Rapid amplification of cDNA ends (RACE)

Mit der rapid amplification of cDNA ends (RACE) ist es möglich, sowohl das 5´- als auch das 3´-Ende einer mRNA zu bestimmen. Für die Identifikation des Transkripti-onsstartpunktes (TS) des AD Operons wurde in dieser Arbeit das 5´RACE System⁴⁵ verwendet. Die Methode beruht auf der Fähigkeit des Enzyms TdT (Terminal deoxy-nucleotidyl transferase), das 3´-Ende der cDNA mit einem Poly-Cytosin Anhang zu versehen. Durch PCR mit einem den polymeren Cytosin-Anhang erkennenden und einem genspezifischen Primer kommt es zu einer Amplifikation, die durch Sequen-zierung eine Bestimmung des TS ermöglicht. Für die cDNA Synthese wurde DNase behandelte gRNA von S. suis Kulturen verwendet, die nach der Teilung bei einer OD600 von 0,3 für weitere 2 h bei 32°C bzw. 42°C kultiviert wurden. Die Durchführung erfolgte exakt nach Herstellerangaben. Für die cDNA Synthese wurde der Primer GSP2 (CCT TTT GAA CAC CAG CCA TCG) verwendet. Nach dem Tailing durch das Enzym TDT erfolgte die erste PCR mit dem genspezifischen Primer ADSprimerext.

(CAA TTT CCT TAC CTG GTC TGT G) und dem den polymeren Cytosinanhang er-kennenden Primer AAP (GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGG IIG). Zur Anreicherung des Amplifikats wurde eine zweite PCR mit den Primern ADSprimerext. und AUAP (GGC CAC GCG TCG ACT AGTAC) durchgeführt. AUAP erkennt dabei spezifisch den 5´-Bereich des AAP Primers. Als template diente der Reaktionsansatz der ersten PCR in einer 1:500 Verdünnung. Alle PCR-Reaktionen wurden bei einer annealing Temperatur von 57°C und einer Elongationszeit von 1 min mit 25 Wiederholungen (Zyklen) durchgeführt. Die anschließende Sequenzie-rung erfolgte durch SEQLAB LABORATORIES, Göttingen.

45 5´RACE System inkl. TdT und der Primer AAP AUAPund, INVITROGEN, Groningen, Niederlande

3.3.11 Mutagenese

3.3.11.1 Stamm 10∆flpS::spcR

Die Inaktivierung des flpS Gens erfolgte mittels Insertionsmutagenese. Dafür wurde ein flpS tragendes, 1509 Bp langes Fragment mit Hilfe der Primer AdR1 (GAC CTA AAT CGA GCC ACC AA) und AdR2 (ACA TGA TGG GAA ACG AGG AG) aus dem S. suis Genom amplifiziert (Elongation 2 min) und in den Klonierungsvektor pGEMT-Easy⁴⁶ kloniert (Plasmid pGEM-flpS). Nach Extraktion der episomalen DNA wurde der Vektor mit dem Restriktionsenzym SnaBI linearisiert und mit Alkalischer Phosphatase (CIP)⁴⁷ behandelt. Eine Spectinomycin-Resistenzkassette (insert) wur-de aus wur-dem Plasmid pICspc (SMITH et al. 1999) mit dem Restriktionsenzym EcoRV geschnitten. Sowohl Vektor als auch insert wurden mit dem QIAquick^TM PCR Purifi-cation Kit⁴⁸ aufgereinigt und anschließend für 3 h bei 16°C im Eppendorf-Thermocycler ligiert. Nach Transfomation in chemokompetente E. coli Zellen wurde die episomale DNA extrahiert und mittels Restriktionsanalysen kontrolliert. Das Plasmid wurde daraufhin in elektrokompetente S. suis Zellen transformiert und zur phänotypischen Differenzierung auf Columbia-Agar mit 6 % Pferdeblut⁴⁹ und 100 µg/ml Spectinomycin ausplattiert. Die Kontrolle der Mutanten erfolgte durch Kolonie-PCR mit den Primern AdR1 und AdR2 und einer Elongationszeit von 4 min. Des Wei-teren wurde eine Southern Blot Analyse durchgeführt. Dafür wurde die chromosoma-le DNA von S. suis Stamm 10 und der putativen Mutante 10∆flpS::spcR mit den Re-striktionsenzymen ClaI und Acc65I geschnitten und, wie unter 3.3.8.1 dargestellt, geblottet. Die Hybridisierung erfolgte mit einer flpS spezifischen Gensonde, die mit den Primern FNR-L (GGA GTT TTG ATG ATA AGC AAC G) und FNR-R (AAA CAT GGC TAA CCG TTT CC) aus dem S. suis Genom amplifiziert worden war.

46 vgl. ²⁷

47 vgl. ²⁴

48 vgl. ²²

49 vgl. ⁵

3.3.11.2 Komplementation des Stammes 10∆flpS::spcR

Für die episomale Komplementation von Stamm 10∆flpS::spcR wurde der Shuttle-vektor pORI23 (Que et al. 2000) benutzt. Das flpS Gen wurde mit den Primern flpSagg-SalI (ACG CGT CGA CGC TAG AAA GGA GGT TTT GAT GAT AAG CAA CG) und flpSend-PstI (CCC TGC AGC ATC TAA ATT CTG CAT AAT TCT TTC C) aus dem S. suis Genom amplifiziert (annealing 57°C, Elongation 1 min). Dadurch wurde die imperfekte Ribosomenbindungsstelle (RBS) des flpS Gens (ggagt) zu der für grampositive Bakterien optimalen Nukleotidfolge „ggagg“ verändert (STROHL 1992). Sowohl das Amplifikat als auch der Vektor wurden mit den Restriktionsenzy-men PstI und SalI geschnitten und ligiert. Somit wurde flpS unter die Kontrolle des konstitutiven L. lactis Promotors P23 gesetzt (VAN DER VOSSEN et al. 1987). Das resultierende Konstrukt wurde in S. suis Stamm 10∆flpS::spcR transformiert und auf Columbia-Agarplatten mit 6 % Pferdeblut⁵⁰ und 5 µg/ml Erythromycin ausplattiert.

Die Kontrolle positiver Klone erfolgte mittels Kolonie-PCR mit den oben genannten Primern (Elongation 1 min) und Plasmid-Isolierung mit anschließender Restriktions-analyse.

3.3.11.3 Stamm 10∆flpS::ermR und 10∆cpsEF∆flpS::ermR

Um den Einfluss der flpS Defizienz auf die Persistenz von S. suis in Epithelzellen zu untersuchen, war es unerlässlich, eine Mutante in einem Kapsel-defizienten geneti-schen Hintergrund zu generieren. Dafür stand in dieser Arbeit Stamm 10∆cpsEF::spcR zur Verfügung (SMITH et al. 1999). Da dieser jedoch bereits eine Spectinomycin-Resistenzkassette trägt, wurde das flpS Gen mit Hilfe einer Erythro-mycin-Resistenzkassette inaktiviert. Diese wurde durch das Enzym PvuII aus dem Plasmid pICerm (BAUMS et al. 2006) geschnitten und in den linearisierten Vektor pGEM-flpS kloniert (pGEM-flpS::ermR). Nach Transformation in elektrokompetente Stamm 10 bzw. Stamm 10∆cpsEF::spcR Zellen erfolgte das Ausplattieren auf Co-lumbia-Blutagarplatten, die 1 µg/ml Erythromycin enthielten. Die Mutanten wurden mittels Kolonie-PCR mit den Primern AdR1 und AdR2 wie unter 3.3.5.1 angegeben kontrolliert.

50 vgl. ⁵

3.3.11.4 Stamm 10∆cpsEF∆arcABC::ermR

Zur Inaktivierung des arcABC Operons wurde das Plasmid pGEMADM (Dissertation GRUENING, 2004) mit dem Restriktionsenzym EcoRV geschnitten. Die Erythromy-cin-Resistenzkassette wurde, wie unter 3.3.11.3 beschrieben, aus dem Vektor pICerm

isoliert und in den linearisierten Vektor pGEMADM kloniert. Das daraus resultierende Plasmid pGEMADM::ermR wurde in elektrokompetente S. suis Stamm 10∆cpsEF::spcR Zellen transfomiert und sowohl mittels Kolonie-PCR (Elongation 4 min) mit dem Primerpaar IFL (TAA GGG CTA TGC TCG GAT TG)/IFR (CTG CCA ATT CTT CCA CCA TT) als auch durch Western Blot Analysen mit Anti-OCT-Antikörpern überprüft.

3.3.11.5 Stämme 10∆argR::ermR, 10∆cpsEF∆argR::ermR und 10∆flpS∆argR::ermR

Zur Inaktivierung des ADS-assoziierten Regulators wurde ein das argR Gen tragen-des Fragment mit den Primern argRKOlin (GCG TGG CGA CTT TAA AAG AG) und argRKOrec (CAA ACC AGC AAA ACG TCT GA) aus dem S. suis Genom amplifiziert (Elongation 1 min) und in den Klonierungsvektor pCR^®2.1-TOPO⁵¹ ligiert (pTOPO-argR). Nach Restriktion mit dem Enzym HincII und Behandlung mit Alkalischer Phosphatase (CIP)⁵² wurde das PvuII geschnittene Fragment mit der Erythromycin-Resistenzkassette in das argR Gen kloniert (pTOPO-argR::ermR). Dieses Konstrukt wurde in S. suis Stamm 10, 10∆cpsEF::spcR und 10∆flpS::spcR transfomiert. Die Mutanten wurden durch Kolonie-PCR mit den Primern argRKOlin und argRKOrec (Elongation 4 min) überprüft.

3.3.11.6 Stamm 10∆ccpA::ermR

Aufgrund unzureichender Restriktionsenzymschnittstellen im ccpA Gen wurden zwei Amplifikate mit den Primerpaaren ccpAL (TTT GTG GCA ATT TGC TCT TG)/ccpALrev-HpaI (GGG GTT AAC CCA CCT GTT TTG AGA ATA GGG TA) und ccpAR (GGC TTG CAA TTG CGT TAT TT)/ccpARfor-HpaI (GGG GTT AAC ACG

51 vgl. ²⁶

52 vgl. ²⁴

AGG AAG GCT ACG CTC TA) generiert (Elongation 1 min). Dabei wurde ein 311 Bp langes Segment aus dem ccpA Gen ausgespart. Die Enzymschnittstellen der inneren Primer ermöglichten einen Restriktionsenzymverdau mit HpaI. Die Fragmente wur-den durch Gelelution aufgereinigt und im Verhältnis 1:1 im Thermocycler ligiert. Nach erneuter Aufreinigung mit dem QIAquick^TM PCR Purification Kit⁵³ erfolgte eine zweite PCR mit den flankierenden Primern ccpAL und ccpAR (Elongation 2 min). Das resul-tierende Amplifikat wurde in den Vektor pGEMT-Easy kloniert (pGEM-ccpA), durch HpaI-Restriktion linearisiert und mit Alkalischer Phosphatase (CIP)⁵⁴ behandelt. Nach Ligation mit der PvuII geschnittenen Erythromycin-Resistenzkassette (pGEM-ccpA::ermR) erfolgte die Transformation in elektrokompetente S. suis Stamm 10 Zel-len. Nach dem Ausplattieren auf Columbia-Agarplatten mit 6 % Pferdeblut⁵⁵ und 1 µg/ml Erythromycin erfolgte zur Überprüfung der Insertion eine Kolonie-PCR mit den flankierenden Primern ccpAL und ccpAR (Elongation 4 min). Die Defizienz im ccpA Gen wurde darüber hinaus durch Northern Blot Analysen bestätigt. Als genspezifi-sche Sonde diente das durch eine PCR-Reaktion mit den Primern ccpAR und ccpARfor-HpaI generierte, 799 Bp lange Amplifikat.

3.3.11.7 Stamm 10∆arcD::ermR

Zur Inaktivierung des putativen Transportproteins ArcD wurde ein 1705 Bp langes Fragment mit den Primern arcDKOfor (CCG TTA CTG TGG CTG AAT TGG) und arcDKOrev (CCT TGC AAT CCT TCT TCA CC) aus dem S. suis Genom amplifiziert (Elongation 2 min). Dieses Amplifikat beinhaltet den 5´-Bereich des arcD Gens mit einer HpaI Enzymschnittstelle. Nach Klonierung in den pGEMT-Easy Vektor (pGEM-arcD) und Linearisierung durch HpaI Restriktion wurde die Erythromycin-Resistenzkassette in das arcD Gen inseriert. Dieses Konstrukt (pGEM-arcD::ermR) wurde wiederum in elektrokompetente Stamm 10 Zellen transformiert. Die Insertion des ermR Gens wurde durch Kolonie-PCR mit den Primern arcDKOfor und arcDKO-rev verifiziert.

53 vgl. ²²

54 vgl. ²⁴

55 vgl. ⁵

3.3.11.8 Das gfp-Reporterkonstrukt pGA14spc-ADfusion

Mit Hilfe der Primer IFL (TAA GGG CTA TGC TCG GAT TG) und IFR (CTG CCA ATT CTT CCA CCA TT) wurde ein 2836 Bp langes Fragment aus dem S. suis Ge-nom amplifiziert (Elongation 2 min), das sowohl den Promotorbereich des AD Ope-rons als auch das gesamte arcA Gen trug. Das Amplifikat wurde in den Klonierungs-vektor pGEMT-Easy⁵⁶ ligiert. Das resultierende Plasmid pIFGEMT-Easy wurde als template für die folgende inverse Pfu-PCR genutzt. Mit den Primern Backbone1-HindIII und Backbone2-KpnI wurde ein Amplifikat generiert, das das arcA Gen aus-spart. Parallel wurde das promotorlose green fluorescence protein (GFP) Allel gfpmut3* (ANDERSEN et al. 1998) mit den Primern gfp-HindIII (CCC AAG CTT CGT AAA GGA GAA GAA C) und gfp-KpnI (CGG GGT ACC TTA TTT GTA TAG TTC ATC) (Elongation 1 min) amplifiziert. Sowohl das insert als auch der Vektor wurden mit den Restriktionsenzymen HindIII und KpnI geschnitten und anschließend ligiert.

Bei dem resultierenden Konstrukt (pIFGEMT-Easy-ADfusion) handelt es sich um ei-ne transkriptioei-nelle Fusion zwischen dem AD Operon Promotor und dem gfpmut3*

Gen. Durch Restriktion mit dem Enzym EcoRI konnte ein die Fusion tragendes Fragment mit einer Größe von 2308 Bp separiert werden, das daraufhin in den eben-falls EcoRI geschnittenen Shuttlevektor pGA14spc (SMITH et al. 1995) kloniert wurde.

Als Negativkontrolle für die gfp-Reporterassays diente ein Konstrukt (pGA14spc -Prom), das das promotorlose gfp Gen trug. Dieses wurde mit dem Primerpaar gfp-HindIII/gfp-KpnI in pGEMT-Easy kloniert (Elongation 1 min). Durch Restriktion mit EcoRI wurde das Fragment ebenfalls in pGA14spc subkloniert. Beide Plasmide wur-den zu phänotypischen Untersuchungen in die Stämme 10, 10∆flpS::ermR und 10∆argR::ermR transformiert.

56 vgl. ²⁷

3.4 Sonstige Methoden