II. Entwicklung eines zweidimensionalen, chromatograpischen
4.6 Ausblick
Die im vorhergehenden Abschnitt diskutierten Anwendungsmöglichkeiten des entwickelten zweidimensionalen Chromatographiesystems setzen die vollständige Automatisierung des Verfahrens voraus. Dazu gehören die Verbindung der ersten und zweiten Dimension und die Verwendung von zwei Säulenpaaren in der zweiten Dimension (s. Abb. 4.5). Erst mit dem automatisierten System lassen sich die erforderlichen Testreihen zur weiteren Charakterisierung des Verfahrens durchführen. Im Besonderen wird die Reproduzierbarkeit der Trennungen bei mehrfacher Injektion identischer Proben zu untersuchen sein, wenn das Verfahren bei der Untersuchung und dem Vergleich von Proteomen eingesetzt werden soll.
Anhand eines Proteinstandards mit einer hinreichend komplexen Zusammensetzung muss die Trennleistung des Systems bestimmt werden, um Kriterien zu erarbeiten, die festlegen, wann eine Regeneration oder ein Austausch der Säulen notwendig ist.
Eine Validierung muss weiterhin die Anwendung des Systems auf Extrakte aus verschiedenen Quellen beinhalten, um den universellen Charakter der Trennung zu dokumentieren. Dazu wird es notwendig sein, den Einfluss anderer Puffersubstanzen und leichter Änderungen des pH-Wertes des Laufpuffers auf das Trennergebnis genauer zu untersuchen. Ferner müssen Richtlinien festgelegt werden, nach denen die Anpassung des Trennprotokolls an den jeweiligen Extrakt erfolgt. Neben der Bearbeitung wässriger Proteinextrakte ist die Anwendbarkeit des zweidimensionalen Systems auf spezielle Extrakte von großem Interesse. Beispielsweise erfordern Membranproteine bereits bei der Extraktion die Beimengung oberflächenaktiver Substanzen zum Extraktionspuffer. Deren Einfluss auf die chromatographische Trennung muss daher eingehend untersucht werden. Wegen der Ionenaustauschchromatographie der ersten Dimension kommen dafür ausschließlich
nicht-ionische Tenside in Frage (z.Bsp. CHAPS, Triton , Tween). Die Wirkung dieser Substanzen auf das Verhalten des Gesamtsystems ist vermutlich vielschichtig, was u.Ust. eine Neufestlegung der Trennparameter erfordern wird (Buckley & Wetlaufer, 1989 & 1990;
Chang, 1984; Lee, 1996; Lew & London, 1997; Sing et al., 1992; Wetlaufer & Königbauer, 1986).
In dem geschlossenen System kann abschließend geklärt werden, ob die beobachteten Proteinverluste tatsächlich durch die manuellen Eingriffe entstanden sind, oder ob sie durch die Chromatographie selbst verursacht werden. Die Untersuchung der Proteinzusammen-setzung der Fraktionen mit Hilfe der 2DE ist dabei ein wichtiges Hilfsmittel, um gegebenenfalls spezifische Proteinverluste im Verlauf der Trennung aufzuspüren oder auszuschließen.
Mit der Automatisierung kann beim Übergang von der ersten in die zweite Dimension auf das Sammeln von Fraktionen verzichtet werden. Das Eluat der ersten Dimension wird alternierend auf eines der beiden Säulenpaare der zweiten Dimension aufgegeben, sodass die Probennahmerate, und damit das „Fraktionsvolumen“, beliebig variiert werden kann. Die Probennahmerate zwischen der ersten und der zweiten Dimension kann damit an die Auflösung der ersten Dimension angepasst werden. Dadurch geht eine in der ersten Dimension erzielte Trennung beim Übergang zur zweiten Dimension nicht verloren.
Die Trennleistung des Verfahrens ist im Wesentlichen von den Peak-Kapazitäten der Trennsäulen in den zwei Dimensionen abhängig. Daher müssen, zusätzlich zu der weiteren Optimierung der Trennparameter, in beiden Dimensionen Matrizes eingesetzt werden, die eine hohe Auflösung ermöglichen. In der ersten Dimension ist mit der porösen monolithischen Matrix bereits eine sehr hohe Auflösung erzielt worden. Die Verwendung von ähnlichen Matrizes in der zweiten Dimension erlaubt wahrscheinlich eine ähnlich deutliche Steigerung der Peak-Kapazität wie beim Übergang von der partikulären zur monolithischen Matrix der ersten Dimension.
In der zweiten Dimension werden etwa 10 % der aufgegebenen Proteine nicht gebunden und können, wegen der starken Verdünnung, u.Ust. nicht mehr nachgewiesen werden. Die Einführung einer dritten HIC-Stufe unter Verwendung einer noch höheren Ammoniumsulfat-konzentration könnte diesen Teil der Probe binden und einer Trennung zugänglich machen.
Um eine vollständige Bindung aller Proteine eines Extraktes auf der hydrophoben Matrix, ohne die Gefahr einer Präzipitation zu erreichen, wäre jedoch eine kontinuierliche Erhöhung der Ammoniumsulfatkonzentration anstelle der inkrementellen Erhöhung in zwei oder drei Stufen vorzuziehen. Eine mögliche Darstellung einer solchen kontinuierlichen Erhöhung könnte sich auf einer HIC-Matrix ergeben, die, ähnlich einer Gruppenseparationsmatrix, ein Ausschlussvolumen von etwa 5 000 bis 6 000 Da aufweist. Die Säule würde mit einer hohen Ammoniumsulfatkonzentration äquilibriert, die dann in einem kurzen Gradienten bis auf etwa 0,5 M abgesenkt wird. Das Gradientenvolumen müsste dabei kleiner als das halbe insgesamt zugängliche Volumen der Säule sein. Die Probenaufgabe erfolgte dann bei der niedrigen Ammoniumsulfatkonzentration. Entsprechend des Trennmechanismus der Gelfiltration bewegen sich die Proteine schneller durch die Säule als der Ammoniumsulfat-gradient, sodass die Ammoniumsulfatkonzentration in der Umgebung der Probe kontinuierlich ansteigt. Es wird angenommen, dass ein Protein sich genau bei der
Salz-konzentration auf der Säule anordnet, an der die Geschwindigkeit, mit der es sich auf der Säule bewegt, der des Gradienten entspricht. In Bereichen mit einer höheren Salz-konzentration bindet das Protein stärker an die HIC-Matrix und bewegt sich langsamer als der Gradient. Wenn die Salzkonzentration in der Umgebung sinkt wird die Bindung geschwächt und das Protein bewegt sich schneller durch die Säule. Dadurch käme es zu einer Fokussierung der Proteine in einem kleinen Volumen entsprechend der Hydrophobizität ihrer Oberfläche. In Anlehnung an die Chromatofokussierung könnte daher von einer hydrophoben Fokussierung gesprochen werden. Der Vorteil eines solchen Verfahrens, sollte es realisierbar sein, läge in den niedrigen Ammoniumsulfatkonzentrationen denen die Proteine eines Extraktes ausgesetzt würden. Nachteilig ist jedoch, dass das Trennvolumen nur etwa halb so groß wie das insgesamt zugängliche Volumen der Trennsäule gewählt werden könnte, sodass für eine ausreichende Peak-Kapazität relativ lange Säulen erforderlich wären.
Eine andere Möglichkeit der schonenden hydrophoben Bindung wäre der Einsatz eines immobilisierten Hydrophobizitätsgradienten. Dazu wäre eine HIC-Matrix notwendig, deren Ligandendichte und/oder Ligandenhydrophobizität zum Ende der Säule stark zunimmt. Hier würden die Proteine schon bei niedrigen Ammoniumsulfatkonzentrationen binden, ohne, dass es zu einer Präzipitation oder zur Denaturierung auf der Matrix kommt. Problematisch wäre jedoch die Elution, da bei einer Umkehrung der Flussrichtung und Absenkung der Salz-konzentration die Verteilung wieder rückgängig gemacht würde. Um die Verteilung der Proteine entsprechend ihrer Hydrophobizität aufrecht zu erhalten, wäre daher entweder eine Elution vertikal zu der normalen Flussrichtung oder die Aufhebung der Bindung durch eine Temperaturabsenkung notwendig.
5 Zusammenfassung
Auf der Grundlage der Ionenaustausch- und der hydrophoben Interaktionschromatographie wurde ein Protokoll zur umfassenden Auftrennung komplexer Proteingemische unter nativen Bedingungen entwickelt. Die Auslegung der Trennverfahren erfolgte unter Verwendung eines Extraktes aus Saccharomyces cerevisiae. Aufgrund der Trennprinzipien sollte das zwei-dimensionale chromatographische System auch auf andere Extrakte anwendbar sein.
In der ersten Dimension der zweidimensionalen Trennung wurde der Modellextrakt auf einen Kationen- und einen Anionenaustauscher aufgetragen, die bei der Beladung gekoppelt waren aber getrennt eluiert wurden. Bei einem optimalen pH-Wert des Laufpuffers von 6,6 wurden 13 % der Proteine vom Kationen- und 85 % vom Anionenaustauscher eluiert. Für die weitere Auftrennung der Fraktionen der ersten Dimension wurden in der zweiten Dimension zwei hydrophobe Interaktionssäulen eingesetzt. Die Bindung der Proteine erfolgte durch Anheben der Ammoniumsulfatkonzentration auf 1,33 M vor der ersten Säule. Ungebundene Proteine im Durchlauf wurden durch eine weitere Anhebung der Salzkonzentration auf 2,25 M auf einer zweiten Säule gebunden. Dadurch ergab sich bereits bei der Bindung auf eine der zwei Säulen eine Trennung der Proteine anhand ihrer unterschiedlichen hydrophoben Eigenschaften. Wie in der ersten Dimension wurde eine weitere Auftrennung durch die Gradientenelution der entkoppelten Säulen erzielt. Insgesamt wurden noch 67 % der aufgetragenen Proteine nach der Trennung nachgewiesen. Hinweise auf einen spezifischen Proteinverlust durch Präzipitation bei den Salzkonzentrationen der zweiten Dimension wurden nicht gefunden.
Durch die Koppelung der Ionenaustauschchromatographie in der ersten und der hydro-phoben Interaktionschromatographie in der zweiten Dimension wurde eine Peak-Kapazität von 152 erreicht. Diese entspricht in etwa den Kapazitäten anderer zweidimensionaler Chromatographien. Unter Verwendung leistungsfähigerer Matrizes in beiden Dimensionen ist eine Steigerung dieser Kapazität auf etwa 700 realistisch. In der vorliegenden Form würden die Proteine eines komplexen Gemisches, nach erfolgter Automatisierung des Systems, innerhalb von 3,5 h auf insgesamt 592 Fraktionen verteilt. Dies entspricht einer Reduzierung der Komplexität der Probe um den Faktor 70.
Die Proteinbeladung des vorgeschlagenen Verfahrens liegt mit 25 mg pro Lauf deutlich über der Proteinkapazität bisher entwickelter Verfahren. Zusätzlich ist eine Maßstabs-vergrößerung einfach durchführbar. Dies ist insbesondere für die Untersuchung und den Nachweis schwach exprimierter Proteine in der Proteomforschung von Bedeutung. Die Proteine liegen nach der Trennung gelöst und in der nativen Konformation vor. Damit stehen sie direkt für weitere Aufreinigungsschritte, Aktivitätstests oder Nachweismethoden zur Verfügung.
Das Verfahren ist für eine schnelle Proteinaufreinigung im Labormaßstab geeignet und reduziert für einen Großteil der Trennprobleme die zeit- und arbeitsintensive Ermittlung der optimalen Trennparameter. Die Probenvorbereitung beschränkt sich auf die Entfernung störender Substanzen und den Austausch des Probenpuffers gegen den Laufpuffer.
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