Tierärztliche Hochschule Hannover Institut für Mikrobiologie
Wachstumsphasenabhängige Merkmale von Streptococcus suis und deren Bedeutung
für das Überleben im Wirt
INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften
- Doctor rerum naturalium - (Dr. rer. nat.)
vorgelegt von Daniela Willms Bad Oeynhausen
Hannover 2014
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Peter Valentin-Weigand Institut für Mikrobiologie
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachter: Prof. Dr. Peter Valentin-Weigand
2. Gutachter: Prof. Dr. Georg Herrler
Tag der mündlichen Prüfung: 03.11.2014
Die vorliegende Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG), Bonn, im Rahmen des Sonderforschungsbereichs 587 „Immunreaktionen der Lunge bei Infektion und Allergie“ gefördert.
Für Mama
Diese Arbeit wurde in Teilen veröffentlicht:
Publikation
Willenborg, J., Willms, D., Bertram, R., Goethe, R., und Valentin-Weigand P. (2014) Characterization of multi-drug tolerant persister cells in Streptococcus suis.
BMC Microbiol. 14:120. doi: 10.1186/1471-2180-14-120
Präsentation
Willms, D., Willenborg, J., Rohde, M., Goethe, R. und Valentin-Weigand, P. (2012) Growth dependent interactions of Streptococcus suis serotype 2 and 9 strains with porcine monocytes
112th ASM General Meeting, San Francisco, 16.-19. Juni 2012
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 17
2 Schrifttum ... 21
2.1 Streptococcus suis ... 21
2.1.1 Epidemiologie ...21
2.1.2 Virulenzfaktoren und Virulenz-assoziierte Faktoren ...23
2.2 Wachstumsphasenabhängige Regulation bei Bakterien ... 29
2.2.1 Wachstumsphasenabhängige Genregulation in S. suis ...32
2.3 Pathomechanismen und Erreger-Wirtszell-Interaktionen bei S. suis... 33
2.3.1 Pathogenese von S. suis-Erkrankungen...33
2.3.2 Allgemeine Merkmale von Monozyten und deren Bedeutung für S. suis: (Modifizierte) Trojan horse theory ...35
2.3.3 Interaktion von S. suis mit Monozyten und Makrophagen ...38
2.4 Antibiotikaresistenz und -toleranz von Bakterien ... 42
2.4.1 Therapie und Resistenz gegenüber Antibiotika ...42
2.4.2 Antibiotikatoleranz und Persisterzellen ...43
2.4.3 Genetik von Persistern ...46
2.4.4 Mechanismen der Persisterformation ...48
2.4.5 Persister und small colony variants (SCVs) ...49
2.4.6 Eliminierung von Persistern ...50
2.4.7 Persisterbildung und Antibiotikatoleranz von Streptokokken...51
3 Material und Methoden ... 53
3.1 Material ... 53
3.1.1 Chemikalien, Reagenzien, Verbrauchsmaterialien und Geräte ...53
3.1.2 Bakterienstämme ...53
3.1.3 Antikörper ...54
3.1.4 Antibiotika ...55
3.2 Methoden ... 55
3.2.1 Bakteriologische Methoden ...55
3.2.2 Bestimmung von Antibiotikatoleranzen ...58
3.2.3 Zellbiologische Methoden ...62
3.2.4 Interaktion von S. suis mit CD14-positiven Monozyten ...70
3.2.5 Proteinbiochemische Methoden ...79
4 Ergebnisse ... 84
4.1 Wachstumskinetiken verschiedener Streptokokken-Spezies ... 85
4.2 Wachstumsphasenabhängige Persisterbildung von S. suis ... 88
4.2.1 MHK-Bestimmung ...89
4.2.2 Wachstumsphasenabhängige Toleranz von S. suis gegenüber Antibiotika verschiedener Wirkstoffklassen ...90
4.2.3 Vererbbarkeit der Persistenz von S. suis ...94
4.2.4 Eliminierung von S. suis-Persisterzellen ...96
4.2.5 Small-colony-variants (SCV)-ähnlicher Phänotyp von S. suis nach Gentamicinbehandlung ...98
4.2.6 Wachstumsphasenabhängige Toleranz von S. suis gegenüber Antibiotikakombinationen ...99
4.2.7 Toleranz von S. suis gegenüber Gentamicin nach Hemmung der PMF ... 103
4.2.8 Wachstumsphasenabhängige Toleranz von S. suis- Stoffwechselmutanten gegenüber Gentamicin ... 104
4.2.9 Wachstumsphasenabhängige Toleranz verschiedener S. suis-Stämme gegenüber Gentamicin ... 108
4.2.10 Verlängerte Antibiotikatoleranz verschiedener Streptokokken-Spezies ... 111
4.3 Wachstumsphasenabhängige Wechselwirkung von S. suis mit porzinen Monozyten ... 114
4.3.1 Präparation und Charakterisierung porziner MNCs und CD14-positiver Monozyten ... 116
4.3.2 Überlebensfähigkeit von S. suis in Anwesenheit porziner CD14-positiver Monozyten ... 126
4.3.3 Auswirkungen von S. suis auf die Vitalität und Morphologie porziner CD14-positiver Monozyten ... 139
4.3.4 Induktion der ROS-Produktion porziner CD14-positiver Monozyten durch S. suis ... 144
5 Diskussion ... 148
5.1 Wachstumsphasenabhängige Persisterbildung von S. suis ... 150
5.2 Wachstumsphasenabhängige Wechselwirkung von S. suis mit porzinen CD14-positiven Monozyten ... 163
6 Zusammenfassung ... 175
7 Summary ... 178
8 Literaturverzeichnis ... 181
9 Anhang ... 217
9.1 Ergebnisse ... 217
9.1.1 Kapseldicke der S. suis Serotypen 2 (10) und 9 (A3286/94) während des Wachstumsphasenverlaufs ... 217
9.1.2 Überleben von S. suis in PBS ... 218
9.1.3 Vermehrungsfaktor von S. suis in RPMI-Medium ... 218
9.1.4 S. suis (10): Vergleich der Überlebensfähigkeit von kryokonservierten und frisch kultivierten Bakterien nach Gentamicinbehandlung ... 219
9.1.5 Vergleich der Überlebensfähigkeit von S. suis-Stamm 10 in verschiedenen Medien nach Gentamicinbehandlung ... 219
9.1.6 Auswirkungen der MHK von Gentamicin auf die Ausprägung der Antibiotikumtoleranz von S. suis-Stamm 10 im Heritabilitätstest ... 220
9.1.7 Überlebenskinetik der erythromycinresistenten Mutante 10∆ccpA und von S. suis-Stamm 10 in Anwesenheit von Erythromycin. ... 221
9.1.8 Charakterisierung porziner MNCs anhand der Verteilung von CD-Markern ... 221
9.1.9 CFSE-Markierung von S. suis ... 222
9.1.10 ROS-Produktion verschiedener Zellpopulationen ... 223
9.2 Reagenzien, Materialien, Geräte und Software ... 224
9.2.1 Reagenzien und Chemikalien ... 224
9.2.2 Kits ... 226
9.2.3 Verbrauchsmaterialien ... 226
9.2.4 Geräteverzeichnis ... 226
9.2.5 Software ... 228
9.3 Abbildungsverzeichnis ... 229
9.4 Tabellenverzeichnis ... 232
Abkürzungsverzeichnis
α Alpha
∆ Delta
% Prozent
< kleiner als
6PDG 6-Phosphoglukonatdehydrogenase
A. bidest Aqua bidestillata
A. dest Aqua destillata
AD Arginin Deiminase
ADS Arginin Deiminase System
AP alkalische Phosphatase
APS Ammoniumpersulfat
ApuA Amylopullulanase
ATP Adenosintriphosphat
BCA engl.: bicinchoninic acid
BMEC engl.: brain microvascular endothelial cells
BSA bovines Serumalbumin
bzw. beziehungsweise
°C Grad Celcius
Ca Calcium
ca. circa
CCCP engl.: Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone CcpA engl.: catabolite control protein A
CD engl.: cluster of differentiation
CDC engl.: cholesterol-dependent pore-forming cytolysins
cDNA engl.: complementary DNA
CDS engl.: colostrum deprived serum
CK Carbamat-Kinase
CFSE engl.: carboxyfluorescein succinimidyl ester CNS engl.: central nervous system
CO2 Kohlenstoffdioxid
cps engl.: capsule polysaccharide
CSP engl.: competence stimulating peptide DAPI 4’,6-Diamidin-2-phenylindol
DHR Dihydrorhodamin
DNA engl.: deoxyribonucleic acid
DIF Doppelimmunfluoreszenz
DPA engl.: daptomycin protection assay
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EF engl.: extracellular factor
ENO Enolase
et al. lat.: et alii
etc. lat.: et cetera
evtl. eventuell
exp exponentiell
FACS engl.: fluorescence-activated cell sorting
FBPS engl.: fibronectin and fibrinogen binding protein of S. suis FCS enfl.: fetal calf serum
FITC Fluoresceinisothiocyanat
FL engl.: fluorescent
FlpS engl.: FNR-like protein (von S. suis)
FSC engl.: forward scatter
g Erdbeschleunigung
g Gramm
GalU Glukose-1-phosphat Uridylyltransferase GAPDH Glycerinaldehyd-3-Phosphatdehydrogenase
GAS Gruppe A-Streptokokken
GBS Gruppe B-Streptokokken
GlnA Glutamin Synthetase
h lat.: hora (Stunde)
HEp-2-Zellen Humane Epitheliomzellen Typ 2
HeLa Henrietta Lacks (Namensgeberin für menschliche Epithelzellen eines Zervixkarzinoms)
i. d. R. in der Regel
IgG Immunglobulin G
IL Interleukin
KBE koloniebildende Einheiten
l Liter
LPS Lipopolysaccharid
M Molarität (mol/l)
MACS engl.: magnetic-activated cell sorting MCP-1 engl.: monocyte chemotactic protein one
mg Milligramm
MHK minimale Hemmkonzentration
MIC engl.: minimal inhibitory concentration
MIF Membranimmunfluoreszenz
min Minute(n)
ml Milliliter
mM Millimolar
MNCs engl.: mononuclear cells
MOI engl.: multiplicity of infection
MRP engl.: muramidase-released protein
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µM Mikromolar
N normal
NaCl Natriumchlorid
n. d. nicht determiniert
ng Nanogramm
NH3 Stickstofftrihydrid (= Ammoniak) NK Zellen natürliche Killerzellen
nm Nanometer
n. s. nicht signifikant
OCT Ornithin-Carbamoylransferase
OD optische Dichte
OFS Opazitätsfaktor von S. suis
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PBS engl.: phosphate buffered saline
PE Phycoerythrin
PMF engl.: proton-motive force
Pgm Phosphoglucomutase
pH engl.: power of hydrogen (pH-Wert)
PJ Propidiumjodid
PTS Phosphotransferasesystem
PVDF Polyvinylidenfluorid
QS engl.: quorum sensing
RALP engl.: RofA-like protein
ROS engl.: reactive oxygen species RPMI Roswell Park Memorial Institut
RT Raumtemperatur
® engl.: registered trademark
SAO engl.: surface antigen one SCV engl.: small colony variant SDS engl.: sodium dodecyl sulphate
sek Sekunde(n)
SLY Suilysin
SSC engl.: sideward scatter7
SLA-II engl.: swine leucocyte antigen II
STSS engl.: streptococcal toxic shock syndrome
stat stationär
SWC engl.: swine workshop cluster
TA Toxin-Antitoxin
TEM Transmissionelektronenmikroskopie
TEMED N, N, N’, N’-Tetramethylethylendiamin TBST engl.: tris-buffered saline Tween-20
THB engl.: Todd Hewitt broth
™ engl.: trade mark
TNF-α Tumornekrosefaktor Alpha
Tris Tris-(hydroxymethyl-)aminomethan
U engl.: unit (Einheit)
u. a. unter anderem
ÜNK Übernachtkultur
UpM Umdrehungen pro Minute
V Volt
VBNC engl.: viable but not culturable
[v/v] Volumen pro Volumen
[w/v] Gewicht pro Volumen
WT Wildtyp
x -fache/mal
z. B. zum Beispiel
ZNS zentrales Nervensystem
Abkürzungen erwähnter Bakterienstämme
E. coli Escherichia coli
L. lactis Lactococcus lactis
M. tuberculosis Mycobacterium tuberculosis P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa S. agalactiae Streptococcus agalactiae S. dysgalactiae Streptococcus dysgalactiae S. gordonii Streptococcus gordonii
S. mutans Streptococcus mutans
S. pneumoniae Streptococcus pneumoniae S. pyogenes Streptococcus pyogenes
S. suis Streptococcus suis
Staph. aureus Staphylococcus aureus
Einleitung
17
1 Einleitung
Bei Streptococcus (S.) suis handelt es sich um ein grampositives, fakultativ anaerobes, bekapseltes Kokkenbakterium. Der natürliche Wirt des Bakteriums ist das Schwein, in dessen oberen Respirationstrakt, Genitaltrakt und Intestinaltrakt es als Kommensale die Mukosa besiedeln kann (Higgins et al., 1990; Robertson und Blackmore, 1989; Swildens et al., 2004). Eine Besiedlung mit S. suis kann zur Infektion der Schweine führen und Erkrankungen wie Septikämien, Meningitiden, Pneumonien, Endokarditiden oder Arthritiden verursachen (Clifton-Hadley und Alexander, 1980; Staats et al., 1997). S. suis kann auch Menschen, die in engem Kontakt zu Schweinen stehen, infizieren, und gilt deshalb als ein bedeutender Zoonoseerreger. Bei erkrankten Menschen wurden z. B. Endokarditiden und Meningitiden diagnostiziert (Arends und Zanen, 1988; Rosenkranz et al., 2003). In China kam es 1998 und 2005 bei infizierten Menschen zu schweren S. suis- Ausbrüchen, in deren Zusammenhang u. a. das streptococcal toxic shock-like syndrome (STSS) beschrieben wurde (Tang et al., 2006; Yu et al., 2006). Schweine, die mit S. suis kolonisiert sind, aber keine klinischen Symptome zeigen, können maßgeblich zur Verbreitung des Keimes beitragen.
Die Zusammensetzung der polysaccharidhaltigen Kapsel bildet die Grundlage für die Serotypisierung von S. suis. Bisher wurden 33 Serotypen beschrieben, wobei Serotyp 2 weltweit am häufigsten isoliert wurde und als der virulenteste gilt (Gottschalk et al., 2010). Die Kapsel stellt den wichtigsten Virulenzfaktor von S. suis dar. Für Serotyp 2 konnte gezeigt werden, dass sie vor Phagozytose durch porzine Monozyten und murine Makrophagen schützt und somit maßgeblich zur Virulenz von S. suis beiträgt (Charland et al., 1998; Segura et al., 1998; Segura und Gottschalk, 2002; Smith et al., 1999). Allgemein ist allerdings wenig über die Pathogenese von S. suis-Erkrankungen bekannt.
Ein wichtiger Schritt in der Pathogenese von S. suis stellt das Übertreten der mukosalen Epithelzell- und Endothelzellbarriere dar, um im Wirt ins Blut zu gelangen.
Mit dem Blutstrom kann sich S. suis im Organismus ausbreiten und die Zielorgane erreichen, wobei eine Manifestation im ZNS eine besondere Hürde darstellt, da hierzu die Überwindung der Blut-Liquor-Schranke nötig ist. In dem Zusammenhang
Einleitung
18
wurde die Trojan horse theory postuliert, laut derer S. suis intrazellulär in den Monozyten persistierend das ZNS erreicht (Williams und Blakemore, 1990). Die modifizierte Trojan horse theory besagt dagegen, dass S. suis extrazellulär an den Monozyten adhärierend ins ZNS gelangt (Gottschalk und Segura, 2000). Dass die Wachstumsphase einen Einfluss auf die Expression von Adhäsinen und somit auf die Stärke der Bindung des Bakteriums an die Wirtszelle hat, wurde für S. pyogenes zusammengefasst (Kreikemeyer et al., 2003).
Bakterielle Infektionen werden vornehmlich antibiotisch behandelt, wobei das Versagen von Antibiotikatherapien ein epidemiologisches und wirtschaftliches Problem darstellen kann. Neben der Antibiotikaresistenz existiert das Phänomen der Antibiotikatoleranz, das bereits für viele Bakterien, und in dieser Arbeit erstmalig für S. suis beschrieben wurde. Eine Antibiotikatoleranz kann durch die Ausbildung von Persisterzellen vermittelt werden. Bakterielle Persister stellen eine phänotypisch variante Subpopulation in einer Bakterienkultur dar (Lewis, 2007; Lewis, 2010a;
Lewis, 2010b; Wiuff et al., 2005). Der Anstieg antibiotikatoleranter Zellen mit zunehmendem Wachstum einer Bakterienkultur gilt als ein typisches Merkmal für die Ausbildung von Persisterzellen (Lewis, 2007) und wird durch einen Einfluss der limitierenden Bedingungen in der stationären Wachstumsphase diskutiert (Keren et al., 2004a).
Vielfach wurde bei Bakterien eine Veränderung des Phänotyps und des Genexpressionsprofils während des Wachstums beschrieben (Amako et al., 2008 Beckert et al., 2001; Chaussee et al., 1997; Chaussee et al., 2001; Chaussee et al., 2002; Kreikemeyer et al., 2002; Lleo Mdel et al., 2007; McIver und Scott, 1997;
Molinari et al., 2001; Na et al., 2006; Navarro Llorens et al., 2010; Nystrom, 2004;
Oliver, 2005; Reid et al., 2001; Schuster et al., 2004; Sitkiewicz und Musser, 2009).
Willenborg et al. (2011) ermittelten eine wachstumsphasenabhängige Expression Virulenz-assoziierter und Metabolismus-regulierender Faktoren in S. suis.
Einleitung
19
Zielsetzung der Arbeit
Die Wachstumsphase scheint sowohl für den Metabolismus als auch für die Virulenz von S. suis eine Rolle zu spielen. In dieser Arbeit wurde die wachstumsphasenabhängige Ausprägung von Merkmalen und die Konsequenzen für das Überleben und die Ausbreitung von S. suis im Wirt näher analysiert. Der Fokus lag dabei auf der Untersuchung der Fähigkeit von S. suis zur Bildung von Persistern und der Wechselwirkung von S. suis mit porzinen Monozyten.
Die unter Bakterien weit verbreitete Persisterbildung äußert sich in einer Toleranz gegenüber Antibiotika, was sich als problematisch im Hinblick auf die Eliminierung von Persisterzellen darstellt. Da von anderen Pathogenen bekannt ist, dass die Wachstumsphase einen Einfluss auf die Ausbildung von antibiotikatoleranten Phänotypen haben kann, wurde in dieser Arbeit die wachstumsphasenabhängige Persisterbildung des virulenten S. suis Serotyp 2-Stammes 10 untersucht, um einen Eindruck zu erlangen, ob dieses Phänomen auch von Relevanz für diesen Erreger ist. Weitere Analysen sollten erste Hinweise liefern, welche Faktoren an einer evtl.
bestehenden Fähigkeit zur Persisterbildung beteiligt sein könnten.
Die Dissemination von S. suis im Blut inklusive der Translokation zu den Zielorganen stellt einen wichtigen Schritt in der Pathogenese dar. Laut (modifizierter) Trojan horse theory wird vermutet, dass S. suis Monozyten als Vehikel nutzt, um intrazellulär persistierend bzw. extrazellulär adhärierend ins ZNS zu gelangen. In vorangegangenen Studien wurde die Assoziation von S. suis mit adhärenten oder vorbehandelten Monozyten oder Makrophagen erforscht. In dieser Arbeit wurde die Assoziation von S. suis erstmals mit affinitätsaufgereinigten, naïven Monozyten aus porzinem Vollblut in Suspension (Batch-Verfahren) untersucht. Ziel dieser Arbeit war es, durch diesen Versuchsaufbau den in-vivo-Bedingungen möglichst nahe zu kommen, um so genauere Aussagen bezüglich der Assoziation von S. suis mit porzinen Monozyten treffen zu können. Da gezeigt wurde, dass die Wachstumsphase von S. suis einen Einfluss auf den Metabolismus und die Expression von Virulenz-assoziierten Faktoren hat, sollte in dieser Arbeit dementsprechend ermittelt werden, ob wachstumsphasenabhängige Unterschiede in der Assoziationsfähigkeit von S. suis bestehen. In den Studien wurden der
Einleitung
20
hochvirulente S. suis Serotyp 2-Stamm 10 und der Serotyp 9-Stamm A3286/94 hinsichtlich ihrer Assoziation miteinander verglichen. Darüber hinaus wurden weitere Einflüsse, den S. suis auf die Eigenschaften der porzinen Monozyten hat, untersucht.
Schrifttum
21
2 Schrifttum
2.1
Streptococcus suis
Streptococcus (S.) suis ist ein bedeutender Krankheitserreger des Schweins, der auch Menschen infizieren kann und deshalb als wichtiger Zoonoseerreger gilt. Es handelt sich um ein grampositives, fakultativ anaerobes Kokkenbakterium, das auf Schafblutagar eine α-Hämolyse verursacht, wobei es auf pferdebluthaltigen Nährböden auch mit β-Hämolyse wachsen kann. S. suis besitzt eine Kapsel, die größtenteils aus Polysacchariden zusammengesetzt ist. Die Komposition der Polysaccharid-Antigene bildet die Grundlage für die Serotypisierung von S. suis.
Bislang wurden 33 Seroytypen beschrieben, es existieren allerdings zusätzlich zahlreiche nicht typisierbare Serotypen (Wisselink et al., 2000). Die verschiedenen Serotypen weisen bezüglich ihrer Virulenz eine große Diversität auf, selbst innerhalb eins Serotyps gibt es avirulente und virulente Stämme. Das klinische Erscheinungsbild infizierter Schweine reicht dabei von Arthritiden, Abszessen, Pneumonien über Septikämien bis hin zu Endokarditiden und Meningitiden (Staats et al., 1997).
2.1.1 Epidemiologie
S. suis kolonisiert als Kommensale insbesondere die Tonsillen und Nasennebenhöhlen des oberen Respirationstraktes, aber auch den Genital- und Intestinaltrakt des Schweins (Higgins et al., 1990; Robertson und Blackmore, 1989;
Swildens et al., 2004). Neben einer Infektion der Schweine, die in einem klinischen Erscheinungsbild resultiert, können klinisch symptomlose Tiere Träger von S. suis sein und so maßgeblich zur Verbreitung des Erregers zwischen Betrieben und zur Infektion ganzer Bestände beitragen. Faktoren, die bei den Tieren Stress verursachen und somit einen Krankheitsausbruch begünstigen, können beispielsweise mangelnde Hygiene, zu dicht besetzte Ställe oder andere Infektionen sein. Saug- und Absatzferkel sind dabei besonders anfällig für eine S. suis-Infektion (Staats et al., 1997), wobei die Übertragung sowohl horizontal als auch vertikal über
Schrifttum
22
die Muttersau stattfinden kann (Amass et al., 1997). Die meisten Tiere, die Träger von S. suis sind, zeigen allerdings subklinische Erscheinungen, was sich in Kümmern und geringer Tagegewichtszunahme widerspiegelt. Neben der klinischen Symptomatik resultieren v. a. diese subklinischen Erscheinungen in hohen finanziellen Verlusten in der Schweinehaltung (Staats et al., 1997). S. suis kommt ebenfalls häufig bei Wildschweinen vor (Baums et al., 2007).
Serotyp 2 wurde weltweit am häufigsten aus erkrankten Schweinen isoliert und gilt als der virulenteste Serotyp (Gottschalk et al., 2010). In den letzten Jahren hat in Europa neben Serotyp 2 zunehmend Serotyp 9 an Bedeutung erlangt. In Deutschland und in den Niederlanden ist Serotyp 9 sogar der am häufigsten isolierte Serotyp (Wisselink et al., 2000). Nach nasaler Infektion von Schweinen wurde für Serotyp 9 eine geringere Virulenz als für Serotyp 2 festgestellt (Beineke et al., 2008).
Weitere in Europa bedeutsame Serotypen sind die Serotypen 1, 7 und 14 (Allgaier et al., 2001; Higgins et al., 1992; Wisselink et al., 2000).
S. suis kann als Zoonoseerreger auch Menschen infizieren, und zwar vor allem dann, wenn über einen längeren Zeitraum enger Kontakt zwischen Mensch und Schwein oder dessen Produkten besteht. Gefährdet sind z. B. Schlachthofmitarbeiter, Landwirte, Jäger oder Tierärzte. In westlichen Ländern kommt es meist nur zu sporadischen Infektionen beim Menschen. Das klinische Erscheinungsbild äußert sich zumeist in Arthritiden, Meningitiden, Endokarditiden oder Septikämien (Arends und Zanen, 1988; Rosenkranz et al., 2003). Gehäufte S. suis-Infektionen beim Menschen treten v. a. in asiatischen Ländern auf. Eine S. suis-Infektion gilt in Vietnam als die häufigste Ursache bakterieller Meningitis bei Erwachsenen und in Thailand als zweithäufigste Ursache. In Hong Kong wurde S. suis als dritthäufigster Erreger bakterieller Meningitis diagnostiziert (Hui et al., 2005; Mai et al., 2008;
Wangkaew et al., 2006). In China kam es 1998 und 2005 zu untypisch schweren S. suis-Ausbrüchen bei infizierten Menschen (Tang et al., 2006; Yu et al., 2006). Der Ausbruch im Jahr 2005 forderte innerhalb weniger Wochen 215 Erkrankte, wovon 38 starben. Bemerkenswert war das gehäufte Vorkommen invasiver Gewebsinfektionen.
Diese entsprachen dem Krankheitsbild des streptococcal toxic shock-like syndrome (STSS), welches normalerweise durch Gruppe A-Streptokokken (GAS) verursacht
Schrifttum
23
wird. Damit einhergehend waren hämorrhagisches Fieber, niedriger Blutdruck, Schock und multiples Organversagen. Allerdings wurde in den entsprechenden S. suis-Stämmen nicht das für das STSS verantwortliche Superantigen, wie es in GAS vorkommt, gefunden.
2.1.2 Virulenzfaktoren und Virulenz-assoziierte Faktoren
Für S. suis wurden wenige experimentell bestätigte Virulenzfaktoren und zahlreiche Virulenz-assoziierte-Faktoren beschrieben. In dieser Arbeit ist eine Auswahl bestimmter Virulenz-assoziierter Faktoren beschrieben. Für einen umfassenden Überblick sei auf die Übersichtsartikel von Baums und Valentin-Weigand (2009) und Fittipaldi et al. (2012) verwiesen.
2.1.2.1 Kapsel
Die Kapsel gilt als der wichtigste Virulenzfaktor von S. suis, da sie das Bakterium vor Phagozytose durch Immunzellen schützt. In Infektionsversuchen konnte nachgewiesen werden, dass kapsellose Serotyp 2-Mutanten sowohl im Schwein als auch in der Maus im Vergleich zum Wildtyp (WT) avirulent waren (Charland et al., 1998; Smith et al., 1999). Die Avirulenz der kapsellosen Mutanten wird auf deren verstärkte Phagozytose durch murine und porzine Makrophagen bzw. durch porzine Monozyten und neutrophile Granulozyten zurückgeführt (Charland et al., 1998;
Segura et al., 1998; Smith et al., 1999; Benga et al., 2008). Die Kapsel von S. suis Serotyp 2 scheint auch eine Bedeutung in der Pathogenese zu haben. Es wird angenommen, dass S. suis während der Infektion für eine bessere Adhäsion an den Epithelzellen die Expression der Kapseldicke herunterreguliert und nach Eintritt in den Blutstrom wieder heraufreguliert, um den Phagozytoseschutz aufrecht zu erhalten (Gottschalk und Segura, 2000).
Die Kapsel von S. suis besteht vornehmlich aus verschiedenen Polysacchariden, auf deren Komposition die Serotypisierung basiert. Bisher wurden 33 Serotypen beschrieben. Die Kapsel der Serotypen 1 und 2 ist hauptsächlich aus Glukose, Galaktose, N-Acetylglukosamin und N-Acetylneuraminsäure (Sialinsäure) aufgebaut,
Schrifttum
24
die Kapsel von Serotyp 1 enthält zusätzlich noch N-Acetylgalaktosamin und die von Serotyp 2 Rhamnose (Charland et al., 1995). Smith et al. (2000) konnten Sialinsäure als Kapselbestandteil in den Serotypen 1, 2, 14, 27 und ½, aber nicht in Serotyp 9 nachweisen. Segura und Gottschalk (2002) beschrieben, dass Sialinsäure zur Adhärenz von S. suis Serotyp 2 an murine Makrophagen beiträgt.
2.1.2.2 MRP und EF
Das muramidase-released protein (MRP) wurde als Membran-assoziiertes Protein beschrieben (Smith et al., 1992), wohingegen der extracellular factor (EF) als sezerniertes Protein im Kulturüberstand nachgewiesen wurde (Vecht et al., 1991).
Auffällig war das gehäufte Vorkommen dieser Proteine in hochvirulenten S. suis- Stämmen, die aus erkrankten Schweinen isoliert wurden. Isolate von Tonsillen gesunder Schweine waren zumeist MRP-/EF-negativ (Vecht et al., 1991). MRP-, EF- oder MRP-/EF-Deletionsmutanten zeigten im Infektionsversuch hingegen die gleiche Virulenz wie der WT, weshalb diese Proteine keine essentielle Rolle in der Virulenz zu spielen scheinen (Smith et al., 1996). Allerdings konnten Wisselink et al. (2001) zeigen, dass eine MRP/EF-Kombinationsvakzinierung bei Schweinen eine Protektion gegen S. suis hervorrief, eine Vakzinierung mit nur einem der beiden Proteine dagegen nicht. Die Funktion von MRP und EF ist bisher ungeklärt. Aufgrund des hohen Vorkommens bei den meisten virulenten S. suis-Stämmen, werden diese beiden Faktoren als Virulenzmarker bezeichnet und diagnostisch zur Identifikation von virulenten S. suis-Stämmen herangezogen (Smith et al., 1996).
2.1.2.3 Suilysin (SLY)
Suilysin wurde in fast allen S. suis Serotypen nachgewiesen (Okwumabua et al., 1999). Die Prävalenz für den hochvirulenten Serotyp 2 beträgt sogar 95% (Segers et al., 1998). Dieses Protein wurde von Jacobs et al. (1994) aus S. suis- Kulturüberständen gewonnen und als ein Hämolysin identifiziert. Analysen ergaben, dass es zur Familie der Cholesterol-abhängigen porenbildenden Zytolysinen (engl.:
cholesterol-dependent pore-forming cytolysins, CDC) gehört und die Aminosäuresequenz eine Homologie von 52% zum Pneumolysin von S. pneumoniae
Schrifttum
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aufweist. Durch das Vorhandensein einer N-terminalen Signalsequenz wurde es als sezerniertes Exotoxin beschrieben (Jacobs et al., 1994; Segers et al., 1998). Es wurde ein zytotoxischer Effekt des Suilysins auf Epithelzellen (Lalonde et al., 2000;
Norton et al., 1999), Endothelzellen (Charland et al., 2000) und Makrophagen (Segura und Gottschalk, 2002) nachgewiesen. Norton et al. (1999) beschrieben, dass bekapselte sly-positive S. suis-Stämme im Gegensatz zu sly-negativen Stämmen in der Lage sind, HEp-2-Zellen zu invadieren, wobei von sublytischen Suilysin-Konzentrationen ausgegangen wurde. Sie vermuteten, dass Suilysin die Invasion der Epithelzellen des oberen Respirationstraktes von virulenten S. suis- Stämmen vermittelt. Benga et al. (2008) fanden heraus, dass Suilysin keinen Einfluss auf die Adhärenz von S. suis an neutrophile Granulozyten hat, aber dass die Phagozytose sly-positiver Stämme im Vergleich zu sly-negativen Stämmen reduziert ist. Infektionsversuche im Schwein zeigten, dass eine sly-negative Mutante nur eine leicht attenuierte Infektion hevorruft (Allen et al., 2001). Lun et al. (2003) beschrieben sogar, dass eine sly-negative Mutante ebenso virulent wie der WT ist. Suilysin scheint an der Pathogenese von S. suis beteiligt zu sein, ist aber als Virulenzfaktor nicht essentiell. Es wird als Virulenz-assoziierter Faktor angesehen, der eine wichtige Rolle in der Interaktion von S. suis mit dem Wirt zu spielen scheint (Baums und Valentin-Weigand, 2009).
2.1.2.4 Adhäsine
Adhäsine sind von großer Bedeutung in der Pathogenese von S. suis, da sie dem Bakterium ermöglichen, mit Komponenten der extrazellulären Matrix zu interagieren (Esgleas et al., 2005).
Smith et al. (2001) identifizierten das Fibronektin- und Fibrinogen-bindende Protein von S. suis (FBPS). Es weist Homologien zu den Fibrinogen-bindenden Proteinen von S. pyogenes und S. gordonii auf. Das fbps-Gen wurde in allen Serotypen nachgewiesen. In vitro wurde gezeigt, dass das Protein humanes Fibronektin und Fibrinogen binden kann. Eine im Vergleich zum WT reduzierte Kolonisation der Organe durch die fbps-Mutante lässt vermuten, dass FBPS an der Pathogenese von S. suis beteiligt ist (de Greeff et al., 2002).
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Die Enolase vermittelt die Bindung von Bakterien an Plaminogen (Pancholi, 2001).
Für die Enolase von S. suis wurde nachgewiesen, dass sie neben Plasminogen auch Fibronektin binden kann. Durch die Bindung der Enolase an das Plasmin bzw.
Plasminogen des Wirts wird wahrscheinlich durch dessen Aktivierung eine fibrinolytische Wirkung an der Bakterienoberfläche verursacht, wodurch die Invasion der Bakterien in das Gewebe ermöglicht wird (Esgleas et al., 2008). Es wurde nachgewiesen, dass die Enolase in infizierten Schweinen die Produktion von Antikörpern induziert und eine protektive Wirkung hat (Zhang et al., 2009).
Die Glycerinaldehyd-3-Phosphatdehydrogenase (GAPDH) von S. suis ist zur GAPDH von GAS homolog und kommt in virulenten und avirulenten S. suis-Stämmen vor. In einem Infektionsversuch in der Maus kam es erst nach Zugabe von Albumin zum Kulturmedium zu einer Erhöhung der Virulenz von S. suis, was vermuten lässt, dass Albumin und GAPDH miteinander interagieren, und dass die GAPDH an der Pathogenese von S. suis beteiligt sein könnte (Quessy et al., 1997). Jobin et al.
(2004) konnten zeigen, dass die GAPDH die Bindung von S. suis an humanes und porzines Plasminogen vermittelt. Des Weiteren wurde festgestellt, dass eine Präinkubation mit rekombinanter GAPDH zu einer verminderten Adhäsion von S. suis an porzine Epithelzellen der Trachea und HEp-2-Zellen führte, was die Vermutung nahe legt, dass dieses Protein in den ersten Schritten einer S. suis- Infektion involviert ist (Brassard et al., 2004; Wang und Lu, 2007). Proteomanalysen ergaben, dass die GAPDH in Schweinen eine starke immunogene Reaktion hervorruft (Zhang et al., 2008a).
Ferner wurde gezeigt, dass die 6-Phosphoglukonatdehydrogenase (6PDG) an der Bindung von HEp-2- und HeLa-Zellen beteiligt ist. Eine Immunisierung von Mäusen mit rekombinanter 6PDG führte zu deren Protektion vor einer S. suis Serotyp 2- Infektion. Somit scheint die 6PDG eine Rolle in der Pathogenese von S. suis zu spielen (Tan et al., 2008).
Si et al. (2009) beschrieben eine putative Beteiligung der Glutamin Synthetase (GlnA) an der Virulenz von S. suis. Sie fanden heraus, dass die Adhärenz einer glnA- Mutante an HEp-2-Zellen im Vergleich zum WT stark reduziert war. Außerdem scheint die GlnA bei der Kolonisation spezifischer Organe, die bei einer S. suis-
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Infektion betroffen sind, eine Rolle zu spielen. Des Weiteren erwies sich im Mausmodell die Virulenz der glnA-Mutante im Vergleich zum WT als attenuiert.
Von der Amylopullulanase (ApuA) wird einerseits angenommen, dass sie in vivo durch den Abbau von Glycogen und Stärke im oberen Respirationstrakt des Schweins der Bereitstellung von Nährstoffen dient. Andererseits wurde in vitro gezeigt, dass ApuA die Adhäsion von S. suis an porzine Epithelzellen und porzinen Mukus fördert. Diese Bifunktionalität könnte eine Verbindung zwischen der Kohlenhydratverwertung und der Kolonisation und Infektion des Wirtes durch S. suis darstellen (Ferrando et al., 2010).
2.1.2.5 Arginin Deiminase System
Das Arginin Deiminase System (ADS) ist ein weiterer putativer Virulenzfaktor von S. suis. Es ist unter prokaryotischen Organismen weit verbreitet und existiert z. B. in Halobakterien, Pseudomonas spp., Bacillus spp., Milchsäurebakterien oder oralen Streptokokken (Casiano-Colón und Marquis, 1988; Cunin et al., 1986; Gamper et al., 1991; Maghnouj et al., 2000; Ruepp und Soppa, 1996; Zúñiga et al., 1998). Das ADS stellt für S. suis einen alternativen Stoffwechselweg dar. Die Expression des ADS in S. suis ist, wie auch für viele andere Bakterien beschrieben, mit dem Kohlenhydratstoffwechsel verknüpft und unterliegt der Katabolitrepression (Gruening et al., 2006; Zeng et al., 2006). Dies bedeutet, dass in Anwesenheit einfach zu metabolisierender Zucker, vornehmlich Glukose, klassische Stoffwechselwege aktiviert und alternative Stoffwechselweg reprimiert werden, während es v. a.
während des Wachstums durch Verbrauch der primären Kohlenhydrate zu einer Aufhebung der Repression kommt (Titgemeyer und Hillen, 2002). Bei S. suis besteht das ADS aus den drei Enzymen Arginin-Deiminase (AD), Ornithin- Carbamoyltransferase (OCT) und Carbamat-Kinase (CK), die die Umsetzung von Arginin zu Adenosintriphosphat (ATP), Ammoniak (NH3) und Kohlenstoffdioxid (CO2) katalysieren. Citrullin, Ornithin und Carbamoylphosphat entstehen dabei als Neben- bzw. Zwischenprodukte (Gamper et al., 1991). Die Enzyme AD und OCT wurden bei S. suis als Zellwand-assoziiert und Temperatur-induzierbar beschrieben (Winterhoff et al., 2002). Das ADS von S. suis scheint allgemein eine wichtige Rolle bezüglich
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seines Metabolismus und seiner Pathogenität zu spielen, da es dem Bakterium ermöglicht, mittels dieses alternativen Stoffwechselweges durch die Produktion von ATP bzw. Ammoniak unter Sauerstoff- oder Nahrungslimitierung bzw. unter sauren Bedingungen zu überleben (Gruening et al., 2006). Die drei Enzyme AD, OCT bzw.
CK werden von den Genen arcA, arcB bzw. arcC kodiert. Für diese Gene wurde nachgewiesen, dass sie als Operon organisiert sind und polycistronisch transkribiert werden (Winterhoff et al. 2002). Das arcABC Operon wird von weiteren Genen flankiert, die mit ihm assoziiert sind und deren entsprechenden Produkte teilweise regulierend auf das ADS wirken. Stromaufwärts vom arcA-Gen liegt das Gen flpS. Es weist eine Homologie von 64% zu dem Gen flp von S. gordonii auf. Außerdem hat es Homologien zu den Crp/Fnr Transkriptionsfaktoren, welche in vielen Bakterien verantwortlich für die anaerobe Genregulation sind (Spiro, 1994). Gruening et al.
(2006) wiesen nach, dass das ADS von S. suis unter mikroaerophilen und anaeroben Wachstumsbedingungen induziert wird, wobei das flpS-Gen wahrscheinlich die sauerstoffabhängige Regulation des ADS unterstützt. Stromabwärts vom arcC-Gen existieren die Gene arcD, arcT, arcH und argR. Das arcD-Gen hat eine Homologie von 70% zu einem Arginin-Ornithin-Antiporter von S. gordonii. Es konnte nachgewiesen werden, dass das arcD-Gen mit dem arcABC-Operon ko-transkribiert wird (Gruening, Dissertation, 2004). Analysen ergaben, dass dieses Gen in S. suis evtl. ebenfalls für einen Arginin-Ornithin-Antiporter kodiert und durch den Import von Arginin vermutlich zur besseren Überlebensfähigkeit von S. suis beiträgt (Fulde, Dissertation, 2007). Das arcT-Gen ist zu 67 bis 72% zu dem arcT-Gen von S. gordonii homolog, und das arcH-Gen hat eine Homologie bis zu 69% zu einer β- Endogalaktosidase von Clostridium perfringens. Das Gen argR ist zu 70% zu dem arcR-Gen, das in S. gordonii für einen Arginin Repressor kodiert, homolog (Gruening et al., 2006). Für S. suis wurde nachgewiesen, dass das ADS durch Arginin induziert werden kann, da eine potentielle Bindungsstelle für ArgR existiert (Fulde et al., 2011). Fernab vom arcABC-Operon liegt das ccpA-Gen. Das CcpA (catabolite control protein A) ist ein wichtiger Katabolitrepressor. Es wurde beschrieben, dass es während des Wachstums bei einem Zuckerüberschuss die Expression von Genen reprimiert (Kietzman und Caparon, 2010; Titgemeyer und Hillen, 2002; Zomer et al.,
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2007). Willenborg et al. (2011, 2014) konnten zeigen, dass das CcpA in S. suis als globaler Genregulator fungiert und u. a. die Expression Virulenz-assoziierter Faktoren, so auch indirekt das ADS, wachstumsphasenabhängig reguliert.
2.2 Wachstumsphasenabhängige Regulation bei Bakterien
Das bakterielle Wachstum in einer statischen Bakterienkultur ist durch verschiedene Phasen gekennzeichnet. Nach einer Adaptationszeit (lag-Phase) werden in der exponentiellen Wachstumsphase (log-Phase) die noch ausreichend zur Verfügung stehenden Nährstoffe verstoffwechselt. Anschließend folgt die stationäre Phase, in der es zu einer Limitierung der Nährstoffe und zur Akkumulation hemmender Stoffwechselprodukte kommt. Der Verbrauch der Nährstoffe und das Erreichen des Toleranzwertes der Bakterienpopulationsdichte führen schließlich in die Absterbephase (Sahl, 1994). Während des Wachstums kann es zur Veränderung der Ausprägung verschiedener Merkmale und zur massiven Reprogrammierung des Expressionsprofils von Bakterien, was u. a. auch die Expression Virulenz-assoziierter Faktoren betrifft, kommen.
Navarro Llorens et al. (2010) lieferten eine Übersicht über verschiedene Regulationswege gramnegativer Bakterien beim Eintritt in die stationäre Wachstumsphase. Die Expression des alternativen Sigmafaktors RpoS, die Aktivierung des stringent response durch Akkumulation von ppGpp (Tetra- Guanosinphosphat) und diverser anderer Regulatoren kann beispielsweise in einer schnellen Veränderung des Genexpressionsmuster zur Anpassung an wechselnde Umgebungsbedingungen zu Beginn der stationären Wachstumsphase resultieren.
Weiterhin wurden während der stationären Wachstumsphase Veränderungen kataboler Aktivitäten, wie z. B. der Anstieg von Enzymen der Glykolyse und der Abfall von Enzymen des Zitratzyklus, beobachtet (Nystrom, 2004). Sitkiewicz und Musser (2009) ermittelten wachstumsphasenabhängige Veränderungen des Transkriptoms von S. agalactiae (Gruppe B-Streptokokken, GBS). Während des Wachstums wurden Gene, die im alternativen Stoffwechsel involviert sind, heraufreguliert. So konnte beispielsweise eine Aktivierung des Argininmetabolismus
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inklusive der Gene, die für einen Arginin-Ornithin-Antiporter, für die Arginin- Deiminase, für die Ornithin-Carbamoyltransferase und für die Carbamat-Kinase kodieren, festgestellt werden. Stressfaktoren aus der Umwelt, wie z. B.
Nährstoffmangel in der stationären Wachstumsphase, können auch den bakteriellen Zelltod induzieren. Dieser Vorgang wird häufig über Toxin-Antitoxin (TA)-Module vermittelt (Engelberg-Kulka et al., 2006). Bakterien, die sich langfristig in der stationären Wachstumsphase befinden, sind außerdem in der Lage, spezielle Phänotypen auszubilden, die das Überleben der Population unter diesen harschen Bedingungen sichern. Einen besonderen Status, den Bakterien als Überlebensstrategie einnehmen können, ist die Unkultivierbarkeit bei bestehender Viabilität (engl.: viable but not culturable, VBNC) (Lleo Mdel et al., 2007; Na et al., 2006). Dieser Status ist gekennzeichnet durch geringe Stoffwechselaktivität und morphologische Veränderungen und ist charakteristisch für Bakterien in der stationären Wachstumsphase oder dormante Stadien (Amako et al., 2008; Oliver, 2005). Die Dormanz spielt eine Rolle bei der in Kapitel 2.4 beschriebenen Persisterbildung von Bakterien. Quorum sensing (QS) ist ein Phänomen von Bakterien, bei dem die Genexpression abhängig von der Zelldichte koordiniert wird (Keller und Surette, 2006). In Pseudomonas (P.) aeruginosa kontrolliert RpoS die QS-Genexpression beim Eintreten in die stationäre Wachstumsphase (Schuster et al., 2004). QS ist allgemein beim Übergang in die stationäre Wachstumsphase involviert und hat einen Einfluss auf andere Eigenschaften, wie z. B. die Bildung von Biofilmen und Virulenz (Lazazzera, 2000). Begleitend zu der erhöhten Stressantwort der Bakterien bedingt durch die limitierenden Bedingungen in der stationären Wachstumsphase kommt es außerdem zu einer veränderten Expression Virulenz- assoziierter Faktoren.
Ein bedeutendes Beispiel für eine nährstoff- und milieuabhängige Expression von Virulenzfaktoren ist die Regulation der Kapselexpression in S. pneumoniae während der Infektion des Wirts (Kadioglu et al., 2008). Die maximale Expression der Kapsel stellt einen wichtigen Phagozytoseschutz während der systemischen Infektion dar, behindert allerdings durch die Maskierung der Adhäsine die Interaktion mit den Epithelzellen zu Beginn einer Infektion. Hammerschmidt et al. (2005) beschrieben,
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dass während der Interaktion mit respiratorischen Epithelzellen die Kapsel von S. pneumoniae in vivo und in vitro herunterreguliert war. Sitkiewicz und Musser (2009) beschrieben für S. agalactiae, dass in der stationären Phase Virulenzfaktoren herunterreguliert wurden, die bei der Etablierung einer Infektion beteiligt sind, so z. B.
auch in der Kapselsynthese involvierte Gene. Des Weiteren wurde gezeigt, dass das CcpA-Homolog RegM die Transkription des cps Locus in S. pneumoniae reguliert.
Dies lässt darauf schließen, dass die Zuckerverfügbarkeit ebenso einen Einfluss auf die Kapselexpression hat (Giammarinaro und Paton, 2002). Es wurde weiterhin beschrieben, dass die zwei Proteine Pgm (Phosphoglucomutase) und GalU (Glukose-1-phosphat Uridylyltransferase), die im Kohlenhydratstoffwechsel eine Rolle spielen, die Kapselexpression beeinflussen. Die Mutation der entsprechenden Gene führte dazu, dass S. pneumoniae nahezu keine Kapsel mehr produzierte und Beeinträchtigungen im Wachstum zeigte (Cieslewicz et al., 2001; Mollerach et al., 1998).
Kreikemeyer et al. (2003) fassten für den humanpathogenen Erreger S. pyogenes (GAS) eine wachstumsphasenabhängige Expression verschiedener Virulenzfaktoren und Genregulatoren zusammen und schlossen daraus, dass sich das Bakterium während der Infektion den jeweiligen Bedingungen und Anforderungen im Wirt anpassen kann. So beeinflusst eine wachstumsphasenabhängige Aktivität und gegenseitige Regulation der ‘stand-alone’ response Regulatoren Mga, RALP (RofA- like protein) und Rgg/RopB wahrscheinlich die Interaktion von GAS mit dem Wirt im Hinblick auf Adhärenz, Kolonisierung, Persistenz und Ausbreitung des Erregers (Beckert et al., 2001; Chaussee et al., 1997; Chaussee et al., 2001; Chaussee et al., 2002; Kreikemeyer et al., 2002; McIver und Scott, 1997; Molinari et al., 2001; Reid et al., 2001). Die Identifikation bestimmter putativer Domänen innerhalb des Mga Regulons lassen eine Phosphorylierung des Mga durch ein Phosphotransferasesystem (PTS) vermuten, was ein weiter Hinweis darauf ist, dass eine wachstumsphasenabhängige Zuckerverwertung mit der Expression von Virulenzfaktoren zusammenhängt (Hondorp und McIver, 2007). Diese Vermutung wird durch die Erkenntnis unterstützt, dass der Katabolitrepressor CcpA an den mga- Promotor bindet und die Expression von mga während des Wachstums beeinflusst
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Kürzlich beschrieben Guo et al. (2014), dass die Induktion der Kompetenz und die Expression der Kompetenzgene durch XIP (sigX-inducing peptide) und CSP (competence-stimulating peptide) in S. mutans abhängig von der Wachstumsphase sind. Außerdem hatte der pH-Wert der Umgebung einen maßgeblichen Einfluss auf den XIP-vermittelten Signalweg.
2.2.1 Wachstumsphasenabhängige Genregulation in S. suis
Allgemein ist sehr wenig über eine wachstumsphasenabhängige Genexpression und wachstumsphasenabhängige Phänotypen bei S. suis bekannt. Während der Pathogenese ist S. suis unterschiedlichen Bedingungen im Wirt ausgesetzt, wie z. B.
wechselnden pH-Werten oder Zuckerkonzentrationen. Dies erfordert eine ständige Anpassung von S. suis während der Pathogenese, was z. B. durch eine gesteuerte Regulation der ADS- oder Kapsel-Expression gewährleistet werden kann. Der Wechsel von einer nährstoffreichen zu einer nährstoffarmen Umgebung findet auch während des Wachstums von S. suis in einer Flüssigkultur statt. Willenborg et al.
(2011) untersuchten die wachstumsphasenabhängige Expression von Virulenz- assoziierten Faktoren in S. suis. Die Gene arcB (stellvertretend für das arcABC- Operon) und sly (Suilysin) waren in stationär gewachsenen Bakterien im Vergleich zu exponentiell gewachsenen Bakterien heraufreguliert, während die Gene cps2A (erstes Gen des Kapsel-Synthese-Locus), sao (surface antigen one) und ofs (Opazitätsfaktor) in stationär gewachsenen Bakterien im Vergleich zu exponentiell gewachsenen Bakterien herunterreguliert waren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Regulation der Expression von Virulenz-assoziierten Faktoren in S. suis vermutlich durch die Glukoseverfügbarkeit vermittelt wird. Außerdem wurde gezeigt, dass der Katabolitrepressor CcpA einen regulatorischen Einfluss auf die Expression Virulenz-assoziierter Gene hat. In der exponentiellen Wachstumsphase kam es durch CcpA zur Repression von arcB, wohingegen die Expression der Gene cps2A, sly, ofs, sao, eno (Enolase) und mrp (muramidase-released protein) durch CcpA aktiviert wurde. Zudem ergaben cDNA-Microarray-Analysen, dass das CcpA als globaler Genregulator fungiert. So gehört ein Großteil der Gene, die unter dem
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regulatorischen Einfluss von CcpA stehen, dem Kohlenhydratstoffwechsel an.
Außerdem scheint das CcpA einen Einfluss auf die Expression von Genen zu haben, die in der Kapsel- und Sialinsäuresynthese involviert sind. Spätere Analysen ergaben, dass das CcpA sowohl einen direkten als auch einen indirekten Effekt auf die Genexpression hat (Willenborg et al., 2014). Die Ergebnisse zeigen, dass sich das CcpA als zentrales Protein in der wachstumsphasenabhängigen Expression von Virulenz-assoziierten Faktoren in S. suis erweist und bestätigen die bereits für andere Pathogene beschriebene Verbindung von Metabolismus und Virulenz.
2.3 Pathomechanismen und Erreger-Wirtszell-Interaktionen bei S. suis
2.3.1 Pathogenese von S. suis-Erkrankungen
Über die genaue Pathogenese von S. suis ist wenig bekannt. Es wird angenommen, dass S. suis in den Tonsillen der Schweine für längere Zeit überleben und nach Adhäsion und Invasion der Epithelzellen der Immunabwehr entgehen kann (Fittipaldi et al., 2012). Die Adhäsion von S. suis an Epithelzelllinien diverser Spezies wurde in mehreren Studien untersucht. So wurde herausgefunden, dass S. suis sowohl an porzine, als auch an humane und canine Epithelzellen adhäriert (Benga et al., 2004;
Lalonde et al., 2000; Norton et al., 1999). An der Oberfläche von S. suis befindliche Adhäsine scheinen allerdings von der Polysaccharidkapsel maskiert zu werden, da für kapsellose Mutanten im Vergleich zum WT eine erhöhte Adhäsion festgestellt werden konnte (Lalonde et al., 2000; Benga et al., 2004). Bereits 1991 beschrieben Gottschalk et al., dass in Lungenschnittpräparaten eine erhöhte Adhärenz von S. suis mit einer dünneren Kapsel einherging. Fittipaldi et al. (2012) postulierten die Hypothese, dass S. suis zu Beginn des Infektionsgeschehens als Reaktion auf Umweltsignale die Expression der Kapsel herunterreguliert, was zu einer verstärkten Interaktion von bakteriellen Adhäsinen und Wirtsrezeptoren führt. Die Ergebnisse bezüglich der Invasion der Epithelzellen durch S. suis sind konträr. So konnten beispielsweise Norton et al. (1999) und Benga et al. (2004) die Invasion der Epithelzellen durch S. suis bestätigen. Lalonde et al. (2000) konnten dagegen keine
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Invasion durch S. suis feststellen. Für Suilysin-sezernierende S. suis-Stämme konnte jeweils ein zytolytischer Effekt auf die Zellen nachgewiesen werden, wohingegen dieser Effekt durch sly-negative Stämme nicht eintrat. Lalonde et al. (2000) postulierten daraufhin, dass für das Überwinden der Epithelzellbarriere der zytolytische Effekt des Suilysins nötig ist. Eine weitere Studie ergab, dass Suilysin in einer sublytischen Konzentration zu einer Aufnahme von S. suis in HEp-2-Zellen beiträgt (Seitz et al., 2013). In in-vivo-Experimenten in der Maus stellte sich heraus, dass sly-negative Mutanten zwar das respiratorische Epithel kolonisierten, aber im Vergleich zum WT in der Virulenz attenuiert waren (Seitz et al., 2012). Für die Invasion von Epithelzellen stellte sich auch die Kapsel als ein wichtiger Faktor heraus. Benga et al. (2004) beschrieben, dass kapsellose S. suis-Stämme im Gegensatz zu bekapselten Stämmen invasiv waren. Zum Verlassen des Blutstromes und zur Manifestion im Zielgewebe bzw. des ZNS muss S. suis das Endothel bzw.
den Plexus choroideus überqueren. Ähnlich den Ergebnissen bezüglich der Adhärenz am Epithel konnte gezeigt werden, dass bekapselte Stämme eine verminderte Adhärenz an Endothelzellen aufweisen, aber auch, dass eine kapsellose Mutante nicht-invasiv war (Benga et al., 2005). Benga et al. (2005) fanden heraus, dass S. suis an porzine brain microvascular endothelial cells (BMEC) adhäriert, aber diese nicht invadiert. Charland et al. (2000) ermittelten ähnliche Ergebnisse für humane BMEC. Vanier et al. (2004) beschrieben dagegen auch eine Invasion porziner BMEC. Tenenbaum et al. (2009) wiesen nach, dass S. suis in der Lage ist, porzine Epithelzellen des Plexus choroideus zu invadieren und von der basolateralen, also der dem Blutstrom zugewandten Seite, zur apikalen, also der dem Liquorraum zugewandten Seite, zu durchdringen. Das Suilysin wird bedingt durch seine zytotoxischen Effekte im Zusammenhang mit der Penetration der Blut- Liquor-Schranke diskutiert. Allerdings konnten auch sly-negative Stämme die zerebralen Endothelzellen invadieren (Vanier et al., 2004). Für die Dissemination von S. suis mit dem Blutstrom spielt die Kapsel in der Hinsicht eine wichtige Rolle, da sie vor Phagozytose durch Monozyten, Makrophagen und neutrophile Granulozyten schützt (Benga et al., 2008; Charland et al., 1998; Smith et al., 1999). Es wird angenommen, dass S. suis die Expression der Kapsel für eine bessere Adhäsion an
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den Zellen herunterreguliert und nach dem Erreichen des Blutstroms wieder heraufreguliert, um den Phagozytoseschutz zu gewährleisten (Gottschalk und Segura, 2000). Mit dem Blutstrom gelangt S. suis zu den Zielorganen. In diesem Zusammenhang wurde die Trojan horse theory (Williams und Blakemore, 1990) bzw.
die modifizierte Trojan horse theory (Gottschalk und Segura, 2000; Segura und Gottschalk, 2002) entwickelt, die in Kapitel 2.3.2 näher erläutert sind. Zur Aufklärung der genauen Mechanismen zum Überqueren der Epithel- bzw. Endothelzellen, sowie der exakten Art der Verbreitung mit dem Blut bedarf es weiterer Untersuchungen.
2.3.2 Allgemeine Merkmale von Monozyten und deren Bedeutung für S. suis:
(Modifizierte) Trojan horse theory
Monozyten sind Teil der unspezifischen und spezifischen Immunantwort. Sie eliminieren Pathogene und Tumorzellen durch Phagozytose; außerdem wirken sie regulierend auf das Immunsystem ein, indem sie Zytokine produzieren und Antigene prozessieren und diese den Lymphozyten präsentieren. Sie stammen zusammen mit neutrophilen Granulozyten von einer gemeinsamen myeloiden Vorläuferzelle ab.
Obwohl während der Myelopoese eine Aufspaltung in die granulozytäre und monozytäre Zelllinie erfolgt, besitzen diese beiden Zelllinien viele gleiche Oberflächenantigene. Die myeloiden Vorläuferzellen differenzieren sich im Knochenmark über die Promonozyten zu den Monozyten aus, die schließlich ins Blut abgegeben werden. Im Blut können die Monozyten einige Tage zirkulieren, bevor sie in verschiedene Gewebe auswandern, wo sie weiter zu spezifischen Gewebsmakrophagen ausdifferenzieren (Gordon et al., 1988; van Furth et al., 1972).
Jede Zelle exprimiert bestimmte Oberflächenantigene, anhand derer sich die Zelle differenzieren und charakterisieren lässt. Hier erfolgt eine Beschreibung einiger wichtiger myeloider und speziell monozytärer Oberflächenantigene, um die Monozyten, die in dieser Arbeit über eine Oberflächenmarker-vermittelte paramagnetische Separation angereichert wurden, zu charakterisieren.
Die Oberflächenmarker SWC3/CD172a, CD14, CD16 und SWC1 (CD = engl.: cluster of differentiation; SWC = engl.: swine workshop cluster) sind charakteristisch für die myeloide Zelllinie. Das Oberflächenantigen SWC3 war der erste etablierte porzine
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myelomonozytäre Marker (Blecha et al., 1994). Dieser Marker diente als Hauptmarker der porzinen myelomonozytären Zellen, da er bereits auf den Vorläuferzellen und auch während des gesamten Differenzierungsprozesses der Monozyten und neutrophilen Granulozyten exprimiert wird (Summerfield und McCullough, 1997). Der porzine Marker SWC3 ist zum humanen Marker CD172a homolog (Alvarez et al., 2000). Ezquerra et al. (2009) vermuteten, dass die frühe Expression von CD172a und die mit der Zelldifferenzierung ansteigende Expression dieses Oberflächenantigens darauf hindeuten, dass dieses Molekül in der Kontrolle der Proliferation, Differenzierung und Aktivierung der Zellen involviert ist. Die Identifizierung des porzinen Markers CD14 beruhte ursprünglich auf seine Kreuzreaktivität mit Antikörpern, die gegen humane CD14-Marker gerichtet sind.
CD14 galt als einer der charakteristischsten myeloiden Marker. Er wird auf Monozyten, Gewebsmakrophagen und zu einem geringen Level auch auf Granulozyten exprimiert (Kielian et al., 1994; Domínguez et al., 1998). Für das humane CD14-Molekül wurde gezeigt, dass es an der Bindung von Lipopolysacchariden (LPS) gramnegativer Bakterien beteiligt ist (Triantafilou, M. und Triantafilou, K., 2002) und eine Rolle in der Erkennung und Phagozytose von Zellen, die apoptotisch sind, spielt (Gregory, 2000a; Gregory, 2000b). CD16 wird von porzinen Monozyten und Makrophagen und zu einem geringen Anteil von neutrophilen Granulozyten (Dato et al., 1992) und SWC1 wird ebenfalls sowohl von Monozyten als auch von Granulozyten exprimiert (Saalmüller et al., 1987).
Die Oberflächenantigene CD163 und SWC9/CD203a stellen wichtige Marker im Zuge des Differenzierungsprozesses der Monozyten und Makrophagen dar. Sie werden nicht von Granulozyten exprimiert. Sánchez et al. (1999) beschrieben, dass das porzine Oberflächenantigen 2A10 zu dem humanen Marker CD163 homolog ist.
Dieses Molekül ist entscheidend für die Untersuchung der Heterogenität von porzinen Monozyten und Makrophagen (Thacker et al., 2001). Humane CD163- Marker bilden Rezeptoren für Hämoglobin/Haptoglobin-Komplexe (Kristiansen et al., 2001) und eine Stimulation humaner Monozyten/Makrophagen über CD163 führt zur Produktion pro- und anti-inflammatorischer Zytokine (Philippidis et al., 2004; van den Heuvel et al., 1999). Das porzine Oberflächenantigen SWC9 stellte sich als homolog
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zum humanen Marker CD203a heraus (Petersen et al., 2007). Die Expression von SWC9 wird während der Differenzierung porziner Monozyten zu Makrophagen heraufreguliert und dient somit der Untersuchung des Reifegrades von Monozyten (Basta et al., 1999; Chamorro et al., 2000; McCullough et al., 1999).
Die Heterogenität humaner Monozyten basiert vornehmlich auf der Stärke der Expression von CD14 und CD16. So lassen sich grob die zwei Monozyten- Subpopulationen CD14high CD16- und CD14+ CD16+ unterscheiden (Passlick et al., 1989; Ziegler-Heitbrock et al., 1993). Im Gegensatz zu humanen Monozyten exprimiert der Hauptteil aller porzinen Monozyten kontinuierlich CD16. Porzine Monozyten können stattdessen basierend auf der CD163-Expression in zwei Subpopulationen unterteilt werden (Chamorro et al., 2000; Sánchez et al., 1999).
Zusammen mit der CD172a- und CD14-Expression und der Expression des sogenannten swine leucocyte antigen II (SLA-II) können porzine Monozyten in vier Subsets eingeteilt werden (Chamorro et al., 2005). Die Einteilung korrespondiert mit dem Reifegrad der Monozyten. Die Expression der Oberflächenmarker der vier Subsets ist in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1: Expressionsmuster von CD172a, CD163, CD14 und SLA-II innerhalb Subsets porziner Monozyten und deren Reifegrad (modifiziert nach Chamorro et al., 2005)
Subset CD172a CD163 CD14 SLA-II Reifegrad
I + - high - unreif
reif
II + - + low
III + + low high
IV + + - high
+ Expression, - keine Expression
Porzine Monozyten exprimieren außerdem SWC1, aber kein SWC9 (SWC1+ SWC9-).
Während der Ausreifung zu Makrophagen werden die Monozyten größer und produzieren mehr Granula. Außerdem kommt es zu einer rapiden Heraufregulierung von SWC9. Des Weiteren wird die Expression von CD163 weiter heraufreguliert und die von SWC1 und CD14 herunterreguliert. Reife Makrophagen exprimieren schließlich kein SWC1 mehr, wohingegen CD14 noch in sehr geringen Mengen
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vorhanden ist (Chamorro et al., 2000; McCullough et al., 1997; McCullough et al., 1999).
Es wird vermutet, dass porzine Monozyten in der Pathogenese von S. suis von Bedeutung sind. S. suis kann nach Überschreiten der Epithelzellbarriere ins Blut gelangen, sich dort ausbreiten und mit dem Blutstrom das Zielorgan erreichen, wobei die genauen Mechanismen bisher ungeklärt sind. Insbesondere das Erreichen des ZNS, wozu zusätzlich die Überwindung der Blut-Liquor-Schranke nötig ist, stellt eine Hürde in der Pathogenese von S. suis dar. In diesem Zusammenhang wurde die Trojan horse theory postuliert, die besagt, dass S. suis porzine Monozyten als Vehikel benutzt, um intrazellulär persistierend zum Gehirn zu gelangen (Williams und Blakemore, 1990). Hinweise für diese Theorie lieferten Monozyten, die aus dem Blut eines Schweines, das eine S. suis-Bakteriämie aufwies, gewonnen wurden. Der bakterienenthaltende Monozytenanteil war mit 2% allerdings nur sehr gering. Busque et al. (1998) konnten mittels Durchflusszytometrie ebenfalls eine Aufnahme von S. suis durch porzine und humane Phagozyten feststellen. Die Ergebnisse der meisten anderen Studien lassen allerdings vermuten, dass auch andere Wege existieren, die zur Dissemination von S. suis beitragen. Außerdem wurde gezeigt, dass die Kapsel vor Phagozytose schützt, während kapsellose Mutanten schneller phagozytiert und auch abgetötet werden (Charland et al. 1996; Smith et al., 1999).
Gottschalk und Segura (2000) stellten dagegen fest, dass eine hohe Bakterienanzahl an Phagozyten adhäriert, ohne phagozytiert zu werden, und postulierten daraufhin die modifizierte Trojan horse theory. Laut dieser Theorie wird vermutet, dass Bakterien zum größten Teil außen an die Monozyten binden, was eine Bakteriämie verursacht und so zur Verbreitung der Infektion führt.
2.3.3 Interaktion von S. suis mit Monozyten und Makrophagen
Es existiert eine Reihe von Studien, die sich mit der Assoziation von S. suis mit Phagozyten beschäftigen. In Bezug auf diese Arbeit war insbesondere die Assoziation mit Monozyten und Makrophagen von Interesse.
Charland et al. (1996) beschrieben, dass sowohl virulente als auch avirulente S. suis Serotyp 2-Stämme von Monozyten, die aus porzinem Blut gewonnen und adhärieren
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gelassen wurden, phagozytiert werden. Nach 3 h Ko-Inkubation wiesen etwa 20 bis 30% der Monozyten intrazellulär vorhandene Bakterien auf, wobei rund 20% der Bakterien des avirulenten Stammes und 40% der Bakterien des virulenten Stammes in den Monozyten überleben konnten. Des Weiteren vermuteten sie, dass das Vorhandensein von Sialinsäure in der Kapsel von S. suis wahrscheinlich keinen Einfluss auf die Phagozytoserate hat. Charland et al. (1998) ermittelten, dass nach 1 h Ko-Inkubation der WT eines Serotyp 2-Stammes von knapp über 20% von porzinen Monozyten abstammmenden Makrophagen phagozytiert wurde, während zwei kapsellosen Serotyp 2-Mutanten von rund 70% der Makrophagen phagozytiert wurden. Für murine Makrophagen wurden ähnliche Ergebnisse erzielt. Zur Auswertung der von Charland et al. (1996 und 1998) ermittelten Ergebnisse wurden die intrazellulären Bakterien jeweils mit Farbstoffen sichtbar gemacht. Segura et al.
(1998) bestimmten das intrazelluläre Vorhandensein von Bakterien in adhärenten murinen Makrophagen erstmalig durch Ausplattieren der Bakterien mit anschließender quantitativer Auswertung. Extrazelluläre Bakterien wurden zuvor antibiotisch abgetötet. Sie verwendeten die murinen Makrophagenzelllinien J774 und P388D1 und murine peritoneale Exsudatmakrophagen. Sie stellten fest, dass ein bekapselter Serotyp 2-Stamm nach 90 min Ko-Inkubation fast gar nicht von den murinen Makrophagen phagozytiert wurde. Im Vergleich dazu konnte eine kapsellose Serotyp 2-Mutante von den murinen Makrophagen besser phagozytiert werden, wobei die Phagozytoserate mit 0,5% allgemein sehr gering war. Die Phagozytoserate eines bekapselten und eines unbekapselten Stammes von Gruppe B-Streptokokken (GBS) betrug dagegen jeweils bis zu 10%. Weiterhin konnte festgestellt werden, dass die phagozytierte kapsellose S. suis Serotyp 2-Mutante nicht in der Lage war, länger in den Makrophagen zu überleben – im Gegensatz zum bekapselten und kapsellosen GBS-Stamm. Die im Vergleich zu früheren Ergebnissen deutlich geringere Internalisation von S. suis begründeten Segura et al. (1998) mit den verschiedenen Methoden, mit denen die Ergebnisse erzielt und ausgewertet wurden.
Busque et al. (1998) beschrieben anhand durchflusszytometrischer Analysen, dass S. suis von jeweils über 90% der humanen neutrophilen Granulozyten und Monozyten phagozytiert wurde. Der Anteil an porzinen Leukozyten, der phagozytierte
