Glukose und die Regulation durch das Catabolite control protein A

4.1.2.1 Glukose

Wie im vorherigen Abschnitt beschrieben, verlief die Expression des ADS proportio-nal zur Zellzahl und erfolgte bei höherer Kultivierungstemperatur früher. Um nun ei-nen möglichen Zusammenhang zwischen der Kultivierungstemperatur bzw. der Zell-zahl und dem Glukosegehalt des Mediums zu untersuchen, wurden die Streptokok-ken, wie oben bereits beschrieben, bebrütet. Zehn ml Bakterienkultur wurden bis 4 h nach dem Temperaturwechsel stündlich entnommen. Der Überstand wurde daraufhin sterilfiltriert und die Glukosekonzentration mit Hilfe des glucose (GO) assay Kits (Sig-ma) nach Herstellerangaben bestimmt. Wie in Abbildung 5B ersichtlich, war die Glu-kosekonzentration 1 h nach Temperaturwechsel in der 32°C und 42°C Kultur durch-aus vergleichbar (73,4 µg/µl bzw. 73,8 µg/µl). Bereits 2 h nach dem Wechsel sank die Konzentration in der 42°C Kultur um das 15-fache auf ca. 4,5 µg/µl, während in der 32°C Kultur nur ein Rückgang auf 48,7 µg/µl zu verzeichnen war. Dies war genau der Zeitpunkt, an dem im Western Blot bereits eine vollständige Induktion des ADS der bei 42°C bebrüteten Streptokokken erkennbar war (Abbildung 2, Spur 4). Die Induktion der OCT, und damit des ADS, erfolgte bei 32°C 3 h nach dem Tempera-turwechsel (Abbildung 4). Zu diesem Zeitpunkt enthielt das Medium noch eine Glu-kosekonzentration von 7,5 µg/µl.

Um zu überprüfen, ob das ADS von S. suis der Katabolitrepression unterliegt, wur-den Übernachtkulturen 1:15 in THB und THB+1 % Glukose verdünnt und bei 32°C bis zu einer OD600 von 0,3 kultiviert. Der weitere Ablauf des Experiments erfolgte wie oben bereits beschrieben. Ohne Glukosezusatz konnte im Western Blot mit Hilfe von Anti-OCT-Antikörpern eine Expression des ADS für die bei 42°C bebrüteten Strepto-kokken nach 2 h (Spur 7), bei einer Kultivierungstemperatur von 32°C nach 3 h (Spur 9) beobachtet werden. Mit Glukosezusatz war eine abgeschwächte Induktion des ADS sowohl bei einer Kultivierungstemperatur von 32°C (Spur 14) als auch von 42°C (Spur 16) erst 4 h nach dem Temperaturwechsel erkennbar (Abbildung 6).

Abbildung 5: Temperatur-abhängiger Glukoseverbrauch im Wachstumsverlauf.

A: S. suis Stamm 10 wurde in THB Medium bei 32°C bis zu einer OD600 von 0,3 (0) bebrütet. Die Kul-tur wurde geteilt und bei 32°C (●- -●) bzw. 42°C (■─■) für weitere 4 h kultiviert. Der Wachstumsverlauf wurde durch Bestimmung der Bakterienzahl anhand der optischen Dichte bei 600 nm 1 – 4 h nach Temperaturwechsel bestimmt.

B: 1-4 h nach Temperaturwechsel wurden 10 ml Bakterienkultur abzentrifugiert. Der Überstand wurde sterilfiltriert und der Glukosegehalt der 32°C (schwarze Balken) bzw. 42°C Kultur (weiße Balken) be-stimmt.

Abbildung 6: Glukose- und Temperatur-abhängige Expression des ADS.

S. suis Stamm 10 wurde bei 32°C in THB oder THB+ 1 % Glukose bis zu einer OD600 von 0,3 bebrü-tet, geteilt und bei 32°C bzw. 42°C weiterkultiviert. 1 – 4 h nach Temperaturwechsel wurden 10 ml Bakterienkultur entnommen und lysiert. 5 µg Ganzzelllysat wurden auf eine PVDF-Membran geblottet.

Die Expression des ADS wurde mit Hilfe von Anti-OCT-Antikörpern (α-OCT) ermittelt. Die kreuzreakti-ve, unspezifische Bande (*) zeigt, dass vergleichbare Mengen an Ganzzelllysat aufgetragen wurden.

Daraus lässt sich folgern, dass die Induktion des ADS sowohl proportional zur Zell-zahl als auch proportional zur sinkenden Glukosekonzentration in der Umgebung ist.

Ein repressiver Effekt der Glukose spricht dafür, dass das ADS von S. suis der Kata-bolitrepression unterliegt.

4.1.2.2 Das Catabolite control protein A (CcpA)

Die Katabolitrepression wird in grampositiven Bakterien durch das „Catabolite control protein A“ (CcpA) vermittelt. In Anwesenheit von Glukose als bevorzugte Energie-quelle bindet CcpA an spezifische Transkriptionsfaktorbindungsstellen [cre-sites (ca-tabolite responsive element)] und vermittelt, je nach Lage der cre-sites, entweder eine Aktivierung oder eine Reprimierung der Transkription. Der Promotorbereich des AD Operons von S. suis beinhaltet eine Sequenz mit nahezu 93 %iger Homologie zur Konsensussequenz der CcpA Bindungsstelle grampositiver Bakterien (TGWAARCGYTWNCW) 42 Bp stromaufwärts des TS (Abbildung 7). Um nun den Effekt dieses Regulators auf die ADS Transkription zu studieren, wurde eine Inserti-onsmutante im ccpA Gen mit Hilfe einer Erythromycin Resistenzkassette hergestellt.

Die Überprüfung der Insertion erfolgte mittels PCR und Northern Blot Analysen (Da-ten nicht gezeigt). Zur Charakterisierung wurden dann der Wildtyp (WT) S. suis Stamm 10 und die Mutante Stamm 10∆ccpA über Nacht bei 37°C in THB Medium bebrütet und am darauf folgenden Tag 1:15 in THB Medium verdünnt. Zum besseren Vergleich mit den vorher beschriebenen Ergebnissen wurden die Bakterien bei 37°C bis zu einer OD600 von 0,3 (Zeitpunkt 0) kultiviert. Nach weiteren 1 – 3 h wurden 10 ml Kultur entnommen und daraus gRNA präpariert. Zur Auswertung des Northern Blot Experiments wurde der Filter mit einer arcB spezifischen Gensonde hybridisiert (Abbildung 8). Beim WT konnte eine Repression der Transkription in der mittleren logarithmischen Phase (Spur 1) und eine vollständige Induktion des AD Operons in der stationären Phase beobachtet werden (Spur 5). Bei der Mutante blieb die Re-pression in der mittleren logarithmischen Phase aus (Spur 2). Es war vielmehr eine schwache Transkription sichtbar, die sich proportional zur Zellzahl verstärkte (Spur 4). In der stationären Phase war ebenfalls eine starke Induktion des AD Operons zu beobachten (Spur 6). Bei einem Vergleich mit der vollständigen Induktion des WT

(Spur 5), war jedoch deutlich zu erkennen, dass die Intensität des Signals, und damit die Transkription bei Stamm 10∆ccpA, abgeschwächt war.

Abbildung 7: In silico Analyse des Promotorbereichs des AD Operons.

Der mittels 5´RACE ermittelte Transkriptionsstartpunkt (+1, roter Pfeil) wurde 79 Bp stromaufwärts des AD Translationsstartpunktes (ATG) identifiziert. Des Weiteren konnten die Sigmafaktorbindungsstellen der RNA-Polymerase 10 (TATA) bzw 35 (-35) Bp stromaufwärts von +1 identifiziert werden und sind als schwarze Balken dargestellt. Die mittels Sequenzanalysen ermittelten, putativen Bindungsstellen für FlpS (-65,5) und CcpA (-42,5) sind als blaue Balken hervorgehoben. Ein Vergleich der Sequenz mit den Konsensussequenzen der DNA-Bindungsstellen von CRP und CcpA befindet sich unter dem Diagramm. Abweichende Bp sind in rot dargestellt.

Abbildung 8: Einfluss der ccpA Defizienz auf die Transkription des ADS.

S. suis Stamm 10 und 10∆ccpA wurden in THB Medium bei 37°C bis zu einer OD600 von 0,3 kultiviert.

Nach weiteren 1 – 3 h wurden 10 ml Bakterienkultur entnommen. Auf Zelllyse und Präparation der gRNA folgte der Transfer auf eine Nitrozellulosemembran. Die Auswertung des Northern Blots erfolgte mit Hilfe einer arcB spezifischen Gensonde. Der Mengenabgleich konnte durch die 16S bzw. 23S ribosomale rRNA gewährleistet werden. Operon-spezifische Transkripte sind durch Pfeile gekenn-zeichnet

Die Ergebnisse verdeutlichen, dass die Inaktivierung des ccpA Gens in S. suis einen Einfluss auf die Regulation des ADS hat. In der logarithmischen Phase führt sie zu einer früheren Transkription des AD Operons, während in der stationären Phase eine vollständige Induktion der ADS Expression nicht erreicht wird.

4.1.3 Sauerstoff und die Regulation durch das FNR-like protein of