4.3 Wachstumsphasenabhängige Wechselwirkung von S. suis mit porzinen
4.3.1 Präparation und Charakterisierung porziner MNCs und CD14-positiver
Um die Wechselwirkung von S. suis mit den porzinen Monozyten testen zu können, mussten die Monozyten zunächst aus dem Vollblut gesunder Schweine gewonnen werden. Monozyten bilden zusammen mit den Lymphozyten die Zellpopulation der MNCs, wobei die Lymphozyten den Hauptanteil der MNCs ausmachen. Sowohl die MNCs als auch die Monozyten wurden morphologisch charakterisiert, bevor die Monozyten in weiteren Experimenten eingesetzt wurden. In einem ersten Schritt wurden die MNCs mittels einer Biocoll-Dichtegradientenzentrifugation aus dem Vollblut separiert. Dazu wurde Biocoll mit dem porzinen Vollblut überschichtet und zentrifugiert, was in einer dichteabhängigen Separierung der Blutbestandteile resultierte. Die MNCs reicherten sich in der Interphase zwischen Biocoll- und Blutplasmaschicht an. Die Interphase wurde abpipettiert, gewaschen, in RPMI-Medium resuspendiert und durchflusszytometrisch hinsichtlich Morphologie und Vitalität am BD accuri™ C6 (BD, Heidelberg) untersucht und mit der BD accuri™ C6 Software ausgewertet (Abbildung 11A und 11B). Des Weiteren wurde anhand spezifischer fluoreszenzkonjugierter Antikörper die Verteilung bestimmter Oberflächenmoleküle durchflusszytometrisch untersucht, um die MNCs näher zu charakterisieren und um Subpopulationen zu definieren (Abbildung 11C bis 11E).
Abbildung 11A zeigt die durchflusszytometrische Erfassung der Morphologie der in der Interphase befindlichen Zellen. Es wurden 10000 Zellen gemessen und als Dotplot dargestellt. Aufgetragen ist die Größe der Zellen, gemessen im forward scatter (FSC-Kanal, x-Achse), gegen die Zellgranularität, gemessen im sideward scatter (SSC-Kanal, y-Achse). Die Hauptpopulation wurde eingegrenzt und als MNCs
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definiert. Von der Gesamtheit der erfassten Zellen betrug der Anteil der als MNCs definierten Zellpopulation 96,4%. Dieser Wert lässt auf eine saubere Separation der Interphase schließen und zeigt, dass mit der Interphase die MNCs von den übrigen Blutzellen separiert wurden.
Zur Erfassung der Vitalität wurden die MNCs mit dem Vitalitätsmarker Propidiumjodid (PJ) inkubiert. In Abbildung 11B ist die Vitalität der separierten MNCs dargestellt. Der Anteil der vitalen MNCs an den Gesamt-MNCs betrug 98,5%.
Die in den Assoziationsversuchen eingesetzten porzinen Monozyten wurden durch die Erfassung einer charakteristischen Verteilung spezifischer Oberflächenmoleküle (CD-Marker) definiert. Da es während der Prozedur der Anreicherung der Monozyten bereits zu einer Besetzung spezifischer CD-Marker kommt, wurde eine Charakterisierung der Zellen zusätzlich vor der Anreicherung der Monozyten durchgeführt. Dazu wurden die MNCs mit den fluoreszenzkonjugierten Antikörpern gegen die Oberflächenmarker CD172a, CD14 und CD163 inkubiert. CD172a ist ein Panmonozytenmarker (Haverson et al., 1994; McCullough et al., 1997). Die Verteilung und die Intensität der Expression von CD14 und CD163 variiert während des Reifungsprozesses der Monozyten, wodurch sich Monozyten-Subsets definieren lassen (Chamorro et al., 2005).
In Abbildung 11C wurde der prozentuale Anteil der CD172a-positiven MNCs und der CD172a-negativen Zellen erfasst. Es wurden 100000 MNCs durchflusszytometrisch erfasst und als Dotplot dargestellt. Die Zellen, die eine deutliche Fluoreszenz im FL1-Kanal aufwiesen, wurden als Region R1 definiert und die darin befindlichen Zellen als CD172a-positive Zellen. CD172a ist ein Panmonozytenmarker, der innerhalb der gesamten Monozytenpopulation, inklusive aller Reifungsstadien, exprimiert wird. Da Lymphozyten kein CD172a exprimieren, handelt es sich bei den CD172a-positiven Zellen um die Monozyten. Der Anteil an CD172a-positiven MNCs, also an Monozyten, innerhalb der Gesamt-MNCs betrug 2,2%. Hierbei handelt es sich um eine repräsentative durchflusszytometrische Erfassung. Anzumerken ist, dass der Anteil der Monozyten an den MNCs innerhalb von drei Messungen von etwa 2 bis 6% variierte (siehe Anhang, Tabelle 5). Diese Werte verdeutlichen den allgemein geringen Anteil von Monozyten an den MNCs in porzinem Vollblut. Die Zellen in R2
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repräsentieren die Lymphozyten, die kein CD172a exprimieren. Der Anteil CD172a-negativer Zellen betrug 88,6%.
Über das Expressionsmuster von CD14 und CD163 lassen sich Monozytensubpopulationen bzw. -reifegrade klassifizieren. Laut Chamorro et al.
(2005) können porzine Monozyten je nach Expression von CD172a, CD14, CD163 und SLA DR in die vier Subsets I, II, III und IV unterteilt werden.
In Abbildung 11D sind die CD172a-negativen Zellen (Lymphozyten) aus Region R2 im FL2-/FL4-Kanal dargestellt. Im FL2-Kanal werden die CD163-positiven Zellen und im FL4-Kanal die CD14-positiven Zellen erfasst. Da Lymphozyten kein CD14 bzw.
CD163 exprimieren, konnte die Grenzwerte im FL2- und FL4-Kanal für CD163- und CD14-negative Zellen definiert werden. Der Anteil CD14- und CD163-negativer Zellen aus R2 betrug 98,7%.
Abbildung 11E zeigt die prozentuale Verteilung der CD14- und CD163-positiven Zellen innerhalb der CD172a-positiven Zellen aus Region R1 (siehe Abbildung 11C).
Über die Intensität der Fluoreszenzmessungen lassen sich sowohl Monozyten mit hoher Ausprägung von CD14 bzw. CD163 als auch Monozyten mit geringer Ausprägung von CD14 bzw. CD163 erfassen.
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A B
C D
E
Abbildung 11: Präparation porziner MNCs und deren Charakterisierung anhand spezifischer Oberflächenmoleküle (CD-Marker).
Die Morphologie, Vitalität und Verteilung spezifischer Oberflächenmoleküle der Zellen wurden durchflusszytometrisch am BD accuri™ C6 (BD, Heidelberg) untersucht und mit der BD accuri™ C6 Software
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ausgewertet. Mononukleäre Zellen (MNCs) des porzinen Vollblutes wurden nach Biocoll-Dichtegradientenzentrifugation und anschließender Separation der Interphase nach Herstellerangaben präpariert.
Die MNCs wurden mit fluoreszenzkonjugierten Antikörpern gegen die Oberflächenmarker CD14, CD163 und CD172a inkubiert und in Propidiumjodid (PJ)- Lösung aufgenommen. Dargestellt sind repräsentative FACS-Bilder.
A: Darstellung der Morphologie mononukleärer Zellen aus der Interphase nach der Biocoll-Separation als Dichteplot im FSC-/SSC-Kanal. Aufgetragen ist die Größe der Zellen (FSC/x-Achse) gegen die Granularität (SSC/y-Achse).
B: Erfassung des prozentualen Anteils vitaler Zellen im FL3-/SSC-Kanal nach Ausgrenzung der Propidiumjodid (PJ)-positiven Zellen. PJ dient als Indikator für die Zellvitalität und wird im FL3-Kanal detektiert. Aufgetragen ist die Fluoreszenzintensität (FL3/x-Achse) gegen die Granularität (SSC/y-Achse).
C: Erfassung des prozentualen Anteils CD172a-positiver MNCs im FL1-/SSC-Kanal, hier definiert als Region R1, und des prozentualen Anteils CD172a-negativer MNCs (Lymphozyten), hier definiert als Region R2. CD172a ist ein Panmonozytenmarker und diente somit als Eingrenzung der porzinen Monozytenpopulation. Der FITC-konjugierte anti-CD172a-Antikörper wird im FL1-Kanal detektiert. Aufgetragen ist die Fluoreszenzintensität (FL1/x-Achse) gegen die Granularität (SSC/y-Achse).
D: Darstellung der CD172-negativen Zellen aus R2 im FL2-/FL4-Kanal zur Festlegung der Grenzwerte für CD163-positive Zellen im FL2-Kanal und CD14-positive Zellen im FL4-Kanal.
E: Erfassung der prozentualen Verteilung der CD14-positiven und CD163-positiven MNCs innerhalb der CD172a-positiven MNCs (Monozyten) aus R1 im FL2-/FL4-Kanal. Über die CD14- und CD163-Verteilung lassen sich Monozytensubpopulationen klassifizieren. Die definierte Region R3 repräsentiert die Monozytensubpopulation CD14high CD163low und die definierte Region R4 die Monozytensubpopulation CD14low CD163high. Der Alexa 647-konjugierte anti-CD14-Antikörper wird im FL4-Kanal und der PE-647-konjugierte anti-CD163-Antikörper im FL2-Kanal detektiert. Aufgetragen ist die Fluoreszenzintensität im FL2-Kanal (x-Achse) gegen die Fluoreszenzintensität im FL4-Kanal (y-Achse).
Anhand der unterschiedlichen Intensität der Verteilung von CD14 und CD163 wurden die zwei Regionen R3 und R4 definiert, die jeweils eine Monozytensubpopulation repräsentieren. R3 repräsentiert die Monozytensubpopulation CD14high CD163low. Der prozentuale Anteil an der Gesamtmonozytenpopulation beträgt 34,6%. Die Monozytensubpopulation CD14low CD163high wird durch R4 repräsentiert. Ihr prozentualer Anteil an den Gesamtmonozyten beläuft sich auf 55,3%. Die Monozytenpopulation besteht somit zu etwa einem Drittel aus der Subpopulation CD14high CD163low und zu knapp zwei Dritteln aus der Subpopulation CD14low CD163high. Der Restanteil CD14- und CD163-negativer Zellen betrug 8,0%. Die Verteilung von CD14 und CD163 innerhalb der Monozyten (CD172a-positive MNCs) ergab, dass die mit der Interphase separierten Monozyten größtenteils Subset III zuzuordnen waren.
Der Monozytenanteil innerhalb der MNCs ist sehr gering. Den Hauptanteil bilden die Lymphozyten, wohingegen der Anteil der Monozyten an den MNCs beim Schwein nur etwa 2 bis 10% beträgt (Thorn, 2010). Um Studien hinsichtlich der Wechselwirkung von S. suis ausschließlich mit porzinen Monozyten durchführen zu können, mussten die Monozyten aufgereinigt und aus den MNCs angereichert
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werden. Dazu wurden die MNCs mit einem anti-CD14-Antikörper, der mit magnetischen Microbeads konjugiert ist, markiert. CD14 fungiert als Monozytenmarker, da fast die komplette im Blut zirkulierende Monozytenpopulation CD14 exprimiert. Die markierten MNCs wurden in einem magnetischen Feld von den unmarkierten MNCs separiert und dadurch angereichert (engl.: magnetic activated cell sorting, MACS). Die immunomagnetisch angereicherten CD14-positiven MNCs wurden in RPMI-Medium aufgenommen und durchflusszytometrisch sowohl hinsichtlich ihrer Morphologie und Vitalität (Abbildung 12A und 12B), als auch in Bezug auf die Verteilung spezifischer Oberflächenmoleküle (CD-Marker, Abbildung 12C und 12D) untersucht.
In Abbildung 12A ist die durchflusszytometrische Erfassung der Morphologie der angereicherten CD14-positiven MNCs dargestellt. Der Anteil der als CD14-positiven MNCs definierten Zellpopulation betrug in Bezug auf die gesamten erfassten Zellen 93,9%. Dieser Wert deutet auf eine effiziente Anreicherung der CD14-positiven MNCs. Die deutlich sichtbare Verlagerung der Population der CD14-positiven MNCs im Vergleich zur nicht aufgereinigten MNC-Gesamtpopulation (Abbildung 11A) bestätigt eine Anreicherung einer MNC-Subpopulation.
Der Anteil der vitalen CD14-positiven MNCs an den gesamten CD14-positiven MNCs betrug 92,1%. Dieser Wert deutet darauf, dass die CD14-positiven MNCs durch die Aufreinigung nur eine geringe Schädigung erfuhren.
Die aufgereinigten und angereicherten CD14-positiven MNCs wurden wie die nicht- angereicherten MNCs ebenso hinsichtlich der Expression spezifischer CD-Marker untersucht. Dazu wurden die CD14-postiven MNCs mit Fluoreszenz-konjugierten Antikörpern gegen CD172 und CD163 inkubiert.
Abbildung 12C zeigt die Erfassung des prozentualen Anteils der CD172a-positiven MNCs innerhalb der CD14-positiven MNCs. Der eingegrenzte Bereich wurde als Region R1 definiert und die darin befindlichen Zellen als CD172a-positive Zellen. Der Anteil an CD172a-positiven MNCs, also an Monozyten, betrug 94,6%. Im Vergleich zu Abbildung 11C, in der die CD172a-positiven MNCs innerhalb der Gesamt-MNCs dargestellt sind, wird ebenso das Verschwinden der CD172a-negativen Zellen (Lymphozyten) innerhalb der angereicherten CD14-positiven MNCs deutlich.
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In Abbildung 12D ist die Erfassung des prozentualen Anteils der CD163-positiven MNCs innerhalb der CD14-positiven MNCs dargestellt. Die Abgrenzung der CD163-positiven Zellen erfolgte anhand unmarkierter Zellen im FL2 Kanal (Daten nicht gezeigt). Der eingegrenzte Bereich wurde als Region R2 definiert und die darin befindlichen Zellen als CD163-positive Zellen. Der Anteil CD163-positiver MNCs innerhalb der CD14-positiven MNCs betrug 66,7%.
A B
C D
Abbildung 12: Anreicherung porziner CD14-positiver MNCs (Monozyten) und deren Charakterisierung anhand spezifischer Oberflächenmoleküle (CD-Marker).
Die Morphologie, Vitalität und Verteilung spezifischer Oberflächenmoleküle der Zellen wurden durchflusszytometrisch am BD accuri™ C6 (BD, Heidelberg) untersucht und mit der BD accuri™ C6 Software ausgewertet. MNCs des porzinen Vollblutes wurden mit magnetischen anti-CD14-Antiköpern markiert und anschließend wurden die CD14-positiven MNCs mittels immunomagnetischer Separation angereichert. Die CD14-positiven MNCs wurden mit fluoreszenzkonjugierten Antikörpern gegen CD163 und CD172a inkubiert und in PJ-Lösung aufgenommen. Dargestellt sind repräsentative FACS-Bilder.
A: Darstellung der Morphologie der angereicherten CD14-positiven MNCs als Dichteplot im FSC-/SSC-Kanal.
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Aufgetragen ist die Größe der Zellen (FSC/x-Achse) gegen die Granularität (SSC/y-Achse).
B: Erfassung des prozentualen Anteils vitaler CD14-positiver MNCs im FL3-/SSC-Kanal nach Ausgrenzung der Propidiumjodid (PJ)-positiven Zellen. PJ dient als Indikator für die Zellvitalität und wird im FL3-Kanal detektiert.
Aufgetragen ist die Fluoreszenzintensität (FL3/x-Achse) gegen die Granularität (SSC/y-Achse).
C: Erfassung des prozentualen Anteils der CD172a-positiver Zellen innerhalb der CD14-positiven MNCs im FL1-/
SSC-Kanal, hier definiert als Region R1. CD172a als Panmonozytenmarker diente zur Bestätigung der CD14-positiven MNCs als porzine Monozyten. Der FITC-konjugierte anti-CD172a-Antikörper wird im FL1-Kanal detektiert. Aufgetragen ist die Fluoreszenzintensität (FL1/x-Achse) gegen die Granularität (SSC/y-Achse).
D: Erfassung des prozentualen Anteils der CD163-positiven MNCs innerhalb der CD14-positiven MNCs (Monozyten) im FL2-/SSC-Kanal, hier definiert als Region R2. Die Ausprägung von CD163 klassifiziert eine Monozytensubpopulation. Der PE-konjugierte anti-CD163-Antikörper wird im FL2-Kanal detektiert. Aufgetragen ist die Fluoreszenzintensität (FL2/x-Achse) gegen die Granularität (SSC/y-Achse).
Anhand der Verteilung der CD-Marker auf den porzinen CD14-positiven Monozyten wurden diese Subset III zugeordnet.
Auf eine zusätzliche Charakterisierung mit dem anti-CD14-Antikörper wurde verzichtet, da die CD14-positiven MNCs bereits über den anti-CD14-Antikörper angereichert wurden.
Die Verlagerung der Population im FSC-/SSC-Kanal vor und nach der Anreicherung der CD14-positiven MNCs und der Nachweis der Expression des Panmonozytenmarkers CD172a auf fast den gesamten CD14-positiven MNCs bestätigen die CD14-positiven MNCs als Monozyten. Die CD14-positiven MNCs wurden in den folgenden Versuchen deshalb genauer als CD14-positive Monozyten beschrieben. Anhand des Expressionsmuster von CD14 und CD163 innerhalb der porzinen Monozyten vor der Anreicherung und der CD14-positiven Monozyten nach der immunomagnetischen Aufreinigung wurden die in den weiteren Versuchen eingesetzten CD14-positiven Monozyten Subset III zugeordnet.
In einem weiteren Schritt wurden die immunomagnetisch angereicherten porzinen CD14-positiven Monozyten funktionell hinsichtlich ihrer grundsätzlichen Phagozytosefähigkeit charakterisiert. Dazu wurden die CD14-positiven Monozyten mit fluoreszierenden Latexbeads bei einer MOI von 1:8 für 3 h in RPMI-Medium bei 37°C rotierend inkubiert. Die Latexbeads besaßen einen Durchmesser von einem µm und entsprachen somit in etwa der Größe von S. suis. Ein separater Ansatz der Latexbeads-Suspension wurde mit porzinen Immunglobulinen der Klasse G (IgG) beladen, um eine eventuell bestehende Phagozytosefähigkeit zu stimulieren. Nach der Inkubation der porzinen CD14-positiven Monozyten mit den unbehandelten bzw.
IgG-beladenen Latexbeads wurde ein Aliquot durchflusszytometrisch untersucht (Abbildung 13A und 13D). Es wurden 10000 Zellen erfasst und als Dotplot
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dargestellt. Ein weiteres Aliquot wurde auf einen Objektträger zentrifugiert und zur Darstellung der Zellkerne der Monozyten mit Prolong® Gold mit DAPI eingedeckt. Die Präparate wurden am konfokalen Mikroskop Leica TCS SP5 (Leica; Wetzlar) untersucht und mit der Software LAS ausgewertet (Abbildung 13B, 13C, 13E und 13F). Bei den konfokalmikroskopischen Aufnahmen handelt es sich um repräsentative Aufnahmen (40-fache Vergrößerung), die das Bild mehrerer Gesichtsfelder widerspiegeln. In den konfokalmikroskopischen Aufnahmen weisen die Latexbeads eine Grünfluoreszenz und die Zellkerne der porzinen CD14-positiven Monozyten eine Blaufluoreszenz auf. Abbildung 13A zeigt die durchflusszytometrische Erfassung des prozentualen Anteils mit unbehandelten Latexbeads assoziierten porzinen positiven Monozyten. Der Anteil an CD14-positiven Monozyten, die mit unbehandelten Latexbeads assoziiert waren, betrug nur 0,2%. Dieser Wert ist vernachlässigbar und deutet darauf, dass porzine CD14-positive Monozyten nicht oder nur minimal mit Latexbeads assoziieren. Diese Feststellung wird durch die zugehörigen konfokalmikroskopischen Aufnahmen bestätigt, dargestellt in Abbildung 13B und 13C. Die unbehandelten Latexbeads lagen vereinzelt zwischen den Monozyten (Abbildung 13B). Eine räumliche Nähe vereinzelter Latexbeads zu den CD14-positiven Monozyten (Abbildung 13C) kann auf eine minimal vorhandene Assoziation oder auf ein zufälliges Beieinanderliegen deuten.
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A B C
D E F
Abbildung 13: Assoziation von fluoreszierenden unbehandelten bzw. IgG-beladenen Latexbeads mit porzinen CD14-positiven Monozyten.
Porzine CD14-positive Monozyten wurden mit fluoreszierenden Latexbeads (MOI 1:8) für 3 h in RPMI-Medium bei 37°C rotierend inkubiert. Ein Aliquot der Ansätze wurde durchflusszytometrisch am BD accuri™ C6 (BD, Heidelberg) untersucht und mit der BD accuri™ C6-Software ausgewertet (Fluoreszenz im FL1-Kanal), ein weiterer wurde auf einen Objektträger zentrifugiert, zur Darstellung der Zellkerne mit ProLong® Gold mit DAPI eingedeckt, am konfokalen Mikroskop Leica TCS SP5 (Leica) untersucht und mit der Software LAS ausgewertet.
Dargestellt sind repräsentative FACS-Bilder und konfokal-mikroskopische Aufnahmen.
A-C: Assoziation porziner CD14-positiver Monozyten mit unbehandelten Latexbeads.
A: Durchflusszytometrische Erfassung des prozentualen Anteils mit unbehandelten Latexbeads assoziierten CD14-positiven Monozyten im FL1-/SSC-Kanal. Aufgetragen ist die Fluoreszenz der Zellen (FL1/x-Achse) gegen die Granularität (SSC/y-Achse).
B und C: Konfokal-mikroskopische Überprüfung der Assoziation der CD14-positiven Monozyten mit unbehandelten Latexbeads.
D-F: Assoziation porziner CD14-positiver Monozyten mit porzinen IgG-beladenen Latexbeads.
D: Durchflusszytometrische Erfassung des prozentualen Anteils mit IgG-beladenen Latexbeads assoziierten CD14-positiven Monozyten im FL1-/SSC-Kanal. Aufgetragen ist die Fluoreszenz der Zellen (FL1/x-Achse) gegen die Granularität (SSC/y-Achse).
E und F: Konfokal-mikroskopische Überprüfung der Assoziation der CD14-positiven Monozyten mit IgG-beladenen Latexbeads.
B, C, E und F: grün = Latexbeads, blau = Zellkerne der porzinen CD14-positiven Monozyten; Vergrößerung 40-fach.
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Abbildung 13D zeigt die Assoziation der porzinen CD14-positive Monozyten mit den beladenen Latexbeads. Der Anteil an CD14-positiven Monozyten, die mit IgG-beladenen Latexbeads assoziiert waren, betrug 5,6%. Dieser Wert lässt auf eine Assoziation der Latexbeads zu den CD14-positiven Monozyten schließen, die zwar gering ist, aber durch die Beladung mit den porzinen IgG erhöht wurde.
Die zugehörigen konfokalmikroskopischen Aufnahmen, dargestellt in Abbildung 13E und 13F, bestätigen die Assoziation der CD14-positiven Monozyten mit den IgG-beladenenen Latexbeads. Mehrere vereinzelte, in Haufen oder in Ketten liegende IgG-beladene Latexbeads waren mit den CD14-positiven Monozyten assoziiert, wobei zwischen einer Adhärenz und einer Internalisation nicht unterschieden werden kann. Allerdings ist eine Internalisation der IgG-beladenen Latexbeads nicht auszuschließen. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die porzinen CD14-positiven Monozyten prinzipiell zur Antikörper-vermittelten Phagozytose fähig sind.
4.3.2 Überlebensfähigkeit von S. suis in Anwesenheit porziner CD14-positiver