Die Regulation des ADS

Das ADS von S. suis wurde als ein Temperatur-induziertes Enzymsystem identifiziert (WINTERHOFF et al. 2001). Dafür wurden die Bakterien bei 32°C bis zu einer OD600

von 0,3 kultiviert, geteilt und für weitere 2 h bei 32°C bzw. 42°C bebrütet. Eine Induk-tion des ADS war sowohl im Western- als auch im Northern Blot bei Bakterien aus der 42°C Kultur zu beobachten (Abbildungen 4, 8). Von B. subtilis ist jedoch bekannt, dass eine Reaktion auf höhere Umgebungstemperaturen transkriptionell bereits nach 3 min erfolgt (SCHUMANN 2003). Nach einer Verkürzung des Intervalls der 42°C Exposition auf 1 h, war jedoch weder auf RNA- noch auf Proteinebene eine Induktion des ADS zu erkennen. Darüber hinaus rief eine Kultivierung für 3 h bei 32°C eben-falls eine Induktion des ADS hervor (Abbildung 4). Betrachtet man in diesem Zu-sammenhang die Wachstumskinetiken näher, ist zu erkennen, dass die Expression des ADS mit dem Eintritt in die stationäre Phase einhergeht. Das wiederum war in der 42°C Kultur 2 h, in der 32°C Kultur 3 h nach dem Temperaturwechsel der Fall (Abbildung 4). Die Temperatur scheint also als Induktor des ADS allenfalls eine indi-rekte Rolle zu spielen. Vielmehr ist von einer Wachstumsphasen-abhängigen Ex-pression des ADS auszugehen, die auf Grund des gesteigerten Metabolismus bei höherer Umgebungstemperatur früher eintritt (vgl. Abildungen 5, 9 und 10).

GRUENING et al. (2006) berichteten, dass die Supplementation von Glukose einen Rückgang der AD Aktivität bedingt. Diesem Phänomen liegt offenbar ein als Katabo-litrepression bekannter Mechanismus zu Grunde, wobei die Expression nicht-verwandter, katabolischer Enzyme gehemmt wird, wenn in der Umgebung energe-tisch günstigere und leichter katabolisierbare Energiequellen zur Verfügung stehen (MADIGAN 2001). Geht man nun davon aus, dass ein schnelleres Wachstum bei 42°C durch gesteigerten Metabolismus gleichzeitig einen höheren Glukosebedarf bedingt, könnte ein potentiell reprimierender Effekt der Katabolitrepression bei höhe-ren Temperatuhöhe-ren früher aufgehoben sein. Dafür spricht, dass in Übereinstimmung mit der Wachstumsphasen-abhängigen Expression des ADS die Glukose in der 42°C Kultur bereits 2 h, in der 32°C Kultur erst 3 h nach Temperaturwechsel vollständig verbraucht war (Abbildung 5). In Anwesenheit von Glukose konnte eine Expressions-induktion der Ornithin-Carbamoyltransferase, und damit des ADS, frühestens nach 4 h detektiert werden (Abbildung 6).

Die Katabolitrepression wird in grampositiven Bakterien u. a. über die Enzyme HPr (histidine-containing PTS phosphotransferase), HPr Kinase/Phosphatase (HPrK/P) und das Catabolite control protein A (CcpA) vermittelt (STULKE u. HILLEN 2000).

Bei der Katalyse von Glukose entsteht Phosphoenolpyruvat (PEP). Dies wiederum aktiviert das Enzym EI (PTS phosphotransferase enzyme I). Dabei handelt es sich um ein Mitglied des Phosphotransferasesystems (PTS), welches in Prokaryoten den wichtigsten Aufnahmemechanismus von Kohlenstoffen darstellt. EI phosphoryliert HPr an einem Histidinrest, was einen gesteigerten Import des entsprechenden Zu-ckers bewirkt. Die glykolytische Verwertung der Kohlenstoffquelle bedingt unweiger-lich eine Akkumulation von Intermediaten, wie z.B. Fruktose-1,6-bisphosphat. Das führt dazu, dass das Protein HPr zusätzlich an einem Serinrest in Position 46 durch HprK/P phosphoryliert wird. HPr-Ser-P wirkt als Co-Repressor auf das CcpA Protein.

Sinkt der Spiegel glykolytischer Intermediate, dephosphoryliert HPrK/P HPr-ser-P und die Katabolitrepression bleibt aus. Der metabolische Status grampositiver Bakte-rien spiegelt sich also in dem Verhältnis von HPr-his-P und HPr-ser-P wider. CcpA ist der transkriptionelle Mediator der Katabolitrepression (DEUTSCHER et al. 1995).

Wenn durch einen Co-Repressor, z.B. HPr-Ser-P, aktiviert, bindet es an sogenannte catabolite responsive elements (cre-sites) (HENKIN et al. 1991). Dabei kommt es je nach Lage dieser Erkennungssequenz in der Promotorregion entweder zu einer Akti-vierung oder einer Repression der Transkription (STULKE u. HILLEN 2000). Durch in silico Analysen des Promotorbereichs des AD Operons von S. suis konnte 42,5 Bp stromaufwärts des Transkriptionsstartpunktes (TS) eine Sequenz mit fast vollständi-ger Homologie zur cre-Konsenussequenz identifiziert werden. Diese überlavollständi-gert das Bindungsmotiv der RNA-Polymerase 35 Bp stromaufwärts des TS (Abbildung 7). Die Glukose-abhängige Repression der ADS Induktion könnte also ein durch CcpA be-dingter Effekt sein. Um diese These zu untermauern, wurde eine Insertionsmutante hergestellt und phänotypisch charakterisiert. Die Kulturbedingungen wurden derart konzipiert, dass ein Vergleich zu den vorher beschriebenen Experimenten gegeben war. Die OD600 von 0,3 (Zeitpunkt des Temperaturwechsels) wurde dabei als Zeit-punkt 0 definiert. Nach einer Stunde (logarithmische Phase) konnte in der Northern Blot Analyse mit der ccpA Mutante bereits eine leichte Transkription festgestellt wer-den, die sich proportional zur Zellzahl steigerte. Dies deutet darauf hin, dass CcpA zwar Einfluss auf die Repression des AD Operons hat, zeigt aber auch gleichzeitig,

dass andere Faktoren zur vollständigen Induktion des ADS notwendig sind. Der WT hingegen zeigte wieder das typische Expressionsprofil, d. h. eine Reprimierung der ADS Transkription in der mittleren logarithmischen Phase (nach 2 h) und eine starke Induktion im Zeitpunkt 3 h (stationäre Phase). Auch bei Stamm 10∆ccpA war die stärkste Transkription im Northern Blot in der stationären Phase sichtbar. Im Ver-gleich zum WT war das Signal jedoch von geringerer Intensität (Abbildung 8). Eine Erklärung dafür könnte sein, dass CcpA, oder ein dem CcpA Regulon (ZOMER et al.

2007) zugehöriges Protein, gleichzeitig als Induktor des ADS oder assoziierter Regu-latoren fungiert. Darüber hinaus ist ebenfalls nicht auszuschließen, dass Arginin durch die basale Transkription des ADS in der logarithmischen Phase bei fehlendem CcpA Protein verstoffwechselt wird. Dieses Arginin stände dann in der späten statio-nären Phase nicht mehr zur Verfügung, um die Arginin-abhängige Transkripti-onssteigerung zu induzieren. Dafür spricht, dass ein rgg-negativer S. pyogenes Stamm (Rgg ist ein funktionelles Homolog von CcpA) bereits in der frühen logarith-mischen Phase Arginin verstoffwechselte (CHAUSSEE et al. 2003).

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich der Sauerstoffgehalt des Wachs-tumsmediums antiproportional zur Induktion des ADS von S. suis verhält. Ähnlich wie der Glukosegehalt erreichte der O2-Partialdruck seine geringsten Werte in der 42°C Kultur 2 h nach Temperaturwechsel. Ein vergleichbarer Wert konnte bei den bei 32°C bebrüteten Streptokokken erst nach 3 h gemessen werden (Abbildung 9). Umgekehrt konnte eine Kultivierung unter permanenter Sauerstoffzufuhr die Induktion des ADS unterdrücken (Abbildung 11). Dies war allerdings nur mit der ccpA negativen Mutante möglich, so dass, hierarchisch betrachtet, die Glukose-abhängige Regulation über der Sauerstoff-abhängigen Regulation zu stehen scheint. Aus der Literatur ist be-kannt, dass die Sauerstoff-abhängige Induktion des ADS durch Vertreter der CRP/FNR Familie von Transkritpionsregulatoren hervorgerufen wird (DONG et al.

2004; GAMPER et al. 1991; LU et al. 1999; MAKHLIN et al. 2007). Alle Mitglieder dieser Familie zeigen einen typischen, gemeinsamen Aufbau. Sie haben eine Länge von ca. 230 Aminosäuren und besitzen einen hoch homologen C-terminalen Bereich.

In diesem befindet sich das sogenannte helix-turn-helix Motiv, das die Bindung des Regulators an die DNA ermöglicht (GREEN et al. 2001). Die Sensor-Domäne ist im N-terminalen Bereich lokalisiert und weist im Allgemeinen keine hohen Homologien zu entsprechenden Bereichen anderer Mitglieder der CRP/FNR Familie auf. Die

na-mensgebenden Vertreter der Regulatorfamilie sind das CRP- und das FNR-Protein.

CRP steht für cAMP receptor protein und ist bislang nur für gramnegative Bakterien beschrieben. Bei diesen fungiert es allerdings als zentraler Regulator der Katabo-litrepression. Steigt der cAMP Spiegel in der Zelle an, kommt es zu Inkorporation von cAMP, Homodimerisierung und Aktivierung diauxisch reprimierter Gene. Das fumara-te and nitrafumara-te reduction regulator (FNR) Profumara-tein hingegen ist der wohl bekannfumara-tesfumara-te Vertreter der Sauerstoff-abhängigen Regulatoren. Charakteristisch sind die vier Cysteinreste, die unter anaeroben Bedingungen als Liganden zur Inkorporation eines Eisen-Schwefel-Clusters fungieren. Auch hier kommt es zu einer Homodimerisierung und Transkriptionsregulation. Im Allgemeinen fehlen den Vertretern der FNR-like pro-teins (FLP) zwei dieser Cysteinreste. FLPs sind, im Gegensatz zu grampositiven Bakterien, bei gramnegativen Bakterien weit verbreitet und charakterisieren sich da-durch, dass sie eine fnr-negative E. coli Mutante nicht komplementieren können. Das beruht wohl auf der Unfähigkeit, an der FNR-spezifischen Konsensussequenz zu binden (GOSTICK et al. 1998; GREEN et al. 2001; KORNER et al. 2003). Trotzdem ist das FlpA von L. lactis in der Lage, einen Eisen-Schwefel-Cluster zu inkorporieren (SCOTT et al. 2000). Im Gegensatz zum FNR liegt FlpA aber bereits als Homodimer vor und bindet den Komplex unter aeroben Bedingungen, was zu einer Inaktivierung des Regulators führt. Das FLP von Lactobacillus casei bedient sich eines Mechanis-mus der Selbstaktivierung ohne Eisen-Schwefel-Komplex (GOSTICK et al. 1998;

GOSTICK et al. 1999). Auch dieses Protein liegt bereits als Homodimer vor und bil-det in Anwesenheit von Sauerstoff intramolekulare Disulfidbrücken aus. Diese aktive Form bindet wiederum an entsprechende Promotorsequenzen und induziert die Transkription. Für das FNR-like protein of S. suis (FlpS) ist ebenfalls eine Beteiligung an der Sauerstoff-abhängigen Regulation des ADS anzunehmen. So konnte gezeigt werden, dass der flpS-negative Stamm 10∆flpS nicht mehr in der Lage war, das ADS unter anaeroben Bedingungen zu induzieren (Abbildung 13). Dabei sprach die schnelle Transkriptionsinduktion bei gleichzeitiger Abnahme des Sauerstoffpartial-drucks für eine Beteiligung eines konstitutiv exprimierten Regulatorgens (Abbildung 17), dessen Aktivierung durch Konformationsänderung erfolgt, da eine Proteinneu-synthese durch Chloramphenicol ausgeschlossen werden konnte (Abbildung 10).

Weiterführende Sequenzanalysen ergaben, dass es sich bei FlpS tatsächlich um ein Protein der CRP/FNR Familie handeln muss. Da FlpS jedoch lediglich zwei

Cystein-reste enthält, ist es in die Gruppe der FNR-like Proteine einzuordnen. Die Beteiligung eines Eisen-Schwefel-Clusters bei der Aktivierung des Regulators ist allerdings als unwahrscheinlich anzusehen, da die Supplementation von Eisenchelatoren keine Induktion der ADS Expression in S. suis bewirkte (Dissertation WINTERHOFF 2001).

Funktionell scheint also eine Homologie zum Flp von L. casei gegeben zu sein. An-dererseits konnte jedoch mittels Insertionsmutagenese gezeigt werden (Abbildung 13), dass FlpS als Induktor des ADS fungiert und somit, abweichend vom L. casei FLP, unter anaeroben Bedingungen in der aktiven Konformation vorliegen müsste.

Eigene Untersuchungen haben allerdings gezeigt, dass ein in TY+Gal Medium kulti-vierter WT Stamm trotz permanenter Sauerstoffzufuhr (Schütteln bei 250 Upm) be-reits in der frühen logarithmischen Phase eine vollständige Induktion des ADS auf-wies (Daten nicht gezeigt). Ein flpS-defizienter Stamm hingegen konnte in diesem Minimalmedium auch unter Sauerstoffzufuhr kein dem WT vergleichbares Wachs-tumsverhalten aufweisen. Erst der Austausch von Galaktose gegen Glukose führte zu vergleichbaren Wachstumskinetiken (Daten nicht gezeigt). Nimmt man an, dass es sich bei FlpS nicht um einen Sauerstoff-abhängigen Regulator handelt, sondern das dieser vielmehr auf den Energiegehalt der Zelle reagiert, kann auch der oben beschriebene Phänotyp der ccpA Mutante erklärt werden, die unter aeroben Bedin-gungen die ADS Transkription reprimierte (Abbildung 11). Da es sich bei S. suis um ein homofermentatives Bakterium handelt, ist eine oxidative Phosphorylierung auf Grund unvollständiger Synthesewege für Hämin und Chinone nicht möglich. Für S.

agalactiae konnte aber gezeigt werden, dass die Integration von externem Hämin und Chinon in die bakterielle Membran eine vollständige Ausprägung der Atmungs-kette zur Folge haben kann (YAMAMOTO et al. 2005). In diesem Fall würde Sauer-stoff als finaler Elektronenakzeptor verwendet werden. Da es sich bei THB um ein sehr reiches, auf Fleischextrakt basierendes Medium handelt, ist von der Verfügbar-keit von Hämin und Chinonen auszugehen. Das Schütteln bedingte in diesem Fall eine gute Dissoziation des Sauerstoffs in der Flüssigkeit und führte insgesamt zu ei-nem höheren ATP-Nettogewinn, dass sich neben der Repression des ADS auch in einem besseren Wachstum (YAMAMOTO et al. 2005) widerspiegelte.

Wie oben bereits erwähnt, haben alle Mitglieder der CRP/FNR Familie von Transkrip-tionsregulatoren einen hochkonservierten C-terminalen Bereich, der für die Bindung des Proteins an die DNA verantwortlich ist. Das spiegelt sich wiederum in einer

ho-hen Homologie der DNA-Bindungssequenzen wider. So weisen alle das imperfekte Palindrom TGA/TCA auf (GREEN et al. 2001). Wie bereits beschrieben, zeigt eine Sequenz im Promotorbereich des ADS an Position -65,5 höchste Homologie zur CRP Konsensussequenz (Abbildung 7). Ein Vergleich zwischen dem CRP von E. coli und dem FlpS von S. suis ergab jedoch keine Übereinstimmungen in den für die cAMP Inkorporation essentiellen Aminosäureresten. Ein ähnliches Phänomen ist auch für das ArcR Protein von Staphylococcus aureus bekannt. Auch hier erfolgt die Bindung eines potentiell Sauerstoff-abhängigen Regulators an eine für das CRP Pro-tein homologe Erkennungssequenz (MAKHLIN et al. 2007). Ob es sich dabei um ein phylogenetisches Rudiment oder einen bis jetzt nicht entschlüsselten Mechanismus Energie-abhängiger Regulation handelt, kann hier nicht geklärt werden.

Reporterstudien zeigten, dass die Promotoraktivität des ADS von S. suis durch die Anwesenheit von Arginin um den Faktor 1,5 gesteigert werden kann (Abbildung 8).

Ähnliche Beobachtungen machten auch ZENG et al. (2006) bei S. gordonii. Sie konnten nachwiesen, dass ArcR, ein Protein aus der Arginine Repressor Familie, eine Transkriptionssteigerung des ADS bewirkt. Charakteristisch für die Arginin-Repressoren ist die funktionelle Zweiteilung des Proteins. Der N-terminale Teil ist dabei für die DNA Bindung verantwortlich (GRANDORI et al. 1995; MAAS 1994). Der C-terminale Teil hingegen inkorporiert das Arginin und stabilisiert den hexameren Zustand. Studien an dem E. coli ArgR ergaben, dass die Aminosäuren Glutamin und Asparaginsäure für die Argininbindung verantwortlich sind. Diese sind auch im ArgR von S. suis hoch konserviert und befinden sich, wie bei S. gordonii, an den Positio-nen N104, D125 und D126. Um eine Beteiligung von ArgR an der Transkription des ADS nachzuweisen, wurden EMSA-Tests durchgeführt. Dabei konnte der Bereich der Bindung auf einen 74 Bp langen Sequenzabschnitt eingegrenzt werden (Abbil-dung 18). In diesem konnten allerdings weder Homologien zur Bin(Abbil-dungssequenz des E. coli ArgR noch ein für DNA-Bindungsproteine typisches palindromes Sequenz-muster nachgewiesen werden. Für das ArcR Protein von S. gordonii identifizierten ZENG et al. (2006) einen 28 Bp langen Bereich, der ebenfalls keine Homologien zur Bindungssequenz des ArgR Proteins von E. coli aufwies. Vergleicht man nun die ArcR Bindungsstelle von S. gordonii mit dem Promotorbereich des AD Operons von S. suis konnten, außer einer A/T reichen Region in beiden Fällen, keine weiteren Homologien nachgewiesen werden. Darüber hinaus fiel auf, dass sowohl für das

ArcR von S. gordonii als auch für das S. suis ArgR kein Arginin zur Bindung an die DNA notwendig ist (Abbildung 18). Die Supplementation zusätzlichen Arginins führt aber sehr wohl zu einer Stabilisierung der DNA-Protein-Interaktion (ZENG et al.

2006). Um einer ADS Expression bei Abwesenheit des Substrats Arginin vorzubeu-gen, sind mehrere Regulationsmechanismen vorstellbar. So unterliegt z. B. das ArgR Protein von E. coli der Autoregulation (LIM et al. 1987). Für B. subtilis ist ein posttranskriptioneller Regulationsmechanismus des rocDEF-Operons (Arginin-kataboler Stoffwechselweg) nachgewiesen worden (HEIDRICH et al. 2007). Einer konstitutiven Expression des Arginin Repressors AhrC steht eine Glukose-abhängige Repression durch die non-coding RNA S1 gegenüber. Das bedeutet, in Anwesenheit von Glukose kommt es zu einer transkriptionellen Induktion von S1, die wiederum die Translation der konstitutiv transkribierten ahrC mRNA verhindert. Eine Arginin-abhängige Induktion ist daher nur in Abwesenheit von Glukose möglich (HEIDRICH et al. 2007). Die Frage der Regulation des S. suis ArgR muss indes offen bleiben. Ob es sich dabei um einen transkriptionellen, wie für E. coli gezeigt, oder um einen posttranskriptionellen Mechanismus (B. subtilis) handelt, ist in weiterführenden Stu-dien zu klären.

Zusammenfassend ist die Regulation des ADS sehr komplex. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich die Induktion proportional zur Zellzahl und antiproportional zum Sauerstoff- und Glukosegehalt verhält (Wachstumsphasen-abhängig). Darüber hinaus erhöht sich die Promotoraktivität des AD Operons in Anwesenheit von Argi-nin. Eine vereinfachte schematische Darstellung der Abhängigkeit des ADS von den verschiedenen Parametern ist Abbildung 28 zu entnehmen. Während ein repressori-scher Effekt durch Glukose (Katabolitrepression) direkt oder indirekt durch das CcpA vermittelt wird und die Arginin-abhängige Induktion über ArgR als gesichert anzuse-hen ist, bedarf die FlpS-abhängige Regulation weiterer Untersuchungen. Als Homo-fermentierer sind die Streptokokken normalerweise unabhängig von der externen Sauerstoffkonzentration. Ob es also biologisch sinnvoll ist, einen Sauerstoff-abhängigen Regulator an einen alternativen, Energie-produzierenden Stoffwechsel-weg zu koppeln, wenn die primäre ATP-Synthese ebenfalls Sauerstoff-unabhängig abläuft, müssen weitere Untersuchungen zeigen. Auffallend war weiterhin, dass, ähnlich wie für B. licheniformis beschrieben (MAGHNOUJ et al. 1998; MAGHNOUJ et al. 2000), sowohl die Defizienz im argR Gen als auch im flpS Gen nur eine basale

Expression des ADS bedingte, die sich durch Arginin nicht weiter verstärken ließ (Abbildung 15). Da eine mögliche transkriptionelle Interaktion ausgeschlossen wer-den konnte (Abbildung 17), sind weitere Studien zur genauen Aufklärung dieses Me-chanismus notwendig. Denkbar ist, dass sowohl FlpS als auch ArgR essentiell für die Stabilisierung des RNA-Polymerase-DNA-Komplexes sind. Für das ArcR von B. li-chenifomis ist bekannt, dass es bei der Interaktion mit der DNA zu einem sogenann-ten „bending“ kommt (MAGHNOUJ et al. 2000). Dabei wird diese um ca. 90° gewun-den (SCHULTZ et al. 1991). Geht man nun davon aus, dass FlpS tatsächlich an die aus dem Promotorbereich des AD Operons identifizierte, CRP-homologe Sequenz bindet, könnte ArgR auf diese Weise in direkte Nachbarschaft zur RNA-Polymerase treten und so dessen Bindung an die DNA zusammen mit dem FlpS stabilisieren.

Abbildung 28: Vereinfachtes Modell der Zusammenhänge zwischen der ADS Induktion und verschiedenen Wachstumsparametern.

5.2 Die funktionelle Charakterisierung des ADS als