Sauerstoff und die Regulation durch das FNR-like protein of

4.1.3.1 Sauerstoff

Um den Einfluss des Sauerstoffgehaltes auf die ADS Expression zu studieren, wur-den parallel zu wur-den Wachstumskinetiken Sauerstoffmessungen durchgeführt. S. suis Stamm 10 wurde über Nacht in THB Medium bei 37°C bebrütet. Nach 1:15 Verdün-nung in frischem THB Medium wurden die Bakterien bei 32°C bis zu einer OD600 von 0,3 kultiviert, geteilt und für weitere 4 h bei 32°C bzw. 42°C bebrütet. Dabei wurden stündlich sowohl der Sauerstoffpartialdruck als auch die OD600 bestimmt. Wie für den Glukosegehalt beschrieben (Abbildung 5), konnte auch in diesem Fall eine Assozia-tion zwischen dem Sauerstoffverbrauch und dem Wachstum hergestellt werden (Ab-bildung 9). Bereits 1 h nach Temperaturwechsel wurde in dem 42°C Kulturansatz ein Sauerstoffpartialdruck von 17,2 mbar gemessen, während der in der 32°C Kultur 22,4 mbar betrug. Der niedrigste Partialdruck in der 42°C Kultur konnte dann mit 6,3 mbar 2 h nach Temperaturwechsel dokumentiert werden. Das war genau der Zeit-punkt, an dem die Western Blot Analyse erstmals eine vollständige Induktion des ADS erkennen ließ (Abbildung 4). Nach 3 h betrug der Sauerstoffpartialdruck der 32°C Kultur 12,3 mbar. Auch in diesem Fall konnte eine Induktion des ADS im Wes-tern Blot beobachtet werden. Um nun den Einfluss der Parameter „Zellzahl“ und

„Glukosekonzentration“ auf die Sauerstoff-abhängige ADS Transkription möglichst gering zu halten, wurde S. suis Stamm 10 bei 32°C bis zu einer OD600 von 0,8 kulti-viert. Dabei wurde der Erlenmeyerkolben im Abstand von 15 min geschwenkt. Vorhe-rige Versuche zeigten, dass unter diesen Bedingungen das ADS nicht induziert ist.

Durch Zugabe von Chloramphenicol wurde die Translationsmaschinerie gehemmt.

Dadurch sollte es den Bakterien zum einen nicht mehr möglich sein, sich zu

vermeh-ren. Zum anderen sollten die Zellen nicht mehr in der Lage sein, Enzyme des Gluko-sekatabolismus zu synthetisieren. Die Bakterienkultur wurde geteilt und für 10 min bei 32°C bzw. 42°C inkubiert. Danach wurden die OD600 und der Sauerstoffpartial-druck des Mediums bestimmt. Die Bakterien wurden geerntet und lysiert, um gRNA zu präparieren. Aus Abbildung 10A wird ersichtlich, dass das Wachstum durch Chlo-ramphenicolzugabe gehemmt wurde. Gleichzeitig sank der Sauerstoffpartialdruck in der 42°C Kultur von initial 60 mbar auf 8 mbar, wo hingegen der in der 32°C Kultur lediglich auf 24 mbar sank. Der entsprechende Northern Blot, hybridisiert mit einer arcB spezifischen Gensonde, zeigte eine Induktion des ADS lediglich bei den bei 42°C kultivierten Streptokokken (Abbildung 10B).

Wie oben bereits beschrieben, kann durch Glukose die Expression des ADS repri-miert werden. Um den Einfluss dieser Glukose-abhängigen Repression auszuschlie-ßen, wurde eine Insertionsmutante im ccpA Gen hergestellt (Stamm 10∆ccpA, siehe oben). Der Einfluss von Sauerstoff auf die ADS Transkription sollte nun untersucht werden, indem Übernachtkulturen 1:15 in THB verdünnt und bis zu einer OD600 von 0,3 bei 37°C kultiviert wurden. Der Ansatz wurde geteilt und entweder als Stand- o-der als Schüttelkultur bei 250 Umdrehungen pro min weiterkultiviert. Ein, 2 und 3 h nach der Teilung wurden je 10 ml Bakterienkultur entnommen, um daraus gRNA zu präparieren. Der Northern Blot in Abbildung 11, hybridisiert mit einer arcB spezifi-schen Gensonde, zeigt eindeutig eine Aufregulation des AD Operons bei zunehmen-der Wachstumsdauer, bzw. höherer Zellzahl, bei den Bakterien aus zunehmen-der Standkultur.

Eine Induktion des AD Operons war dagegen auch nach 3 h nicht zu erkennen, wenn während der Kultivierung eine dauerhafte Belüftung gegeben war.

Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass neben der Wachstumsdauer und der Glukose-konzentration auch der Sauerstoffgehalt in der Umgebung einen Einfluss auf die In-duktion der ADS Expression hat. In Analogie zum Glukosegehalt erfolgt offensichtlich eine Induktion des ADS bei sinkendem Sauerstoffpartialdruck.

Abbildung 9: Temperatur-abhängiger Sauerstoffverbrauch im Wachstumsverlauf.

A: S. suis Stamm 10 wurde in THB Medium bei 32°C bis zu einer OD600 von 0,3 (0) kultiviert, geteilt und für weitere 1 – 4 h bei 32°C (●--●) bzw. 42°C (■─■) bebrütet. Der Wachstumsverlauf wurde durch Bestimmung der Bakterienzahl anhand der OD600 dokumentiert.

B: Parallel zur Messung der optischen Dichte 1 – 4 h nach Temperaturwechsel wurde der Sauerstoff-gehalt des Mediums für die 32°C (●- -●) bzw. die 42°C (■─■) Kultur mit Hilfe einer Sauerstoffelektrode gemessen.

Abbildung 10: Sauerstoff-abhängige Transkription des ADS.

A: S. suis Stamm 10 wurde unter leichtem Schütteln bei 32°C bis zu einer OD600 von 0,8 (0) bebrütet.

Chloramphenicol wurde zugesetzt. Die Kultur wurde geteilt und für 10 min bei 32°C bzw. 42°C ohne Schütteln inkubiert. Die OD600 der 32°C (■─■) bzw. 42°C Ansatz (●─●) Kultur wurde bestimmt, ebenso der Sauerstoffpartialdruck für die 32°C (□- -□) bzw. die 42°C Kultur (○- -○).

B: Zum Zeitpunkt 10 min wurden die Bakterien aus A geerntet, lysiert und gRNA wurde präpariert.

Nach Transfer auf eine Nitrozellulosemembran erfolgte die Auswertung des Northern Blots mit Hilfe einer arcB spezifischen Gensonde. Der Mengenabgleich konnte durch die 16S bzw. 23S ribosomale rRNA gewährleistet werden. Operon-spezifische Transkripte sind mit Pfeilen gekennzeichnet.

Abbildung 11: Sauerstoff-abhängige Repression des ADS.

S. suis Stamm 10∆ccpA wurde in THB Medium bei 37°C bis zu einer OD600 von 0,3 bebrütet und ge-teilt. Die eine Hälfte wurde als Stand- (St), die andere als Schüttelkultur (Sch) mit 250 Upm für weitere 3 h bei 37°C kultiviert. Nach 1 – 3 h wurden jeweils 10 ml Bakterienkultur entnommen. Die Zellen wur-den lysiert und die gewonnene gRNA auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Die Auswertung im Northern Blot erfolgte mit einer arcB spezifischen Gensonde. Der Mengenabgleich konnte durch die 16S bzw. 23S ribosomale rRNA gewährleistet werden. Operon-spezische Transkripte sind durch Pfei-le gekennzeichnet.

4.1.3.2 Das FNR-like protein of S. suis (FlpS)

Für S. gordonii konnte gezeigt werden, dass das Flp Protein an der Sauerstoff-abhängigen Regulation des ADS beteiligt ist (DONG et al. 2004). Da, trotz hoher He-terogenität der Mitglieder der CRP/FNR Familie, eine Homologie zum Flp von 64 % besteht, sollte untersucht werden, ob auch das Flp von S. suis (FlpS) für die oben beschriebene Reaktion des ADS auf wechselnde Sauerstoffbedingungen verantwort-lich ist.

In silico Analysen des Promotorbereichs des AD Operons zeigten, dass sich 65,5 Bp stromaufwärts des TS eine Sequenz befindet, die nur in einem Nukleotid von der Konsensussequenz (TGTGA – N6 – TCACA) der CRP Bindungsstelle abweicht (Ab-bildung 7). Um nun den Einfluss von FlpS auf die ADS Transkription zu überprüfen, wurde eine Insertionsmutante (Stamm 10∆flpS) generiert und mittels PCR, Southern Blot- und Northern Blot Analysen verifiziert (Daten nicht gezeigt). Die Bakterien wur-den, wie oben bereits beschrieben, über Nacht bei 32°C kultiviert, 1:15 in frischem THB Medium verdünnt und bis zu einer OD600 von 0,3 bei gleicher Temperatur

be-brütet. Die Entnahme von 10 ml Bakterienkultur erfolgte jeweils stündlich bis 4 h nach dem Temperaturwechsel auf 42°C (Abbildung 12). Mit Hilfe von Anti-OCT-Antikörpern konnte im Western Blot beim WT eine Induktion des ADS 2 h nach Tem-peraturwechsel auf 42°C bestätigt werden (Spur 7). Bei einer Bebrütungstemperatur von 32°C war diese Induktion erst nach 3 h sichtbar (Spur 9). Stamm 10∆flpS hinge-gen war zu keinem Zeitpunkt in der Lage, eine dem WT vergleichbare Expression zu induzieren (Spuren 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16). Unter Berücksichtigung des Sauerstoff-verbrauchs im Wachstumsverlauf (Abbildung 9) konnte angenommen werden, dass eine Reaktion auf wechselnde Sauerstoffpartialdruckbedingungen durch das Fehlen des flpS Gens nicht mehr möglich sei. Zur Absicherung wurden die Bakterien in einer Anaerobierkammer bei 37°C bebrütet. 10 ml Bakterienkultur wurden in der mittleren logarithmischen Phase (OD600 0,3) entnommen. Nach der Präparation von Ganzzell-lysaten wurden diese mittels Western Blot auf eine PVDF-Membran überführt, und diese wurde sowohl mit Anti-OCT- als auch mit Anti-AD-Antikörpern inkubiert (Abbil-dung 13A). Die vorherigen Ergebnisse bestätigend, konnte auch in diesem Fall keine Induktion der ADS Expression bei Stamm 10∆flpS (Spur 2, 4), im Gegensatz zum WT (Spur 1, 3), beobachtet werden. Zum Ausschluss polarer Effekte durch die Inser-tion der Spectinomycin Resistenzkassette in das flpS Gen wurde die entsprechende Mutante komplementiert. Mittels PCR wurde das vollständige flpS Gen aus dem WT Genom mit Hilfe der Primer flpSagg-SalI und flpSend-PstI amplifiziert. Dabei wurde die Ribosomenbindungsstelle (RBS) zu der für grampositive Bakterien optimalen Nukleotidfolge „ggagg“ verändert (STROHL 1992). Das Amplifikat wurde daraufhin in den Shuttlevektor pORI23 (QUE et al. 2000) kloniert und episomal in Stamm 10∆flpS transformiert. Der WT, die flpS Mutante und die komplementierte Mutante 10∆flpS::pORI23flpS wurden über Nacht bei 37°C in THB Medium anaerob bebrütet.

Nach 1:15 Verdünnung in frischem THB Medium, und Kultivierung bis zum Zeitpunkt 0 (OD600 0,3), wurden 10 ml Bakterienkultur nach weiteren 3 h Bebrütungszeit ent-nommen. Der Western Blot in Abbildung 13B zeigte die erwartete Induktion der OCT, und damit des ADS, bei den WT Lysaten (Spur 1) bzw. die fehlende Induktion bei Stamm 10∆flpS (Spur 2). Durch Komplementierung konnte der WT Phänotyp wieder hergestellt werden (Spur 3), so dass die Defizienz der ADS Expression von Stamm 10∆flpS nicht auf polare Effekte zurückzuführen war.

Die Ergebnisse in diesem Abschnitt deuten auf eine Beteiligung von FlpS an der Sauerstoff-abhängigen Regulation des ADS hin. Des Weiteren konnte gezeigt wer-den, dass FlpS essentiell für die Induktion des ADS bei S. suis ist.

Abbildung 12: Einfluss der flpS Defizienz auf die Expression des ADS im Wachstumsverlauf.

S. suis Stamm 10 und 10∆flpS wurden in THB Medium bei 32°C bis zu einer OD600 von 0,3 bebrütet, geteilt und für 4 h Stunden bei 32°C bzw. 42°C weiterkultiviert. Nach 1 – 4 h wurden 10 ml Bakterien-kultur entnommen. Die Zellen wurden lysiert und als Ganzzelllysate (10 µg) auf eine Nitrozellulose-membran transferiert. Die Auswertung des Western Blots erfolgte mit Hilfe von Anti-OCT-Antikörpern (α-OCT). Die kreuzreaktive, unspezifische Bande (*) zeigt, dass vergleichbare Mengen an Ganzzellly-sat aufgetragen wurden.

Abbildung 13: Einfluss der flpS Defizienz auf die anaerobe ADS Expression.

A: S. suis Stamm 10 und 10∆flpS wurden unter anaeroben Bedingungen bis zu einer OD600 von 0,3 kultiviert. Die Bakterien wurden geerntet, lysiert und in angegebenen Mengen auf eine PVDF-Membran geblottet. Die Detektion im Western Blot erfolgte mit Anti-AD- und Anti-OCT-Antikörpern (α-AD, α-OCT). Die kreuzreaktive, unspezifische Bande (*) zeigt, dass vergleichbare Mengen an Ganz-zelllysat aufgetragen wurden.

B: S. suis Stamm 10, 10∆flpS und die komplementierte Mutante 10∆flpS::pORI23flpS wurden bis in die stationäre Phase bei 37°C unter anaeroben Bedingungen bebrütet. Ansonsten wurde wie unter A verfahren. Die Detektion erfolgte durch Anti-OCT-Antikörper (α-OCT).