Proteinbiochemische Methoden

3.2.5.1 Gewinnung von Überständen infizierter porziner CD14-positiver Monozyten

Es sollte untersucht werden, ob durch die Ko-Inkubation von porzinen CD14-positiven Monozyten und S. suis ein Einfluss von den Bakterien auf die Monozyten ausgeht, was eventuell zu einer Schädigung der Monozyten führen könnte. Ein Hinweis auf einen schädigenden Einfluss auf die Monozyten könnte die Produktion des Proteins Suilysin sein. Suilysin ist ein von S. suis sezerniertes Exotoxin, das durch seine zytolytische Aktivität Wirtszellen schädigen kann (Benga et al., 2004;

Charland et al., 2000; Jacobs et al., 1994; Lalonde et al., 2000; Norton et al., 1999;

Segura und Gottschalk, 2002; Tenenbaum et al., 2005; Tenenbaum et al., 2006;

Vanier et al., 2004). Deshalb wurde die Menge an sezerniertem Suilysin des WT, der Kapselmutante 10∆cps, der Suilysinmutante 10∆sly des S. suis Serotyp 2-Stammes 10 und des WT des Serotyp 9-Stammes A3286/94 bestimmt.

Dazu wurden in 1,5 ml-Reaktionsgefäßen 1 x 10⁶ Monozyten mit 1 x 10⁷ KBE von S. suis in RPMI-Medium rotierend für 3 h bei 37°C inkubiert. Die Menge des Gesamtansatzes betrug 1 ml. Nach der Inkubation der Monozyten mit den Bakterien wurden die Ansätze für 10 min bei 8600 x g und 4°C zentrifugiert. Von den Überständen wurden 500 µl abgenommen und bis zur weiteren Verwendung bei -80°C gelagert. Der Überstand wurde hinsichtlich der Menge an Suilysin nach Auftrennung der Proteine in der SDS-PAGE mittels Immunoblot analysiert.

Material und Methoden

80 3.2.5.2 Bestimmung der Proteinkonzentration

Um in den folgenden Versuchen (SDS-PAGE, Immunoblot) für alle Proben die gleiche Proteinmenge einzusetzen, musste die Proteinkonzentration in den einzelnen Proben bestimmt werden. Dies erfolgte durch die BCA-Methode mittels des Bio-Rad-D_C-Protein-Assays (Bio-Rad, München) nach Herstellerangaben. Der entstandene Farbkomplex wurde photometrisch bei einer Wellenlänge von 550 nm im Plattenlesegerät GENios Pro (Tecan, Crailsheim) gemessen. In der nachfolgenden SDS-PAGE wurden von jeder Probe jeweils 19 µg Protein eingesetzt.

3.2.5.3 Sodium dodecyl sulphate-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) Um gezielt das Suilysin aus den gewonnenen Überstanden infizierter CD14-positiver Monozyten nachweisen zu können, wurden die Proteine zunächst nach ihrem Molekulargewicht in einem elektrischen Feld aufgetrennt. Die Auftrennung erfolgte unter denaturierenden Bedingungen in einem Polyacryamidgel bestehend aus einem 5%-igen [v/v] Sammelgel und einem 10%-igem [v/v] Trenngel. Es wurden jeweils 37,5 µl Probe mit 12,5 µl 4 x Roti Load gemischt und für 10 min bei 95°C gekocht.

Von den behandelten Proben wurden 35 µl auf das Gel aufgetragen. Der Einlauf in das Sammelgel erfolgte für 30 min bei 100 Volt (V), die Auftrennung im Trenngel für etwa 3 h bei 150 V in 1 x SDS-PAGE-Laufpuffer in einer Gelelektrophoreselaufkammer. Die Spannung lieferte das Power Pac 200 (Bio-Rad, München). Als Größenstandard diente der Proteinmarker PageRuler^™ Prestained Protein Ladder #26619 (Fermentas, St. Leon-Rot).

Zusammensetzung des verwendeten Puffers und der Gele:

10 x SDS-PAGE-Laufpuffer: A. bidest

+ 0,25 mM [w/v] Tris + 1,9 mM [w/v] Glycin + 1% [w/v] SDS

Verdünnung auf 1 x mit A. bidest

Material und Methoden

81 5%-iges Sammelgel: A. bidest

+ 5% [v/v] Acrylamid

+ 130 mM [w/v] Tris-HCl (pH 6,8) + 0,1% [w/v] SDS

+ 0,2% [v/v] TEMED

+ 0,12% [w/v] Ammoniumpersulfat (APS) 10%-iges Trenngel: A. bidest

+ 10% [v/v] Acrylamid

+ 380 mM [w/v] Tris-HCl (pH 8,8) + 0,08% [w/v] SDS

+ 0,2% [v/v] TEMED + 0,12% [w/v] APS

3.2.5.4 Immunoblot

Die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine wurden mittels eines Elektrotransfers auf eine Polyvinyliden Fluorid- (PVDF-) Membran (Millipore, Darmstadt) übertragen, wozu das halbtrockene Westernblot Verfahren angewandt wurde. Hierfür wurde zunächst die PVDF-Membran für 1 min in Methanol aktiviert, in A. bidest gewaschen und für 10 min in Transferpuffer äquilibriert. Das Polyacrylamidgel mit den aufgetrennten Proteinen und 4 Whatman^® Filterpapiere (3 mm; Hartenstein, Würzburg) wurden ebenfalls für 10 min in Transferpuffer äquilibriert. Anschließend wurden die einzelnen Komponenten wie folgt luftblasenfrei in die Westernblot- Apparatur geschichtet: 2 x Filterpapier, PVDF-Membran, Gel, 2 x Filterpapier. Der Transfer der Proteine erfolgte für 70 min bei 15 V mittels des Trans-Blot^® SD Semi-Dry Transfer Cell Systems (Bio-Rad, München).

Der gezielte Nachweis des Suilysins nach dem Transfer der aufgetrennten Gesamtproteine auf die PVDF-Membran erfolgte durch die Verwendung eines polyklonalen rabbit anti-Suilysin-Antikörpers. Zunächst wurden die unspezifischen Antikörper-Bindungsstellen durch Inkubation der Membran über Nacht in 1 x TBST (engl.: tris-buffered saline Tween 20) mit 5% [w/v] Milchpulver (Sucofin, Edeka, Hannover) und 0,02% [v/v] Natriumazid geblockt. Die Membran wurde zweimal mit A.

Material und Methoden

82

bidest und einmal mit 1 x TBST gespült. Dann wurde die Membran mit 8 ml des polyklonalen Primärantikörpers rabbit anti-Suilysin, der gegen das Suilysin gerichtet ist, für 1 h bei RT inkubiert. Der Primärantikörper wurde dazu 1:1300 in 1 x TBST mit 1% [w/v] Milchpulver angesetzt. Anschließend wurde die Membran viermal für jeweils 5 min mit 1 x TBST schüttelnd bei 200 UpM gewaschen (Schütteltisch). Daraufhin erfolgte die Inkubation mit dem 1:10-vorverdünnten Sekundärantikörper goat anti-rabbit-AP für 1 h bei RT (8 ml). Der Sekundärantikörper ist gegen den Primärantikörper gerichtet und mit der alkalischen Phosphatase (AP), einem Enzym, konjugiert. Der Sekundärantikörper wurde vor Gebrauch auf 1:10000 in 1 x TBST mit 5% [w/v] Milchpulver weiterverdünnt. Nach der Inkubation wurde die Membran erneut viermal für jeweils 5 min mit 1 x TBST schüttelnd bei 200 UpM gewaschen.

Anschließend wurde die Membran für 4 min mit 800 µl des Substrats AP Juice (p.j.k., Kleinbittersdorf) inkubiert. Dazu wurde die Membran auf eine Folie gelegt und mit dem Substrat beträufelt. Eine zweite Folie wurde luftblasenfrei auf die Membran gelegt, so dass es zur gleichmäßigen Verteilung des Substrats auf der Membran kam. Die AP, die mit dem Sekundärantikörper konjugiert ist, setzt das Substrat AP-Juice enzymatisch um, wobei es zu einer Chemielumineszenzreaktion kommt. Nach der Inkubation mit dem Substrat wurde die Membran zwischen zwei Whatman^® -Filterpapieren getrocknet. Die Detektion der Signale erfolgte daraufhin mittels einer Chemielumineszenzmessung durch den Chemo Cam Imager 3.2 (Intas, Göttingen) und die Auswertung mit der Chemostar Aufnahmesoftware.

Zusammensetzung der verwendeten Pufferr:

Transferpuffer: 25 mM Tris-HCl (pH 7,5) + 192 mM Glycin

+ 10% [v/v] Methanol

10 x TBST (autoklaviert): 0,1 mM Tris-HCl (pH 7,5) + 1,5 mM NaCl

+ 0,5% [v/v] Tween 20

Verdünnung auf 1 x mit A. bidest

Material und Methoden

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Zur statistischen Auswertung wurden der t-Test (normalverteilte Werte) bzw. der Mann-Whitney-U-Test (nicht normalverteile Werte) angewendet.

Ergebnisse

84

4 Ergebnisse

In dieser Arbeit wurde die wachstumsphasenabhängige Ausprägung von Merkmalen in Hinblick auf die Persisterbildung und die Wechselwirkung mit porzinen Monozyten von S. suis untersucht.

Es ist bekannt, dass die Wachstumsphase von Bakterien einen Einfluss auf deren Metabolismus und Virulenz hat. S. suis generiert während des frühen Wachstums in einer statischen Kultur die Energie mittels klassischer Stoffwechselwege durch Umsetzung primärer Zucker, vornehmlich Glukose. Mit voranschreitendem bakteriellen Wachstum und dem zunehmenden Verbrauch von Glukose kommt es zur Aufhebung der Repression des ADS, so dass das ADS S. suis als alternativer Stoffwechselweg zur Verfügung steht. Das ADS ermöglicht S. suis unter Nährstoff- und Sauerstofflimitierung und unter sauren Bedingungen zu überleben und gilt als Virulenz-assoziierter Faktor (Gruening et al., 2006). Der metabolische Zustand von S. suis in der exponentiellen Wachstumsphase unterscheidet sich demnach sehr von dem in der stationären Wachstumsphase. Des Weiteren wurde für S. suis eine wachstumsphasenabhängige Regulation der Virulenz-assoziierten Faktoren arcB, sly, sao, ofs und cps2A beschrieben (Willenborg et al., 2011). Für S. pneumoniae wurde ebenso eine nährstoff- und milieuabhängige Regulation der Kapselexpression während der Infektion des Wirts festgestellt (Kadioglu et al., 2008). Kreikemeyer et al. (2003) beschrieben für S. pyogenes eine wachstumsphasenabhängige Expression von Adhäsinen, was es dem Erreger ermöglicht, während des Infektionsgeschehen die Intensität der Adhärenz und Kolonisation zu regulieren und sich den Bedingungen im Wirt anzupassen.

Bei bakteriellen Persistern handelt es sich um eine antibiotikatolerante Subpopulation innerhalb einer Bakterienkultur, und es ist bekannt, dass es während des bakteriellen Wachstums zu einer Zunahme des Anteils der Persisterzellen gemessen an der Gesamtpopulation kommt (Lewis, 2007).

Der Einfluss der Wachstumsphase auf die Fähigkeit zur Bildung von Persistern und der Assoziation mit porzinen Monozyten von S. suis wurde in dieser Arbeit durch den Vergleich von exponentiell und stationär gewachsenen Bakterien ermittelt.

Ergebnisse

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