Auswirkungen von S. suis auf die Vitalität und Morphologie porziner

In den TEM-Aufnahmen waren neben mit S. suis assoziierten auch beschädigte porzine CD14-positiven Monozyten zu erkennen. Die Annahme, dass im Zuge der fortschreitenden Assoziation S. suis einen Einfluss auf die porzinen CD14-positiven Monozyten haben könnte, sollte im Folgenden geklärt werden. Demnach wurden zunächst Veränderungen von Morphologie und Vitalität der Monozyten durchflusszytometrisch analysiert. Dazu wurden porzine CD14-positive Monozyten mit Kryokonservaten der stationären Wachstumsphase der S. suis-Stämme 10, 10∆cps, 10∆sly und A3286/94 bei einer MOI von 1:10 in RPMI-Medium für 3 h bei 37°C rotierend inkubiert. Als Kontrolle wurde ein Ansatz ohne Bakterien mitgeführt.

Anschließend wurde der Vitalitätsmarker PJ zu den Ansätzen pipettiert und die Morphologie und die Vitalität der CD14-positiven Monozyten wurden durchflusszytometrisch analysiert.

Ergebnisse

140

Die Abbildungen 20A bis 20E zeigen die Morphologie der CD14-positiven Monozyten nach 3-stündiger Inkubation (Abbildung 20A) und nach Ko-Inkubation mit S. suis-Stamm 10 (Abbildung 20B), 10∆cps (Abbildung 20C), 10∆sly (Abbildung 20D) und A3286/94 (Abbildung 20E). Im Vergleich zur Morphologie uninfizierter CD14-positiver Monozyten (Abbildung 20A) zeigten sich nach Infektion mit der Kapselmutante 10∆cps die größten Veränderungen in der Morphologie der Monozyten. Während eine Abnahme der Größe der Monozyten zu verzeichnen war, nahm deren Granularität stark zu. Außerdem wurde eine große Streuung der Monozyten vor allem im SSC-Kanal festgestellt, was auf viele unterschiedlich stark granulierte Monozyten deutet (Abbildung 20C). S. suis-Stamm 10 hatte im Vergleich zur Kapselmutante 10∆cps einen deutlich geringeren, aber dennoch großen Einfluss auf die Morphologie der Monozyten. Neben einer homogenen Hauptpopulation, die der Morphologie uninfizierter Monozyten entspricht, wurden auch Populationen kleinerer und weniger granulierter Monozyten detektiert. Ein kleiner Anteil an Monozyten zeigte ebenfalls eine Streuung vor allem im SSC-Kanal und deutete auch auf das Vorliegen stärker granulierter Monozyten (Abbildung 20B). Die Suilysinmutante 10∆sly hatte die geringste Auswirkung auf die Morphologie der Monozyten. Die Morphologie war ähnlich der uninfizierter Monozyten. Ein geringer Anteil zeigte eine etwas größere Streuung im FSC-kanal und deutete auf das Vorliegen von teilweise kleineren Monozyten (Abbildung 20D). Der Einfluss von S. suis-Stamm A3286/94 auf die Monozyten war etwas größer als von der Suilysinmutante 10∆sly, aber im Vergleich zum WT von Stamm 10 deutlich geringer. Die Hauptpopulation der Monozyten war im FSC-Kanal etwas breiter gestreut. Dies deutete auf das Vorhandensein eines Anteils etwas kleinerer Monozyten (Abbildung 20E). In den Abbildungen 20F bis 20J ist die Erfassung des prozentualen Anteils vitaler CD14-positiver Monozyten dargestellt. Auffällig war, dass es mit zunehmender Veränderung der Morphologie der Monozyten auch zunehmend zu einem Verlust der Zellvitalität kam. Uninfizierte Monozyten wiesen eine hohe Vitalitätsrate von 96,9%

auf (Abbildung 20F).

Ergebnisse

141

A B C

D E

F G H

I J

Beschriftung siehe nächste Seite

Ergebnisse

142

Abbildung 20: Auswirkung der S. suis-Stämme 10, 10∆cps, 10∆sly und A3286/94 auf die Morphologie und Vitalität porziner CD14-positiver Monozyten nach 3 h Ko-Inkubation.

Porzine CD14-positive Monozyten wurden mit Kryokonservaten der stationären Wachstumsphase von S. suis-Stamm 10, 10∆cps, 10∆sly und A3286/94 (MOI 1:10) in RPMI-Medium für 3 h bei 37°C rotierend inkubiert. Die Ansätze wurden in PJ-Lösung aufgenommen und die Morphologie und die Vitalität der CD14-positiven Monozyten wurden durchflusszytometrisch am BD accuri™ C6 (BD, Heidelberg) untersucht und mit der BD accuri™ C6 Software ausgewertet erfasst. Dargestellt sind repräsentative FACS-Bilder.

A-E: Darstellung der Morphologie der CD14-positiven Monozyten nach 3 h Inkubation (A) und nach 3 h Ko-Inkubation mit S. suis-Stamm 10 (B), 10∆cps (C), 10∆sly (D) und A3286/94 (E) als Dichteplot im FSC-/SSC-Kanal. Aufgetragen ist die Größe der Zellen (FSC/x-Achse) gegen die Granularität (SSC/y-Achse).

F-J: Erfassung des prozentualen Anteils vitaler CD14-positiver Monozyten im FL3-/SSC-Kanal nach Ausgrenzung PJ-positiver Zellen nach 3 h Inkubation (F) und nach 3 h Ko-Inkubation mit S. suis-Stamm 10 (G), 10∆cps (H), 10∆sly (I) und A3286/94 (J) im FL3-/SSC-Kanal. PJ dient als Indikator für die Zellvitalität und wird im FL3-Kanal detektiert. Aufgetragen ist die Fluoreszenzintensität (FL3/x-Achse) gegen die Granularität (SSC/y-Achse).

Der Einfluss der Kapselmutante 10∆cps, die von den getesteten Stämmen den größten Einfluss auf die Zellmorphologie hatte, führte bei den Monozyten auch zu dem größten Vitalitätsverlust. Nach Inkubation mit der Kapselmutante 10∆cps waren nur noch 11,7% der Zellen vital (Abbildung 20H). Nach Inkubation mit S. suis-Stamm 10 waren dagegen noch 60,6% der Monozyten vital (Abbildung 20G). Der geringste Einfluss der Suilysinmutante 10∆sly auf die Morphologie der Monozyten spiegelte sich ebenso in deren Zellvitalität wider, da die Monozyten eine Vitalitätsrate von 83,6% aufwiesen (Abbildung 20I). Stamm A3286/94 hatte ebenfalls einen geringen Einfluss auf die Morphologie der Monozyten, der allerdings etwas größer als der von der Suilysinmutante 10∆sly war. Dementsprechend waren nach Inkubation mit Stamm A3286794 noch 75,3% der Monozyten vital (Abbildung 20J). Allgemein fiel auf, dass nicht-vitale Monozyten (PJ-positive Monozyten) eine große Streuung im SSC-Kanal aufwiesen, also unterschiedlich stark granuliert waren, und dass die Streuung umso größer war, je niedriger die Zellvitalität war (Abbildung 20F bis 20J).

Diese Auffälligkeit geht mit den Ergebnissen bezüglich des Einflusses der Bakterien auf die Morphologie der Monozyten konform, da mit zunehmendem Einfluss auf die Morphologie der Monozyten auch eine größere Streuung im SSC-Kanal festgestellt wurde (Abbildung 20A bis 20E).

Die bisherigen Ergebnisse ergaben, dass mit der hohen Assoziation von S. suis mit porzinen CD14-positiven Monozyten auch ein Einfluss der Bakterien auf die Morphologie und Vitalität der Zellen einhergeht. Eine Infektion mit der Kapselmutante 10∆cps führt zu den stärksten Veränderungen in der Morphologie und zum größten

Ergebnisse

143

Vitalitätsverlust der Monozyten, gefolgt von Stamm 10 (WT), Stamm A3286/94 und der Suilysinmutante 10∆sly.

Die durchflusszytometrischen Untersuchungen zeigten, dass die S. suis-Stämme 10, 10∆cps, 10∆sly und A3286/94 einen schädigenden Einfluss auf die porzinen CD14-positiven Monozyten haben, wobei ein höherer Vitalitätsverlust nach Infektion mit Suilysin-exprimierenden Stämmen im Vergleich zur Infektion mit der Suilysinmutante 10∆sly zu verzeichnen war. Deshalb lag die Vermutung nahe, dass während einer Ko-Inkubation von porzinen CD14-positiven Monozyten und S. suis das sezernierte Suilysin ebenso zu einer Schädigung dieser Monozyten führen könnte. Folglich war von Interesse, ob die beschriebenen S. suis-Stämme unter den Versuchsbedingungen der Infektionsexperimente unterschiedliche Mengen an Suilysin sezernieren, was den unterschiedlichen Schädigungsgrad der porzinen CD14-positiven Monozyten erklären könnte. Nachdem die Monozyten mit den S. suis-Stämmen wie in Kapitel 3.2.5.1 beschrieben infiziert wurden, wurden die Monozyten mit den Bakterien zentrifugiert und die Gesamt-Proteinmenge der Überstände wurde bestimmt. Anschließend wurden gleiche Proteinmengen in einem 10%-igen SDS-Gel aufgetrennt. Der Nachweis des sezernierten Suilysins erfolgte wie unter 3.2.5.4 beschrieben mittels spezifischer Antikörper im Immunoblot.

Abbildung 21: Immunoblot zur Detektion sezernierten Suilysins im Überstand nach 3 h Infektion porziner CD14-positiver Monozyten mit S. suis-Stamm 10, A3286/94, 10∆sly und 10∆cps.

Nach 3-stündiger Infektion CD14-positiver Monozyten mit den S. suis-Stämmen 10, A3286/94, 10∆sly und 10∆cps (MOI 1:10) wurden die Überstände der infizierten Monozyten nach Angleichung der Proteinmenge elektrophoretisch in einem 10%-igen SDS-Gel aufgetrennt. Der Nachweis des bakteriell sezernierten Suilysins erfolgte mittels Immunoblot mit einem polyklonalen anti-Suilysin-Antikörper (anti-SLY) und einem mit alkalischer Phosphatase (AP) konjugiertem Sekundärantikörper. Die anschließende Detektion erfolgte mittels Inkubation mit AP-Substrat und nachfolgender Chemielumineszenz-Messung am Chemo Cam Imager 3.2 (Intas, Göttingen) und die Auswertung mit der Chemostar Aufnahmesoftware. Ko: Suilysin-Positivkontrolle.

Abbildung 21 zeigt, dass im Vergleich der untersuchten S. suis-Stämme, im Überstand mit Stamm 10 infizierter Monozyten die größte Suilysinmenge nachgewiesen wurde. Nach Infektion mit S. suis-Stamm A3286/94 war im Vergleich zu Stamm 10 deutlich weniger Suilysin nachzuweisen. Nach Infektion mit der

Ko 10 A3286/94 10∆sly 10∆cps

anti-SLY

Ergebnisse

144

Suilysinmutante 10∆sly konnte im Überstand kein Suilysin nachgewiesen werden.

Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die sezernierte Suilysinmenge für den Grad der Schädigung der Monozyten verantwortlich sein könnte. Interessanterweise war die sezernierte Suilysinmenge durch die Kapselmutante 10∆cps geringer als durch den WT von S. suis-Stamm 10. Dies korreliert nicht mit dem Grad der Schädigung der Monozyten durch die Kapselmutante und bedarf weiterer Abklärung.

4.3.4 Induktion der ROS-Produktion porziner CD14-positiver Monozyten durch