Regulation und Funktion des Arginin Deiminase Systems von Streptococcus suis

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Tierärztliche Hochschule Hannover

Regulation und Funktion des Arginin Deiminase Systems von Streptococcus suis

THESE

zur Erlangung des Grades DOCTOR OF PHILOSOPHY

- PhD -

im Fachbereich Mikrobiologie

an der Tierärztlichen Hochschule Hannover

vorgelegt von Marcus Fulde aus Herford

Hannover 2007

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Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Betreuungsgruppe: Prof. Dr. P. Valentin-Weigand

Prof. Dr. G. Herrler,

Institut für Virologie, Zentrum für Infektionsmedizin, Stif- tung Tierärztliche Hochschule Hannover

Prof. Dr. S. Hammerschmidt,

Ludwig-Maximilians-Universität München, Max-von- Pettenkofer-Institut für Hygiene und Medizinische Mikrobio- logie, Lehrstuhl Bakteriologie

Externe Begutachtung: PD Dr. B. Kreikemeyer,

Medizinische Fakultät, Institut für Medizinische Mikrobio- logie, Virologie und Hygiene, Universität Rostock

Tag der mündlichen Prüfung: 16.11.2007

Vorliegende Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen des Sonderforschungsbereichs 587 „Immunreaktionen der Lunge bei Infek- tion und Allergie“ und des Graduiertenkollegs 745 „Mukosale Erreger-Wirt- Interaktionen“ gefördert.

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Meiner Familie und Melina

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Gruening, P., Fulde, M., Valentin-Weigand, P., Goethe, R. (2006)

Structure, regulation and putative function of the arginine deiminase system of Streptococcus suis.

Journal of Bacteriology, Jan. 2006, p. 361-369 Präsentationen

Fulde, M., Baums, C. G., Gruening, P., Valentin-Weigand, P. (2005) Strategies to inactivate virulence-associated genes in Streptococcus suis.

Genetics of Infection, Annual Meeting of the German Genetics Society, Sep- tember 2005, Braunschweig.

Gruening, P., Fulde, M., Valentin-Weigand, P., Goethe, R. (2005)

Structure, regulation and putative function of the arginine deiminase operon of Streptococcus suis.

2. Gemeinsame Tagung von DGHM und VAAM, September 2005, Göttingen.

Fulde, M., Valentin-Weigand, P., Goethe, R. (2006)

Regulation of the arginine deiminase operon of Streptococcus suis.

DVG-Tagung der Fachgruppe „Bakteriologie und Mykologie“, Juni 2006, Wetz- lar.

In: Themenheft der Berliner und Münchener Tierärztlichen Wochenschrift (BMTW)

Streptococcal Genetics, Meeting of the American Society for Microbiology, Juni 2006, Saint Malo, Frankreich.

107^th General Meeting of the American Society for Microbiology, Mai 2007, To- ronto, Kanada.

FlpS is essential for the expression of the arginine deiminase system of Strep- tococcus suis.

59. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie e.V., September 2007, Göttingen.

In: International Journal of Medical Microbiology 297S1 (Suppl. 43): 101

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2 Schrifttum ...14

2.1 Streptococcus suis... 14

2.1.1 Epidemiologie... 14

2.1.2 Pathogenese von S. suis Infektionen ... 15

2.1.3 Virulenz- und Virulenz-assoziierte Faktoren... 17

2.2 Das Arginin Deiminase System ... 23

2.2.1 Die physiologische Bedeutung und die Regulation des ADS ... 25

2.2.2 Das ADS als Überlebensfaktor bakterieller Erreger ... 26

2.2.3 Das ADS von S. suis... 27

2.3 Zielsetzung der Arbeit ... 30

3 Material und Methoden ...31

3.1 Chemikalien, Reagenzien, Geräte und Wachstumsmedien ... 31

3.2 Bakteriologische Methoden ... 31

3.2.1 E. coli... 31

3.2.2 S. suis... 32

3.2.3 Kultivierungsbedingungen zur Untersuchung der ADS Expression... 33

3.3 Molekularbiologische Methoden ... 35

3.3.1 Isolierung chromosomaler DNA aus S. suis... 35

3.3.2 Isolierung episomaler DNA aus S. suis... 36

3.3.3 Isolierung episomaler DNA aus E. coli... 36

3.3.4 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung bakterieller Nukleinsäuren mittels Ultraviolett-(UV)-Absorptionsspektrometrie... 38

3.3.5 Klonierungen ... 38

3.3.6 Polymerase chain reaction (PCR) ... 40

3.3.7 Transformation ... 43

3.3.8 Southern Blot Analyse... 44

3.3.9 Northern Blot Analyse ... 47

3.3.10 Rapid amplification of cDNA ends (RACE) ... 50

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3.4.1 Herstellung von Ganzzelllysaten ... 56

3.4.2 Bestimmung der Proteinkonzentration ... 56

3.4.3 Eindimensionale SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS- PAGE)... 56

3.4.4 Coomassieblau-Färbung... 57

3.4.5 Konservierung von SDS-Polyacrylamid-Gelen... 57

3.4.6 Western Blot Analyse... 58

3.4.7 Überexpression rekombinanter his-tag Fusionsproteine und Herstellung polyklonaler Antikörper... 59

3.4.8 Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)... 60

3.4.9 Überlebensstudien ... 62

3.4.10 Verwendete Computersoftware... 63

4 Ergebnisse...65

4.1 Die Regulation des Arginin Deiminase Systems durch externe Stimuli... 66

4.1.1 Temperatur... 66

4.1.2 Glukose und die Regulation durch das Catabolite control protein A (CcpA)... 68

4.1.3 Sauerstoff und die Regulation durch das FNR-like protein of S. suis (FlpS)... 72

4.1.4 Arginin und die Regulation durch den Arginine Repressor (ArgR) ... 78

4.2 Die Rolle des ADS als Virulenz-assoziierter Faktor von S. suis... 84

4.2.1 Phänotypische Charakterisierung des ADS und assoziierter Gene .... 85

5 Diskussion...102

5.1 Die Regulation des ADS... 103

5.2 Die funktionelle Charakterisierung des ADS als Virulenz-assoziierter Faktor ... 111

6 Zusammenfassung ...118

7 Summary...119

(7)

8.2 Literaturverzeichnis ... 122 8.3 Verbrauchsmaterialien ... 147 8.4 Geräteverzeichnis ... 149

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Abb. Abbildung A. bidest Aqua bidestillata

AD Arginin-Deiminase

ADP Adenosindiphosphat

ADS Arginin Deiminase System

APS Ammoniumpersulfat

Arginin-HCl Argininhydrochlorid

ATCC American Type Culture Collection, Manassas, USA

ATP Adenosintriphosphat

Bp Basenpaare

BSA bovines Serumalbumin

bspw. beispielsweise

BTPE Bis-Tris/PIPES/EDTA (Standardlösung)

bzw. beziehungsweise

°C Grad Celsius

ca. circa

cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat cDNA engl.: complementary DNA

Ci Curie

CIP engl.: calf intestinal phosphatase

CK Carbamat-Kinase

CO2 Kohlenstoffdioxid

cm Zentimeter

c.p.m engl.: counts per minute

CTAB Hexadecyltrimethyl Ammonium Bromid

d engl.: day

Da Dalton

dCTP 2’-Desoxy-Cytosin-5’-Triphosphat

d. h. das heißt

DMEM engl.: Dulbecco´s modified Eagle´s medium DMSO Dimethylsulfoxid

DNA engl.: desoxyribonucleic acid

DNase Desoxyribonuklease

dNTP 2’-Desoxy-Nukleotid-5’-Triphosphat

DTT Dithiothreitol

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evtl. eventuell

F Farrad

FCS engl.: fetal calf serum

g Gramm

GAS Gruppe-A-Streptokokken

GET Glukose/EDTA/Tris (Standardlösung)

gDNA genomische DNA

gRNA gesamt RNA

h lat.: hora (Stunde)

HEPES 4-(Dihydroxyethyl)Piperazinethansulfonsäure i. d. R. in der Regel

IPTG Isopropylthiogalactosid

k kilo

kDa Kilodalton

l Liter

LB Luria-Bertani

M Molarität (mol/l)

m milli, 10^-3

μ mikro, 10^-6

max. maximal

mg Milligramm

min Minute

mRNA engl.: messenger RNA

N normal

NH3 Ammoniak

nm Nanometer

Ω Ohm

O2 Sauerstoff

OCT Ornithin-Carbamoyltransferase

OD optische Dichte

OLR Offener Leserahmen

PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PCR engl.: polymerase chain reaction

pH pH-Wert

PIPES 1,4-Piperazindiethanolsulfonsäure PBS engl.: phosphate buffered saline

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RNA engl.: ribonucleic acid

RNase Ribonuklease

rRNA ribosomale RNA

RT Raumtemperatur

s Sekunde(n)

S Svedberg

SDS engl.: sodium dodecyl sulphate

sog. sogenannten

SSC engl.: standard saline citrate SS-DNA engl.: salomon sperm DNA

ssp. subspezies

SSTS engl.: streptococcal toxic shock syndrome

Taq Thermus aquaticus

TBE Tris/Borsäure/EDTA (Standardlösung)

TE Tris/EDTA (Standardlösung)

TED engl.: tris-carboxymethyl ethylene diamine TEMED N, N, N´, N`-Tetramethyl-ethyldiamin TEN Tris/EDTA/NaCl (Standardlösung)

THB Todd Hewitt broth

TM engl.: trade mark

Tris Tris-(hydroxymethyl-)aminomethan

tRNA transfer RNA

TS Transkriptionsstartpunkt

TSB Tryptic soy broth

U Unit

u. a. unter anderem

Upm Umdrehungen pro Minute

UV Ultraviolett

V Volt

v. a. vor allem

[v/v] Volumen pro Volumen

[w/v] Gewicht pro Volume

W Watt

WT Wildtyp

z. B. zum Beispiel

® engl.: registered trademark

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1 Einleitung

Streptococcus (S.) suis ist ein grampositives, fakultativ anaerobes α- hämolysierendes Kokkenbakterium. Als Kommensale ist es vor allem im oronasalen Bereich seines natürlichen Wirtes, dem Schwein, zu finden. Mitunter kommt es jedoch zu schweren klinischen Erkrankungen, wie Meningitiden, Pneumonien oder Arthritiden. Wirtschaftlich gravierender wirken sich aber die subklinischen Erkrankun- gen aus, die durch geringere Tagesgewichtszunahmen oder Kümmern Schäden in Millionenhöhe hervorrufen (STAATS et al. 1997). Zoonotisches Potential besitzt S. suis vor allem dort, wo es dauerhaft zu einem engen Kontakt zwischen Mensch und Schwein kommt. Im Jahr 2005 gelangte ein S. suis Ausbruch in China in die Schlagzeilen, bei welchem binnen zwei Wochen 215 Menschen erkrankten und 39 an Sepsis oder einem STSS-ähnlichen Krankheitsbild starben (TANG et al. 2006; YU et al. 2006). In westlichen Ländern sind vereinzelt Fälle bei beruflich prädisponierten Personen wie Tierärzten, Jägern oder Mitarbeitern der Fleischindustrie bekannt. Hier wurden vor allem Endokarditiden und Meningitiden diagnostiziert (ARENDS u.

ZANEN 1988; ROSENKRANZ et al. 2003).

Die hohe Diversität im Krankheitsbild spiegelt sich auch in der hohen Anzahl unterschiedlicher Kapselserotypen wider. Bis heute sind 35 Serotypen identifiziert, jedoch existieren weitaus mehr nicht-typisierbare Stämme (ALLGAIER et al. 2001; REHM et al. 2007; WISSELINK et al. 2000). Bei klinisch erkrankten Tieren werden die Seroty- pen 2 und 9 mit Abstand am häufigsten isoliert. Es kann jedoch auch innerhalb eines Serotyps zu einer unterschiedlichen Virulenzausprägung kommen, so dass von weiteren, serotypübergreifenden Pathogenitätsfaktoren auszugehen ist.

WINTERHOFF et al. (2002) beschrieben in diesem Kontext erstmalig das Arginin Deiminase System von S. suis. Sie exponierten Streptokokken mit einer Auswahl wirtstypischer Stressoren, um auf diesem Weg neue Virulenzfaktoren zu identifizieren. Im Proteom konnten nach einem Temperaturwechsel von 32°C auf 42°C zwei signifikant aufregulierte Proteine nachgewiesen werden. N-terminale Ansequenzie- rung und anschließender Datenbankabgleich erbrachten hohe Homologien zu dem streptococcal acid glycoprotein (SAGP), einer Arginin-Deiminase, und zur Ornithin- Carbamoyltransferase von S. pyogenes. Diese Enzyme gehören zu einem bei Proka-

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ryoten und einfachen Protisten weit verbreiteten, katabolen Enzymsystem, dem Argi- nin Deiminase System (ADS). Das System katalysiert die Umwandlung von Arginin zu Ornithin und umfasst die Enzyme Arginin-Deiminase, Ornithin- Carbamoyltransferase und Carbamat-Kinase. Dabei entstehen 1 Mol Kohlenstoffdi- oxid, 2 Mol Ammoniak und 1 Mol ATP pro Mol umgesetzten Arginins.

Als Energie-liefernder Stoffwechselweg wurde das ADS bereits detailliert beschrieben. So wird es z.B. von Bacillus licheniformis oder Pseudomonas aeruginosa zur Energiegewinnung unter anaeroben Bedingungen genutzt (GAMPER et al. 1991;

MAGHNOUJ et al. 1998). Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Transkription des ADS der Katabolitrepression unterliegt (DONG et al. 2004; ZENG et al. 2006) und durch Arginin (GRUENING et al. 2006; ZENG et al. 2006) bzw. Ano- xie (GAMPER et al. 1991) induziert werden kann.

Über die Beteiligung des ADS an der Pathogenese ist bis heute wenig bekannt. Ora- le Streptokokken nutzen das in der Arginolyse gebildete Ammoniak um den extrazel- lulären pH-Wert anzuheben (CASIANO-COLON u. MARQUIS 1988). So könnte zum Beispiel einer Azidifizierung in sauren Zellkompartimenten entgegengewirkt werden.

Für S. pyogenes konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass eine sagp negative, isogene Deletionsmutante in Epithelzellen deutlich schlechter überlebt als der entsprechende WT Stamm (DEGNAN et al. 2000). Ob es sich dabei aber um einen di- rekten, aktiven Prozess handelt ist fraglich. Zwar konnten BUDIN-VERNEUIL et al.

(2006) zeigen, dass in Lactococcus lactis eine verstärkte Transkription des ADS durch Absenken des extrazellulären pH-Wertes von 7,0 auf 5,0 hervorgerufen werden kann. Es ist jedoch aus der Literatur bekannt, dass die Enzyme der Glykolyse bereits bei pH-Werten um 5,0 deutliche Aktivitätsverluste zeigen (CASIANO-COLON u. MARQUIS 1988). Da das ADS allerdings der Katabolitrepression unterliegt, darf die Möglichkeit einer Derepression durch Energiedefizit bei niedrigen pH-Werten nicht außer Acht gelassen werden. Hinzu kommt, dass die Zellmembran bei niedrigen pH-Werten permeabel für Arginin wird (CASIANO-COLON u. MARQUIS 1988), welches dann wieder sowohl als Induktor für die Transkription (ZENG et al. 2006) als auch als Substrat zur Katalyse genutzt werden kann. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass eine klare Abgrenzung zwischen Stoffwechselweg und putativem Viru- lenzfaktor nicht möglich ist. Vielmehr muss hier von einem durch Adaption an sich

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ändernde Umweltverhältnisse induzierten, assoziierten Virulenzfaktor gesprochen werden. Diese Zusammenhänge sollen im Folgenden ausführlicher diskutiert werden.

Ziel dieser Arbeit war es, die biologische Bedeutung des ADS für das Überleben von S. suis im Wirtsorganismus zu untersuchen. Durch in vitro Versuche sollte die Regu- lation des ADS entschlüsselt werden, um mit dem so gewonnenen Wissen dessen Relevanz in der Erreger-Wirt-Interaktion zu klären.

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2 Schrifttum

2.1 Streptococcus suis

Bei Streptococcus (S.) suis handelt es sich um ein grampositives, fakultativ anaero- bes, kokkoides Bakterium. Wie alle Streptokokken ist auch S. suis auf ein komplexes Nährstoffangebot angewiesen. Als Homofermentierer gewinnt es dabei die Energie in Form von ATP hauptsächlich aus der Glykolyse und produziert als primäres Stoff- wechselendprodukt Milchsäure. Während bei der Kultivierung auf Schafblutagar eine α-Hämolyse zu beobachten ist, wächst S. suis auf Pferdeblut-haltigen Nährböden sowohl mit α- als auch mit β-Hämolyse. Basierend auf der Zusammensetzung der Kapselantigene sind bis heute 35 verschiedene Serotypen beschrieben worden (1-34, 1/2). Neueste Studien deuten allerdings darauf hin, dass es sich bei den Sero- typen 32 und 34 um Streptococcus orisratti handelt (HILL et al. 2005). Diese Diversi- tät in der Zusammensetzung der Kapsel spiegelt sich auch in dem klinischen Er- scheinungsbild einer S. suis Infektion wider. So können Meningitiden, Arthritiden, Pneumonien, Endokarditiden, Polyserositiden und Abszesse beobachtet werden. In selteneren Fällen kommt es zu einem perakutem, septikämischen Verlauf mit plötzli- chen Todesfällen (STAATS et al. 1997).

2.1.1 Epidemiologie

Als Kommensale ist S. suis sowohl beim Haus- als auch beim Wildschwein weit verbreitet (BAUMS et al. 2007; STAATS et al. 1997). Hier besiedelt der Erreger v. a. die Schleimhäute des oberen Respirationstraktes und der Tonsillen (HIGGINS et al.

1990). Darüber hinaus kann S. suis auch aus dem Genital- und Intestinaltrakt isoliert werden (ROBERTSON u. BLACKMORE 1989; SWILDENS et al. 2004). An pathoge- ner Bedeutung gewinnt der Erreger vor allem dann, wenn die Tiere dauerhaft Stress ausgesetzt sind. Das ist zumeist die Folge von Missmanagement in der Haltung, wie z.B. fehlende Hygiene, heterogene Gruppengröße oder andere Infektionen (STAATS et al. 1997). Dabei ist das Alter der Tiere weniger ausschlaggebend. Jedoch sind Saug- und Absatzferkel prädisponiert (STAATS et al. 1997) und infizieren sich sowohl horizontal als auch vertikal (AMASS et al. 1997). Die Infektion einer ganzen

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Herde ist meistens bedingt durch das Einbringen von S. suis positiven Träger-Tieren.

Auch eine vorherige Behandlung mit Penicillin garantiert keinen S. suis negativen Status (STAATS et al. 1997). Dabei werden Morbiditäten von bis zu 50% beobachtet.

Ohne entsprechende Medikation kann die Mortalitätsrate bis zu 20% betragen (STAATS et al. 1997). Aus erkrankten oder verendeten Tieren werden zumeist Strep- tokokken der Serotypen 1, 2, 7, 9 und 14 isoliert (ALLGAIER et al. 2001; HIGGINS et al. 1992; WISSELINK et al. 2000). Ökonomisch wichtiger sind jedoch die für die meisten Träger-Tiere typischen, subklinischen Erscheinungen, wie Kümmern oder eine verminderte Tagesgewichtszunahme. Allein dadurch sind in den USA bis 1997 Schäden von geschätzten 300 Millionen US-Dollar aufgetreten (STAATS et al. 1997).

Zoonotisches Potential entwickelt S. suis v. a. dort, wo es dauerhaft zu einem engen Kontakt zwischen Mensch und Schwein kommt. In den westlichen Ländern wird meist von Einzelfällen bei Tierärzten, Jägern oder Mitarbeitern der Fleischindustrie berichtet. Klinisch treten hier insbesondere Meningitiden, Septikämien, Arthritiden und Endokarditiden auf (ARENDS u. ZANEN 1988; ROSENKRANZ et al. 2003). Ein ungewöhnlich starker Ausbruch ereignete sich 2005 in Sichuan, einer Provinz Chinas (YU et al. 2006). Binnen zwei Wochen erkrankten 215 Menschen, meist Bauern, von denen 39 starben. Auffallend hierbei war die geringe Anzahl an Fällen von Meninigi- tis, Arthritis oder Endokarditis. Vielmehr nahm das Krankheitsgeschehen einen pera- kuten bis akuten Verlauf, welcher stark an das streptococcal toxic shock syndrome (STSS) von Gruppe-A-Streptokokken (GAS) erinnerte. Vielfach traten hohes Fieber, Durchfall, petechiale Blutungen, Herzversagen und multiples Organversagen auf (GOTTSCHALK et al. 2007; TANG et al. 2006). Ob diese Form vergleichbar mit dem Toxin- bzw. Superantigen-vermittelten STSS von GAS ist, müssen weitere Untersu- chungen klären.

2.1.2 Pathogenese von S. suis Infektionen

Über die Pathogenese von S. suis ist bis heute wenig bekannt. In der Literatur ist mehrfach ein dreistufiges Modell beschrieben worden, bestehend aus I. Kolonisation und Invasion des respiratorischen Epithels, II. Ausbreitung im Blut und III. Penetrati- on des Endothels einschließlich Manifestation im Zielgewebe (Dissertation BENGA 2004, CHANTER et al. 1993; GOTTSCHALK u. SEGURA 2000).

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Die Adhärenz an das respiratorische Epithel wird in der Literatur kontrovers diskutiert. LALONDE et al. (2000) konnten zeigen, dass S. suis zwar in der Lage ist, an porzine Epithelzellen zu binden, nicht jedoch zu invadieren. Sie postulierten, dass der toxische Effekt des Suilysins nötig ist, um diese erste Barriere zu durchbrechen und so eine Dissemination im Blut hervorzurufen. Dieses Phänomen ist indessen nicht in Einklang zu bringen mit den Beobachtungen von LUN et al. (2003), die berichteten, dass eine sly-negative Mutante im Infektionsmodell nicht attenuiert war.

Weiterführende Ergebnisse lieferte die Arbeit von (BENGA et al. 2004). Sie führten die Invasion von S. suis in Epithelzellen auf die Ausprägung der Kapsel zurück. Das bestätigte auch die Untersuchungen von (GOTTSCHALK et al. 1991), der eine er- höhte Adhärenz von S. suis in Lungenschnittpräparaten mit einer dünneren Kapsel in Verbindung bringen konnte. BENGA et al. (2004) diskutierten daraufhin die Möglich- keit, dass die Kapselsynthese in der Pathogenese reguliert sei. Des Weiteren konnten sie zeigen, dass die Invasion von S. suis über einen Rezeptor-vermittelten Me- chanismus erfolgt. Die Bakterien gelangten dadurch in saure Phagolysosmen, in denen ADS positive Stämme persistieren konnten. Wie sie aber von dort in den Blut- strom gelangen, bedarf weiterer Untersuchungen.

Die Dissemination der Bakterien im Blut dient zweifelsfrei der Translokation zum Zielgewebe. WILLIAMS u. BLAKEMORE (1990) diskutierten in diesem Zusammen- hang die sog. „Trojan horse theory“. Dabei sollen die Bakterien intrazellulär in Mono- zyten persistieren. So könnten sie zum einen der Wirtsantwort entgehen und zum anderen relativ schnell ins Zielgewebe gelangen. SEGURA u. GOTTSCHALK (2002) fanden allerdings heraus, dass sich die Mehrzahl der Bakterien nicht in den Monozy- ten befand, sondern lediglich an diese adhärierten. Sie postulierten daraufhin die sog. „modified Trojan horse theory“.

Der letzte Schritt der Pathogenese umfasst die Penetration des Endothels und die Manifestation im Zielgewebe. BENGA et al. (2005) konnten in diesem Zusammen- hang zeigen, dass, ähnlich der Kolonisation des respiratorischen Epithels, die Kapsel eine Adhärenz sowohl an porzine endotheliale Aortenzellen als auch an zerebrale Endothelzellen inhibiert. Im Gegensatz zu den oben beschriebenen Ergebnissen war jedoch eine kapsellose Mutante nicht in der Lage, diese Zellen zu invadieren, so

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dass andere, vielleicht Co-Faktor abhängige, Enzyme zur Manifestation einer S. suis Infektion im Gewebe nötig sind.

2.1.3 Virulenz- und Virulenz-assoziierte Faktoren

2.1.3.1 Kapsel

Die Kapsel galt für lange Zeit als der einzig bestätigte Virulenzfaktor von S. suis. Sie ist vornehmlich aus Zuckern aufgebaut und bildet die Grundlage der Serotypisierung.

Hauptkomponenten dieses komplexen Oligosaccharidgerüstes sind Glukose, Galak- tose, N-Acetylglukosamin und Sialinsäure, wobei die Serotyp 1 Kapsel zusätzlich N- Acetylgalaktosamin, die Serotyp 2 Kapsel hingegen Rhamnose enthält (CHARLAND et al. 1995). Sialinsäure, als nicht-Zuckerbestandteil der Kapsel, konnte bis jetzt lediglich bei den Serotypen 1, 2, 14, 27 und 1/2 nachgewiesen werden (SMITH et al.

2000).

Die Inaktivierung der für den Kapselsyntheseapparat verantwortlichen Gene führte in zwei verschiedenen Infektionsmodellen mit dem Schwein zu einem totalen Verlust der Virulenz. Als Ursache dafür wird die in vitro ermittelte, erhöhte Phagozytoserate isogener Kapseldefizienzmutanten gegenüber porzinen Monozyten und alveolaren Makrophagen diskutiert (CHARLAND et al. 1998; SMITH et al. 1999). Da die Mehr- zahl der avirulenten Stämme aber auch in der Lage ist eine Kapsel auszubilden, bzw.

kapsellose hochvirulente Stämme existieren, ist von weiteren, Serotyp- übergreifenden Virulenzfaktoren auszugehen.

2.1.3.2 OFS

Mit dem Opazitätsfaktor von S. suis (OFS), ein Mitglied der MSCRAMM- (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) Familie, konnte kürzlich ein weiterer Virulenzfaktor identifiziert werden (BAUMS et al. 2006). Die N-terminale Signalsequenz und das C-terminale LPXTG-Motiv lassen vermuten, dass das Protein auf der bakteriellen Oberfläche lokalisiert ist. Der N-terminale Bereich zeigt darüber hinaus hohe Homologien zu dem Fibronektin-bindenden Oberflächenprotein (FnBA) von S. dysgalactiae und dem Serum-Opazitätsfaktor (SOF) von S. pyogenes. In Ü- bereinstimmung mit diesen führte rekombinantes OFS ebenfalls zu einer Trübung

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von equinem, porzinem und humanem Serum. Diese Serumtrübung ist wohl zurück- zuführen auf die Degradation von sog. „high-densitiy lipids“ (HDL), die in der Mani- festation der Infektion als anti-inflammatorische Faktoren eine Rolle spielen (WADHAM et al. 2004). Die Identifizierung von OFS als Virulenzfaktor von S. suis konnte in einem Infektionsversuch mit Schweinen nachgewiesen werden. Eine isogene ofs-Deletionsmutante war in ihrer Virulenz hochgradig attenuiert (BAUMS et al.

2006).

2.1.3.3 MRP und EF

Das muramidase-released protein (MRP) und der extracellular factor (EF) werden als sog. Virulenzmarker bezeichnet. Grund dafür ist ihr Vorkommen in hochvirulenten S. suis Serotyp 2 Stämmen, isoliert aus Organen erkrankter Schweine. Dagegen werden von den Tonsillen gesunder Schweine vornehmlich MRP/EF-negative Geno- typen isoliert (VECHT et al. 1991). Das MRP hat ein errechnetes Molekulargewicht von 136 kDa und ist auf Grund der N-terminalen Signalsequenz sowie des C- terminalen LPXTG-Motivs als Membran-assoziiertes Protein beschrieben worden (SMITH et al. 1992). WISSELINK et al. (2000) berichteten zudem von einer kleineren Variante des MRP Proteins (MRP^small), die insbesondere bei virulenten Serotyp 1 Stämmen isoliert werden konnte. Eine größere Variante (MRP*) wird dagegen zumeist beim Serotyp 9 nachgewiesen. Der EF besitzt keine Membranverankerung und wurde als sezerniertes Protein im Kulturüberstand identifiziert (VECHT et al. 1991). I.

d. R. hat EF ein Molekulargewicht von 110 kDa, kommt aber in fünf verschiedenen Größenvarianten (EF*) vor (SMITH et al. 1993). Homologievergleiche beider Proteine mit bekannten Virulenzfaktoren ließen keinen Schluss über eine mögliche Funktion zu. Die hohe Prävalenz MRP/EF-positiver Stämme in erkrankten Tieren lässt jedoch auf eine Beteiligung dieser Faktoren in der Pathogenese schließen. Ferner wurde EF als ein in vivo aufreguliertes Protein nachgewiesen (SMITH et al. 2001). Infektions- versuche mit MRP-, EF- und MRP/EF-negativen Deletionsmutanten zeigten allerdings keine Attenuation in der Virulenz, so dass ein diagnostischer Nachweis beider Faktoren lediglich als Hinweis eines erhöhten Virulenzpotentials des Erregers gedeu- tet werden kann (SMITH et al. 1996).

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2.1.3.4 Suilysin

Die Hämolyseaktivität von S. suis ist eine seit langem bekannte Eigenschaft (KLIPPER-BAELZ und SCHLEIFER 1987). JACOBS et al. (1994) identifizierten zum ersten Mal ein aus dem Kulturüberstand gewonnenes Protein von 54 kDa mit hämo- lytischer Aktivität. Sequenz- (SEGERS et al. 1998) und Proteinaktivitätsanalysen (JACOBS et al. 1994) charakterisierten dieses Suilysin (SLY) als einen Vertreter der Thiol-aktivierten Zytolysine (TACY). Epidemiologische Studien ergaben, dass SLY in nahezu allen Serotypen nachgewiesen werden kann (OKWUMABUA et al. 1999) und in dem in Europa dominierenden Serotyp 2 mit einer Prävalenz von 95 % auftritt (SEGERS et al. 1998). Dies gab Grund zu der Annahme, dass SLY in der Pathoge- nese von S. suis beteiligt sein könnte. In vitro Analysen zeigten, dass neutralisieren- de anti-SLY-Antikörper (α-SLY) den zytolytischer Effekt SLY-positiver Stämme auf Epithelzellen komplett inhibierten (NORTON et al. 1999). Ein Suilysin-abhängiger zytolytischer Effekt auf Epithel- (LALONDE et al. 2000), Endothel- (CHARLAND et al.

2000) und Immunzellen (SEGURA u. GOTTSCHALK 2002) konnte ebenfalls nachgewiesen werden. In vivo führte die Immunisierung mit rekombinantem SLY zu einer vollständigen Protektion gegen eine homologe experimentelle Infektion im Mausmo- dell (JACOBS et al. 1994). Infektionsversuche im Schwein mit einer SLY-defizienten Mutante führten hingegen nur zu geringer (ALLEN et al. 2001) oder überhaupt keiner Attenuation (LUN et al. 2003). Andererseits konnten Unterschiede im Zytokinprofil der Wirtsantwort beobachtet werden (LUN et al. 2003; SEGURA et al. 2006) was das Suilysin zwar nicht als essentiellen Virulenzfaktor, wohl aber als Virulenz-assoziiert charakterisiert.

2.1.3.5 Fibronektin- und Fibrinogen bindendes Protein und weitere Adhäsine Mittels in vivo Promotoranalysen konnte das Fibronektin- und Fibrinogen-bindende Protein (FBPS) als ein an der Pathogenese beteiligter Faktor nachgewiesen werden (SMITH et al. 2001). Sequenzanalysen ergaben hohe Homologien zu entsprechenden Fibrinogen-bindenden Proteinen von S. pneumoniae und S. gordonii. Das Prote- in erwies sich als immunogen und war in der Lage sowohl humanes Fibronektin als auch humanes Fibrinogen zu binden (DE GREEFF et al. 2002b). FBPS konnte bei

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allen Serotypen mit Ausnahme von Serotyp 32 und 34 nachgewiesen werden. Letz- tere wurden jedoch als S. orisratti klassifiziert (HILL et al. 2005). Eine Beteiligung des FBPS in der Pathogenese von S. suis wurde durch einen Kompetitionsinfektionsver- such im Schwein bestätigt. Während die Kolonisation der Tonsillen keine Unter- schiede zwischen dem WT und einer FBPS-defizienten Mutante zeigte, konnte bei erkrankten Schweinen der WT signifikant häufiger aus den Organen reisoliert werden (DE GREEFF et al. 2002b).

Die Adhärenzeigenschaften der Bakterien sind gerade im ersten Schritt der Patho- genese von ausgesprochener Wichtigkeit. Die Studien zu diesem Thema begannen mit den Arbeiten von KURL et al. (1989) sowie GOTTSCHALK et al. (1991). Letzterer konnte zeigen, dass S. suis in der Lage war, sowohl an gesunde als auch an er- krankte Lungengewebe zu adhärieren. Die Fähigkeit zur Adhärenz ging dabei einher mit der Dicke der Polysaccharidkapsel (GOTTSCHALK et al. 1991). Die hämaggluti- nierenden Eigenschaften von S. suis wurden erstmals von KURL et al. (1989) untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass die Agglutination von Erythrozyten durch Galakto- se, N-Acetylgalaktosamin und Sialinsäure inhibiert werden konnte. Weiterführende Untersuchungen von HAATAJA et al. (1993; 1996) identifizierten die Galα1-4Gal Bindung des auf Erythrozyten vorkommenden Trihexosyldceramids (GbO3) als Epi- top für Galaktose-abhänginge Agglutination. Das dafür verantwortliche Adhäsin wurde erstmals von TIKKANEN et al. (1995) charakterisiert. Es hat ein Molekulargewicht von 18 kDa und kommt auf Grund unterschiedlicher Bindungsspezifitäten in den zwei Varianten PO und PN vor. Darüber hinaus scheint es serotypübergreifend exprimiert zu werden (TIKKANEN et al. 1996). Das Adhäsin ist immunogen und induziert eine bakterizide Aktivität nach Passage in BALB/c Mäusen. Des Weiteren konnte eine Antiproportionalität zwischen der Expression der Kapsel und den hämagglutinieren- den Eigenschaften von S. suis nachgewiesen werden.

In diesem Zusammenhang konnten LIUKKONEN et al. (1992) die α2-3 Bindung aus dem N-Acetylneuraminyl-α2-3poly-N-Acetyllactosamin Glykan als Rezeptor für die Sialin-abhängige Hämagglutination von S. suis identifizieren.

QUESSY et al. (1997) identifizierten ein weiteres Adhäsin mit einem spezifischen Molekulargewicht von 39 kDa. N-terminale Ansequenzierung erbrachte eine hohe Homologie zu einer Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH). Da ein

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Vorkommen sowohl in virulenten als auch in avirulenten S. suis Stämmen gezeigt werden konnte, blieb die Beteiligung in der Pathogenese unklar. Die Supplementati- on von Albumin steigerte allerdings die Virulenz von S. suis im Mausmodell, so dass eine Interaktion zwischen dem Enzym und dem Albumin diskutiert wurde. Neben Al- bumin konnte auch eine Bindung an humanes sowie porzines Plasminogen gezeigt werden (JOBIN et al. 2004). Da aber der Verlust der GAPDH nur zu einer verringer- ten Plasminogenbindung führte, sind weitere Studien zur Interaktion mit der extrazel- lulären Matrix nötig. BRASSARD et al. (2001; 2004) konnten zeigen, dass die GAPDH von S. suis oberflächenassoziiert ist und neben der Rolle im glykolytischen Stoffwechsel auch als Adhäsin des respiratorischen Epithels fungiert.

2.1.3.6 Weitere Virulenz-assoziierte Faktoren

In diesem Abschnitt sollen nun die Faktoren zusammengefasst werden, die sich auf Grund ihrer Funktion oder ihrer Immunogenität als Virulenz-assoziiert qualifizieren.

FONTAINE et al. (2004) identifizierten eine DNase (SsnA), die auffallend häufig bei aus inneren Organen isolierten Stämmen aller Serotypen vorkam. Die Proteinse- quenz kodiert für eine N-terminale Signalsequenz und einen C-terminalen Membran- anker (LPKTG), was für eine extrazelluläre, membrangebundene Lokalisation spricht.

Funktionell scheint die Aktivität von SsnA an die Verfügbarkeit von Calcium und Magnesium gebunden zu sein und konnte durch Supplementation neutralisierender Antikörper inhibiert werden. Das Protein erwies sich darüber hinaus als ausgespro- chen immunogen. Die Rolle in der Pathogenese ist unklar. FONTAINE et al. (2004) gehen davon aus, dass die DNase-Aktivität Nukleotide für den zelleigenen Stoff- wechsel rekrutiert.

RevS ist ein Regulatorprotein, dass die Transformation von einem schwach virulenten zu einem hochvirulenten Stamm bedingen kann (SMITH et al. 2001). Der genaue Regulationsmechanismus ist unbekannt. Allerdings konnte gezeigt werden, dass RevS für die Repression von mindestens einem Gen verantwortlich ist (DE GREEFF et al. 2002a). Eine RevS-negative Deletionsmutante stellte sich als attenuiert in der Kolonisation der Tonsillen dar (DE GREEFF et al. 2002a).

OKWUMABUA u. CHINNAPAPAKKAGARI (2005) identifizierten ein Protein mit un- bekannter Funktion, dass in nahezu allen Serotypen zu finden ist. Sequenzanalysen

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ergaben ein Molekulargewicht von 38 kDa. Das Protein ist hochimmunogen und be- wirkt eine 100 %ige Protektion nach homologer Infektion im Schweineinfektionsmo- dell.

ALLEN et al. (2004) beschrieben erstmalig das Vorkommen einer Hyaluronat-Lyase (Hyl) in S. suis. Dabei handelt es sich um ein Enzym, das spezifisch die β-1-4 Bin- dung zwischen N-Acetylglukosamin und Glukoronat der Hyaluronsäure spalten kann.

Hyaluronsäure ist Bestandteil in vielen eukaryotischen Geweben, wie z.B. Synovia und Knorpel, und bildet einen Großteil der Extrazellularmatrix. Die Beteiligung von Hyl an der Pathogenese von S. suis ist unklar. Vorstellbar ist zum einen die Akquirie- rung von Kohlenstoffquellen, zum anderen kann es eine Rolle bei der Dissemination im Wirt spielen.

Ein hochimmunogenes Enzym wurde als Glutamat-Dehydrogenase von S. suis identifiziert (OKWUMABUA et al. 2001). Trotz fehlender N-terminaler Signalsequenz konnte das Protein auf der Zelloberfläche nachgewiesen werden. Eine mögliche Be- teiligung an der Pathogenese ist bisher unklar, jedoch konnte gezeigt werden, dass hochvirulente Serotyp 2 Stämme eine ebenfalls hohe Enzymaktivität aufwiesen.

Sortasen spielen in der Struktur und Funktion der Zellhülle grampositiver Bakterien eine große Rolle. Sie sind für die kovalente Bindung von Proteinen an die äußere Zellwand verantwortlich. OSAKI et al. (2002) identifizierten fünf solcher Sortasen (srtA-E) im Genom von S. suis. Zwei-D-Gelelektrophorese Studien des Oberflächen- profils ergaben, dass bei einer srtA negativen Mutante 15 Proteine im Vergleich zum Wildtyp signifikant herunterreguliert waren oder fehlten. Die Inaktivierung der anderen putativen Sortasen erbrachte allerdings keine Unterschiede (MARRAFFINI et al.

2006; OSAKI et al. 2002). Später konnte das Vorhandensein der Sortasen B-D jedoch mit der Ausbildung von Pili-Strukturen in S. pneumoniae in Verbindung ge- bracht werden (BAROCCHI et al. 2006). Da ein ähnliches Gencluster auch bei S. suis vorliegt, ist ebenfalls von der Fähigkeit des Erregers zur Bildung von Pili aus- zugehen.

Durch Transposonmutagenese konnte ein hyperhämolytischer S. suis Phänotyp ge- neriert werden (LUN u. WILLSON 2005). Sequenzanalysen ergaben, dass es sich bei dem defizienten Gen um die putative Mannose-Permease IID handelte (manN).

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Ein regulatorischer Einfluss des entsprechenden Proteins auf die Suilysin- Transkription wurde mittels gfp-Reporterstudien bestätigt.

Wasserstoffperoxid ist ein Nebenprodukt des aeroben Stoffwechsels, welches durch die Fenton-Reaktion in toxische Hydroxyl-Radikale umgewandelt werden kann. So- wohl PULLIAINEN et al. (2003; 2005) als auch KAUKO et al. (2004; 2006) konnten zeigen, dass das Dps-like peroxide resistance protein (Dpr) von S. suis in der Lage ist, zweiwertiges Eisen zu inkorporieren und so dessen Oxidation in der Fenton- Reaktion zu inhibieren. Diese Fähigkeit könnte Grundlage für die Wasserstoffpero- xidresistenz Katalase-negativer Streptokokken sein.

Des Weiteren konnten durch Eisen-Mangelbedingungen 18 und durch in vivo Kom- plementation 22 weitere, putativ Virulenz-assoziierte Gene identifiziert werden. Dazu gehörten unter anderem Regulatoren, Transporter- und Stoffwechselgene (SMITH et al. 2001). Eine mögliche Beteiligung an der Pathogenese von S. suis Infektionen ist in weiteren Studien zu klären.

2.2 Das Arginin Deiminase System

Das Arginin Deiminase System (ADS) ist ein kataboler Stoffwechselweg, der die Umsetzung von Arginin zu Ornithin katalysiert. Es besteht aus den drei Enzymen Ar- ginin-Deiminase (AD), Ornithin-Carbamoyltransferase (OCT) und Carbamat-Kinase (CK). Im ersten Schritt hydrolisiert die AD das Arginin. Dabei entstehen Citrullin und Ammoniak. Die OCT setzt das Citrullin mit anorganischem Phosphat (Pi) zu Ornithin und Carbamoylphosphat um. Bei der Übertragung des Phosphatrests von Carba- moylphosphat auf ADP durch die CK entstehen schließlich ATP, Ammoniak und Koh- lenstoffdioxid (Abbildung 1).

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-

Abbildung 1: Schematische Darstellung der enzymatischen Reaktionen des ADS.

Modifiziert nach GAMPER et al. (1991).

Das ADS ist im prokaryotischen Reich weit verbreitet. So konnte es z.B. bei Pseu- domonas spp., Bacillus spp., Oenococcus oeni, einigen Halobakterien, oralen Strep- tokokken und Milchsäurebakterien nachgewiesen werden (CASIANO-COLON u.

MARQUIS 1988; GAMPER et al. 1991; LUTHI et al. 1990; MAGHNOUJ et al. 1998;

RUEPP et al. 1995; RUEPP u. SOPPA 1996; TONON et al. 2001; VANDER WAUVEN et al. 1984; ZUNIGA et al. 1998). Aber auch bei einfachen, meist pathoge- nen Protisten wurde das ADS beschrieben (PALM et al. 2003). Die kodierenden Ge- ne arcA, arcB und arcC sind zumeist hochkonserviert und werden polycistronisch als arcABC Operon transkribiert (BARCELONA-ANDRES et al. 2002; BUDIN-VERNEUIL et al. 2006; GAMPER et al. 1991; MAKHLIN et al. 2007; ZUNIGA et al. 1998;

ZUNIGA et al. 2002b). Mit diesem Operon können zusätzliche Gene für putative Re- gulatoren, Antiporter oder Peptidasen assoziiert sein. Da die Regulation des ADS im folgenden Kapitel eingehend beschrieben wird und über die Peptidasen keine weiteren Studien vorliegen, wird im Folgenden nur auf den Arginin-Ornithin Antiporter ArcD eingegangen. Dieser wurde ausführlich bei Lactococcus (L.) lactis und Pseu- domonas (P.) aeruginosa beschrieben (BOURDINEAUD et al. 1993; DRIESSEN et al. 1987; VERHOOGT et al. 1992). Dabei handelt sich um ein transmembranales Protein, das bei P. aeruginosa aus 13 Helices besteht. Es ermöglicht den elektro- neutralen, stöchiometrisch ausgeglichenen Austausch von Arginin und Ornithin. E- nergie in Form von ATP ist dafür nicht notwendig. Man geht jedoch davon aus, dass der Austausch konzentrationsabhängig ist. Um diesen zu initiieren, muss es zu- nächst zu einer intrazellulären Akkumulation von Ornithin kommen. Dies ist, neben dem Katabolismus durch die AD, auch durch das Lysin-Transportsystem möglich,

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das gleichzeitig den Symport von H⁺ und Ornithin katalysiert (DRIESSEN et al.

1987). Die Bedeutung des ArcD von S. suis wird in dieser Arbeit näher untersucht.

2.2.1 Die physiologische Bedeutung und die Regulation des ADS

So hochkonserviert die Genanordnung des ADS bei den Prokaryoten ist, so hetero- log ist die Funktion und damit auch die Regulation. Als alternativer, ATP generieren- der Stoffwechselweg ist das ADS bei P. aeruginosa und Bacillus (B.) licheniformis ausführlich beschrieben. Bei Ersterem erfolgt die Induktion des ADS ausschließlich unter anaeroben Bedingungen (GALIMAND et al. 1991; GAMPER et al. 1991) und wird durch das Regulatorprotein ANR (anaerobic regulator of arginine catabolism and nitrate reduction), einem FNR-Homolog der CRP/FNR Familie von Transkriptionsre- gulatoren, vermittelt. ANR bindet im Promotorbereich des AD Operons 41,5 Bp stromaufwärts des Transkriptionsstartpunktes (TS) und ruft so die Transkriptionsin- duktion hervor, die durch die Addition von Arginin noch um das zwei- bis dreifache verstärkt werden kann (LU et al. 1999). Grund dafür ist die Bindung des Arginin Re- pressors ArgR 73,5 Bp stromaufwärts des TS. In diesem Kontext postulierten LU et al. (1999) ein Modell, in dem es zu einer Interaktion zwischen ANR und ArgR kommt, was wiederum zu einer erhöhten Stabilität des RNA-Polymerase-DNA-Komplexes führen soll.

Die Induktion des ADS erfolgt bei B. licheniformis ebenfalls in Abwesenheit von Sau- erstoff und dient so der anaeroben Energiegewinnung (MAGHNOUJ et al. 2000). In diesem Fall ist jedoch zusätzlich die Verfügbarkeit des Substrats Arginin notwendig (MAGHNOUJ et al. 1998). Die Sauerstoff-abhängige Regulation wird durch das Pro- tein ArcR, ebenfalls ein Mitglied der CRP/FNR Familie, vermittelt. Dieses bindet an eine palindrome Sequenz 65,5 Bp stromaufwärts des TS und führt zu einer Windung (bending) der DNA (MAGHNOUJ et al. 2000). Auf diese Weise könnte eine Interakti- on der RNA-Polymerase mit dem Arginin Repressor ArgR hergestellt werden, der ungewöhnlich weit (-108 Bp) stromaufwärts des TS bindet (MAGHNOUJ et al. 1998).

Das ADS von S. gordonii unterliegt der Katabolitrepression. In grampositiven Bakte- rien wird dies über das Catabolite control protein A (CcpA) vermittelt, das an spezifi- sche cre-sites (catabolite recognizing elements) bindet (DONG et al. 2004; ZENG et al. 2006). Grundlage der Katabolitrepression ist, dass in Anwesenheit der primären

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Energiequelle Glukose, andere, alternativ Energie synthetisierende Stoffwechselwe- ge unterdrückt werden. In diesem Zusammenhang wurde eine cre-site 28,5 Bp stromaufwärts des TS entdeckt, die die Bindungsstelle der RNA-Polymerase (-35 Region) überlagert. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass das ADS von S. gor- donii durch Argininsupplementation induzierbar ist (ZENG et al. 2006). Der verant- wortliche Repressor ArgR bindet dabei an eine Sequenz, die, anders als die oben angeführten Arginin Repressoren, keine Homologien zu der Bindungssequenz des Arginin Regulators von Escherichia coli aufweist und mit 28 Bp einen ungewöhnlich langen Bereich der DNA erkennt. Schließlich wird die Sauerstoff-abhängige Regula- tion auch bei S. gordonii durch ein Mitglied der CRP/FNR Familie (FLP) vermittelt.

Wie die drei angeführten Beispiele verdeutlichen, sind die effektivsten Stimuli der ADS Induktion Glukose, Sauerstoff und Arginin. Das konnte für eine Vielzahl von Bakterien, wie z.B. Enterococcus faecalis (BARCELONA-ANDRES et al. 2002), Lac- tobacillus sakei (ZUNIGA et al. 2002a), Clostridium (C.) perfringens (OHTANI et al.

1997) oder Staphylococcus aureus (MAKHLIN et al. 2007) bestätigt werden. Die Hie- rarchie ist dabei allerdings unterschiedlich aufgebaut. So mag es für ein homofer- mentatives Bakterium wie S. gordonii auf Grund einer unvollständigen Atmungskette von größerer Relevanz sein, durch ADS Induktion auf einen niedrigen Energiegehalt der Zelle auch unter aeroben Bedingungen zu reagieren, als bspw. P. aeruginosa, das als terminalen Elektronenakzeptor auch Nitrit bzw. Nitrat nutzen kann.

Einem besonderen Mechanismus scheint die Regulation des ADS von L. lactis zu unterliegen. Es konnte gezeigt werden, dass eine Erniedrigung des pH-Wertes von 7,0 auf 5,0 ausreicht, um eine Induktion der ADS Transkription hervorzurufen (BUDIN-VERNEUIL et al. 2006). Diese pH-Wert abhängige Regulation wurde bereits für orale Streptokokken diskutiert (CURRAN et al. 1995; CURRAN et al. 1998; ZENG et al. 2006), konnte aber experimentell bisher nicht belegt werden.

2.2.2 Das ADS als Überlebensfaktor bakterieller Erreger

Als Stoffwechselweg ist das ADS eingehend beschrieben. Das Wissen über eine Be- teiligung in der Pathogenese ist hingegen eher rudimentär. In oralen Streptokokken dient das während der Arginolyse durch das ADS gebildete Ammoniak dazu, die Bakterien vor sauren, glykolytisch bedingten pH-Werten zu schützen (CASIANO-

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COLON u. MARQUIS 1988). Dies gilt v. a. für Säure-sensitive Bakterien, wie bspw.

S. sanguis, die davon profitieren, dass ADS-positive Stämme, gerade in heterologen Biofilmen, den pH-Wert der Umgebung anheben können (CURRAN et al. 1995).

Die AD von S. pyogenes (syn. SAGP für streptococcal acid glycoprotein) wurde erstmals aus Zellextrakten isoliert, die das Wachstum verschiedener Tumorzelllinien inhibierten (YOSHIDA et al. 1987; YOSHIDA et al. 1998). In vivo konnte gezeigt werden, dass sich die Überlebenszeit von Mäusen mit einer Karzinom-verursachten As- citis nach intraperitonealer Applikation von SAGP deutlich verlängerte (YOSHIDA et al. 1991). DEGNAN et al. (1998) berichteten in weiterführenden Studien, dass SAGP auch für die Inhibierung der Proliferation und Apoptoseinduktion bei humanen peri- pheren Blutmonozyten (PBMC) verantwortlich ist. Sie führten dies u. a. darauf zu- rück, dass funktionelles SAGP den extrazellulären Argininspiegel senkt und somit das Substrat zur Bildung von Stickstoffmonoxid (NO) entzieht. NO ist bei Blutmono- zyten verantwortlich für die Neusynthese von DNA. DEGNAN et al. (2000) generier- ten erstmalig eine isogene sagp-defiziente Mutante. Wie für die oralen Streptokokken beschrieben, konnte auch in diesem Fall eine ADS-abhängige Protektion gegenüber sauren Bedingungen gezeigt werden. Darüber hinaus war das ADS essentiell für das Überleben in der frühen Phase der Invasion (DEGNAN et al. 2000).

Das Phänomen der SAGP-abhängigen Internalisation wurde von MAROUNI et al.

(2003) diskutiert. So führte die Defizienz im sagp Gen zu einer erhöhten Internalisati- onsrate der Streptokokken nach Co-Kultivierung mit humanen Epithelzellen. Grund dafür soll eine in den mutagenisierten Streptokokken schwächer ausgeprägte Transkription der Cystein-Protease SPEB sein. Diese wiederum ist dafür zuständig, Oberflächenmoleküle von der Zellwand abzuspalten und so der Internalisation durch Wirtszellen vorzubeugen (BERGE u. BJORCK 1995).

2.2.3 Das ADS von S. suis

Das ADS von S. suis wurde in einer vorangegangenen Dissertation als ein Tempera- tur-induziertes, Oberflächen-assoziiertes Enzymsystem identifiziert (WINTERHOFF et al. 2002) und molekularbiologisch (GRUENING et al. 2006) sowie epidemiologisch (SILVA et al. 2006) charakterisiert.

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Zur Identifizierung neuer Virulenzfaktoren von S. suis wurde das Proteom einer durch Hitzeschock gestressten Kultur analysiert und mit dem Expressionsprofil einer bei 32°C bebrüteten Kultur verglichen. Dabei konnten wiederholt zwei signifikant aufregulierte Proteine nachgewiesen werden. N-terminale Ansequenzierung und nachfol- gende Sequenzvergleiche identifizierten diese Proteine als zu 89 % homolog zu dem SAGP bzw. der OCT von S. pyogenes (WINTERHOFF et al. 2002). Elektronenmikro- skopische Untersuchungen mittels Immunogoldmarkierung sowie Western Blot Ana- lysen mit fraktionierten S. suis Lysaten wiesen auf eine Oberflächen-assoziierte Lo- kalisation der AD hin. Ähnliche Beobachtungen machte auch HONG (2006) für die AD von S. equi spp. zooepidemicus. Stoffwechselenzyme, die an der Oberfläche exprimiert als Adhäsin fungieren wurden in der Literatur u. a. für S. pneumoniae (HAMMERSCHMIDT 2006) und S. suis (BRASSARD et al. 2004) beschrieben. Dabei ist der Mechanismus des transmembranalen Transports auf Grund fehlender N- terminaler Signalsequenz und C-terminaler Verankerung bis heute nicht geklärt (CHHATWAL 2002). Da adhäsive Fähigkeiten bereits für die AD von S. pyogenes (MAROUNI et al. 2003) beschrieben wurden, darf auch im Fall der S. suis AD von einer Bifunktionalität des Enzyms ausgegangen werden.

Das ADS scheint sowohl für den Metabolismus als auch für die Pathogenese von S. suis Infektionen von ausgesprochener Wichtigkeit zu sein. Von 210 getesteten Isolaten konnte mittels Multiplex-PCR (MP-PCR) in 97,1 % aller Fälle das arcA Gen nachgewiesen werden (SILVA et al. 2006). Ob der homofermentative Metabolismus der Streptokokken und die Fähigkeit des ADS, sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen Energie zu produzieren die hohe Prävalenz des arcA Gens erklären, müssen weitere Studien zeigen. GRUENING et al. (2006) berichteten jedoch in diesem Zusammenhang, dass eine arcA-negative Deletionsmutante deutliche Wachstumsdefizite gegenüber dem Wildtyp zeigte.

Die Rolle des ADS von S. suis in der Pathogenese stellt die Grundlage dieser Arbeit dar. BENGA et al. (2004) lieferten dazu erste Ergebnisse, die zeigten, dass eine na- türlich ADS-negative Mutante nach Co-Kultivierung mit humanen Epithelzellen (HEp- 2) schneller abgetötet wurde als ein ADS-positiver Stamm. Da es sich bei der Mutan- te jedoch um einen avirulenten, genetisch nicht weiter charakterisierten Stamm han-

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delte, können heterologe Einflüsse durch andere Faktoren nicht ausgeschlossen werden.

GRUENING et al. (2006) lieferte erste Ergebnisse zur Regulation des ADS von S. suis. Sie konnten zeigen, dass die Gene des Enzymsystems polycistronisch als arcABC Operon transkribiert werden und einer endonukleolytischen Modifikation un- terliegen. Die enzymatische Aktivität der AD war, ähnlich der bei S. gordonii, durch Glukose reprimierbar und durch Arginin bzw. Anoxie induzierbar. Ursächlich für die Sauerstoff-abhängige Induktion könnte dabei das stromaufwärts des arcA Gens ge- legene flpS Gen sein. Dieses weist eine Homologie von 64 % zu dem flp von S. gor- donii auf. Darüber hinaus konnten weitere ADS-assoziierte Gene identifiziert werden.

Stromabwärts von arcC befindet sich ein OLR (arcD) mit 70 %iger Homologie zu einem putativen Arginin-Ornithin Antiporter von S. gordonii. Es konnte gezeigt werden, dass dieser, im Gegensatz zu P. aeruginosa, nicht Teil des AD Operons ist, wohl a- ber mit diesem co-transkribiert wird (Dissertation GRUENING 2004). Weiter strom- abwärts liegt eine putative Xaa-His Dipeptidase (arcT) mit einer Homologie von 71 % zum arcT Gen von S. gordonii. Ein OLR mit insgesamt 4259 Bp weist eine Homolo- gie von 69 % zu einer Endo-beta-galaktosidase C von C. perfringens auf. Eine Betei- ligung am ADS konnte bis jetzt bei keiner anderen Bakterienspezies beobachtet werden. Lediglich auf Grund der Lokalisation zwischen den für die Regulatorproteine kodierenden und das ADS umrahmenden Gene flpS und argR wurde die Bezeich- nung arcH gewählt. Wie bereits angeführt, wird das ADS von S. suis durch das argR Gen komplettiert. Es weist eine Homologie von 70 % zu dem Arginin Repressor (ArcR) von S. gordonii auf und ist als einziges der ADS Gene komplementär kodiert.

Eine Übersicht über das ADS von S. suis liefert Abbildung 2.

Abbildung 2: Die genetische Organisation des ADS von S. suis.

Stromabwärts des AD Operons (rot) befindet sich das für den putativen Arginin-Ornithin Antiporter kodierende Gen arcD (gelb). Das ADS wird von den OLR flpS und argR flankiert (blau), die für die gleichnamigen ADS-assoziierten Regulatoren kodieren. Das Gen für eine putative Xaa-His Dipeptida- se (arcT) und ein OLR (arcH) mit Homologien zu einer Endo-beta-galaktosidase C von C. perfringens sind in weiß dargestellt.

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2.3 Zielsetzung der Arbeit

S. suis ist ein sehr wichtiger Infektionserreger beim Schwein, der neben schweren klinischen Erkrankungen auch wirtschaftliche Schäden in Millionenhöhe verursacht.

Darüber hinaus gewinnt das zoonotische Potential von S. suis immer mehr an Be- deutung. Über die Pathogenese ist indes wenig bekannt.

In früheren Arbeiten konnte das Arginin Deiminase System von S. suis als ein Tem- peratur-induziertes, Oberflächen-assoziiertes Enzymsystem identifiziert werden. Ne- ben der Funktion im alternativen Energiestoffwechsel ist das ADS in der Literatur auch als ein putativer Virulenzfaktor beschrieben worden. Ziel dieser Arbeit war die molekularbiologische und funktionelle Charakterisierung des ADS von S. suis. Damit sollte ein Beitrag zur Aufklärung der biologischen Relevanz im Krankheitsgeschehen dieses wirtschaftlich bedeutenden bakteriellen Erregers erbracht werden.

Der erste Teil beschäftigt sich vornehmlich mit der transkriptionellen und translatio- nellen Antwort auf externe, möglichst wirtsnahe Stimuli. Dabei wird der Einfluss der assoziierten Regulatoren CcpA, FlpS und ArgR auf das ADS eingehend charakterisiert.

Im zweiten Teil werden die Mechanismen zur intrazellulären Persistenz anhand ADS- und assoziierter Regulatormutanten herausgearbeitet und in einem in vitro Infekti- onsmodell verifiziert. Dabei wird die Verfügbarkeit des Substrats Arginin auf die Funktionalität des Enzymsystems anhand von Mutagenesestudien im Arginin- Transportgen arcD untesucht.

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3 Material und Methoden

3.1 Chemikalien, Reagenzien, Geräte und Wachstumsmedien

Die in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien und Reagenzien stammten, wenn nicht durch Fußnoten gekennzeichnet, von SIGMA (Deisenhofen), MERCK (Darm- stadt) oder ROTH (Karlsruhe). Eingesetzte Enzyme einschließlich mitgelieferter Re- aktionspuffer, Protein- und DNA-Größenmarker wurden von INVITROGEN (Gronin- gen, Niederlande), Restriktionsendonukleasen von NEW ENGLAND BIOLABS (Frankfurt am Main) bezogen. In abweichenden Fällen erfolgte eine Kennzeichnung.

Die Herkunft verwendeter Kits und biologischer Zusätze ist durch Fußnoten im Text angegeben. Angeführte Wachstumsmedien und gekennzeichnete Puffer wurden vor Gebrauch bei 121°C und 1 bar Überdruck autoklaviert. Im Anhang befindet sich eine Auflistung der Verbrauchsmaterialien und Gerätschaften.

3.2 Bakteriologische Methoden 3.2.1 E. coli

Alle Klonierungsarbeiten wurden mit Hilfe des Escherichia coli (E. coli) Stammes DH5α [supE44 ∆lacU169 (Φ80lacZ ∆M15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1]

durchgeführt. Als Bestandteil des The Qiaexpressionist^TM1 Kits wurde zur Herstellung rekombinanter Proteine der E. coli Stamm M15 [pREP4], ein E. coli Stamm K12 De- rivat, mit folgendem Phänotyp verwendet: NaI^S, Str^S, Rif^S, Thi^–, Lac^–, Ara⁺, Gal⁺, Mtl^–, F^–, RecA⁺, Uvr⁺, Lon⁺.

3.2.1.1 Stammhaltung und Kultivierung

Alle E. coli Stämme wurden als Glycerinstocks bei -72°C gelagert. Dafür wurden 500 µl Bakterienkultur mit 500 µl 50 %iger [v/v] Glycerinlösung in A. bidest gemischt. Die Anzucht erfolgte auf Luria-Bertani- (LB)- Agarplatten (1 % [w/v] NaCl, 1 % [w/v] Bac-

1 QIAGEN, Hilden

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to-Trypton², 0,5 % [w/v] Hefeexktrakt, 1,5 % [w/v] Agar-Agar) bei 37°C für 12 – 14 h.

Auf festen Nährböden waren die Bakterien bis zu vier Wochen bei 4°C lagerbar. Zur Anzucht in Flüssigkultur wurden die Bakterien in LB-Medium bei 37°C und 120 Upm für 12 – 14 h in Schikane-Erlenmeyerkolben kultiviert. Falls erforderlich wurden Anti- biotika in folgenden Konzentrationen zugesetzt: Ampicillin 100 µg/ml, Erythromycin³ 100 µg/ml (bei der Kultivierung von E. coli mit dem Vektor pORI23 500 µg/ml), Ka- namycin 25 µg/ml, Spectinomycin 50 µg/ml.

3.2.2 S. suis

In dieser Arbeit wurde ausnahmslos der hochvirulente mrp/ef/sly/ofs-positive Serotyp 2 Stamm 10 bzw. die Kapsel-defiziente Mutante Stamm 10∆cpsEF::spcR verwendet (SMITH et al. 1999). S. suis Stamm 10 wurde aus einem an Meningitis erkrankten Schwein isoliert.

3.2.2.1 Stammhaltung und Kultivierung

Die Lagerung von S. suis Stämmen einschließlich aller Mutanten erfolgte ebenfalls in Glycerinstocks (500 µl 50 %ige [v/v] Glycerinlösung und 500 µl Bakterienkultur) bei - 80°C. Zur Anzucht auf festen Nährböden wurden die Bakterien auf Columbia- Blutagarplatten mit 6 % Schafblut⁴ bzw. 6 % Pferdeblut⁵ über Nacht bei 37°C bebrü- tet. Die kulturelle Anzucht erfolgte in Todd Hewitt broth⁶ (THB) stehend bei 37°C in Erlenmeyer-Kolben. Antibiotika wurden ggf. in folgenden Konzentrationen zugesetzt:

Chloramphenicol 8 µg/ml, Erythromycin 1 µg/ml (pORI23 5 µg/ml), Spectinomycin 100 µg/ml. Die Kultivierung der mutagenisierten Stämme erfolgte in den Übernacht- kulturen mit entsprechendem Antibiotikum.

2 DIFCO, Detroit, USA

3 FLUKA, Buchs, Schweiz

4 OXOID, Wesel

5 WDT, Serumwerk Memsen, Hoyerhagen

6 BD, New York, USA

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3.2.3 Kultivierungsbedingungen zur Untersuchung der ADS Expression Zur Untersuchung von Temperatur als Einfluss auf Wachstum und ADS Expression wurden 10 ml THB Medium mit einer S. suis Kolonie beimpft und für 12 – 14 h bei 32°C im Wasserbad kultiviert. Nach 1:15 Verdünnung in frischem THB Medium (100 ml) wurde die Kultur bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm (OD600) von 0,3 bebrütet, geteilt und für weitere 1 – 4 h bei 32°C bzw. 42°C im Wasserbad kultiviert.

Der Wachstumsverlauf wurde durch Bestimmung der Zellzahl anhand der OD600 do- kumentiert. Ggf. wurde der Sauerstoffgehalt des Mediums im Wachstumsverlauf mit Hilfe einer Sauerstoffelektrode nach Herstellerangaben gemessen. Zur Bestimmung des Glukosegehaltes im Wachstumsverlauf wurden nach 1 – 4 h jeweils 10 ml Bak- terienkultur abzentrifugiert (12000 Upm, 4°C, 10 min), der Überstand wurde sterilfiltriert (Porengröße: 0,2 µm), und der Glukosegehalt mit Hilfe des glucose (GO) assay Kits⁷ nach Herstellerangaben bestimmt. Anschließende Northern- bzw. Western Blot Analysen wurden, wie im Folgenden beschrieben, durchgeführt. Um den Einfluss von Wachstumsdauer und Glukosegehalt auf die ADS Expression auszuschließen, wurde S. suis Stamm 10 bis zu einer OD600 von 0,8 bei 32°C im Wasserbad bebrütet. Dabei wurde die Belüftung durch halbstündliches Schwenken des Erlenmeyerkolbens si- chergestellt. Nach Zugabe von 8 µg/ml Chloramphenicol (finale Konzentration) wurde die Kultur geteilt und für weitere 10 min bei 32°C bzw. 42°C im Wasserbad inkubiert.

Parallel wurde die OD600 und der Sauerstoffpartialdruck des Mediums mit Hilfe einer Sauerstoffelektrode zum Zeitpunkt des Temperaturwechsels und nach 10 min bestimmt. Die Auswertung der transkriptionellen Induktion erfolgte anhand von Northern Blot Analysen.

Zur Bestimmung der ADS Expression unter anoxischen Bedingungen wurden die Bakterien in einer Anaerobierkammer bebrütet. Zur Entgasung wurde frisch autokla- viertes THB Medium vor Beginn der Wachstumskinetik für 2 d in der Anaerobier- kammer inkubiert. Zehn ml Kulturmedium wurden mit einer Kolonie fraktioniert ausgestrichener Streptokokken beimpft und für 12 – 14 h bei 37°C bebrütet. Nach 1:15 Verdünnung in frischem Medium erfolgte eine Kultivierung von 8 h bei 37°C. Ggf.

wurden 50 mM Arginin-HCl zugesetzt. Die ADS Expression wurde durch Western

7 SIGMA, Saint Louis, USA

(34)

Blot Analysen ermittelt. Um den Einfluss der ständigen Verfügbarkeit von Sauerstoff auf die ADS Expression zu untersuchen, wurden 20 ml THB Medium mit einer Kolo- nie fraktioniert ausgestrichener Streptokokken beimpft und für 12 – 14 h bei 37°C bebrütet. Nach 1:15 Verdünnung in frischem THB Medium wurden die Bakterien bis zu einer OD600 von 0,3 kultiviert, geteilt und für weitere 3 h bei 37°C bebrütet. Dabei wurde die eine Hälfte als Standkultur, die andere als Schüttelkultur bei 250 Upm in einem Schikane-Erlenmeyerkolben kultiviert. Die Auswertung erfolgte durch Northern Blot Analysen.

Der Einfluss von Glukose auf Wachstumsverhalten und ADS Expression wurde durch die Kultivierung bei 32°C bzw 42°C in THB oder THB+ 1 % [w/v] Glukose untersucht. Dafür wurden die Bakterien für 12 – 14 h in 20 ml bei 32°C im Wasserbad kultiviert. Nach 1:15 Verdünnung in THB bzw. THB+ 1 % [w/v] Glukose wurden die Bakterien bis zu einer OD600 von 0,3 bebrütet, geteilt und für weitere 1 – 4 h bei 32°C bzw. 42°C kultiviert. Die Auswertung erfolgte durch Bestimmung der optischen Dichte bei 600 nm und Western Blot Analysen. Die Kultivierung unter Glukose-restriktiven Bedingungen erfolgte in Trypton-Hefeextrakt (3 % [w/v] Bacto-Trypton⁸, 0,18 % [w/v]

Hefeextrakt) Medium (TY). Als Kohlenstoffquelle diente 10 mM Galaktose (TY+Gal).

Ggf. wurden 50 mM Arginin-HCl zugesetzt. Die Bakterien wurden bei 37°C für 12 – 14 h in einem Kulturvolumen von 20 ml bebrütet. Nach einer Verdünnung auf eine OD600 von 0,01 bzw. 0,02 wurden die Streptokokken für bis zu 24 h bei 37°C kultiviert. Die Auswertung erfolgte je nach Indikation durch Western Blot Analysen, Be- stimmung der Zellzahl anhand der OD600 oder durch Bestimmung des Ammoniakge- haltes im Medium. Dieser wurde mit Hilfe des ammonia assay Kits⁹ zu den Zeitpunk- ten 0 h und 24 h nach Herstellerangaben gemessen. Durch Berechnung der Diffe- renz konnte die Ammoniakproduktion der Bakterien in 24 h bestimmt werden.

Der Einfluss von Arginin auf Wachstumsverhalten und ADS Expression wurde neben Western Blot Analysen, Wachstumskinetiken, Bestimmung des extrazellulären pH- Wertes im Kulturmedium und Ammoniakproduktion auch durch Fluoreszenzmessun- gen durchgeführt. Dafür wurden die das episomale gfp-Fusionskonstrukt tragenden Bakterien für 12 – 14 h in TY+Gal Medium mit 100 µg/ml Spectinomycin bei 37 °C

8 vgl. ²

9 SIGMA, Deisenhofen

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bebrütet. Nach 1:15 Verdünnung in frischem TY+Gal+ 100 µg/ml Spectinomycin Me- dium wurden die Bakterien für weitere 8 h bei 37°C kultiviert. Nach einer Zentrifugati- on (12000 Upm, RT, 2 min) wurden die sedimentierten Streptokokken mit 1 x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 6,5 mM Na2HPO4, 1,7 mM KH2PO4 pH 7,2) gewaschen und erneut zentrifugiert (12000 Upm, RT, 2 min). Die Ansätze wurden in 1 x PBS resuspendiert und mit 1 x PBS auf die geringste OD600 eingestellt. Die Promotoraktivi- tät des AD Operons wurde anhand der Fluoreszenz (Exzitation: 485 nm, Emission:

535 nm) bestimmt. Das promotorlose gfp Konstrukt diente dabei als Negativkontrolle.

Die GFP Expression wurde als relative Fluoreszenzintensität nach Abzug der Nega- tivkontrolle angegeben.

3.3 Molekularbiologische Methoden

3.3.1 Isolierung chromosomaler DNA aus S. suis

Zur Isolierung chromosomaler DNA wurden 10 ml THB Medium mit einer Bakterien- kolonie beimpft und bei 37°C für 12 – 14 h bebrütet. Die Kulturen wurden zentrifugiert (8000 Upm, 4°C, 15 min) und der Überstand verworfen. Die sedimentierten Strepto- kokken wurden in einem Exsikkator getrocknet, in 550 µl 2 x TEN mit Lysozym¹⁰ (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 150 mM NaCl, 10 mg/ml Lysozym) und 10 µl RNase A¹¹ (100 µg/ml) resuspendiert und folgend für 30 min bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Nach Zugabe von 15 µl 20 %igen [w/v] SDS und 10 µl Protei- nase K¹² (20 mg/ml) erfolgte ein weiterer Inkubationsschritt von 1 h bei 37°C im Wasserbad. 125 µl 4 M NaCl und 80 µl auf 50°C erhitztes CTAB wurden zugegeben, die Ansätze gemischt und für 10 min bei 65°C erhitzt. Zur Trennung der DNA von denaturierten Proteinen wurden die Ansätze mit 780 µl Chloroform/Isoamylalkohol in einem Verhältnis von 24:1 versetzt und bis zu einer homogenen Trübung vorsichtig gemischt. Nach einer Zentrifugation (12000 Upm, 4°C, 5 min) wurde der durchsichti- ge, visköse Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt und in einem weiteren

10 MERCK, Darmstadt

11 ROTH, Karlsruhe

12 MERCK, Darmstadt

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Reinigungsschritt mit 780 µl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) versetzt.

Nach einer erneuten Zentrifugation (12000 Upm, 4°C, 5 min) und Abnahme des Ü- berstandes wurde dieser in einem neuen Reaktionsgefäß zur DNA Fällung mit 500 µl 100 %igem [v/v] Isopropanol gemischt und zentrifugiert (12000 Upm, 4°C, 30 min).

Die sedimentierte DNA wurde mit 500 µl 80 %igem [v/v] Ethanol gewaschen, zentrifugiert (12000 Upm, 4°C, 5 min) und nach Abnahme des Überstandes im Exsikkator getrocknet. Nach Resuspension in 50 µl TE Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0, autoklaviert) wurde die DNA Konzentration spektralphotometrisch bestimmt und bei -20°C gelagert.

3.3.2 Isolierung episomaler DNA aus S. suis

Die Isolierung episomaler DNA aus S. suis erfolgte mit Hilfe des PureYield^TM Midi- prep Systems¹³ mit leichten Modifikationen. Dafür wurden 50 ml THB Medium mit einer Bakterienkolonie beimpft und für 12 – 14 h bei 37°C stehend kultiviert. Nach einer Zentrifugation (8000 Upm, 4°C, 10 min) wurden die sedimentierten Bakterien in 3 ml der vom Hersteller mitgelieferten Cell Resuspension Solution resuspendiert. Es folgte die Zugabe von Lysozym¹⁴ (10 mg/ml) und eine Inkubation von 30 min bei 37°C im Wasserbad. Der weitere Verlauf der Präparation erfolgte exakt nach Herstel- lerangaben. Die aufgereinigte Plasmid-DNA wurde bis zum Gebrauch bei -20°C gelagert.

3.3.3 Isolierung episomaler DNA aus E. coli

Zur Präparation kleinerer Mengen episomaler Plasmid DNA aus E. coli (bis 10 ml Bakterienkultur) wurde die modifizierte Methode nach BIRNBOIM u DOLY (1979) durchgeführt. Dafür wurden die Bakterien in LB Medium mit entsprechendem Antibio- tikum für 12 – 14 h bei 37°C schüttelnd (120 Upm) kultiviert. Zwei ml Bakterienkultur wurden in ein neues Reaktionsgefäß überführt und für 2 min bei 12000 Upm und Raumtemperatur (RT) zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und die sedi-

13 PROMEGA, Mannheim

14 vgl. ¹⁰

(37)

mentierten Zellen wurden mit 100 µl GET Puffer (25 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM Glukose, 10 mM EDTA pH 8,0, sterilfiltriert) und 2 µl RNase A¹⁵ (100µg/ml) resuspendiert. Die Isolierung der Plasmid-DNA erfolgte durch Zugabe von 200 µl Na- OH/SDS-Lösung (0,2 N NaOH, 1% [w/v] SDS). Dadurch kommt es zu einer starken Alkalisierung des Ansatzes, was zu einer Denaturierung nicht-überspiralisierter DNA führt. Die Proben wurden für max. 5 min auf Eis inkubiert. Durch Zugabe von 150 µl K-Acetat-Lösung (3 M Kaliumacetat, 11,5 % [v/v] Eisessig) wurde der Ansatz wieder neutralisiert. Die denaturierten DNA Stränge verbinden sich dadurch zu einem unlös- lichen Gemisch, dass nach einer Inkubationszeit von 3 min auf Eis durch Zentrifuga- tion (12000 Upm, RT, 5 min) abgetrennt werden kann. Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und die DNA durch Zugabe von 100 %igem Ethanol [v/v] und Inkubation für 2 min bei RT ausgefällt. Das DNA-Ethanol Gemisch wurde für 5 min bei RT und 12000 Upm zentrifugiert, der Überstand verworfen und die sedimentierte DNA mit 80 %igem [v/v] Ethanol gewaschen. Nach einem weiteren Zentri- fugationsschritt (12000 Upm, RT, 5 min) wurde die sedimentierte DNA im Exsikkator getrocknet. Die Resuspension erfolgte in 30 µl A. bidest und die Lagerung bei -20°C.

Die Isolierung kleiner Mengen Plasmid DNA zur Transformation in elektrokompetente S. suis Zellen wurde mit dem NucleoSpin^®Plasmid Kit¹⁶ nach Herstellerangaben durchgeführt.

Zur Isolierung größerer Mengen DNA (Bakterienkulturen über 50 ml) wurde entweder das NucleoBond AX^® PC 100 Kit¹⁷ oder das PureYield^TM Midiprep System¹⁸ verwendet. Der Gebrauch erfolgte nach Herstellerangaben.

15 vgl. ¹¹

16 MACHEREY-NAGEL, Düren

17 MACHEREY-NAGEL, Düren

18 vgl. ¹³

(38)

3.3.4 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung bakterieller Nuklein- säuren mittels Ultraviolett-(UV)-Absorptionsspektrometrie

Die Konzentration von DNA und RNA wurde spektralphotometrisch nach SAMBROOK (2001) bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt. Dafür wurden die Nukleinsäuren je nach erwarteter Menge 1:50 oder 1:100 in A. bidest verdünnt. Die Messung erfolgte in einer Mikrometerquarzküvette gegen A. bidest als Standard. Das Verhältnis der Absorption bei 260 nm und 280 nm (A260/A280) gibt darüber hinaus Aufschluß über den Reinheitsgehalt der Präparation. Liegt dieser Quotient unter einem Wert von 1,8, ist von einer Verunreinigung durch Proteine oder Phenol auszugehen.

3.3.5 Klonierungen

3.3.5.1 Restriktion

Zur Restriktion chromosomaler und episomaler DNA wurden in dieser Arbeit aus- schließlich Restriktionsendonukleasen des Typs II verwendet. Diese spalten die DNA an bestimmten, Enzym-eigenen Erkennungssequenzen und produzieren so entweder glatte Enden (blunt ends) oder Enden mit Nukleotid-Überhängen (sticky ends).

Die Überhänge bestehen dabei meist aus 2 - 8 Nukleotiden, die sowohl auf dem komplementierenden als auch auf dem komplementären Strang der DNA vorkommen können. Die meisten Restriktionsendonukleasen arbeiten bei einem pH-Wert von 7,4, benötigen aber unterschiedliche Ionenstärken und Mg²⁺-Konzentrationen.

Entsprechende Bedingungen wurden im Restriktionsverdau durch vom Hersteller mitgelieferte Reaktionspuffer erreicht. Zur Restriktion von 1 µg DNA wurde 1 U En- zym eingesetzt. Falls nicht anders angegeben, erfolgte die Inkubation für 1 – 3 h bei 37°C. Zur Restriktion chromosomaler DNA wurden die Reaktionsansätze für 12 - 14 h bei 37 °C im Wasserbad inkubiert.

3.3.5.2 Agarose-Gelelektrophorese

Zur Auswertung von Restriktions- oder PCR-Analysen bedient man sich der Agaro- se-Gelelektrophorese. Die Methode beruht auf der negativen Eigenladung der DNA,