Arginin und die Regulation durch den Arginine Repressor (ArgR)

4.1.4.1 Arginin

Wie in der Einleitung bereits näher erläutert (MAGHNOUJ et al. 1998; ZENG et al.

2006), hat Arginin als natürliches Substrat ebenfalls einen Einfluss auf die Regulation des ADS. Um dieses Phänomen bei S. suis näher zu untersuchen, wurden gfp-Reporterstudien durchgeführt. Dafür wurde der Promotor des AD Operons transkrip-tionell vor das green fluorescence protein (gfp) Allel gfpmut3* fusioniert. Dieses Kon-strukt wurde dann in den Shuttlevektor pGA14spc (SMITH et al. 1995) kloniert und episomal in S. suis Stamm 10 transformiert. Als Negativkontrolle dienten Streptokok-ken, die das promotorlose gfp Gen episomal auf dem pGA14spc Vektor trugen. Um Effekte bedingt durch die Katabolitrepression auszuschließen, wurden die Bakterien in einem auf Trypton-Hefeextrakt basierenden Minimalmedium mit 10 mM Galaktose (TY+Gal) als nicht-reprimierenden Zucker kultiviert (DONG et al. 2004). Als Induktor wurde bei Bedarf 50 mM Arginin zugesetzt. Die Streptokokken wurden über Nacht in TY+Gal bei 37°C bebrütet, 1:15 in frischem Medium verdünnt und für weitere 8 h bei 37 °C kultiviert. Die OD600 wurde bestimmt und auf die geringste optische Dichte der kultivierten Stämme eingestellt. Nach einem Zentrifugationsschritt wurden die Bakte-rien zweimal mit PBS gewaschen und anschließend in PBS aufgenommen. Die Pro-motoraktivität wurde durch die Messung der Fluoreszenz bestimmt. In Abbildung 14 ist die GFP Expression nach Abzug der Negativkontrolle als relative Fluoreszenzakti-vität dargestellt. Ein Vergleich der Kultivierungsansätze mit (+) und ohne (-) Arginin zeigte eine Verstärkung der relativen Fluoreszenzintensität um den Faktor 1,5.

Die Ergebnisse verdeutlichten, dass Arginin auch bei S. suis zu einer Verstärkung der Promotoraktivität des AD Operons führt.

Abbildung 14: Arginin-abhängige Promotoraktivität des AD Operons.

Eine transkriptionelle Fusion zwischen dem AD Promotor und dem promotorlosen gfpmut3* Allel (pGA14spc-ADfusion) wurde episomal in S. suis Stamm 10 transformiert. Die Bakterien wurden darauf-hin für 8 h bei 37°C in TY+Gal ohne (-) oder mit (+) 50 mM Arginin bebrütet. Das Ergebnis ist als rela-tive Fluoreszenzintesität nach Abzug der Negativkontrolle (promotorlose gfp-Kassette) dargestellt.

4.1.4.2 Der Arginine Repressor (ArgR)

Wie im vorherigen Abschnitt ersichtlich wurde, verstärkt sich die Transkription des ADS in Anwesenheit von Arginin. Von anderen Bakterien ist bekannt, dass diese Ak-tivierung durch ein Regulatorprotein aus der Arginine Repressor Familie bedingt wird.

GRUENING et al. (2006) identifizierten am 3´ Ende des ADS einen OLR mit 70 %iger Homologie zum arcR von S. gordonii. Von dem entsprechenden Protein ist bekannt, dass es im Promotorbereich des ADS bindet und dort eine Arginin-abhängige Transkriptionsaktivierung hervorruft (ZENG et al. 2006).

Die Funktion des ArgR von S. suis wurde zunächst durch eine Insertionsmutante (Stamm 10∆argR) untersucht. Die Stämme WT, 10∆flpS, 10∆argR, 10∆arcABC und die Doppelmutante 10∆flpS∆argR wurden über Nacht in der Anaerobierkammer bei 37°C bebrütet, dann 1:15 verdünnt und für weitere 8 h unter anaeroben Bedingungen in THB bzw. THB+ 50 mM Arginin kultiviert. Es wurden Ganzzelllysate hergestellt, und das Expressionsprofil wurde im Western Blot mit Hilfe von Anti-OCT-Antikörpern analysiert. Abbildung 15 zeigt eine Induktion der ADS Translation beim WT, die sich in Anwesenheit von Arginin noch verstärkte (Spur 1, 2). Sowohl bei der flpS-, als auch bei der argR-, und der Doppelmutante blieb diese Induktion aus und es konnte

lediglich eine basale Expression beobachtet werden, die sich, im Gegensatz zum WT, durch Arginin nicht verstärken ließ (Spur 3-6, 9-10). Als Negativkontrolle diente der ADS-defiziente Stamm 10∆arcABC, dessen Lysatpräparation, wie erwartend, kein Signal im Western Blot mit Anti-OCT-Antikörpern zeigte (Spur 7, 8).

Abbildung 15: Einfluss des ADS und ADS-assoziierter Regulatoren auf die Arginin-abhängige ADS Expression.

S. suis Stamm 10 sowie die Mutanten 10∆flpS, 10∆argR, 10∆arcABC und 10∆flpS∆argR wurden an-aerob für 8 h bei 37°C bebrütet. Soweit angegeben, wurde 50 mM Arginin supplementiert. 10 ml Bak-terienkultur wurden geerntet, lysiert und jeweils 10 µg Ganzzelllysat auf eine PVDF Membran transfe-riert. Die Auswertung des Western Blots erfolgte durch Anti-OCT-Antikörper (α-OCT). Die kreuzreakti-ve, unspezifische Bande (*) zeigt, dass vergleichbare Mengen an Ganzzelllysat aufgetragen wurden.

Dieses Ergebnis konnte durch das bereits beschriebene gfp-Reporterkonstrukt, dass episomal sowohl in die flpS- als auch in die argR Mutante transformiert wurde, bestä-tigt werden (Abbildung 16).

Abbildung 16: Einfluss der argR und flpS Defizienz auf die Promotoraktivität des AD Operons.

S. suis Stamm 10 sowie die Mutanten 10∆flpS und 10∆argR mit dem Fusionskonstrukt pGA14spc -ADfusion wurden für 8 h bei 37°C in TY+Gal mit (weiße Balken) bzw. ohne (schwarze Balken) 50 mM Arginin bebrütet. Das Ergebnis ist als relative Fluoreszenzintesität nach Abgzug der Negativkontrolle (promotorlose gfp-Kassette) dargestellt.

Um eine gegenseitige Abhängigkeit in der Transkriptionsregulation von ArgR und FlpS auszuschließen, wurde eine Wachstumskinetik durchgeführt. Dazu wurden die Bakterien (WT Stamm 10, 10∆argR und 10∆flpS) über Nacht bei 37°C in THB Medi-um bebrütet, 1:15 verdünnt und bis zu einer OD600 von 0,3 (Zeitpunkt 0) bei 32°C kultiviert. Nach Teilung der Kultur und Temperaturwechsel auf 42°C, erfolgte die Probenentnahme, indem 10 ml Bakterienkultur nach 1 und 2 h entnommen wurden.

Die Auswertung der Northern Blot Analysen erfolgte mit Hilfe der arcB und flpS spe-zifischen Gensonden (Abbildung 17). Deutlich war hier wieder eine Induktion der ADS Transkription bei dem bei 42°C bebrüteten WT nach einer Inkubationszeit von 2 h zu erkennen (Spur 8). Weder Stamm 10∆argR noch 10∆flpS waren in der Lage, die Transkription des ADS bei 32°C oder 42°C zu induzieren (Spur 3-6, 9-12). Die Aus-wertung mit der flpS spezifischen Gensonde brachte Aufschluss darüber, dass sich ArgR und FlpS nicht gegenseitig transkriptionell beeinflussten. Die flpS mRNA der argR Mutante war im Vergleich zum WT weder auf- noch abreguliert (Spur 1-4, 7-10). Das bedeutet, dass unter den getesteten Bedingungen, also abhängig von Tem-peratur, Wachstumsdauer bzw. Zellzahl, Glukosekonzentration und Sauerstoffgehalt, keine transkriptionelle Regulation des flpS Gens erfolgt, so dass von einer konstituti-ven Transkription auszugehen ist.

Abbildung 17: Transkriptionelle Interaktion der ADS-assoziierten Regulatormutanten 10∆argR und 10∆flpS.

S. suis Stamm 10, 10∆argR und 10∆flpS wurden in THB Medium bei 32°C bis zu einer OD600 von 0,3 kultiviert, geteilt und bei 32°C bzw. 42°C für weitere 2 h kultiviert. Nach 1 und 2 h wurden jeweils 10 ml Bakterienkultur entnommen, um gRNA zu präparieren. Nach dem Transfer auf eine Nitrozellulose-membran erfolgte die Auswertung des Northern Blots mit Hilfe einer arcB bzw. flpS spezifischen Gen-sonde. Der Mengenabgleich konnte durch die 16S bzw. 23S ribosomale rRNA gewährleistet werden.

Durch einen electrophoretic mobility shift assay (EMSA) sollte festgestellt werden, ob es zu einer Interaktion zwischen dem ArgR Protein und der Promotorregion des AD Operons kommt. ArgR konnte als his-tag Fusionsprotein mit Hilfe des The Qiaexpressionist^TM Kits gewonnen werden. Zur Bestimmung der DNA-Erkennungssequenz des Regulators wurden unterschiedliche PCR-Fragmente des AD Promotorbereichs eingesetzt (Abbildung 18). Auf diese Weise konnte der Bereich der ArgR Bindung auf 74 Bp (Position -147 bis -73 vom TS) eingegrenzt werden.

ZENG et al. (2006) konnten durch DNA protection assays zeigen, dass das ArgR von S. gordonii einen 28 bp langen Bereich schützt, der weder für Regulatorproteine typi-sche palindrome Sequenzabschnitte noch Homologien zur Konsensussequenz des E. coli ArgR aufweist. Ein Vergleich zwischen der Erkennungssequenz des ArgR von S. gordonii mit dem Promotorbereich von S. suis ergab jedoch keine weiteren Aus-künfte über die genaue Bindungsstelle des S. suis ArgR (Daten nicht gezeigt).

Abbildung 18: Lokalisation der ArgR Bindung im Promotorbereich des AD Operons.

A: Zur Eingrenzung der Bindungsstelle von ArgR wurden mittels PCR unterschiedlich lange Fragmen-te (1 – 5) aus dem Promotorbereich des AD Operons amplifiziert. Die SigmafaktorbindungssFragmen-tellen (TATA) und (-35) sind als schwarze Balken, die putativen Bindungsstellen von FlpS (-65,5) und CcpA (-42,5) als blaue Balken dargestellt. Transkriptions- (+1, roter Pfeil) und Translationsstartpunkt (ATG) sowie das Stoppkodon des flpS (TGA) Gens sind angeführt.

B: Zur Eingrenzung der ArgR Bindungsstelle wurden die in A beschriebenen Amplifikate (1 – 5) mit (+) bzw. ohne (-) ArgR inkubiert. Die Auswertung erfolgte mittels electrophoretic mobility shift assay in einem 5 %igen Polyacrylamidgel nach Ethidiumbromidfärbung.

Diese Ergebnisse verdeutlichten, dass ArgR ein Regulator des ADS ist und in der Promotorregion des Operons bindet. ArgR ist, wie das FlpS, offensichtlich essentiell für die vollständige Induktion des ADS. Eine transkriptionelle Abhängigkeit der Regu-latoren konnte hingegen ausgeschlossen werden.

Aus diesem Kapitel ist abzuleiten, dass das ADS von S. suis durch eine Vielzahl ex-terner Stimuli reguliert wird. Offenbar erfolgt eine proportionale Induktion zur Zellzahl, die sich in Anwesenheit von Arginin noch verstärken lässt. Umgekehrt proportional hingegen verhält sich die Induktion des ADS zum Glukosegehalt und zum Sauer-stoffpartialdruck der Umgebung. Zusammenfassend lässt sich also eine Korrelation zwischen der stationären Wachstumsphase, in der sowohl der Glukosegehalt als auch der Sauerstoffgehalt niedrig, die Zellzahl jedoch hoch ist, und der ADS Expres-sion erkennen. Darüber hinaus sind die Regulatoren FlpS und ArgR essentiell für die Induktion des Enzymsystems. CcpA übt zwar eine repressorische Wirkung auf das ADS aus, ist aber für die Induktion in der stationären Phase nicht zwingend erforder-lich.

4.2 Die Rolle des ADS als Virulenz-assoziierter Faktor von S. suis