Alle Klonierungsarbeiten wurden mit Hilfe des Escherichia coli (E. coli) Stammes DH5α [supE44 ∆lacU169 (Φ80lacZ ∆M15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1]
durchgeführt. Als Bestandteil des The QiaexpressionistTM1 Kits wurde zur Herstellung rekombinanter Proteine der E. coli Stamm M15 [pREP4], ein E. coli Stamm K12 De-rivat, mit folgendem Phänotyp verwendet: NaIS, StrS, RifS, Thi–, Lac–, Ara+, Gal+, Mtl–, F–, RecA+, Uvr+, Lon+.
3.2.1.1 Stammhaltung und Kultivierung
Alle E. coli Stämme wurden als Glycerinstocks bei -72°C gelagert. Dafür wurden 500 µl Bakterienkultur mit 500 µl 50 %iger [v/v] Glycerinlösung in A. bidest gemischt. Die Anzucht erfolgte auf Luria-Bertani- (LB)- Agarplatten (1 % [w/v] NaCl, 1 % [w/v]
1 QIAGEN, Hilden
to-Trypton2, 0,5 % [w/v] Hefeexktrakt, 1,5 % [w/v] Agar-Agar) bei 37°C für 12 – 14 h.
Auf festen Nährböden waren die Bakterien bis zu vier Wochen bei 4°C lagerbar. Zur Anzucht in Flüssigkultur wurden die Bakterien in LB-Medium bei 37°C und 120 Upm für 12 – 14 h in Schikane-Erlenmeyerkolben kultiviert. Falls erforderlich wurden Anti-biotika in folgenden Konzentrationen zugesetzt: Ampicillin 100 µg/ml, Erythromycin3 100 µg/ml (bei der Kultivierung von E. coli mit dem Vektor pORI23 500 µg/ml), Ka-namycin 25 µg/ml, Spectinomycin 50 µg/ml.
3.2.2 S. suis
In dieser Arbeit wurde ausnahmslos der hochvirulente mrp/ef/sly/ofs-positive Serotyp 2 Stamm 10 bzw. die Kapsel-defiziente Mutante Stamm 10∆cpsEF::spcR verwendet (SMITH et al. 1999). S. suis Stamm 10 wurde aus einem an Meningitis erkrankten Schwein isoliert.
3.2.2.1 Stammhaltung und Kultivierung
Die Lagerung von S. suis Stämmen einschließlich aller Mutanten erfolgte ebenfalls in Glycerinstocks (500 µl 50 %ige [v/v] Glycerinlösung und 500 µl Bakterienkultur) bei -80°C. Zur Anzucht auf festen Nährböden wurden die Bakterien auf Columbia-Blutagarplatten mit 6 % Schafblut4 bzw. 6 % Pferdeblut5 über Nacht bei 37°C bebrü-tet. Die kulturelle Anzucht erfolgte in Todd Hewitt broth6 (THB) stehend bei 37°C in Erlenmeyer-Kolben. Antibiotika wurden ggf. in folgenden Konzentrationen zugesetzt:
Chloramphenicol 8 µg/ml, Erythromycin 1 µg/ml (pORI23 5 µg/ml), Spectinomycin 100 µg/ml. Die Kultivierung der mutagenisierten Stämme erfolgte in den Übernacht-kulturen mit entsprechendem Antibiotikum.
2 DIFCO, Detroit, USA
3 FLUKA, Buchs, Schweiz
4 OXOID, Wesel
5 WDT, Serumwerk Memsen, Hoyerhagen
6 BD, New York, USA
3.2.3 Kultivierungsbedingungen zur Untersuchung der ADS Expression Zur Untersuchung von Temperatur als Einfluss auf Wachstum und ADS Expression wurden 10 ml THB Medium mit einer S. suis Kolonie beimpft und für 12 – 14 h bei 32°C im Wasserbad kultiviert. Nach 1:15 Verdünnung in frischem THB Medium (100 ml) wurde die Kultur bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm (OD600) von 0,3 bebrütet, geteilt und für weitere 1 – 4 h bei 32°C bzw. 42°C im Wasserbad kultiviert.
Der Wachstumsverlauf wurde durch Bestimmung der Zellzahl anhand der OD600 do-kumentiert. Ggf. wurde der Sauerstoffgehalt des Mediums im Wachstumsverlauf mit Hilfe einer Sauerstoffelektrode nach Herstellerangaben gemessen. Zur Bestimmung des Glukosegehaltes im Wachstumsverlauf wurden nach 1 – 4 h jeweils 10 ml Bak-terienkultur abzentrifugiert (12000 Upm, 4°C, 10 min), der Überstand wurde sterilfilt-riert (Porengröße: 0,2 µm), und der Glukosegehalt mit Hilfe des glucose (GO) assay Kits7 nach Herstellerangaben bestimmt. Anschließende Northern- bzw. Western Blot Analysen wurden, wie im Folgenden beschrieben, durchgeführt. Um den Einfluss von Wachstumsdauer und Glukosegehalt auf die ADS Expression auszuschließen, wurde S. suis Stamm 10 bis zu einer OD600 von 0,8 bei 32°C im Wasserbad bebrütet. Dabei wurde die Belüftung durch halbstündliches Schwenken des Erlenmeyerkolbens si-chergestellt. Nach Zugabe von 8 µg/ml Chloramphenicol (finale Konzentration) wurde die Kultur geteilt und für weitere 10 min bei 32°C bzw. 42°C im Wasserbad inkubiert.
Parallel wurde die OD600 und der Sauerstoffpartialdruck des Mediums mit Hilfe einer Sauerstoffelektrode zum Zeitpunkt des Temperaturwechsels und nach 10 min be-stimmt. Die Auswertung der transkriptionellen Induktion erfolgte anhand von Northern Blot Analysen.
Zur Bestimmung der ADS Expression unter anoxischen Bedingungen wurden die Bakterien in einer Anaerobierkammer bebrütet. Zur Entgasung wurde frisch autokla-viertes THB Medium vor Beginn der Wachstumskinetik für 2 d in der Anaerobier-kammer inkubiert. Zehn ml Kulturmedium wurden mit einer Kolonie fraktioniert aus-gestrichener Streptokokken beimpft und für 12 – 14 h bei 37°C bebrütet. Nach 1:15 Verdünnung in frischem Medium erfolgte eine Kultivierung von 8 h bei 37°C. Ggf.
wurden 50 mM Arginin-HCl zugesetzt. Die ADS Expression wurde durch Western
7 SIGMA, Saint Louis, USA
Blot Analysen ermittelt. Um den Einfluss der ständigen Verfügbarkeit von Sauerstoff auf die ADS Expression zu untersuchen, wurden 20 ml THB Medium mit einer Kolo-nie fraktioKolo-niert ausgestrichener Streptokokken beimpft und für 12 – 14 h bei 37°C bebrütet. Nach 1:15 Verdünnung in frischem THB Medium wurden die Bakterien bis zu einer OD600 von 0,3 kultiviert, geteilt und für weitere 3 h bei 37°C bebrütet. Dabei wurde die eine Hälfte als Standkultur, die andere als Schüttelkultur bei 250 Upm in einem Schikane-Erlenmeyerkolben kultiviert. Die Auswertung erfolgte durch Northern Blot Analysen.
Der Einfluss von Glukose auf Wachstumsverhalten und ADS Expression wurde durch die Kultivierung bei 32°C bzw 42°C in THB oder THB+ 1 % [w/v] Glukose un-tersucht. Dafür wurden die Bakterien für 12 – 14 h in 20 ml bei 32°C im Wasserbad kultiviert. Nach 1:15 Verdünnung in THB bzw. THB+ 1 % [w/v] Glukose wurden die Bakterien bis zu einer OD600 von 0,3 bebrütet, geteilt und für weitere 1 – 4 h bei 32°C bzw. 42°C kultiviert. Die Auswertung erfolgte durch Bestimmung der optischen Dichte bei 600 nm und Western Blot Analysen. Die Kultivierung unter Glukose-restriktiven Bedingungen erfolgte in Trypton-Hefeextrakt (3 % [w/v] Bacto-Trypton8, 0,18 % [w/v]
Hefeextrakt) Medium (TY). Als Kohlenstoffquelle diente 10 mM Galaktose (TY+Gal).
Ggf. wurden 50 mM Arginin-HCl zugesetzt. Die Bakterien wurden bei 37°C für 12 – 14 h in einem Kulturvolumen von 20 ml bebrütet. Nach einer Verdünnung auf eine OD600 von 0,01 bzw. 0,02 wurden die Streptokokken für bis zu 24 h bei 37°C kulti-viert. Die Auswertung erfolgte je nach Indikation durch Western Blot Analysen, Be-stimmung der Zellzahl anhand der OD600 oder durch Bestimmung des Ammoniakge-haltes im Medium. Dieser wurde mit Hilfe des ammonia assay Kits9 zu den Zeitpunk-ten 0 h und 24 h nach Herstellerangaben gemessen. Durch Berechnung der Diffe-renz konnte die Ammoniakproduktion der Bakterien in 24 h bestimmt werden.
Der Einfluss von Arginin auf Wachstumsverhalten und ADS Expression wurde neben Western Blot Analysen, Wachstumskinetiken, Bestimmung des extrazellulären pH-Wertes im Kulturmedium und Ammoniakproduktion auch durch Fluoreszenzmessun-gen durchgeführt. Dafür wurden die das episomale gfp-Fusionskonstrukt traFluoreszenzmessun-genden Bakterien für 12 – 14 h in TY+Gal Medium mit 100 µg/ml Spectinomycin bei 37 °C
8 vgl. 2
9 SIGMA, Deisenhofen
bebrütet. Nach 1:15 Verdünnung in frischem TY+Gal+ 100 µg/ml Spectinomycin Me-dium wurden die Bakterien für weitere 8 h bei 37°C kultiviert. Nach einer Zentrifugati-on (12000 Upm, RT, 2 min) wurden die sedimentierten Streptokokken mit 1 x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 6,5 mM Na2HPO4, 1,7 mM KH2PO4 pH 7,2) gewaschen und erneut zentrifugiert (12000 Upm, RT, 2 min). Die Ansätze wurden in 1 x PBS re-suspendiert und mit 1 x PBS auf die geringste OD600 eingestellt. Die Promotoraktivi-tät des AD Operons wurde anhand der Fluoreszenz (Exzitation: 485 nm, Emission:
535 nm) bestimmt. Das promotorlose gfp Konstrukt diente dabei als Negativkontrolle.
Die GFP Expression wurde als relative Fluoreszenzintensität nach Abzug der Nega-tivkontrolle angegeben.