länge der substituierten Alkylgruppen und deren Dichte zu (Schmuck et al., 1986;

Gooding et al., 1986). Die Anwendung von Hydrophobizitätsgradienten zur Proteintrennung wurde bereits von Hofstee (1975) vorgeschlagen und auf die Trennung von Serumalbuminen angewendet (Hofstee & Ottillio, 1978). Dabei wurde eine Agarosematrix eingesetzt, die mit Alkylgruppen zunehmender Kettenlänge substituiert worden war. Die Beladung der Säulen wurde in der Reihenfolge steigender Hydrophobizität (C₀ bis C₄ oder C₄ bis C₈) und einer Salzkonzentration von 3 M NaCl vorgenommen. Die Elution erfolgte nach der Trennung der Säulen durch Reduktion der Salzkonzentration auf 0,3 M NaCl und Zugabe von 50 % Ethylenglykol, welches die hydrophobe Wechselwirkung schwächt, aber auf die meisten Proteine keinen denaturierenden Einfluss hat (Tanford, 1968). Von Scopes & Porath (1990) wurde die Selektivität von C₄-, C₆- und C₈-substituierter Agarose für verschiedene Enzyme der Glykolyse bei niedrigen Natriumsulfatkonzentrationen untersucht und mehrstufige Reinigungsprotokolle vorgeschlagen. Dabei konnten selbst auf der C₈ -sub-stituierten Matrix lediglich 70 % der eingesetzten Proteinmenge gebunden werden.

Die Untersuchung dreier Matrizes mit steigender Hydrophobizität in Abschnitt 3.3.1 ergab, dass die Unterschiede im Bindungsverhalten nicht groß genug waren, um bei nur einer Ammoniumsulfatkonzentration eine vollständige Bindung und gleichmäßige Verteilung der Proteine eines Extraktes auf mehrere Säulen zu erreichen. Daher wurde eine Matrix mittlerer Hydrophobizität ausgewählt und zwei gleichartige Säulen in Reihe beladen. Die Verteilung der Proteine auf die beiden Säulen wurde flexibel durch die Erhöhung der Ammoniumsulfatkonzentration gesteuert. Dazu wurden Konzentrationsstufen von 1,33 M und 2,25 M Ammoniumsulfat ermittelt, die eine gleichmäßige Verteilung gewährleisten (Abschnitt 3.3.4 und 3.3.5), ohne, dass eine Präzipitation bei der Erhöhung der Ammoniumsulfatkonzentration eintritt. Eine Präzipitation oder irreversible Bindung von Proteinen an die Matrix wurde nicht beobachtet (Abschnitt 3.3.6). Dennoch traten bis zu 19 % Proteinverluste beim Übergang von der ersten in die zweite Dimension auf, die scheinbar keinen Einfluss auf die Proteinzusammensetzung hatten (Abschnitt 3.4.5, Abb. 3.31). Ganz auszuschließen sind spezifische Verluste jedoch nicht, da mit der 2DE nur die häufigsten Proteine nachgewiesen werden konnten. Es wird allerdings angenommen, dass es sich im Wesentlichen um Verluste handelt, die durch Abweichung bei der manuellen Probenvorbereitung und Probennahme entstanden sind und nicht mit der Chromatographie selbst in Zusammenhang stehen. Eine genauere Untersuchung der auftretenden Verluste müsste nach erfolgter Automatisierung des Verfahrens durchgeführt werden.

Die Probenvorbereitung für die hydrophobe Interaktionschromatographie bestand aus der Erhöhung der Salzkonzentration durch Zugabe einer hochkonzentrierten Ammoniumsulfat-lösung, die hier manuell durchgeführt wurde. Die spätere Automatisierung dieses Vorgangs lässt sich durch Zumischen eines entsprechenden Puffers vor und zwischen den Säulen über eine Schlauchkupplung und einen statischen Mischer leicht realisieren. Die resultierende Verdünnung der Fraktionen ist unproblematisch, da die enthaltenen Proteine vor der eigentlichen Trennung auf einem eng begrenzten Bereich der Matrix konzentriert werden. Andere Methoden, die Salzkonzentration vor der zweiten Dimension zu erhöhen, wie die on-line-Dialyse oder die Gruppenseparation, sind technisch schwieriger zu gestalten und bedeutend aufwändiger.

Die Möglichkeit, die Proteine auf Matrizes mit steigender Ligandendichte zu verteilen, wurde in dieser Arbeit nicht untersucht. Mit zunehmender Ligandendichte steigen Retention und Auflösung von Proteinen (Fausnaugh et al., 1984a). Neben der Oberflächenhydrophobizität der Proteine spielt auch deren Molekulargewicht eine Rolle, da große Proteine bei steigender Ligandendichte mit mehreren Bereichen gleichzeitig mit den Oberflächensubstituenten interagieren können. Dies ist der Grund für die Beobachtung, dass die Hydrophobizität von Proteinen mit der Proteingröße zunimmt (Isobe et al., 1991). Die Denaturierung von Proteinen auf hochsubstituierten Matrizes, wie sie in der RPLC eingesetzt werden, ist letztlich auf die Strukturveränderungen durch diese multiplen Bindungen zurückzuführen. Bei einer allmählichen Steigerung der Ligandendichte, in separaten Säulen oder als fixierter Hydrophobizitätsgradient in einer Säule, könnte jedoch u.Ust. eine vollständige und schonende Bindung aller Proteine eines komplexen Extraktes erreicht werden.

Die Untersuchungen für die Festlegung der Trennparameter in der zweiten Dimension wurden sämtlich bei Raumtemperatur durchgeführt, da die Retention wegen der Abhängigkeit der hydrophoben Wechselwirkung von der Entropie mit der Temperatur ansteigt (Hjertén, 1977; Jennissen, 1978). Gleichzeitig nimmt jedoch auch die Neigung zu Strukturveränderungen bei Proteinen zu (Cohen et al., 1985, Ingraham et al., 1985; Lu et al., 1986; Wu et al., 1986a + b). Die Absenkung der Temperatur zur Stabilisierung der Proteine führt zu einer Verringerung der Retentionszeiten und damit zu einem Auflösungsverlust, der durch eine Erhöhung des Gradientenvolumens oder niedrigere Fließgeschwindigkeiten kompensiert werden kann. Dadurch erhöht sich wiederum die Kontaktdauer der Proteine mit der Matrix, die neben der Temperatur ebenfalls einen Einfluss auf die Denaturierung von Proteinen hat. Durch die Verwendung von Matrizes, deren Auflösung weitgehend unabhängig von der Fließgeschwindigkeit ist, lässt sich die Kontaktdauer jedoch sehr niedrig halten. Dazu gehören insbesondere unporöse Partikel mit Durchmessern kleiner als 20 µm (Hjertén & Liao, 1988; Kato et al., 1989), poröse Partikel mit perfusiven Poren (Afeyan et al., 1990) oder monolithische Matrizes (Xie et al.,1997). In dieser Arbeit wurde die Matrix Source™ ISO verwendet, mit der bei den gewählten Säulengeometrien Trennungen im Bereich von etwa 15 min möglich waren. Durch die kurze Kontaktzeit mit der Matrix war die Durchführung der Trennungen der zweiten Dimension bei Raumtemperatur tolerierbar.