Phänotypische Charakterisierung des ADS und assoziierter Gene

4.2.1.1 Einfluss auf den pH-Wert im Wachstumsverlauf

Basierend auf der Hypothese, dass die Ammoniakproduktion bei der Arginolyse durch das ADS an der Persistenz in Epithelzellen beteiligt ist (BENGA et al. 2004), wurde eine Insertionsmutante mit inaktiviertem ADS konstruiert (Stamm 10∆arcABC).

Durch die bereits beschriebene Operonstruktur war es dem mutierten Stamm nicht mehr möglich, die Enzyme AD, OCT und CK zu synthetisieren (beispielhaft für OCT in Abbildung 15, Spur 7, 8). Im ersten Schritt konnte nun die Fähigkeit der Bakterien überprüft werden, den extrazellulären pH-Wert anzuheben. Dafür wurden der WT Stamm 10 und die ADS-defiziente Mutante Stamm 10∆arcABC über Nacht in TY+Gal Medium bei 37°C bebrütet. Am folgenden Tag wurden die Bakterien in gleichem Me-dium auf eine OD600 von 0,01 eingestellt. Arginin als Substrat wurde dabei in einer Konzentration von 50 mM supplementiert. Die Kultivierung erfolgte bei 37°C. Nach 2, 4, 6 und 8 h wurde die OD600 bestimmt und der pH-Wert gemessen. Wie in Abbildung 19A deutlich wird, sank der pH-Wert in der Kultur des WT (schwarze Balken) und der ADS Mutante (karierte Balken) gleichermaßen bis 4 h nach Inokulation auf ca. 6,6.

Nach 6 h war eine Stagnation des pH-Wertes beim WT zu erkennen. Bereits 8 h nach Inokulation war der WT in der Lage den extrazellulären pH-Wert anzuheben (6,7), bis dieser ein gemessenes Maximum von pH 7,92 nach 24 h erreichte. Anders hingegen Stamm 10∆arcABC. Hier blieb die Stagnationsphase aus und es war ein gleichmäßiger Abfall des pH-Wertes im Kulturmedium zu beobachten. So wurden

Werte von ca. 6,51 nach 6 h und im Mittel 6,47 nach 8 h gemessen. Das pH-Minimum in der Kultur erreichte die ADS-defiziente Mutante 24 h nach Inokulation mit einem Wert von ca. 5,6. Betrachtet man die Wachstumskinetik näher (Abbildung 19B), fällt auf, dass sich das Wachstum der Bakterien bis 2 h nach Inokulation kaum unterschied. Während der WT eine OD600 von im Mittel 0,045 erreichte, konnten bei Stamm 10∆arcABC Werte von ca. 0,04 gemessen werden. Im Folgenden behielt der WT seine Wachstumsgeschwindigkeit mit einer Verdopplungszeit von ca. 1,5 h bis zum Zeitpunkt 6 h nach Inokulation (OD600 im Mittel 0,361) bei. Bei der ADS-defizienten Mutante konnte hingegen ein stark verlangsamtes Wachstum beobachtet werden. Während diese 4 h nach Inokulation noch eine OD600 von ca. 0,064 erreich-te, das in etwa der Hälfte des für den WT gemessenen Wertes entsprach (ca. 0,12), konnte nach 6 h nur noch eine OD600 von im Schnitt 0,096 gemessen werden. Der WT erreichte sein Wachstumsmaximum nach 10 h mit einer OD600 von ca. 1,5 (Da-ten nicht gezeigt) und wies zum Ende des Experimentes nach 24 h noch eine opti-sche Dichte von im Schnitt 1,216 auf. Bei Stamm 10∆arcABC konnte hingegen ein stetiges Wachstum mit einer maximalen optischen Dichte von ca. 0,46 nach 24 h gemessen werden.

Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass ein ADS-negativer Stamm weder in der Lage ist, ein dem WT vergleichbares Wachstum in einem nährstoffarmen Medium zu errei-chen, noch den extrazellulären pH-Wert nach Argininsupplementation anzuheben.

Abbildung 19: Einfluss des ADS und ADS-assoziierter Regulatoren auf die Arginin-abhängige pH-Wert Änderung im Wachstumsverlauf.

A: S. suis Stamm 10 (schwarz), 10∆flpS (weiß), 10∆argR (gestreift) und 10∆arcABC (kariert) wurden über einen Zeitraum von 24 h in TY+Gal+ 50 mM Arginin bei 37°C kultiviert. Die Bestimmung des pH-Wertes erfolgte zu angegebenen Zeitpunkten.

B: Parallel wurde das Wachstum anhand der optischen Dichte bei 600 nm dokumentiert. Bei den Wer-ten handelt es sich um Standardabweichungen und Mittelwerte aus einem Dreifachansatz.

Wie im ersten Kapitel beschrieben, sind die Regulatoren FlpS und ArgR essentiell für die Induktion des ADS. Durch Mutagenesestudien konnte gezeigt werden, dass so-wohl ein flpS als auch ein argR-negativer Stamm unter induzierenden Bedingungen lediglich eine basale Expression des ADS hervorrufen (Abbildung 15, 16). Um zu

ü-berprüfen, ob diese basale Expression ausreicht, den extrazellulären pH-Wert anzu-heben und somit die intrazelluläre Persistenz ermöglicht, wurden Stamm 10∆flpS und 10∆argR wie oben beschrieben kultiviert. Die Auswertung erfolgte erneut anhand des Wachstums und des pH-Wertes. Ähnlich den vorherigen Ergebnissen, war auch bei den Regulatormutanten kein Unterschied im Wachstum bis zum Zeitpunkt 2 h im Vergleich zum WT erkennbar. Danach verlängerte sich auch hier die Generations-zeit. Stamm 10∆argR (gestreifte Balken) wuchs dabei schneller als die flpS Mutante (weiße Balken) und erreichte schon nach 6 h eine OD600 von 0,184, die bei der flpS Mutante mit im Mittel 0,183 erst nach 8 h gemessen werden konnte (Abbildung 19B).

Zu diesem Zeitpunkt erreichte Stamm 10∆argR bereits eine OD600 von ca. 0,28 und wies somit, im Vergleich zur ADS-negativen Mutante (ca. 0,14), eine doppelte so ho-he Wachstumsgeschwindigkeit in der logarithmischo-hen Phase auf. Nach 24 h glicho-hen sich die Werte der flpS- (0,503) und der argR Mutante (0,507) nahezu vollständig, und waren damit nur geringfügig höher als die OD600 von Stamm 10∆arcABC (ca.

0,46). Die in den Wachstumskinetiken gewonnenen Erkenntnisse spiegelten sich dann auch in den pH-Werten des Kulturmediums wider (Abbildung 19A). Bis 4 h nach Inokulation waren keine Unterschiede zwischen dem WT (pH 6,59) und Stamm 10∆flpS (pH 6,59) bzw. Stamm 10∆argR (pH 6,58) erkennbar. Während sich in der WT Kultur im Folgenden die oben bereits beschriebene Stagnationsphase mit an-schließender pH-Wert Anhebung ereignete, kam es bei den Regulatormutanten, ähn-lich dem Stamm 10∆arcABC, zu einem gleichmäßigen Abfall der Werte in der Kultur bis zum Zeitpunkt 24 h nach Inokulation mit den gemessenen Minima von pH 5,57 für die flpS- und pH 5,6 für die argR Mutante. Auffällig hierbei war jedoch, dass der pH-Wert Abfall der mutagenisierten Stämme mit dem Wachstum assoziiert zu sein schien. So wurde nach 6 h bei Stamm 10∆argR in der Kultur bereits ein pH-Wert von 6,41 erreicht, der bei der flpS-negativen Mutante mit pH 6,39 erst 8 h nach Inokulati-on gemessen werden kInokulati-onnte.

Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass sowohl für die „biologische Fitness“ von S. suis als auch für die Fähigkeit, den extrazellulären pH-Wert anzuheben, ein funkti-onelles, induzierbares ADS essentiell ist. Aus diesem Grund wurden in den folgen-den phänotypischen Untersuchungen der ADS-negative Stamm 10∆arcABC und die assoziierten Regulatormutanten 10∆flpS und 10∆argR parallel charakterisiert.

Im nächsten Schritt galt es zu beweisen, dass das vom ADS gebildete Ammoniak durch Argininkatalyse ursächlich für die extrazelluläre pH-Wert Steigerung beim WT war. Daher wurde die Ammoniakproduktion des WT und der ADS-defizienten Mutan-ten mit dem ammonia assay Kit (Sigma) bestimmt. Übernachtkulturen wurden für 24 h in TY+Gal mit bzw. ohne 50 mM Arginin bei 37°C bebrütet. Die Bakterien wurden abzentrifugiert und der Ammoniakgehalt des Überstandes nach 0 und 24 h gemes-sen. Die Differenz ergab die Ammoniakproduktion der Streptokokken in 24 h. Abbil-dung 20 zeigt für den WT eine deutlich höhere Ammoniakproduktion in Anwesenheit von Arginin (1,148 mg/ml) im Gegensatz zu dem Kultivierungsansatz ohne Arginin-zugabe (0,087 mg/ml). Diese um den Faktor 13 erhöhte Produktion blieb bei den Mutanten aus (0,0361 mg/ml zu 0,0357 mg/ml Ammoniak; beispielhaft für die argR Mutante gezeigt).

Die Fähigkeit des WT den extrazellulären pH-Wert anzuheben beruht also auf der Produktion von Ammoniak durch Arginolyse mittels eines induzierbaren ADS.

Abbildung 20: Einfluss der ADS-assoziierten Regulatormutante 10∆argR und Stamm 10∆arcD auf die Ammoniakproduktion.

WT Stamm 10, 10∆argR und 10∆arcD wurden für 24 Stunden in TY+Gal Medium bei 37°C ohne (schwarze Balken) bzw. mit (weiße Balken) 50 mM Arginin kultiviert. Nach Zentrifugation wurde der Ammoniakgehalt des Kulturüberstandes mit Hilfe des ammonia assay Kits (Sigma) gemessen. Abzüg-lich der Werte zum Zeitpunkt 0 ist hier die Ammoniakproduktion in mg/ml angegeben.

4.2.1.2 Bedeutung für das Überleben unter sauren Bedingungen

Grundlage zur Persistenz in Phagolysosomen ist die Fähigkeit, ein saures Milieu zu tolerieren. Das kann z. B. durch die Neutralisierung niedriger pH-Werte geschehen.

Es konnte bereits gezeigt werden, dass der WT Stamm 10 im Gegensatz zu den ADS-defizienten Mutanten in der Lage war, den extrazellulären pH-Wert durch Am-moniakproduktion anzuheben. Ob dies ausreicht, saure Bedingungen zu überdauern, sollte mit folgenden Experimenten untersucht werden. Dafür wurden die Bakterien (WT, 10∆flpS, 10∆argR und 10∆arcABC) über Nacht in TY+Gal bei 37°C bebrütet.

Die Zellen wurden geerntet, mit PBS gewaschen und auf eine OD600 von 1,2 einge-stellt. Diese Suspension wurde 1:10 in Phosphatpuffer verdünnt, dessen pH-Werte auf 5, 6 oder 7 eingestellt waren. Arginin wurde in einer Konzentration von 25 mM supplementiert. Als Kontrolle diente der Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 5,0 ohne Arginin. Die Ansätze wurden bei 37°C inkubiert, und das Überleben der Bakte-rien durch Ausplattieren nach 1 und 2 h bestimmt. Die Ergebnisse wurden als pro-zentuales Überleben der Ausgangskonzentration ausgedrückt (Abbildung 21).

Die Überlebensrate des WT und der Mutanten wies für die pH-Werte 6,0 (weiße Bal-ken) und 7,0 (schwarze BalBal-ken) mit ca. 100 % keine wesentlichen Unterschiede nach einer Inkubationszeit von 1 h auf. Nach 2 h konnten sowohl von dem WT als auch von den Mutanten ca. 80 % des Ausgangsinokulums bei pH 7,0 reisoliert werden. Zu diesem Zeitpunkt erreichte der WT bei einem pH-Wert von 6,0 eine Überlebensrate von im Mittel 90 %, die Mutanten ca. 70%. Hohe Standardabweichungen ließen aber eine Beurteilung in diesem Fall nicht zu. Ähnlich verhielt es sich bei einem pH-Wert von 5,0 (gestreifte Balken) nach einer Inkubationszeit von 1 h (WT ca. 80 %, Mutan-ten im Mittel 60 %). Der Einfluss eines funktionellen ADS wurde am deutlichsMutan-ten bei einer Inkubationszeit von 2 h und einem pH-Wert von 5,0. Während der WT eine Ü-berlebensrate von 58 % aufwies, waren bei den Mutanten nahezu 80 % des Inoku-lums abgetötet. Auffällig war, dass in dem Ansatz ohne Argininzusatz (karierte Bal-ken) die Stämme 10∆flpS, 10∆argR und 10∆arcABC mit im Mittel 2,3 % bereits nach 2 h vollständig abgetötet waren, während der WT zu diesem Zeitpunkt und unter die-sen Bedingungen noch eine Überlebensrate von ca. 9 % aufwies.

Abbildung 21: Einfluss des ADS und ADS-assoziierter Regulatoren auf das Überleben im sau-ren Milieu.

S. suis Stamm 10, 10∆flpS, 10∆argR und 10∆arcABC wurden in einem Natriumphosphatpuffer mit 25mM Arginin für eine bzw. zwei Stunden bei pH 7 (schwarz), pH 6 (weiß), ph 5 (gestreift) und pH 5 ohne Argininzusatz (kariert) inkubiert. Die Auswertung erfolgte als % Überleben bezogen auf das Ausgangsinokulum. Die Werte sind als Mittelwerte und Standardabweichungen aus drei unabhängi-gen Experimenten angegeben.

Um polare Effekte auszuschließen, wurden die Experimente beispielhaft mit der oben bereits beschriebenen, komplementierten Mutante 10∆flpS::pORI23flpS wiederholt.

Als Kontrolle diente die flpS Mutante, die episomal den nativen Shuttlevektor pORI23 trug (Abbildung 22). Die gezeigten Ergebnisse bestätigend, konnten auch in diesem Fall bei den pH-Werten 6,0 (weiße Balken) und 7,0 (schwarze Balken) keine Unter-schiede in der Überlebensrate (ca. 100 %) zwischen den beiden Stämmen nach ei-ner Inkubationszeit von 1 h erkannt werden. Jedoch war bereits zu diesem Zeitpunkt der Prozentsatz lebensfähiger flpS-negativer Streptokokken bei pH 5,0 (gestreifte Balken) mit einem Wert von 58,3 % deutlich reduziert gegenüber der komplementier-ten Mutante (109 %). Dieser Trend änderte sich auch nach einer Inkubationszeit von 2 h nicht. Hier wies die Mutante bei pH 5,0 noch eine Überlebensrate von 8,3 % auf, während bei der Komplementation 35 % des Ausgangsinokulums reisoliert werden konnten. Ähnlich wie im vorherigen Experiment beschrieben, divergierten die Werte überlebensfähiger Bakterien bei pH 6,0 und 7,0 auch hier nach einer Inkubationszeit

von 2 h. Während der komplementierte Stamm in der Lage war, sich bei pH 6,0 zu vermehren (135 %), wurde die Mutante bereits abgetötet (68,7 %). Bei pH 7,0 konn-ten 99 % von Stamm 10∆flpS::pORI23flpS reisoliert werden, während sich in diesem Fall der flpS-negative Stamm 10∆flpS vermehrte (143 %).

Abbildung 22: Einfluss der flpS Komplementation auf das Überleben im sauren Milieu.

S. suis Stamm 10∆flpS::pORI23 und die komplementierte Mutante 10∆flpS::pORI23flpS wurden für 1 oder 2 h in einem Natriumphosphatpuffer mit 25 mM Arginin bei den pH-Werten 7,0 (schwarze Bal-ken), 6,0 (weiße Balken) oder 5,0 (gestreifte Balken) inkubiert. Die Auswertung erfolgte als % Überle-ben bezogen auf das Ausgangsinokulum.

Ein funktionelles ADS, und damit die Fähigkeit der Ammoniakproduktion durch Argi-nolyse, sind also essentiell für ein Überleben unter sauren Bedingungen. Wie sich bereits in den vorherigen Versuchen andeutete und sich durch das Absterben des WT in der Negativkontrolle bestätigte, spielt dabei die Verfügbarkeit des Substrats Arginin eine wichtige Rolle. Um Arginin enzymatisch durch das ADS zu katabolisie-ren, müssen die Bakterien in der Lage sein, es zu internalisieren. Bei S. suis wurde stromabwärts des arcC Gens ein OLR identifiziert, der Homologien zu dem Arginin-Ornithin Antiporter von S. gordonii aufweist. Der folgende Abschnitt beschäftigt sich nun mit der Charakterisierung dieses putativen Transportproteins und verdeutlicht die Wichtigkeit von Arginin als Substrat für die Funktionalität des ADS.

4.2.1.3 ArcD als mögliches Transportprotein für Arginin 4.2.1.3.1 Die arcD-unabhängige Expression des ADS

Wie in der Einleitung bereits ausführlich beschrieben, ist das AD Operon gemeinsam mit weiteren ADS-assoziierten Genen auf dem S. suis Chromosom lokalisiert. Dazu gehört unter anderem auch ein OLR, der in der Sequenzanalyse Homologien zu ei-nem Arginin-Ornithin Antiporter (ArcD) von S. gordonii und P. aeruginosa aufweist.

In silico Analysen zeigten, dass der N-terminale Bereich des ArcD Proteins von S. suis für eine Signalsequenz kodiert. Des Weiteren ließ sich durch Computeranaly-sen die Ausbildung von 13 transmembranalen Helices ableiten (Daten nicht gezeigt).

In einer früheren Arbeit (Dissertation GRUENING, 2004) konnte bereits nachgewie-sen werden, dass das arcD von S. suis nicht zusammen mit dem AD Operon auf ei-ner mRNA transkribiert wird. Wohl aber kommt es zu eiei-ner zeitgleichen Induktion.

Um nun den Einfluss des arcD Gens auf die Expression des ADS zu untersuchen, wurden sowohl der WT als auch die entsprechende Defizienzmutante Stamm 10∆arcD über Nacht bei 37°C in TY+Gal mit bzw. ohne 50 mM Arginin kultiviert. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation (8000 Upm, 10 min, 4°C) geerntet und mit PBS gewaschen. Die Auswertung des Experiments erfolgte im Western Blot mit Hilfe von Anti-OCT-Antikörpern (Abbildung 23). Wie bereits beschrieben, konnte beim WT eine Induktion des ADS beobachtet werden (Spur 1), die sich in Anwesenheit von Arginin noch verstärkte (Spur 2). Beim arcD-negativen Stamm konnte jedoch, im Ge-gensatz zu den Regulatormutanten 10∆flpS und 10∆argR, ebenfalls eine Induktion des ADS (Spur 3) nachgewiesen werden, die aber im Vergleich zum WT Stamm schwächer ausgeprägt war. Eine Arginin-abhängige Aufregulation des ADS war in diesem Fall nur marginal erkennbar (Spur 4). Die Defizienz von arcD führt also im Gegensatz zu den Regulatormutanten nicht zum Verlust der Induzierbarkeit des ADS. Wie sich das ArcD auf das Wachstum und die Fähigkeit den extrazellulären pH-Wert anzuheben auswirkt, wurde im Folgenden geklärt.

Abbildung 23: Einfluss der arcD Defizienz auf die ADS Expression.

S. suis Stamm 10 und 10∆arcD wurden über Nacht bei 37°C mit (Spur 2,4) bzw. ohne (Spur 1,3) 50 mM Arginin in TY+Gal bebrütet. Die Bakterien wurden geerntet und lysiert. Jeweils 5 µg Ganzzelllysat wurden auf eine PVDF-Membran transferiert. Die Detektion im Western Blot erfolgte mit Anti-OCT-Antikörpern (α-OCT). Die kreuzreaktive, unspezifische Bande (*) zeigt, dass vergleichbare Mengen an Ganzzelllysat aufgetragen wurden.

4.2.1.3.2 Einfluss auf den pH-Wert im Wachstumsverlauf

S. suis Stamm 10 und die arcD-negative Mutante 10∆arcD wurden über Nacht in TY+Gal Medium bei 37°C bebrütet. Die Kulturen wurden dann sowohl in TY+Gal als auch in TY+Gal+ 50 mM Arginin auf eine OD600 von 0,02 eingestellt und bei 37°C kultiviert. Das Wachstum wurde anhand der optischen Dichte bei 600 nm nach ein, 2, 4, 6, 8 und 24 h ermittelt. Vergleicht man das Verhalten der Bakterien im Medium, ließ sich, ähnlich wie für die ADS- und die Regulator-defizienten Mutanten schon ge-zeigt, in der frühen logarithmischen Phase (bis 3 h nach Inokulation) kein Unter-schied im Wachstum zwischen der arcD Mutante (weiße Balken) und dem WT (schwarze Balken) erkennen (Abbildung 24). Das galt gleichermaßen für die Kultur mit als auch ohne Argininsupplementation. Danach änderte sich das Verhalten. Wäh-rend der WT die Wachstumsgeschwindigkeit beibehielt (Generationszeit ca. 2 h), verlangsamte sich das Wachstum der Mutante auf eine Verdopplungszeit von ca. 4 h (Abbildung 24A+B). Ohne Argininsupplementation (Abbildung 24A) erreichte der WT sein Wachstumsmaximum nach 24 h mit einer OD600 von 0,77, während die Werte der arcD Mutante im Mittel eine optische Dichte von 0,37 nicht überschritten. Auffal-lend war weiterhin, dass es sowohl beim WT als auch bei Stamm 10∆arcD vom Zeit-punkt 8 h zum ZeitZeit-punkt 24 h zu einer Verdopplung der Bakterienzahl kam. Dieses Phänomen war im Ansatz mit Arginin (Abbildung 24B) lediglich bei Stamm 10∆arcD erkennbar (von OD600 0,216 auf 0,493). Der WT erreichte das Wachstumsmaximum bereits 8 h nach Inokulation mit einer OD600 von ca. 1,2. Stellt man nun gleiche

Stämme in den unterschiedlichen Inkubationsansätzen gegenüber, fällt auf, dass die Supplementation von 50 mM Arginin sowohl für den WT als auch für die Mutante ei-ne Steigerung des Wachstums um eiei-nen Faktor von ca. 1,5 bedingte.

Abbildung 24: Einfluss der arcD Defizienz auf das Wachstumsverhalten nach Argininsupple-mentation.

S. suis Stamm 10 (schwarze Balken) und 10∆arcD (weiße Balken) wurden in TY+Gal-(A) bzw.

TY+Gal+ 50 mM Arginin (B) Medium auf eine OD600 von 0,02 eingestellt und bei 37°C kultiviert. Der Verlauf des Wachstums wurde durch Bestimmung der Bakterienzahl anhand der optischen Dichte bei 600 nm zu angegebenen Zeitpunkten dokumentiert.

Ähnlich wie für die Regulatormutanten und Stamm 10∆arcABC beschrieben, bedingt also eine Defizienz im arcD Gen ein schwächeres Wachstum im Vergleich zum WT.

Die Supplementation von Arginin führt aber sowohl beim WT als auch bei Stamm 10∆arcD gleichermaßen zu einer Erhöhung der Wachstumsgeschwindigkeit in der logarithmischen Phase, so dass die Möglichkeit der alternativen Arginininternalisie-rung nicht ausgeschlossen werden kann.

Inwiefern sich dieses Phänomen auf die Fähigkeit auswirkt, den extrazellulären pH-Wert anzuheben und somit Grundlage zur Persistenz im sauren Milieu bietet, wurde erneut durch parallele pH-Wert Studien untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Werte im Ansatz ohne Arginin nach 24 h auf ihr gemessenes Minimum von pH 5,8 beim WT

(schwarze Balken) bzw. 5,9 bei Stamm 10∆arcD (weiße Balken) abfielen (Abbildung 25A). Ähnlich wie bereits für den WT beschrieben, war in diesem Fall jedoch für bei-de Stämme eine Stagnationsphase 3 h nach Inokulation zu erkennen. Während die-se Phadie-se beim WT bis zum Zeitpunkt 8 h anhielt (pH-Werte ca. 6,8), fielen die Werte in der Kultur von Stamm 10∆arcD bereits nach 5 h wieder ab und wiesen nach 8 h im Mittel nur noch einen pH-Wert von 6,6 auf. In Anwesenheit von Arginin konnten bei Stamm 10∆arcD keine Unterschiede im extrazellulären pH-Wert zum Ansatz ohne Arginin beobachtet werden. Es war wiederum eine Stagnationsphase 3 h nach Inoku-lation zu erkennen, die aber erneut nur bis zum Zeitpunkt 5 h aufrechterhalten wurde (Abbildung 25B). Nach 24 h erreichte auch hier die Kultur von Stamm 10∆arcD ein gemessenes Minimum von pH 5,5. Der WT war allerdings in der Lage, den pH-Wert des Mediums nach 24 h von 6,9 auf 8,1 anzuheben.

Abbildung 25: Einfluss der arcD Defizienz auf die pH-Wert Änderung im Wachstumsverlauf.

S. suis Stamm 10 (schwarze Balken) und 10∆arcD (weiße Balken) wurden in TY+Gal-(A) bzw.

TY+Gal+ 50mM Arginin (B) Medium bei 37°C kultiviert. Der pH-Wert wurde parallel zum Wachstum zu angegebenen Zeitpunkten bestimmt.

Für den WT konnte bereits der Nachweis erbracht werden, dass die Erhöhung des pH-Wertes im Medium auf der Ammoniakproduktion des ADS beruht. Da aber die

arcD-negative Mutante, ähnlich wie Stamm 10∆argR nicht in der Lage war, den ext-razellulären pH-Wert nach 24 h anzuheben, musste auch hier davon ausgegangen werden, dass die Ammoniakproduktion trotz funktionellem ADS stark eingeschränkt war. So konnte im Ansatz ohne Arginin eine dem Stamm 10∆argR ähnliche Produkti-on vProdukti-on 0,0249 mg/ml errechnet werden (Abbildung 20). Anders als bei der Regula-tormutante verdoppelte sich jedoch die Ammoniakproduktion nach Substratsupple-mentierung auf einen Wert von 0,053 mg/ml.

Demnach ist ein ArcD-unabhängig induzierbares ADS nicht ausreichend, den extra-zellulären pH-Wert anzuheben, da eine entsprechende Verfügbarkeit von Arginin nicht gegeben ist. Im Gegensatz zu den Regulatormutanten 10∆argR und 10∆flpS sowie zum ADS-negativen Stamm 10∆arcABC konnte hier eine dem WT ähnliche, aber verkürzte Stagnationsphase im pH-Wert Abfall beobachtet werden. Wie sich diese auf das Überleben unter sauren Bedingungen auswirkt, wird im nächsten Ab-schnitt geklärt.

4.2.1.3.3 Bedeutung für das Überleben unter sauren Bedingungen

WT Stamm 10 und die arcD-defiziente Mutante 10∆arcD wurden über Nacht bei 37°C in TY+Gal Medium kultiviert. Der Versuchsaufbau entsprach dabei dem bereits weiter oben beschriebenen. Die Bakterien wurden mittels Zentrifugation geerntet, mit PBS gewaschen und auf eine OD600 von 1,2 eingestellt. Nach einer 1:10 Verdünnung in Natriumphosphatpuffer mit den pH-Werten 5, 6 und 7 wurden die Bakterien für 4 h bei 37°C inkubiert. Arginin als Substrat des ADS wurde in einer Konzentration von 25

WT Stamm 10 und die arcD-defiziente Mutante 10∆arcD wurden über Nacht bei 37°C in TY+Gal Medium kultiviert. Der Versuchsaufbau entsprach dabei dem bereits weiter oben beschriebenen. Die Bakterien wurden mittels Zentrifugation geerntet, mit PBS gewaschen und auf eine OD600 von 1,2 eingestellt. Nach einer 1:10 Verdünnung in Natriumphosphatpuffer mit den pH-Werten 5, 6 und 7 wurden die Bakterien für 4 h bei 37°C inkubiert. Arginin als Substrat des ADS wurde in einer Konzentration von 25