Persisterbildung und Antibiotikatoleranz von Streptokokken

2.4 Antibiotikaresistenz und -toleranz von Bakterien

2.4.7 Persisterbildung und Antibiotikatoleranz von Streptokokken

Die Persisterbildung bei Streptokokken ist allgemein sehr wenig erforscht. Leung und Lévesque (2012) untersuchten die Bildung von Persistern durch S. mutans. Sie beschrieben, dass S. mutans in der Lage ist, Persister zu bilden, die eine Toleranz gegenüber Antibiotika verschiedener Wirkstoffklassen aufweisen. Des Weiteren

Schrifttum

ermittelten sie, dass Persisterlevel von Bakterien, die einen Biofilm ausbilden, sich statistisch nicht signifikant von den Persisterleveln planktonischer Bakterien unterschieden. Interessanterweise stieg der Anteil an Persistern mit dem Alter des Biofilms. Dies wurde auf die fortschreitenden limitierenden Bedingungen im Biofilm, wie z. B. Nährstoffmangel, zurückgeführt. Eine Überexpression der TA-Module MazEF und RelBE führte zu einem Anstieg des Persisterzelllevels, so dass davon auszugehen ist, dass die entsprechenden Gene mit der Antibiotikatoleranz assoziiert sind. Eine Mutation dieser beiden TA-Module hatte keinen Einfluss auf die Antibiotikatoleranz – dies lässt darauf schließen, dass weitere TA-Module in der Ausbildung der Persisterzellen involviert sind. Das Gen rnhB, das für eine putative RNase H kodiert, wurde ebenfalls als ein mit der Persisterbildung assoziiertes Gen identifiziert. Stressoren wie Hitze, ein saurer pH-Wert, oxidativer Stress und Nährstoffmangel führten ebenfalls zu einem erhöhten Persisterlevel in S. mutans.

Des Weiteren konnte festgestellt werden, dass das QS-System von S. mutans ebenfalls in der Bildung stressinduzierter Persister involviert ist. Zuvor wurde beschrieben, dass das QS-Peptid (CSP Pheromon) von S. mutans durch Stress induzierbar ist und Signale innerhalb der Bakterienpopulation übermitteln kann (Perry et al., 2009).

Bei S. suis war zu Beginn dieser Arbeit noch nichts über die Persisterbildung bekannt.

Material und Methoden

3 Material und Methoden 3.1 Material

3.1.1 Chemikalien, Reagenzien, Verbrauchsmaterialien und Geräte

Alle in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien und Reagenzien stammten, wenn nicht anders gekennzeichnet, von den Firmen Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe) oder Sigma (Taufkirchen). Gekennzeichnete Medien und Puffer wurden vor Verwendung bei 121°C und 1 bar Überdruck autoklaviert. Im Anhang befindet sich eine alphabetisch geordnete detaillierte Auflistung aller verwendeten Chemikalien, Reagenzien, Verbrauchsmaterialien und Gerätschaften mit Angabe der Firmen.

3.1.2 Bakterienstämme

In dieser Arbeit wurde der Streptococcus (S.) suis-Stamm 10 (Serotyp 2) (Smith et al., 1999) verwendet. Dieser hochvirulente S. suis-Stamm wurde aus einem an Meningitis erkrankten Schwein isoliert und exprimiert die Virulenzmarker EF, MRP, SLY, OFS und FBPS. Des Weiteren wurden verschiedene isogene Mutanten von S. suis-Stamm 10 verwendet. Die Kapselmutante 10cps∆EF (hier bezeichnet mit 10∆cps) wurde durch Insertion einer Erythromycinresistenzgenkassette in die zur Kapselsynthese wichtigen Gene cps2E und cps2F hergestellt und zeigte eine deutlich geringere Virulenz als der unveränderte Wildtyp (WT)-Stamm (Smith et al., 1999).

Die Mutanten 10∆ccpA, 10∆arcD und 10∆sly wurden ebenfalls durch das Einfügen einer Erythromycinresistenzgenkassette in das ccpA-Gen, in das arcD-Gen bzw. in das sly-Gen (Benga et al., 2008) konstruiert. Das CcpA ist ein global aktives Regulatorprotein und spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation des Arginin-Deiminase-Systems (ADS) und im alternativen Kohlenhydrat-Stoffwechsel (Willenborg et al., 2011). Das ArcD ist ebenfalls mit dem ADS assoziiert und stellt einen putativen Arginin-Ornithin-Transporter dar (Fulde, Dissertation, 2007). Das Suilysin (Sly) ist ein Hämolysin von S. suis (Jacobs et al., 1994; Seitz et al., 2013).

Die Mutanten 10∆flpS und 10∆AD wurden hergestellt, indem eine

Material und Methoden

Spectinomycinresistenzgenkassette in das flpS-Gen bzw. in das arcA-Gen inseriert wurde. Das FlpS ist ebenfalls ein Regulatorprotein des ADS und scheint sauerstoffabhängig reguliert zu sein (Gruening et al., 2006; Fulde, Dissertation, 2007). Von den drei Enzymen, die das ADS bilden, stellt das ArcA das erste Enzym dar (Arginin-Deiminase), dessen Mutante hier mit 10∆AD bezeichnet ist (Gruening et al., 2006).

Als einen weiteren S. suis-Serotyp 2-Stamm wurde der Stamm 05ZYH33 eingesetzt.

Hierbei handelt es sich um ein Humanisolat, das für einen S. suis-Ausbruch in China, begleitet von Symptomen eines streptococcal toxic shock syndrome (STSS), verantwortlich war (Chen et al., 2007).

Außerdem wurde der S. suis Serotyp 9-Stamm A3286/94 verwendet. Dieser SLY- und MRP-positive Stamm wurde ebenfalls aus einem an Meningitis erkrankten Schwein isoliert (Allgaier et al., 2001), war nach intranasaler Infektionen von Schweinen aber weniger virulent im Vergleich zu Serotyp 2-Stamm 10 (Beineke et al., 2008).

Des Weiteren wurden die (fakultativ) humanpathogenen Streptokokken-Spezies S. gordonii (Stamm 30; Rohde et al., 2003), S. pyogenes (M Typ 12, Stamm A40;

Molinari et al., 1997) und S. agalactiae (Serotyp III, Stamm 6313; Schubert et al., 2002) verwendet. Bei S. pyogenes und S. agalactiae handelt es sich um klinische Isolate. Als einen weiteren Vertreter der Familie Streptococcaceae wurde der apathogene Lactococcus lactis Supspezies cremoris-Stamm MG1363 (L. lactis) verwendet.

3.1.3 Antikörper

Für die Anreicherung der porzinen CD14-positiven Monozyten diente der mit magnetischen Microbeads konjugierte mouse anti-human CD14-Antikörper (Biotec, Bergisch Gladbach). Zur Charakterisierung der porzinen mononukleären Zellen (engl.: mononuclear cells, MNCs) und der CD14-positiven Monozyten wurden der Alexa 647-konjugierte mouse anti-human CD14-Antikörper (AbD Serotec, Puchheim), der Phycoerythrin (PE)-konjugierte mouse anti-pig CD163-Antikörper (AbD Serotec, Puchheim) und der Fluorescein Isothiocyanat (FITC)-konjugierte

Material und Methoden

mouse anti-pig CD172a-Antikörper (BD, Heidelberg) eingesetzt. Zur Darstellung der Bakterien in der Doppelimmunfluoreszenz (DIF) wurden als Primärantikörper die Antikörper rabbit anti-S. suis K62 (Beineke et al., 2008) und rabbit anti-S. suis Serotyp 9 (Büttner et al., 2012) und als Sekundärantikörper der Alexa^® Fluor 488-konjugierte goat anti-rabbit-Antikörper und der Alexa^® Fluor 568-konjugierte goat anti-rabbit-Antikörper verwendet (Invitrogen, Darmstadt). Gereinigte porzine IgGs (Sigma) wurden verwendet, um Latexpartikel mit porzinen Antikörpern zu beladen.

Zum Nachweis des Suilysins in Überständen S. suis-infizierter Monozyten dienten der polyklonale Primärantikörper rabbit anti-Suilysin (Benga et al., 2008) und der mit alkalischer Phosphatase (AP)-konjugierte goat anti-rabbit-Sekundärantikörper (Dianova, Hamburg).

3.1.4 Antibiotika

Penicillin G, Amoxicillin, Ciprofloxacin, Rifampicin und Erythromycin wurden von Sigma (Taufkirchen), Gentamicin wurde von Roth (Karlsruhe), Cubicin (Wirkstoff Daptomycin) von Novartis Pharma (Nürnberg) und die Penicillin-Streptomycin-Kombinationsantibiotikalösung Pen-Strep von Gibco (Darmstadt) bezogen.

3.2 Methoden

3.2.1 Bakteriologische Methoden

3.2.1.1 Stammhaltung und Kulturbedingungen

Alle Bakterienstämme wurden als Glyzerolstocks bei -80°C gelagert. Für die Herstellung der Glyzerolstocks wurde eine 50%-ige Glyzerollösung [v/v] 1:1 mit der Übernachtkultur (ÜNK) des entsprechenden Stammes gemischt.

Für die Kultivierung auf festen Nährböden wurden die Glyzerolstocks auf entsprechenden Agarplatten ausgestrichen. S. suis (Stamm 10, A3286/94, 05ZYH33 und die Kapselmutante 10∆cps), S. gordonii (Stamm 30), S. pyogenes (Stamm A 40), S. agalactiae (Stamm 6313) und L. lactis (Stamm MG1363) wurden auf Columbia Agarplatten mit Zusatz von 7% Schafblut (Oxoid, Wesel) kultiviert, die

Material und Methoden

Mutanten 10∆ccpA, 10∆arcD und 10∆sly auf Columbia Agarplatten (Oxoid, Wesel) mit Zusatz von 6% Pferdeblut (WDT, Serumwerk Memsen, Hoyerhagen) und Erythromycin in einer Finalkonzentration von 2 µg/ml und die Mutanten 10∆flpS und 10∆AD auf Columbia Agarplatten mit 6% Pferdeblutzusatz und 100 µg/ml (Finalkonzentration) Spectinomycin. Alle Mutanten wurden vor der weiteren Verwendung in den Persisterversuchen auf Columbia Schafblutagar ohne Antibiotikumzusatz subkultiviert.

Für die Kultivierung in Flüssigkultur wurde ausgehend von der Kultur auf den festen Nährböden Bacto™ Todd Hewitt broth (THB; Difco, Heidelberg; angesetzt nach Herstellerangaben und autoklaviert) mit einer oder mehreren Kolonien inokuliert. Die THB-Flüssigkultur wurde über Nacht bei 37°C unter aeroben Bedingungen stehend inkubiert.

Für alle Studien bezüglich der Antibiotikatoleranz und der Assoziation mit porzinen Monozyten wurde chemisch definiertes RPMI-Medium 1640 (RPMI-Medium; Gibco, Darmstadt) verwendet.

3.2.1.2 Wachstumskinetiken

Zur Ermittlung der Wachstumskinetiken von S. suis-Stamm 10, seiner isogenen Mutanten 10∆ccpA, 10∆flpS, 10∆arcD und 10∆AD, der S. suis-Stämme A3286/94 und 05ZYH33, der Streptococcus Spezies S. gordonii (Stamm 30), S. pyogenes (Stamm A40) und S. agalactiae (Stamm 6313) und dem weiteren Vertreter der Familie Streptococcaceae L. lactis wurden von auf den Blutagarplatten gewachsenen Bakterienkolonien ÜNK in 50 ml THB-Medium inokuliert. Die ÜNK wurden stehend für etwa 14 bis 15 h bei 37°C bebrütet und die optischen Dichten (OD) der ÜNK wurden photometrisch bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD₆₀₀) bestimmt. Die ÜNK wurden mit frischem THB-Medium auf eine OD₆₀₀ von 0,02 verdünnt, wobei das Gesamtvolumen 50 ml betrug. Die Kulturen wurden stehend bei 37°C bebrütet und die OD₆₀₀ wurde stündlich photometrisch erfasst. Zu Beginn der exponentiellen und der stationären Wachstumsphase wurden die Bakterien für weitere Versuche geerntet.

Material und Methoden

3.2.1.3 Frischkulturen und Kryokonservierung

Beim Erreichen der Wachstumsphase wurden die Bakterien geerntet, indem 19 ml der Kultur in der exponentiellen Wachstumsphase und 4 ml der Kultur in der stationären Wachstumsphase für 10 min bei 2700 x g und 4°C in einem 50 ml- bzw.

14 ml-Röhrchen zentrifugiert wurden. Die Bakterienpellets wurden einmal mit 5 ml eiskaltem PBS gewaschen und wiederum für 5 min bei 2700 x g und 4°C zentrifugiert.

Für die Verwendung von Frischkulturen wurden die Bakterienpellets in 1 ml THB-Medium resuspendiert und direkt in weiterführenden Versuchen eingesetzt, wobei die entsprechende Kulturmenge mit der gewünschten Anzahl an KBE entnommen wurde. Die entnommene Kulturmenge entsprach der Menge an kryokonservierten Bakterien (siehe unten), dessen KBE-Konzentration im Vorfeld durch Ausplattieren bestimmt werden kann. In weiteren Versuchen wurde die Menge bei Abweichungen des Eingangsinokulums angepasst.

Für die Kryokonservierung wurden die Bakterienpellets in 850 µl THB-Medium resuspendiert und mit 150 µl 100%-igem [v/v] Glyzerol gemischt (Finalkonzentration des Glyzerols 15%), zu 50 µl-Aliquots in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert.

Zusammensetzung des verwendeten Puffers:

1 x Phosphate buffered saline (PBS) (pH 7,5):

A. bidest

+ 137 mM [w/v] Natriumchlorid (NaCl) + 2,7 mM [w/v] Kaliumchlorid (KCl)

+ 10 mM [w/v] Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Na2HPO4 * 2H2O) + 2 mM [w/v] Kaliumdihydrogenphosphat (KH₂PO₄)

Einstellen des pH-Wertes auf 7,5 mit Salzsäure (HCl)

Material und Methoden

58 3.2.2 Bestimmung von Antibiotikatoleranzen

3.2.2.1 Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK)

Um die Bakterien mit einer definierten Antibiotikakonzentration behandeln zu können, wurde zunächst die minimale Hemmkonzentration (MHK) jedes verwendeten Antibiotikums in RPMI-Medium bestimmt. Die MHK ist die geringste Konzentration eines Antibiotikums, die die Vermehrung der Bakterien sichtbar hemmt. Dazu wurde in einer 96-well-Mikrotiterplatte das entsprechende Antibiotikum geometrisch verdünnt. In die erste Vertiefung wurden 200 µl einer Antibiotikastocklösung pipettiert. Die Stocklösungen von Gentamicin (1,6 mg/ml), Penicillin G (25 µg/ml), Amoxicillin (25 µg/ml) und Daptomycin (1,6 mg/ml) wurden in RPMI-Medium angesetzt, die Stocklösung von Rifampicin (25 µg/ml) in Methanol, die Stocklösung von Ciprofloxacin (100 µg/ml) in 0,1 N Salzsäure und die Stocklösung von Erythromycin (1,6 mg/ml) in Ethanol. In Vertiefung zwei bis zwölf wurden jeweils 100 µl RPMI-Medium vorgelegt. Ausgehend von Vertiefung eins wurden jeweils 100 µl Antibiotikalösung bis Vertiefung zwölf überpipettiert; aus Vertiefung zwölf wurden 100 µl verworfen. Anschließend wurden in jede Vertiefung 100 µl der zu testenden Bakteriensuspension hinzupipettiert, wobei kryokonservierte Bakterien der exponentiellen und stationären Wachstumsphase eingesetzt wurden. Die Anzahl der hinzugegeben koloniebildenden Einheiten (KBE) betrug 5 x 10⁵ pro Vertiefung bzw. 5 x 10⁶ pro Vertiefung. 5 x 10⁶ KBE wurden bei den schlecht sichtbar pelletierenden Bakterienspezies S. gordonii und S. pyogenes eingesetzt. Als Kontrolle dienten Vertiefungen ohne Antibiotikum, in die die gleiche Menge Bakterien pipettiert wurde (Wachstumskontrolle) und Vertiefungen ohne Antibiotikum mit Zugabe von 1% [v/v]

Formaldehyd (finale Konzentration), in die ebenfalls die gleiche Menge Bakterien pipettiert wurde (Fixierung der Bakterien zur Kontrolle der Pelletbildung ohne Vermehrung). Die Mikrotiterplatten wurden anschließend mit einer Breathe Easy^® -Folie abgedichtet, um eine Verdunstung von Flüssigkeit bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung des Gasaustausches zu verhindern, und für 24 h bei 37°C inkubiert. Um die MHK abzulesen, wurden die Mikrotiterplatten mit dem Fotoscanner perfection V700 photo eingescannt (Epson, Meerbusch) und die Konzentration des

Material und Methoden

Antibiotikums, die die Vermehrung der Bakterien gerade noch hemmte, wurde visuell bestimmt. Zur Bestimmung des tatsächlichen Eingangsinokulums wurde weiterhin ein 20 µl-Aliquot aus der Wachstumskontrollvertiefung in 180 µl PBS überführt, geometrisch verdünnt und auf Columbia Schafblutagar in Triplikaten zu jeweils 10 µl ausplattiert. In Tabelle 2 sind die MHK-Bestimmungen der eingesetzten Antibiotika für die entsprechenden S. suis-Stämme und Spezies aufgelistet.

Tabelle 2: Zusammenfassung der MHK-Bestimmungen für die entsprechenden S. suis-Stämme und Spezies.

Antibiotikum

Bakterienstamm Gentamicin Penicillin G Ampicillin Ciprofloxacin Rifampicin Daptomycin Erythromycin

S. suis-Stamm 10 + + + + + + +

S. suis-Stamm A3286/94 + - - - - - -

S. suis-Stamm 05ZYH33 + - - - - - -

S. gordonii (30) + - - + - - -

S. pyogenes (A40) + - - + - - -

S. agalactiae (6313) + - - + - - -

+ bestimmt; - nicht bestimmt

3.2.2.2 Überleben in Anwesenheit von Antibiotika

Um festzustellen, inwiefern die Bakterien in der Lage sind, die Anwesenheit von Antibiotika, deren Konzentration das Hundertfache der MHK übersteigt, zu tolerieren, wurden Überlebenskinetiken durchgeführt. Dazu wurde RPMI-Medium in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß mit 1 x 10⁷ KBE von Bakterien, die sich entweder in der beginnenden exponentiellen oder in der stationären Wachstumsphase befanden, inokuliert. Es wurden entweder Frischkulturen oder kryokonservierte Bakterien verwendet. Das Gesamtvolumen der Reaktion betrug 1 ml. Vor Zugabe der Antibiotika wurden den Ansätzen 20 µl-Aliquots entnommen, um das genaue Eingangsinokulum festzustellen. Es wurden Triplikate zu jeweils 10 µl auf Columbia Schafblutagar ausplattiert. Anschließend wurden die Antibiotika, von denen jeweils eine Stocklösung frisch angesetzt wurde, hinzupipettiert. Die Finalkonzentration der Antibiotika in den Ansätzen entsprach jeweils der 100-fachen Menge der MHK. Die Ansätze wurden daraufhin rotierend bei 37°C inkubiert. Nach 1, 2, 4, 6, 8 und 24 h

Material und Methoden

wurden den Ansätzen jeweils 100 µl-Aliquots entnommen, die 5 min bei 7500 x g und 4°C zentrifugiert wurden. Der Überstand wurde abpipettiert und das Pellet mit 500 µl eiskalter 0,85%-iger [w/v] NaCl-Lösung gewaschen. Dazu wurden die Reaktionsgefäße nach Zugabe der NaCl-Lösung viermal geschwenkt und erneut für 5 min bei 7500 x g und 4°C zentrifugiert. Der Waschüberstand wurde anschließend ebenfalls abpipettiert. Das Pellet wurde in 50 µl eiskalter 0,85%-iger [w/v] NaCl-Lösung resuspendiert, wovon 20 µl nach geometrischer Verdünnung in 180 µl PBS auf Columbia Schafblutagar in Triplikaten (jeweils 10 µl) ausplattiert wurden. Die verbleibende Bakteriensuspension wurde unverdünnt in Triplikaten zu jeweils 10 µl ausplattiert. Das Überleben der Bakterien wurde durch Auszählen der KBE bestimmt.

Die Agarplatten wurden bis zu 72 h inkubiert, um auch langsamwachsende Kolonien zu erfassen.

Zur Inhibierung der protonenmotorischen Kraft (engl.: proton-motive force, PMF) wurden den Ansätzen vor der AntibiotikuZugabe der Inhibitor carbonyl cyanide m-chlorphenyl hydrazone (CCCP; angesetzt nach Herstellerangaben) in einer Finalkonzentration von 20 µM hinzugegeben. Die Ansätze wurden für 10 min auf Eis vorinkubiert, bevor das Antibiotikum hinzugegeben wurde und wie oben beschrieben weiter verfahren wurde.

3.2.2.3 Test auf Heritabilität

Mit dem Heritabilitätstest lässt sich feststellen, ob die Toleranz gegenüber Antibiotika von den Bakterien vererbt wird oder ob die Eigenschaft zur Antibiotikatoleranz der Bakteriensubpopulation eine phänotypische Varianz darstellt. Bei einem horizontalen Transfer der Eigenschaften, die zur Toleranz gegenüber den Antibiotika führen, würde es sich um eine vererbte Resistenz handeln im Gegensatz zur nicht vererbten Antibiotikatoleranz.

Für diesen Test wurden wie unter 3.2.1.3 beschrieben ÜNK von S. suis mit frischem THB-Medium auf eine OD₆₀₀ von 0,02 verdünnt, weiter wachsen gelassen und beim Erreichen der exponentiellen bzw. stationären Wachstumsphase geerntet. Die Pellets wurden einmal mit 5 ml PBS gewaschen, indem die Reaktionsgefäße viermal geschwenkt und erneut für 5 min bei 2700 x g und 4°C zentrifugiert wurden.

Material und Methoden

Anschließend wurden die Pellets in jeweils 1 ml frischem THB-Medium resuspendiert. Daraufhin wurde RPMI-Medium mit 8 µl der resuspendierten exponentiell gewachsenen bzw. mit 7 µl der resuspendierten stationär gewachsenen Bakterien (entsprechend jeweils 1 x 10⁷ KBE) inokuliert. Das Gesamtvolumen des Reaktionsansatzes betrug 1 ml. Zwanzig µl dieses Ansatzes wurden entnommen, geometrisch in PBS verdünnt und auf Columbia Schafblutagar zur Bestimmung des Eingangsinokulums ausplattiert. Anschließend wurden den Ansätzen Gentamicin hinzugegeben; die Finalkonzentration des Gentamicins entsprach dabei in den Ansätzen der 100-fachen MHK. Gentamicin wurde als Antibiotikum im Heritabilitätstest eingesetzt, da es sich in vorangegangenen Versuchen aufgrund seiner Eigenschaften als das Antibiotikum der Wahl herausstellte. Die Ansätze wurde für 3 h rotierend bei 37°C inkubiert, wobei den Ansätzen stündlich ein Aliquot von 100 µl entnommen wurde. Die Aliquots wurden für 5 min bei 7500 x g und 4°C zentrifugiert und die Überstande wurden abpipettiert. Die Pellets wurden wie unter 3.2.2.2 beschrieben gewaschen und zur Bestimmung der KBE auf Columbia Schafblutagar ausplattiert. Nach 3 h Inkubation mit Gentamicin wurden die Ansätze für 5 min bei 7500 x g und 4°C zentrifugiert und die Pellets wurden einmal mit 500 µl 0,85%-iger [w/v] NaCl gewaschen, indem erneut für 5 min bei 7500 x g und 4°C zentrifugiert wurde. Mit den Bakterienpellets wurde eine neue ÜNK in THB-Medium angeimpft. Der Zyklus, der das Animpfen der ÜNK, das Ernten der entsprechenden Wachstumsphase, die Antibiokumbehandlung und das erneute Animpfen einer ÜNK umfasst, wurde insgesamt viermal wiederholt. Für jeden Zyklus wurde der Anteil der antibiotikatoleranten Subpopulation durch ausplattieren und zählen der KBE bestimmt. Die Agarplatten wurden ebenfalls bis zu 72 h inkubiert, um auch hier langsam wachsende Kolonien zu erfassen.

3.2.2.4 Test auf die Eliminierung von Persistern

Um festzustellen, ob S. suis Typ I- oder Typ II-Persiterzellen bildet, wurde der Persisterzell-Eliminierungstest durchgeführt. Bei diesem Test wird eine exponentiell gewachsene Bakterienkultur durch wiederholte Re-Inkulation für mehrere Zyklen in der exponentiellen Wachstumsphase gehalten. Während jedes Zyklus werden

Material und Methoden

exponentiell gewachsene Bakterien mit einem Antibiotikum behandelt. Typ I-Persisterzellen werden wahrscheinlich stressbedingt in der stationären Wachstumsphase gebildet und beim Überimpfen übertragen und somit mit jeder wiederholten Re-Inokulation und Antibiotikumbehandlung durch einen Verdünnungseffekt eliminiert. Da Typ II-Persisterzellen kontinuierlich gebildet werden, bleibt der Typ II-Persisterzelllevel mit jeder weiteren Re-Inokulation und Antibiotikumbehandlung konstant.

Für diesen Test wurde eine ÜNK von S. suis-Stamm 10 mit frischem THB-Medium auf eine OD₆₀₀ von 0,02 verdünnt und bis zur exponentiellen Wachstumsphase wachsen gelassen. Mit einem Aliquot dieser exponentiell gewachsenen S. suis-Kultur wurde erneut frisches THB-Medium auf eine OD₆₀₀ von 0,02 verdünnt und bis zur exponentiellen Wachstumsphase wachsen gelassen. Dieser Zyklus wurde dreimal wiederholt. Für jeden Zyklus wurde eine Gentamicinbehandlung durchgeführt. Dafür wurde in einem 1,5 ml-Reaktionsgefäß RPMI-Medium mit 1 x 10⁷ KBE von exponentiell gewachsenen Bakterien inokuliert. Das genaue Eingangsinokulum wurde wie unter 3.2.2.2 beschrieben bestimmt. Nach Inokulation wurde Gentamicin in der 100-fachen MHK hinzupipettiert und die Ansätze wurden für 1 h bei 37°C rotierend inkubiert. Das Gesamtvolumen der Ansätze betrug 1 ml. Nach der einstündigen Inkubation wurden wie unter 3.2.2.2 beschrieben die überlebenden Bakterien durch Ausplattieren auf Columbia Schafblutagar bestimmt. Der prozentuale Anteil überlebender Bakterien in Bezug auf das Eingangsinokulum vor Gentamicinbehandlung wurde berechnet.

3.2.3 Zellbiologische Methoden

3.2.3.1 Separation mononukleärer Zellen (MNCs) aus porzinem Vollblut

Für das Studium der Assoziation von S. suis mit naïven porzinen Monozyten, mussten zunächst die Monozyten aus heparinisiertem Vollblut gewonnen und angereichert werden. Monozyten stellen einen Teil der MNCs dar, wobei der Anteil der Monozyten an den MNCs beim Schwein etwa 2 bis 10% beträgt (Thorn, 2010).

Die Hauptmasse der MNCs stellen somit die Lymphozyten dar. Das Vollblut, aus

Material und Methoden

denen die MNCs gewonnen wurden, stammte von gesunden Schweinen. Die Separierung der MNCs von den anderen korpuskulären und flüssigen Bestandteilen des Blutes erfolgte über eine Biocoll-Dichtegradienten-Zentrifugation. Dazu wurden in vier 50 ml-Röhrchen jeweils 13 ml heparinisiertes Vollblut (16 I.E. Heparin/ml Blut) 1+1 mit 13 ml 0,85%-iger [w/v] NaCl verdünnt. Anschließend wurden 12 ml des Polymers Biocoll mit einer Dichte von 1,077 g/ml (Biochrom, Darmstadt) mit 12 ml verdünntem Blut vorsichtig überschichtet (insgesamt acht Ansätze) und für 30 min bei 2000 x g und 4°C zentrifugiert, wobei die Beschleunigung und die Abbremsung der Rotordrehung auf langsam gestellt wurde. Nach der Zentrifugation bildet sich ein Gradient, bei dem sich im Pellet die Granulozyten und die Erythrozyten befinden, dann folgen die Biocoll-Schicht und abschließend die Blutplasma-Schicht, wobei sich die MNCs in der Interphase zwischen der Biocoll- und der Blutplasma-Schicht anreichern. Die Interphase mit den MNCs wurde abpipettiert und in ein neues 50 ml-Röhrchen überführt. Pro Gradient wurden 5 ml Interphase entnommen, wobei jeweils die Interphasen von vier Gradienten vereint wurden. Die Interphase in beiden 50 ml-Röhrchen wurde auf 50 ml mit RPMI-Medium aufgefüllt und für 10 min bei 1000 x g und 4°C zentrifugiert. Nach Absaugen der Überstände wurden die Pellets mit 12 ml RPMI-Medium gewaschen und erneut für 5 min bei 1000 x g und 4°C zentrifugiert.

Die Überstände wurden wiederum abgesaugt und die Pellets mit den MNCs in jeweils 1 ml RPMI-Medium resuspendiert. Hierbei wurde darauf geachtet, dass nicht resuspendierbare Zellklümpchen verworfen wurden. Die beiden in 1 ml RPMI-Medium resuspendierten Pellets wurden erneut vereint. Anschließend wurde die Anzahl der MNCs bestimmt, wozu eine Neubauer Zählkammer verwendet wurde. Die Zellsuspension wurde dafür 1:100 in RPMI-Medium verdünnt. Die Zellzahl aller vier Großquadrate (bestehend aus jeweils 16 Kleinquadraten) wurde gezählt und durch vier geteilt, um den Mittelwert eines Großquadrates zu erhalten. Die gezählte und gemittelte Zellzahl entspricht der Zellzahl x 10⁴/ml (unter Berücksichtigung der Verdünnung).

Um die Qualität der präparierten MNCs zu kontrollieren, wurde die Morphologie und Vitalität der Zellen durchflusszytometrisch am BD accuri™ C6 (BD, Heidelberg) überprüft und mit der BD accuri™ C6 Software ausgewertet.

Material und Methoden

3.2.3.2 Immunomagnetische Aufreinigung porziner CD14-positiver MNCs

Monozyten stellen innerhalb der MNCs nur eine kleine Subpopulation dar. Beim Schwein beträgt der Anteil an Monozyten innerhalb der MNCs 2 bis 10% (Thorn, 2010). Um ausschließlich Monozyten zu erhalten, wurden diese aus den MNCs über den Oberflächenmarker CD14 per magnetic activated cell sorting (MACS) angereichert. Dies erfolgte nach Separierung der MNCs mittels einer Antikörpermarkierung und anschließender immunomagnetischer Aufreinigung. Dazu wurden 2 x 10⁸ MNCs für 10 min bei 250 x g und 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde

Im Dokument Wachstumsphasenabhängige Merkmale von Streptococcus suis und deren Bedeutung für das Überleben im Wirt (Seite 51-0)