Bakteriologische Methoden - Wachstumsphasenabhängige Merkmale von Streptococcus suis und deren

3.2 Methoden

3.2.1 Bakteriologische Methoden

3.2.1.1 Stammhaltung und Kulturbedingungen

Alle Bakterienstämme wurden als Glyzerolstocks bei -80°C gelagert. Für die Herstellung der Glyzerolstocks wurde eine 50%-ige Glyzerollösung [v/v] 1:1 mit der Übernachtkultur (ÜNK) des entsprechenden Stammes gemischt.

Für die Kultivierung auf festen Nährböden wurden die Glyzerolstocks auf entsprechenden Agarplatten ausgestrichen. S. suis (Stamm 10, A3286/94, 05ZYH33 und die Kapselmutante 10∆cps), S. gordonii (Stamm 30), S. pyogenes (Stamm A 40), S. agalactiae (Stamm 6313) und L. lactis (Stamm MG1363) wurden auf Columbia Agarplatten mit Zusatz von 7% Schafblut (Oxoid, Wesel) kultiviert, die

Material und Methoden

Mutanten 10∆ccpA, 10∆arcD und 10∆sly auf Columbia Agarplatten (Oxoid, Wesel) mit Zusatz von 6% Pferdeblut (WDT, Serumwerk Memsen, Hoyerhagen) und Erythromycin in einer Finalkonzentration von 2 µg/ml und die Mutanten 10∆flpS und 10∆AD auf Columbia Agarplatten mit 6% Pferdeblutzusatz und 100 µg/ml (Finalkonzentration) Spectinomycin. Alle Mutanten wurden vor der weiteren Verwendung in den Persisterversuchen auf Columbia Schafblutagar ohne Antibiotikumzusatz subkultiviert.

Für die Kultivierung in Flüssigkultur wurde ausgehend von der Kultur auf den festen Nährböden Bacto™ Todd Hewitt broth (THB; Difco, Heidelberg; angesetzt nach Herstellerangaben und autoklaviert) mit einer oder mehreren Kolonien inokuliert. Die THB-Flüssigkultur wurde über Nacht bei 37°C unter aeroben Bedingungen stehend inkubiert.

Für alle Studien bezüglich der Antibiotikatoleranz und der Assoziation mit porzinen Monozyten wurde chemisch definiertes RPMI-Medium 1640 (RPMI-Medium; Gibco, Darmstadt) verwendet.

3.2.1.2 Wachstumskinetiken

Zur Ermittlung der Wachstumskinetiken von S. suis-Stamm 10, seiner isogenen Mutanten 10∆ccpA, 10∆flpS, 10∆arcD und 10∆AD, der S. suis-Stämme A3286/94 und 05ZYH33, der Streptococcus Spezies S. gordonii (Stamm 30), S. pyogenes (Stamm A40) und S. agalactiae (Stamm 6313) und dem weiteren Vertreter der Familie Streptococcaceae L. lactis wurden von auf den Blutagarplatten gewachsenen Bakterienkolonien ÜNK in 50 ml THB-Medium inokuliert. Die ÜNK wurden stehend für etwa 14 bis 15 h bei 37°C bebrütet und die optischen Dichten (OD) der ÜNK wurden photometrisch bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD₆₀₀) bestimmt. Die ÜNK wurden mit frischem THB-Medium auf eine OD₆₀₀ von 0,02 verdünnt, wobei das Gesamtvolumen 50 ml betrug. Die Kulturen wurden stehend bei 37°C bebrütet und die OD₆₀₀ wurde stündlich photometrisch erfasst. Zu Beginn der exponentiellen und der stationären Wachstumsphase wurden die Bakterien für weitere Versuche geerntet.

Material und Methoden

3.2.1.3 Frischkulturen und Kryokonservierung

Beim Erreichen der Wachstumsphase wurden die Bakterien geerntet, indem 19 ml der Kultur in der exponentiellen Wachstumsphase und 4 ml der Kultur in der stationären Wachstumsphase für 10 min bei 2700 x g und 4°C in einem 50 ml- bzw.

14 ml-Röhrchen zentrifugiert wurden. Die Bakterienpellets wurden einmal mit 5 ml eiskaltem PBS gewaschen und wiederum für 5 min bei 2700 x g und 4°C zentrifugiert.

Für die Verwendung von Frischkulturen wurden die Bakterienpellets in 1 ml THB-Medium resuspendiert und direkt in weiterführenden Versuchen eingesetzt, wobei die entsprechende Kulturmenge mit der gewünschten Anzahl an KBE entnommen wurde. Die entnommene Kulturmenge entsprach der Menge an kryokonservierten Bakterien (siehe unten), dessen KBE-Konzentration im Vorfeld durch Ausplattieren bestimmt werden kann. In weiteren Versuchen wurde die Menge bei Abweichungen des Eingangsinokulums angepasst.

Für die Kryokonservierung wurden die Bakterienpellets in 850 µl THB-Medium resuspendiert und mit 150 µl 100%-igem [v/v] Glyzerol gemischt (Finalkonzentration des Glyzerols 15%), zu 50 µl-Aliquots in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert.

Zusammensetzung des verwendeten Puffers:

1 x Phosphate buffered saline (PBS) (pH 7,5):

A. bidest

+ 137 mM [w/v] Natriumchlorid (NaCl) + 2,7 mM [w/v] Kaliumchlorid (KCl)

+ 10 mM [w/v] Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Na2HPO4 * 2H2O) + 2 mM [w/v] Kaliumdihydrogenphosphat (KH₂PO₄)

Einstellen des pH-Wertes auf 7,5 mit Salzsäure (HCl)

Material und Methoden

58 3.2.2 Bestimmung von Antibiotikatoleranzen

3.2.2.1 Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK)

Um die Bakterien mit einer definierten Antibiotikakonzentration behandeln zu können, wurde zunächst die minimale Hemmkonzentration (MHK) jedes verwendeten Antibiotikums in RPMI-Medium bestimmt. Die MHK ist die geringste Konzentration eines Antibiotikums, die die Vermehrung der Bakterien sichtbar hemmt. Dazu wurde in einer 96-well-Mikrotiterplatte das entsprechende Antibiotikum geometrisch verdünnt. In die erste Vertiefung wurden 200 µl einer Antibiotikastocklösung pipettiert. Die Stocklösungen von Gentamicin (1,6 mg/ml), Penicillin G (25 µg/ml), Amoxicillin (25 µg/ml) und Daptomycin (1,6 mg/ml) wurden in RPMI-Medium angesetzt, die Stocklösung von Rifampicin (25 µg/ml) in Methanol, die Stocklösung von Ciprofloxacin (100 µg/ml) in 0,1 N Salzsäure und die Stocklösung von Erythromycin (1,6 mg/ml) in Ethanol. In Vertiefung zwei bis zwölf wurden jeweils 100 µl RPMI-Medium vorgelegt. Ausgehend von Vertiefung eins wurden jeweils 100 µl Antibiotikalösung bis Vertiefung zwölf überpipettiert; aus Vertiefung zwölf wurden 100 µl verworfen. Anschließend wurden in jede Vertiefung 100 µl der zu testenden Bakteriensuspension hinzupipettiert, wobei kryokonservierte Bakterien der exponentiellen und stationären Wachstumsphase eingesetzt wurden. Die Anzahl der hinzugegeben koloniebildenden Einheiten (KBE) betrug 5 x 10⁵ pro Vertiefung bzw. 5 x 10⁶ pro Vertiefung. 5 x 10⁶ KBE wurden bei den schlecht sichtbar pelletierenden Bakterienspezies S. gordonii und S. pyogenes eingesetzt. Als Kontrolle dienten Vertiefungen ohne Antibiotikum, in die die gleiche Menge Bakterien pipettiert wurde (Wachstumskontrolle) und Vertiefungen ohne Antibiotikum mit Zugabe von 1% [v/v]

Formaldehyd (finale Konzentration), in die ebenfalls die gleiche Menge Bakterien pipettiert wurde (Fixierung der Bakterien zur Kontrolle der Pelletbildung ohne Vermehrung). Die Mikrotiterplatten wurden anschließend mit einer Breathe Easy^® -Folie abgedichtet, um eine Verdunstung von Flüssigkeit bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung des Gasaustausches zu verhindern, und für 24 h bei 37°C inkubiert. Um die MHK abzulesen, wurden die Mikrotiterplatten mit dem Fotoscanner perfection V700 photo eingescannt (Epson, Meerbusch) und die Konzentration des

Material und Methoden

Antibiotikums, die die Vermehrung der Bakterien gerade noch hemmte, wurde visuell bestimmt. Zur Bestimmung des tatsächlichen Eingangsinokulums wurde weiterhin ein 20 µl-Aliquot aus der Wachstumskontrollvertiefung in 180 µl PBS überführt, geometrisch verdünnt und auf Columbia Schafblutagar in Triplikaten zu jeweils 10 µl ausplattiert. In Tabelle 2 sind die MHK-Bestimmungen der eingesetzten Antibiotika für die entsprechenden S. suis-Stämme und Spezies aufgelistet.

Tabelle 2: Zusammenfassung der MHK-Bestimmungen für die entsprechenden S. suis-Stämme und Spezies.

Antibiotikum

Bakterienstamm Gentamicin Penicillin G Ampicillin Ciprofloxacin Rifampicin Daptomycin Erythromycin

S. suis-Stamm 10 + + + + + + +

S. suis-Stamm A3286/94 + - - - - - -

S. suis-Stamm 05ZYH33 + - - - - - -

S. gordonii (30) + - - + - - -

S. pyogenes (A40) + - - + - - -

S. agalactiae (6313) + - - + - - -

+ bestimmt; - nicht bestimmt

3.2.2.2 Überleben in Anwesenheit von Antibiotika

Um festzustellen, inwiefern die Bakterien in der Lage sind, die Anwesenheit von Antibiotika, deren Konzentration das Hundertfache der MHK übersteigt, zu tolerieren, wurden Überlebenskinetiken durchgeführt. Dazu wurde RPMI-Medium in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß mit 1 x 10⁷ KBE von Bakterien, die sich entweder in der beginnenden exponentiellen oder in der stationären Wachstumsphase befanden, inokuliert. Es wurden entweder Frischkulturen oder kryokonservierte Bakterien verwendet. Das Gesamtvolumen der Reaktion betrug 1 ml. Vor Zugabe der Antibiotika wurden den Ansätzen 20 µl-Aliquots entnommen, um das genaue Eingangsinokulum festzustellen. Es wurden Triplikate zu jeweils 10 µl auf Columbia Schafblutagar ausplattiert. Anschließend wurden die Antibiotika, von denen jeweils eine Stocklösung frisch angesetzt wurde, hinzupipettiert. Die Finalkonzentration der Antibiotika in den Ansätzen entsprach jeweils der 100-fachen Menge der MHK. Die Ansätze wurden daraufhin rotierend bei 37°C inkubiert. Nach 1, 2, 4, 6, 8 und 24 h

Material und Methoden

wurden den Ansätzen jeweils 100 µl-Aliquots entnommen, die 5 min bei 7500 x g und 4°C zentrifugiert wurden. Der Überstand wurde abpipettiert und das Pellet mit 500 µl eiskalter 0,85%-iger [w/v] NaCl-Lösung gewaschen. Dazu wurden die Reaktionsgefäße nach Zugabe der NaCl-Lösung viermal geschwenkt und erneut für 5 min bei 7500 x g und 4°C zentrifugiert. Der Waschüberstand wurde anschließend ebenfalls abpipettiert. Das Pellet wurde in 50 µl eiskalter 0,85%-iger [w/v] NaCl-Lösung resuspendiert, wovon 20 µl nach geometrischer Verdünnung in 180 µl PBS auf Columbia Schafblutagar in Triplikaten (jeweils 10 µl) ausplattiert wurden. Die verbleibende Bakteriensuspension wurde unverdünnt in Triplikaten zu jeweils 10 µl ausplattiert. Das Überleben der Bakterien wurde durch Auszählen der KBE bestimmt.

Die Agarplatten wurden bis zu 72 h inkubiert, um auch langsamwachsende Kolonien zu erfassen.

Zur Inhibierung der protonenmotorischen Kraft (engl.: proton-motive force, PMF) wurden den Ansätzen vor der AntibiotikuZugabe der Inhibitor carbonyl cyanide m-chlorphenyl hydrazone (CCCP; angesetzt nach Herstellerangaben) in einer Finalkonzentration von 20 µM hinzugegeben. Die Ansätze wurden für 10 min auf Eis vorinkubiert, bevor das Antibiotikum hinzugegeben wurde und wie oben beschrieben weiter verfahren wurde.

3.2.2.3 Test auf Heritabilität

Mit dem Heritabilitätstest lässt sich feststellen, ob die Toleranz gegenüber Antibiotika von den Bakterien vererbt wird oder ob die Eigenschaft zur Antibiotikatoleranz der Bakteriensubpopulation eine phänotypische Varianz darstellt. Bei einem horizontalen Transfer der Eigenschaften, die zur Toleranz gegenüber den Antibiotika führen, würde es sich um eine vererbte Resistenz handeln im Gegensatz zur nicht vererbten Antibiotikatoleranz.

Für diesen Test wurden wie unter 3.2.1.3 beschrieben ÜNK von S. suis mit frischem THB-Medium auf eine OD₆₀₀ von 0,02 verdünnt, weiter wachsen gelassen und beim Erreichen der exponentiellen bzw. stationären Wachstumsphase geerntet. Die Pellets wurden einmal mit 5 ml PBS gewaschen, indem die Reaktionsgefäße viermal geschwenkt und erneut für 5 min bei 2700 x g und 4°C zentrifugiert wurden.

Material und Methoden

Anschließend wurden die Pellets in jeweils 1 ml frischem THB-Medium resuspendiert. Daraufhin wurde RPMI-Medium mit 8 µl der resuspendierten exponentiell gewachsenen bzw. mit 7 µl der resuspendierten stationär gewachsenen Bakterien (entsprechend jeweils 1 x 10⁷ KBE) inokuliert. Das Gesamtvolumen des Reaktionsansatzes betrug 1 ml. Zwanzig µl dieses Ansatzes wurden entnommen, geometrisch in PBS verdünnt und auf Columbia Schafblutagar zur Bestimmung des Eingangsinokulums ausplattiert. Anschließend wurden den Ansätzen Gentamicin hinzugegeben; die Finalkonzentration des Gentamicins entsprach dabei in den Ansätzen der 100-fachen MHK. Gentamicin wurde als Antibiotikum im Heritabilitätstest eingesetzt, da es sich in vorangegangenen Versuchen aufgrund seiner Eigenschaften als das Antibiotikum der Wahl herausstellte. Die Ansätze wurde für 3 h rotierend bei 37°C inkubiert, wobei den Ansätzen stündlich ein Aliquot von 100 µl entnommen wurde. Die Aliquots wurden für 5 min bei 7500 x g und 4°C zentrifugiert und die Überstande wurden abpipettiert. Die Pellets wurden wie unter 3.2.2.2 beschrieben gewaschen und zur Bestimmung der KBE auf Columbia Schafblutagar ausplattiert. Nach 3 h Inkubation mit Gentamicin wurden die Ansätze für 5 min bei 7500 x g und 4°C zentrifugiert und die Pellets wurden einmal mit 500 µl 0,85%-iger [w/v] NaCl gewaschen, indem erneut für 5 min bei 7500 x g und 4°C zentrifugiert wurde. Mit den Bakterienpellets wurde eine neue ÜNK in THB-Medium angeimpft. Der Zyklus, der das Animpfen der ÜNK, das Ernten der entsprechenden Wachstumsphase, die Antibiokumbehandlung und das erneute Animpfen einer ÜNK umfasst, wurde insgesamt viermal wiederholt. Für jeden Zyklus wurde der Anteil der antibiotikatoleranten Subpopulation durch ausplattieren und zählen der KBE bestimmt. Die Agarplatten wurden ebenfalls bis zu 72 h inkubiert, um auch hier langsam wachsende Kolonien zu erfassen.

3.2.2.4 Test auf die Eliminierung von Persistern

Um festzustellen, ob S. suis Typ I- oder Typ II-Persiterzellen bildet, wurde der Persisterzell-Eliminierungstest durchgeführt. Bei diesem Test wird eine exponentiell gewachsene Bakterienkultur durch wiederholte Re-Inkulation für mehrere Zyklen in der exponentiellen Wachstumsphase gehalten. Während jedes Zyklus werden

Material und Methoden

exponentiell gewachsene Bakterien mit einem Antibiotikum behandelt. Typ I-Persisterzellen werden wahrscheinlich stressbedingt in der stationären Wachstumsphase gebildet und beim Überimpfen übertragen und somit mit jeder wiederholten Re-Inokulation und Antibiotikumbehandlung durch einen Verdünnungseffekt eliminiert. Da Typ II-Persisterzellen kontinuierlich gebildet werden, bleibt der Typ II-Persisterzelllevel mit jeder weiteren Re-Inokulation und Antibiotikumbehandlung konstant.

Für diesen Test wurde eine ÜNK von S. suis-Stamm 10 mit frischem THB-Medium auf eine OD₆₀₀ von 0,02 verdünnt und bis zur exponentiellen Wachstumsphase wachsen gelassen. Mit einem Aliquot dieser exponentiell gewachsenen S. suis-Kultur wurde erneut frisches THB-Medium auf eine OD₆₀₀ von 0,02 verdünnt und bis zur exponentiellen Wachstumsphase wachsen gelassen. Dieser Zyklus wurde dreimal wiederholt. Für jeden Zyklus wurde eine Gentamicinbehandlung durchgeführt. Dafür wurde in einem 1,5 ml-Reaktionsgefäß RPMI-Medium mit 1 x 10⁷ KBE von exponentiell gewachsenen Bakterien inokuliert. Das genaue Eingangsinokulum wurde wie unter 3.2.2.2 beschrieben bestimmt. Nach Inokulation wurde Gentamicin in der 100-fachen MHK hinzupipettiert und die Ansätze wurden für 1 h bei 37°C rotierend inkubiert. Das Gesamtvolumen der Ansätze betrug 1 ml. Nach der einstündigen Inkubation wurden wie unter 3.2.2.2 beschrieben die überlebenden Bakterien durch Ausplattieren auf Columbia Schafblutagar bestimmt. Der prozentuale Anteil überlebender Bakterien in Bezug auf das Eingangsinokulum vor Gentamicinbehandlung wurde berechnet.

3.2.3 Zellbiologische Methoden

3.2.3.1 Separation mononukleärer Zellen (MNCs) aus porzinem Vollblut

Für das Studium der Assoziation von S. suis mit naïven porzinen Monozyten, mussten zunächst die Monozyten aus heparinisiertem Vollblut gewonnen und angereichert werden. Monozyten stellen einen Teil der MNCs dar, wobei der Anteil der Monozyten an den MNCs beim Schwein etwa 2 bis 10% beträgt (Thorn, 2010).

Die Hauptmasse der MNCs stellen somit die Lymphozyten dar. Das Vollblut, aus

Material und Methoden

denen die MNCs gewonnen wurden, stammte von gesunden Schweinen. Die Separierung der MNCs von den anderen korpuskulären und flüssigen Bestandteilen des Blutes erfolgte über eine Biocoll-Dichtegradienten-Zentrifugation. Dazu wurden in vier 50 ml-Röhrchen jeweils 13 ml heparinisiertes Vollblut (16 I.E. Heparin/ml Blut) 1+1 mit 13 ml 0,85%-iger [w/v] NaCl verdünnt. Anschließend wurden 12 ml des Polymers Biocoll mit einer Dichte von 1,077 g/ml (Biochrom, Darmstadt) mit 12 ml verdünntem Blut vorsichtig überschichtet (insgesamt acht Ansätze) und für 30 min bei 2000 x g und 4°C zentrifugiert, wobei die Beschleunigung und die Abbremsung der Rotordrehung auf langsam gestellt wurde. Nach der Zentrifugation bildet sich ein Gradient, bei dem sich im Pellet die Granulozyten und die Erythrozyten befinden, dann folgen die Biocoll-Schicht und abschließend die Blutplasma-Schicht, wobei sich die MNCs in der Interphase zwischen der Biocoll- und der Blutplasma-Schicht anreichern. Die Interphase mit den MNCs wurde abpipettiert und in ein neues 50 ml-Röhrchen überführt. Pro Gradient wurden 5 ml Interphase entnommen, wobei jeweils die Interphasen von vier Gradienten vereint wurden. Die Interphase in beiden 50 ml-Röhrchen wurde auf 50 ml mit RPMI-Medium aufgefüllt und für 10 min bei 1000 x g und 4°C zentrifugiert. Nach Absaugen der Überstände wurden die Pellets mit 12 ml RPMI-Medium gewaschen und erneut für 5 min bei 1000 x g und 4°C zentrifugiert.

Die Überstände wurden wiederum abgesaugt und die Pellets mit den MNCs in jeweils 1 ml RPMI-Medium resuspendiert. Hierbei wurde darauf geachtet, dass nicht resuspendierbare Zellklümpchen verworfen wurden. Die beiden in 1 ml RPMI-Medium resuspendierten Pellets wurden erneut vereint. Anschließend wurde die Anzahl der MNCs bestimmt, wozu eine Neubauer Zählkammer verwendet wurde. Die Zellsuspension wurde dafür 1:100 in RPMI-Medium verdünnt. Die Zellzahl aller vier Großquadrate (bestehend aus jeweils 16 Kleinquadraten) wurde gezählt und durch vier geteilt, um den Mittelwert eines Großquadrates zu erhalten. Die gezählte und gemittelte Zellzahl entspricht der Zellzahl x 10⁴/ml (unter Berücksichtigung der Verdünnung).

Um die Qualität der präparierten MNCs zu kontrollieren, wurde die Morphologie und Vitalität der Zellen durchflusszytometrisch am BD accuri™ C6 (BD, Heidelberg) überprüft und mit der BD accuri™ C6 Software ausgewertet.

Material und Methoden

3.2.3.2 Immunomagnetische Aufreinigung porziner CD14-positiver MNCs

Monozyten stellen innerhalb der MNCs nur eine kleine Subpopulation dar. Beim Schwein beträgt der Anteil an Monozyten innerhalb der MNCs 2 bis 10% (Thorn, 2010). Um ausschließlich Monozyten zu erhalten, wurden diese aus den MNCs über den Oberflächenmarker CD14 per magnetic activated cell sorting (MACS) angereichert. Dies erfolgte nach Separierung der MNCs mittels einer Antikörpermarkierung und anschließender immunomagnetischer Aufreinigung. Dazu wurden 2 x 10⁸ MNCs für 10 min bei 250 x g und 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde in 1,6 ml MACS-Puffer resuspendiert und mit 100 µl mouse anti-human CD14-Antikörper, der mit magnetischen Microbeads konjugiert ist, versetzt. Dieser Antikörper kreuzreagiert mit porzinen Monozyten und fungiert als Monozytenmarker.

Die MNCs wurden mit dem Antikörper rotierend für 15 min bei 4°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die markierten MNCs in ein 14 ml-Röhrchen überführt, und mit 12 ml MACS-Puffer gewaschen, indem die Zellsuspension für 10 min bei 250 x g und 4°C zentrifugiert wurde. Das Pellet wurde in 1 ml MACS-Puffer resuspendiert.

Anschließend erfolgte die Anreicherung der CD14-positiven Zellen, die mit den magnetischen Microbeads konjugiert waren, in einem magnetischen Feld mittels des MiniMACS™ Separator Sytems (Miltenyi, Bergisch Gladbach). Dazu wurde ein Dauermagnet (MiniMACS™ Separator; Miltenyi, Bergisch Gladbach) an einem Magnetständer (MultiStand; Miltenyi, Bergisch Gladbach) angebracht und mit einer MS-Säule (MS Column; Miltenyi, Bergisch Gladbach) bestückt. Der Dauermagnet induziert ein starkes magnetisches Feld innerhalb der MS-Säule, die eine Matrix, bestehend aus ferromagnetischen Partikeln, enthält. Die Säule wurde einmal mit 500 µl MACS-Puffer gespült. Anschließend wurde die Suspension mit den MNCs und den markierten CD14-positiven Zellen (= Monozyten) auf die Säule pipettiert, wobei der Durchfluss aufgefangen wurde. Nachdem die gesamte MNC-Suspension die Säule passiert hatte, wurde die Säule dreimal mit jeweils 500 µl MACS-Puffer gespült. Bei dem Durchfluss handelte es sich um die nicht-markierten Zellen, also um von CD14-positiven Monozyten depletierte MNCs. Anschließend wurde die Säule aus dem magnetischen Feld entfernt. Durch Zugabe von 1 ml MACS-Puffer auf die Säule und schnelles Herunterdrücken des Stopfens wurden die CD14-positiven Zellen von der

Material und Methoden

Säule eluiert. Im Eluat befanden sich demzufolge die CD14-positiven Monozyten. Um festzustellen, wie viele CD14-positiven Monozyten sich im Eluat befanden, wurde die Zellzahl mittels einer Neubauer Zählkammer wie in Kapitel 3.2.3.1 beschrieben bestimmt. In weiterführenden Versuchen wurde die Menge an Eluat entsprechend der gewünschten Zellzahl eingesetzt.

Die Qualität der präparierten CD14-positiven Monozyten wurde durch Erfassung der Morphologie und Vitalität der Zellen durchflusszytometrisch am BD accuri™ C6 (BD, Heidelberg) überprüft. Die Auswertung erfolgte mit der BD accuri™ C6 Software.

Zusammensetzung des verwendeten Puffers: und CD14-positiven Monozyten für die verschiedenen Experimente aufgelistet.

Tabelle 3: Behandlung und eingesetzte Zellzahl der porzinen MNCs und CD14-positiven Monozyten in den Experimenten (Zusammenfassung)

Spin-Vertiefung Verfügbare Zellzahl 4 x 10⁵/100µl 2 x 10⁵/100µl

3.2.3.3 Durchflusszytometrische Analysen und fluorescence-activated cell sorting (FACS)

Zellen können durchflusszytometrisch durch Erfassung verschiedener Parameter hinsichtlich spezieller Eigenschaften untersucht werden. Zunächst können die Zellgröße und die Granularität von Zellen zur Darstellung einer charakteristischen Zellmorphologie ermittelt werden. Die Zellgröße wird durch Erfassung des

Material und Methoden

Vorwärtsstreulichtes (engl.: forward scatter, FSC) im FSC-Kanal und die Granularität durch Erfassung des Seitwärtsstreulichtes (engl.: sideward scatter, SSC) im SSC-Kanal bestimmt.

In dieser Arbeit wurde die Morphologie von S. suis, den MNCs und den CD14-positiven Monozyten untersucht. Dazu wurden 50 µl von den kryokonservierten Bakterien, den präparierten MNCs bzw. den präparierten CD14-positiven Monozyten mit 150 µl PBS verdünnt und anschließend durchflusszyometrisch erfasst. Es wurden jeweils 10000 Zellen im FSC- und SSC-Kanal gemessen und als Dot-Plot dargestellt.

Die Größe der Zellen (x-Achse) wurde dabei gegen die Granularität (y-Achse) aufgetragen. Anschließend konnten gewünschte Zellpopulationen für weitere Darstellungen definiert werden.

Mittels der durchflusszytometrischen Analyse können auch Fluoreszenz-markierte Zellen erfasst werden. In diesem Fall handelt es sich um fluorescence-activated cell sorting (FACS). Dabei kann die Fluoreszenz mehrerer verschiedener Wellenlängen in verschiedenen Kanälen gleichzeitig detektiert werden. Durch Erfassung von Fluoreszenz-markierten Zellen können diese von unmarkierten Zellen abgegrenzt werden. Zellen, die mit mehreren Fluoreszenzfarbstoffen gleichzeitig markiert werden, können hinsichtlich bestimmter Merkmale differenziert werden. Die Mehrfachfluoreszenzmessung erfolgte am Durchflusszytometer BD accuri™ C6 (BD, Heidelberg). Die CFSE-, FITC-, PE- und Propidiumjodid (PJ)-markierten Zellen wurden dabei von einem blauen Laser bei einer Wellenlänge 488 nm und die Alexa Fluor^® 647-markierten Zellen von einem roten Laser bei einer Wellenlänge von 640 nm angeregt. Das Durchflusszytometer ist neben zwei Detektoren zur Erfassung des Vorwärts- und Seitwärtsstreulichtes mit vier optischen Filtern und den zugehörigen Detektoren zur Erfassung der emittierten Fluoreszenz ausgestattet. Die Detektion der grünen Fluoreszenz (CFSE, FITC) erfolgte bei 533 nm im FL1-Kanal, die Detektion der dunkelroten Fluoreszenz (PE) bei 585 nm im FL2-Kanal, die Detektion der orange-roten Fluoreszenz (PJ) bei 670 nm im FL3-Kanal und die Detektion der blauen Fluoreszenz (Alexa Fluor^® 647) bei 640 nm im FL4-Kanal.

Material und Methoden

3.2.3.4 Durchflusszytometrische phänotypische Charakterisierung CD14-positiver Monozyten

Für jede Zellpopulation ist die Expression spezifischer CD-Marker (CD = engl.:

cluster of differentiation) charakteristisch. Um die Expression und Verteilung einiger ausgewählter CD-Marker auf den CD14-positiven Monozyten zu untersuchen, wurden die CD-Marker mit fluoreszenzkonjugierten Antikörpern markiert.

Anschließend wurden die Zellen hinsichtlich der Expression der CD-Marker per Fluoreszenzmessung durchflusszytometrisch erfasst. Für diese Analyse wurden in MACS-Puffer resuspendierte Zellen eingesetzt. Als Kontrolle dienten MNCs, die vor dem Experiment für 10 min bei 250 x g und 4°C zentrifugiert und in 2 ml MACS-Puffer resuspendiert wurden. Die Zellzahl wurde wie in Kapitel 3.2.3.1 beschrieben mit der Neubauer-Zählkammer bestimmt.

Als Antikörper wurden anti-CD172a (FITC-konjugiert, grüne Fluoreszenz), anti-CD14 (Alexa 647-konjugiert, blaue Fluoreszenz) und anti-CD163 (PE-konjugiert; dunkelrote Fluoreszenz) verwendet. CD172a wird von der Gesamtheit der porzinen Monozyten- und Makrophagenpopulation exprimiert (Haverson et al., 1994; McCullough et al., 1997). Da in diesem Versuch nur die MNCs/Monozyten von Interesse waren und diese Zellen nach der Dichtegradienten-Zentrifugation von den Granulozyten separiert wurden, und da sich im zirkulierenden Blut keine Makrophagen befinden,

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