Streptococcus-suis-Serotyp-9-Ganzzellvakzine:
Immunogenität, Protektivität und Kombination mit Serotyp 2
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Nadine Büttner
aus Rinteln
Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. Christoph G. Baums Institut für Mikrobiologie
1. Gutachter: PD Dr. Christoph G. Baums 2. Gutachter: Prof. Dr. Michael Wendt Tag der mündlichen Prüfung: 22. Mai 2012
Meinen Eltern
Folgende Teile der vorliegenden Arbeit wurden bereits publiziert oder eingereicht:
BÜTTNER N., KOCK, C., BEINEKE A., WALDMANN K.-H., VALENTIN-WEIGAND P., BAUMS C. G. (2010)
Immunogenicities and protective efficacies of Streptococcus suis capsule conjugate vaccines in piglets
Vortrag auf dem „4th Vaccine and ISV Annual Global Congress“
3. bis 5. October, 2010 – Wien, Österreich
BÜTTNER N., BEINEKE A., DE BUHR N., LILIENTHAL S., MERKEL J., WALDMANN K.-H., VALENTIN-WEIGAND P., BAUMS C. G. (2012) Streptococcus suis serotype 9 bacterin immunogenicity and protective efficacy
Vet Immunol Immunopathol, in press: http://dx.doi.org/10.1016/j.vetimm.2012.03.012.
A Einleitung...11
A.1 Übergreifende Einleitung ... 11
A.2 Literaturübersicht... 13
A.2.1 Allgemeine Eigenschaften und Identifikation von S. suis...13
A.2.2 S. suis als Zoonoseerreger ...13
A.2.3 Diversität und Klonalität virulenter S.-suis-Stämme ...14
A.2.4 Klinik von S.-suis-Erkrankungen beim Schwein...16
A.2.5 Pathologie von S.-suis-Erkrankungen...17
A.2.6 Pathogenese von S.-suis-Erkrankungen...18
A.2.7 Immunogenität der Kapselpolysaccharide von S. suis...20
A.2.8 Immunoproteomics-Studien zur Identifikation immunogener S.-suis- Proteine ...21
A.2.9 Adjuvantien ...22
A.2.10 S.-suis-Immunisierungsversuche (Tabelle 1)...23
B Material und Methoden...33
B.1 Versuchstiere (Kapitel 2 und 3) ... 33
B.2 S.-suis-Stämme (Kapitel 2)... 33
B.3 Herstellung der Ganzzellimpfstoffe für die vergleichende Evaluation der Adjuvantien im November 2010 in der IDT Biologika GmbH (Kurzbezeichnung: Adjuvantienversuch) (Kapitel 2) ... 34
B.4 Herstellung der Impfstoffe für den Vergleich der Einzel- und Kombinationsvakzinen im Mai 2011 in der IDT Biologika GmbH (Kurzbezeichnung: Kombinationsvakzineversuch) (Kapitel 2)... 35
B.5 Expression und Aufreinigung von rekombinantem MRP (rMRP) (Kapitel 2) ... 36
B.6 Westernblot (Kapitel 2) ... 37
B.7 Messung des Proteingehalts (Kapitel 2 und 3) ... 37
B.8 Durchführung des ELISA (Kapitel 2)... 38
B.9 Aufreinigung der neutrophilen Granulozyten für den Opsonophagozytosetest (Kapitel 2)... 39
B.10 Opsonophagozytosetest (Kapitel 2)... 40
B.11 Herstellung eines Anti-Stamm A3286/94 Antiserums (Kapitel 2)... 42
B.14 Bakterienstämme und Kultivierung (Kapitel 3)... 43
B.15 Reinigung der Kapselpolysaccharide (Kapitel 3) ... 44
B.16 Messung des Zuckergehalts (Kapitel 3) ... 45
B.17 SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) der Kapselpolysaccharide (Kapitel 3) ... 45
B.18 Silberfärbung zum Nachweis der Kapelpolysaccharide (Kapitel 3)... 46
B.19 Konjugation der Kapselpolysaccharide (Kapitel 3) ... 46
B.20 Western-Blot-Analyse zur Überprüfung der Konjugation der Kapselpolysaccharide mit BSA (Kapitel 3) ... 47
B.21 Herstellung der Kapselkonjugatvakzine für die Immunisierung der Tiere (Kapitel 3) ... 47
B.22 Versuchstiere und Immunisierung (Kapitel 3)... 48
B.23 Herstellung der Infektionskultur (Kapitel 3)... 48
B.24 Intranasale Infektion der Tiere mit S.-suis-Serotyp-2 (Kapitel 3) ... 49
B.25 Entnahme von Blutproben zur Serumgewinnung (Kapitel 3) ... 49
B.26 Sektion nach Infektion mit S.-suis-Serotyp-2-Stamm 10 (Kapitel 3) ... 50
B.27 Bakteriologische Untersuchung der Organ- und Tupferproben (Kapitel 3) ... 52
B.28 Genotypische Differenzierung der putativen S.-suis-Reisolate (Kapitel 3) ... 52
B.29 Multiplex PCR (Kapitel 3) ... 53
B.30 ELISA zur Detektion S.-suis-Serotyp-2-Kapselpolysaccharid- spezifischer Antikörper (Kapitel 3) ... 54
B.31 Statistische Auswertung (Kapitel 2 und 3) ... 55
B.32 Puffer und Lösungen für den ELISA (Kapitel 2 und 3)... 55
B.33 Puffer zur Aufreinigung der rekombinanten Proteine (Kapitel 2) ... 56
B.34 Puffer für den Westernblot (Kapitel 2 und 3) ... 57
B.35 Immunisierung (Kapitel 3)... 59
C Kapitel 1: Streptococcus suis serotype 9 bacterin immunogenicity and protective efficacy...61
D Kapitel 2: Untersuchungen zur immunogenen Wirkung einer Streptococcus-suis-Serotyp-2- und 9-Kombinationsvakzine ...63
D.1 Einleitung... 63
D.2 Ergebnisse ... 65
D.2.1 Adjuvantienversuch...65
E Kapitel 3: Immunogene und protektive Wirkung einer S.-suis-
Serotyp-2-Kapselpolysaccharidkonjugatvakzine ...85
E.1 Einleitung... 85
E.2 Ergebnisse ... 86
E.2.1 Reinigung der Serotyp-2-Kapselpolysaccharide und Konjugation der Kapselpolysaccharide mit BSA ...86
E.2.2 Nachweis der Kapselpolysaccharide in der Silberfärbung ...87
E.2.3 Westernblot zur Überprüfung der Konjugation...87
E.2.4 Experimentelle Immunisierung mit der Kapselkonjugatvakzine ...88
E.2.5 Untersuchung der protektiven Wirkung der Kapselkonjugatvakzine ...88
E.2.6 Makroskopisch-anatomische Befunde nach der experimentellen Infektion mit S.-suis-Serotyp-2...89
E.2.7 Pathohistologische Befunde nach der experimentellen Infektion mit S.-suis-Seroyp-2 ...90
E.2.8 Reisolierung des sly+ mrp+ epf+ cps2+ S.-suis-Belastungsstammes...91
E.2.9 Untersuchung der Immunogenität der Kapselkonjugatvakzine ...92
E.3 Diskussion ... 98
F Übergreifende Diskussion ...103
G Zusammenfassung ...111
H Summary ...113
I Literatur ...115
J Anhang ...125
J.1 Tabellenverzeichnis...125
Abkürzungsverzeichnis
A. bidest. Aqua bidestilliert
ABTS 2,2`-Azino-di-(3-Ethylenbenzthiazolin)-6-Sulfonsäure AFLP engl.: amplified field fragment length polymorphism
APS Ammoniumpersulfat
BCA Bicinchoninsäure
BSA bovines Serumalbumin
°C Grad Celsius
CPS Kapselpolysaccharide
CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid DNA Desoxyribonucleinsäure
EDTA Ethylendiamintetraacetat EF engl.: extracellular factor
ELISA engl.: enzyme-linked immunosorbent assay
FBPS engl.: fibronectin and fibrinogen binding protein of Streptcoccus suis
IgG Immunglobulin G
i.m. intramuskulär
i.n. intranasal
i.p. intraperitoneal i.v. intravenös
IPTG IsoPropylThioGalactoside
k.A. keine Angaben
KBE koloniebildende Einheiten LEW engl.: lysis equilibration wash MAP engl.: murein-associated protein MRP engl.: muraminidase-released protein mg Milligramm ml Milliliter
mM Millimolar
µg Microgramm
µl Microliter
min Minute
OFS engl.: opacity factor of S. suis
PBS engl.: phosphate buffered saline SAO engl.: surface antigen one s.c. subkutan sec. Sekunden SDS engl.: sodium dodecyl sulfate SLY Suilysin ST Serotyp
TBE TrisBorat EDTA-Puffer
TBST engl.: tris buffered saline tween TEMED Tetramethylethylendiamin THB engl.: Todd Hewitt Βroth
TLR engl.: toll-like-receptor
TSB engl.: Tryptic Soy Broth
ZNS zentrales Nervensystem
A Einleitung
A.1 Übergreifende Einleitung
Streptococcus (S.) suis gehört weltweit zu den wichtigsten Krankheitserregern beim Schwein. Er verursacht vor allem Meningitiden, Septikämien, Polyarthritiden, Endokarditiden und plötzliche Todesfälle (Clifton-Hadley, 1983; Higgins & Gottschalk, 2005; Vecht et al., 1985). Insbesondere Absatzferkel sind anfällig für eine Infektion mit S. suis. Der Infektionsweg verläuft wahrscheinlich in den meisten Fällen nasal.
Trägertiere können den Erreger auf den Schleimhäuten des Respirations-, Genital- oder Digestionstraktes tragen ohne klinisch auffällig zu werden (Staats et al., 1997).
Sowohl biotische als auch abiotische Faktoren sind Wegbereiter für eine Infektion der Tiere mit S. suis (Berthelot-Herault et al., 2005). Bislang wurden 35 Serotypen von S. suis beschrieben, die sich auf Grund von Unterschieden im Aufbau ihrer Polysaccharidkapsel differenzieren lassen (Gottschalk et al., 1991; Higgins et al., 1995). In Europa tritt vor allem Serotyp 2 mit einer Prävalenz von ca. 30% auf, dicht gefolgt von Serotyp 9. Der Serotyp 2 ist vorwiegend in Frankreich, Italien und Spanien zu finden, während der Serotyp 9 häufig in Belgien, den Niederlanden und Deutschland isoliert wird (Silva et al., 2006; Staats et al., 1997; Wisselink et al., 2000). In einem Bestand kommen auch häufig verschiedene Serotypen zeitgleich vor.
Ein kommerzieller S.-suis-Impfstoff ist bis heute in Europa nicht zugelassen. Mittel der Wahl bei einer S.-suis-Problematik in den Beständen sind daher nach wie vor stallspezifische Vakzinen und/oder Antibiotika. Hierbei ist zu beachten, dass der übermäßige Einsatz von Antibiotika zur Verbreitung von Resistenzen beiträgt, die nicht nur für die Schweineproduktion, sondern auch für die gesamte Bevölkerung ein immer größer werdendes Problem darstellt (Hendriksen et al., 2008; Smith et al., 2002).
S. suis betrifft als Zoonoseerreger auch Menschen, die in direktem Kontakt zu infizierten Tieren stehen. Die Symptome einer S.-suis–Infektion beim Menschen sind hohes Fieber, Erbrechen, Hämorrhagien, ZNS-Symptomatik, septischer Schock und Koma (Gottschalk et al., 2007).
Die Entwicklung eines geeigneten Impfstoffes beim Schwein wird durch die Vielzahl an virulenten Pathotypen erschwert (Staats et al., 1997; Wisselink et al., 2000). Die
Einleitung
Pathotypen unterscheiden sich in der Expression virulenzassoziierter Faktoren wie dem muraminidase-realeased protein (MRP) (Smith et al., 1992), dem extracellular factor (EF) (Vecht et al., 1991), dem Suilysin (SLY) (Jacobs et al., 1994) und dem opacity factor of S. suis (OFS) (Baums et al., 2006). Virulente europäische Serotyp- 2-Stämme exprimieren MRP mit einer Molekülgröße von 136 kDa (Staats et al. 1997;
Vecht et al. 1991) und EF mit einer Größe von 110 kDa (Vecht et al., 1991) sowie SLY und OFS als virulenzassoziierte Faktoren. Einige Serotyp-2-Stämme bilden aber eine EF-Variante mit einem erhöhten Molekulargewicht, die als EF* bezeichnet wird (Smith et al., 1993). Die meisten virulenten Serotyp-9-Stämme besitzen eine homologe Variante vom MRP, auch als MRP* bezeichnet (Silva et al., 2006; Smith et al., 1993; Vecht et al., 1991; Wisselink et al., 2000). In Europa lassen sich anhand der Expression von MRP und EF hoch virulente (MRP+, EF+), schwach virulente (MRP+, EF*) und avirulente (MRP-, EF-) Serotyp-2-Stämme unterscheiden (Smith et al., 1993; Vecht et al., 1991). Sowohl eine mrp- als auch eine epf-Knockout-Mutante ist aber in experimentellen Infektionen genauso virulent wie der Wildtyp (Smith et al., 1996). Multilocus locus sequence typing (MLST) hat gezeigt, dass die beiden wichtigsten S.-suis-Pathotypen in Europa, MRP+ EF+ SLY+ OFS+ Serotyp-2- Stämme und MRP+ SLY+ Serotyp-9-Stämme zu den klonalen Komplexen 1 bzw. 16 gehören (King et al., 2002; Rehm et al., 2007).
Unterschiedliche Faktoren von S. suis sind auf ihre protektive Wirkung in Immunisierungsversuchen mit Mäusen oder Schweinen untersucht worden (Baums &
Valentin-Weigand, 2009). Bis heute konnte aber für kein Antigen eine bessere protektive Wirkung als für eine Ganzzellvakzine aufgezeigt werden (Baums et al., 2009; Wisselink et al., 2001). Durch eine Ganzellvakzine wird aber auch eine Immunantwort gegen einzelne Bakterienbestandteile induziert, die nicht mit einer Protektion einhergeht (Baums et al., 2009). Ferner ist zu berücksichtigen, dass Ganzzellvakzinen verschiedene Nebenwirkungen aufweisen können (Liu et al., 2009).
Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der immunogenen und protektiven Wirkung einer Serotyp-9-Ganzzellvakzine basierend auf einem Stamm des klonalen Komplexes 16. Im Gegensatz zu Serotyp-2-Ganzzellvakzinen, basierend auf Stämmen des klonalen Komplexes 1, waren Serotyp-9-Ganzellvakzinen zuvor noch nicht experimentell untersucht worden. Im zweiten Teil dieser Dissertation sollten wichtige Experimente zur industriellen Entwicklung einer Kombinationsvakzine,
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bestehend aus einem Serotyp-2- und 9-Stamm des klonalen Komplexes 1 bzw. 16, umgesetzt werden. Ziel dieses Teils der Dissertation war es, die immunogene Wirkung solcher Kombinationsvakzinen unter Einsatz von vier verschiedenen Adjuvantien zu analysieren. Als wichtigster read-out-Parameter für den Entwicklungsprozess der Kombinationsvakzine wurde die Induktion opsonisierender Antikörper gegen beide S.-suis-Pathotypen definiert und untersucht. Im dritten Teil dieser Arbeit sollten erstmalig proof-of-principle-Experimente zur immunogenen und protektiven Wirkung einer S.-suis-Serotyp-2-Kapselkonjugatvakzine durchgeführt werden.
A.2 Literaturübersicht
A.2.1 Allgemeine Eigenschaften und Identifikation von S. suis
Streptococcus suis ist ein grampositives, fakultativ anaerob wachsendes kokkoides Bakterium. Auf Schafblutagar wächst S. suis mit einer α-Hämolyse und auf Pferdeblutagar mit einer β-Hämolyse. S. suis ist katalase-negativ, positiv für Amylase und negativ in der Voges-Proskauer-Reaktion.
Die Identifikation und Charakterisierung von virulenten S.-suis-Stämmen kann durch eine Multiplex (MP)-PCR erfolgen (Silva et al., 2006). Die Identifikation von S. suis erfolgt in dieser MP-PCR über den Nachweis des Gens für die Glutamatdehydogenase (gdh). Für die weitere Charakterisierung werden die vier Kapselpolysaccharidgencluster (cps) 1, 2, 7 und 9 differenziert, sowie die Gene der virulenzassozierten Faktoren extracellular factor (EF, Gen: epf), muramidase- released protein (MRP, Gen: mrp) und Suilysin (SLY, Gen: sly) sowie das Arginindeaminasegen von S. suis (arcA) nachgewiesen.
A.2.2 S. suis als Zoonoseerreger
Infektionen mit S. suis beim Menschen kommen in Europa nur vereinzelt vor (Lun et al., 2007). S. suis hat als Zoonoserreger, vor allem im asiatischen Raum, in den letzten Jahren immer mehr an Bedeutung gewonnen. Bis zum Jahre 2007 gab es 409 Fälle von humanen Streptokokkeninfektionen weltweit, wobei die meisten davon in China und Thailand auftraten, aber auch in den Niederlande waren einige Fälle zu verzeichnen (Lun et al., 2007). Die Erkrankung betrifft dabei Menschen, die in
Einleitung
direkten Kontakt zu infizierten Schweinen kommen. In den letzten 40 Jahren gab es immer wieder sporadische Ausbrüche von Krankheitsfällen beim Menschen, hervorgerufen durch eine Infektion mit S. suis, die sich zumeist in Meningitissymptomatik äußerten (Gottschalk et al., 2010). 2005 kam es in China zum Ausbruch von S.-suis-Erkrankungen bei 215 Menschen. Die betroffenen Personen hatten zuvor alle direkten Kontakt zu Schweinen, die mit S.-suis-Serotyp-2 infiziert waren. 28% der Personen erkrankten an dem STSS (streptococcal toxic shock-like syndrome) 68% der erkrankten Personen verstarben auf Grund der schweren Symptomatik. 24 % entwickelten eine Sepsis und 48 % erkrankten an einer Meningitis (Yu et al., 2006). Bereits 1998 war es in einer chinesischen Provinz zu einem ähnlichen Ausbruch gekommen.
Bisher war das STSS immer mit Streptokokken der Gruppe A assoziiert, für die beiden Ausbrüche 1998 und 2005 waren jedoch hochvirulente Stämme von S.-suis Serotyp-2 verantwortlich (Tang et al., 2006).
Weitere Symptome einer S.-suis-Erkrankung beim Menschen sind ein durch Meningitis bedingter permanenter Gehörverlust, sowie Septikämien und Endokarditiden (Staats et al., 1997).
Bei dem Ausbruch in China zeigte sich ein Anstieg im Schweregrad der durch S. suis ausgelösten Infektion beim Menschen, bedingt durch eine kürzere Inkubationszeit, einen fulminanten Krankheitsverlauf und eine hohe Mortalitätsrate (Gottschalk et al., 2007).
A.2.3 Diversität und Klonalität virulenter S.-suis-Stämme
S. suis besitzt eine hohe Diversität, die sich unter anderem auf Grund von Unterschieden in der serotypspezifischen Polysaccharidkapsel erklären lässt. Es wurden bislang 35 verschiedene Serotypen beschrieben (Gottschalk et al., 1991;
Higgins et al., 1995). Innerhalb dieser Serotypen treten zum Teil deutliche Virulenzunterschiede auf. In Europa treten folgende Serotypen mit insgesamt 88%
am häufigsten auf: Serotyp 2, 9, 1, 7, 1/2, 4, 14, 3, 8 und 5 (in der Reihenfolge der Häufigkeit). Der Anteil von S.-suis-Serotyp-2 beträgt dabei 32%, der von Serotyp 9 20% und Serotyp 1 macht 12% aus (Wisselink et al., 2000).
Die Populationsstruktur von S. suis wurde und wird auch weiterhin mittels MLST (multilocus locus sequence typing) untersucht (http://ssuis.mlst.net). Bereits in der
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Arbeit von King et al. (2002) wurden 294 verschiedene Isolate von S. suis anhand der Teilsequenz von sieben Haushaltsgenen in der MLST analysiert. Dabei erfolgte die Identifikation der ersten klonalen Komplexe (CC) von S. suis, insbesondere auch von CC1 als den weltweit wichtigsten. Die Assoziation von klonalen Komplexen mit dem klinischen Hintergrund der Stämme wurde von King et al. (2002) beschrieben.
Der CC1 wird dominiert durch Isolate aus inneren Organen von erkrankten Tieren und Menschen. So findet sich die Mehrzahl der Isolate von erkrankten Menschen im CC1, so dass von einer erhöhten Humanpathogenität ausgegangen werden kann.
Unterschiedliche CC1-Stämme sind in experimentellen Infektionen von Schweinen und Mäusen erfolgreich zur Induktion von Erkrankungen eingesetzt worden (King et al., 2002). Auch wenn im CC1 viele Stämme zum Serotyp 2 gehören, konnten King et al. (2002) bereits zeigen, dass die Zugehörigkeit zum gleichen Serotyp nicht zwangsläufig eine genetische Verwandtschaft wiederspiegelt. Es ist davon auszugehen, dass die Gene zur Biosynthese der Kapsel über Gentransfer zwischen verschiedenen klonalen Komplexen innerhalb der S.-suis-Population weiter gegeben wurden (King et al., 2002). Die invasiven Serotyp-9-Stämme konnten keinem gemeinsamen Cluster zugeordnet werden, sondern gehörten zu verschiedenen sequence types (STs) (King et al., 2002).
2007 wurde die verwandtschaftliche Beziehung von über 100 S.-suis-Isolaten erneut mittels AFLP (amplified fragment length polymorphism) untersucht (Rehm et al., 2007). Dabei konnte gezeigt werden, dass sich genetisch verwandte Kluster herausbilden, die mit bestimmten virulenzassoiziierten Genen sowie mit einem charakteristischen klinischen Verlauf zusammenhängen. Ferner kam heraus, dass invasive MRP-positive Serotyp-9-Stämme von S. suis einen Cluster bilden (subcluster A2) und dass dieser Cluster dem MLST ST Komplex 87 zugeordnet werden kann. Da diese Stämme genetisch sehr eng verwandt sind mit den beiden invasiven Serotyp-9-Stämmen des ST Komplex 87, die 2002 beschrieben wurden (King et al., 2002), ist davon auszugehen, dass sie sich von diesen ableiten.
Wahrscheinlich trägt der ST Komplex 87, zu einem größeren Anteil als bisher angenommen, zu Infektionen in Europa bei (King et al., 2002; Rehm et al., 2007).
Einleitung
A.2.4 Klinik von S.-suis-Erkrankungen beim Schwein
S.-suis-Infektionen können sich sehr unterschiedlich manifestieren. Das betrifft sowohl den Krankheitsverlauf wie auch die Symptomatik. S.-suis-Erkrankungen können perakut, akut, subakut oder chronisch verlaufen.
Perakut erkrankte Tiere können innerhalb weniger Stunden nach Ausbruch der Erkrankung, ohne dass sich spezifische klinische Symptome ausgebildet haben, verenden (Staats et al., 1997). Beim akuten Krankheitsverlauf treten häufig zentralnervöse Störungen oder Lahmheiten auf. Weiterhin ist der Verlauf gekennzeichnet durch Fieber bis zu 42°C, Apathie und verminderter Nahrungsaufnahme. Zu den typischen zentralnervösen Störungen gehören Ataxie, Inkoordination, Tremor, Opisthotonus, Nystagmus, Konvulsionen, tetanische Streckkrämpfe aber auch Paralyse (Staats et al., 1997). In Abhängigkeit von dem Schweregrad der Erkrankungen und der Immunität der Tiere können akute Erkrankungen in einen chronischen Verlauf übergehen, zum Tod oder aber zu gesunden Trägertieren führen (Baums, 2012).
Bei der chronischen Verlaufsform werden die Tiere oft durch das klinische Bild eines
„Kümmerers“ in den Beständen auffällig.
Andere Tiere wiederum, die S. suis auf ihren Tonsillen haben, können zu klinisch inapparenten Trägertieren werden (Staats et al., 1997). Trägertiere können aber auch chronische Lahmheiten oder anhaltende ZNS-Symptomatik zeigen.
Die Infektion manifestiert sich vorwiegend zwischen der 2. und 20. Lebenswoche (Rolle & Mayr, 2007). Absatzferkel können etwa bis zur 6. Lebenswoche durch maternale Immunität passiv vor einer akuten S.-suis-Erkrankung geschützt sein (Baums et al., 2010).
Nach einer septikämischen Phase, die mit Fieber, reduziertem Allgemeinbefinden und verminderter Futteraufnahme einhergeht, kann sich die Erkrankung in verschiedenen Organen manifestieren (Rolle & Mayr, 2007).
Eine S.-suis-Infektion beim Saugferkel äußert sich oft in deutlich geschwollenen, schmerzhaften Gelenken, einer Sepsis mit Todesfolge oder Abzessen im Bereich der Kastrationswunde bzw. des Nabels. Während bei Absatzferkeln die Symptomatik oftmals auf eine Meningitis zurückgeht. Dem entsprechend stehen bei Absatzferkeln Ataxie, Tremor, Opisthotonus und schließlich Seitenlage mit Konvulsionen und tetanischen Streckkrämpfen im Vordergrund. In einzelnen Fällen wird auch von S.-
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suis-Erkrankungen während der Mast und bei Sauen berichtet. Es ist aber grundsätzlich kritisch zu beurteilen, wenn Bestandsprobleme in der Mast mit Atemwegsproblematik auf S. suis zurückgeführt werden. S. suis besiedelt den oberen Atemtrakt des gesunden Schweines in hohem Keimgehalt ohne Erkrankungen hervorzurufen. In experimentellen Infektionen mit Serotyp-2- und 9- Stämmen konnten bis heute mittel- oder hochgradige Dyspnoen (beispielsweise mit Maulatmung) nicht hervorgerufen werden (Baums, 2012). In seltenen Fällen kann es bei tragenden Sauen durch eine S.-suis-Infektion zu Aborten kommen.
Differentialdiagnostisch sind bei einer Streptokokkenmeningitis auch Morbus Aujetzky, eine Kochsalzvergiftung und die Kolienterotoxämie in Betracht zu ziehen (Waldmann & Wendt, 2004). Bei Arthritiden kommen neben Streptokokken auch Hämophilus parasuis und Mykoplamen als Ursache in Frage.
A.2.5 Pathologie von S.-suis-Erkrankungen
Die Erkrankungen, die durch eine S.-suis-Infektion beim Schwein verursacht werden, sind Arthritiden, Meningitiden, Pneumonien, Septikämien, Endokarditiden, Polyserositiden, Aborte und Abzesse (s.o.) (Staats et al., 1997).
Dabei ist S. suis verantwortlich für fibrinöse Entzündungen und Infiltrationen von Neutrophilen im Gewebe (Madsen et al., 2002; Williams & Blakemore, 1990). Aber auch lymphoplasmazelluläre Infiltrate können mit S.-suis-Infektionen in Zusammenhang gebracht werden (Beineke et al., 2008).
Die Organe sind im Fall einer Peritonitis oft mit fibrinösen Auflagerungen überzogen.
Auch Serositiden, die durch vermehrte Exudate in den Körperhöhlen gekennzeichnet sind, und Endokarditiden können als Folge der Infektion auftreten (Berthelot-Herault et al., 2005; Staats et al., 1997).
Jensen et al. (Jensen et al., 2010) führte gezielte Untersuchungen hinsichtlich der Ätiologie und der histopathologischen Veränderungen zu Endokarditis bedingten Läsionen an Schweineherzen aus dem Schlachthaus durch. Die Diagnose einer Endokarditis betraf 18% der Tiere. Bei 53 % der Proben war die Ursache auf Streptokokken zurückzuführen, wobei S. suis in 73% der Fälle zu diesen Veränderungen geführt hatte. Sowohl die rechte wie auch die linke Atrioventrikularklappe waren dabei in gleichem Maß betroffen, während bei 8% der Tiere beide Klappen gleichzeitig Veränderungen aufwiesen. Die durch Streptokokken
Einleitung
verursachten Entzündungen waren durch Neutrophileninfiltrate gekennzeichnet und von Granulationsgewebe umschlossen, das wiederum von Fibroblasten und Makrophagen umgeben war (Jensen et al., 2010). Eine durch S. suis bedingte Endokarditis geht oft mit Mikroabzessen in den Gefäßen einher, die zu Infarkten im Gehirn und in den Nieren führen können. In Studien zeigte sich, dass eine Linksherzendokarditis, in den meisten Fällen durch S. suis verursacht, oft in Zusammenhang mit Endokarditis bedingten Hirnläsionen standen (Karstrup et al., 2011).
Meningitiden mit fibrinösem oder eitrigem Charakter können zu einer Trübung der Hirnoberfläche und einem Verstreichen der Furchung führen und treten als septikämische Folgebilder bei Streptokokken-Infektionen auf (Dahme & Weiss, 2007). Im pathohistologischen Bild zeigt sich dies in fibrinös-eitrigen Meningitiden, Plexus chorioiditiden und Ventrikulitiden (Beineke et al., 2008).
Die durch S. suis bedingte Arthritis führt zu einer Ausfällung von Fibrin in Form von Pseudomembranen und Ausgüssen in den Gelenknischen. Der flüssige Exudatanteil ist dann bouillonartig gelb oder trübe und rahmig (Dahme & Weiss, 2007).
A.2.6 Pathogenese von S.-suis-Erkrankungen
Schweine infizieren sich mit S. suis wahrscheinlich hauptsächlich über den oberen Respirationstrakt, wohingegen beim Menschen die Eintrittspforte für S. suis meist verletzte Hautstellen sind (Arends et al., 1984; Gottschalk et al., 2007; Gottschalk &
Segura, 2000). Die genauen Mechanismen, die zu einer Kolonisation von S. suis im Wirt führen, sind bislang noch weitgehend unbekannt (Fittipaldi et al., 2012). S. suis kann wahrscheinlich lange Zeit auf den Tonsillen der Schweine überleben, die mit einer mukosalen Oberfläche aus lymphoidem Gewebe und tiefen Schleimhautkrypten überzogen sind. Nach der Adhäsion und Invasion von S. suis an bzw. in die epithelialen Zellen bleiben sie vom Immunsystem unentdeckt (Fittipaldi et al., 2012). Die derzeitig meist akzeptierte Hypothese ist, dass pathogene S.-suis- Stämme zur Invasion die mukosale Schleimhautbarriere im oberen Respirationstrakt überqueren (Gottschalk & Segura, 2000). Wenn die Bakterien den Blutkreislauf erreicht haben, können sie dort einen septischen Schock oder eine Infektion in dem Zielgewebe auslösen (Gottschalk & Segura, 2000).
Um Störungen im ZNS hervorzurufen, muss S. suis die Blut-Hirn-Schranke oder 18
die Blut-Cerebrospinalfüssigkeitsbarriere überwinden (Fittipaldi et al., 2012;
Tenenbaum et al., 2009).
Eine Adhäsion von S. suis an humane Endothelzellen der Hirnhautgefäße konnte nachgewiesen werden. Es kam jedoch nicht zu einer Invasion (Charland et al., 2000). Umgekehrt wurde jedoch an abgetöteten porzinen Hirnhautendothelzellen eine Adhäsion und Invasion von S. suis mittels gentamicin protection assay und Elektronenmikroskopie beobachtet (Vanier et al., 2004). Dies deckt sich mit Studien von Tenenbaum et al. bei denen gezeigt werden konnte, dass S. suis zytotoxisch für Endothelzellen der Hirnhautgefäße ist und die Bluthirnschranke mittels Transzytose passieren kann (Tenenbaum et al., 2005).
Es gibt verschiedene Theorien zum Überleben von S. suis im Wirt. Ein Überleben der Bakterien innerhalb der Monozyten, von denen sie vorher durch Phagozytose aufgenommen wurden (Trojan horse theory), ist unwahrscheinlich. Vielmehr wird davon ausgegangen, dass S. suis der Phagozytose durch Monozyten, Makrophagen, Mikrogliazellen, neutrophile Granulozyten und dendritische Zellen entgeht (Benga et al., 2008; Chabot-Roy et al., 2006; Lecours et al., 2011; Segura et al., 2004).
Die neutrophilen Granulozyten sind die ersten Zellen, die bei einer Infektion mit S. suis an den Ort des Entzündungsgeschehens rekrutiert werden und das betroffene Gebiet stark infiltrieren (Chabot-Roy et al., 2006). Im Zuge der Extravasation werden die neutrophilen Granulozyten aktiviert. Sie gehören damit zu den ersten Abwehrmechanismen des Wirtes gegen S. suis und spielen für die angeborene Immunantwort eine herausragende Rolle (Burg & Pillinger, 2001; Segal, 2005; Witko-Sarsat et al., 2000). Eine Aktivierung der neutrophilen Granulozyten wird während des Entzündungsprozesses durch das Einwirken von Zytokinen erreicht (Chabot-Roy et al. 2006). Außerdem wurde gezeigt, dass spezifisches IgG zu einem effizienten Abtöten von S. suis durch neutrophile Granulozyten beiträgt. Durch eine IL-1β-Injektion vor einer Infektion mit S. suis im Schwein konnte eine gesteigerte Aktivität der neutrophilen Granulozyten erreicht und die Immunantwort im Wirt verbessert werden (Shi et al., 1994). Aber auch durch die Faktoren GM-CSF (granulocyte macrophage colony stimulating factor), TNF-α (Tumornekrosefaktor- α) und IL-8 konnte eine gesteigerte Eliminierung des Erregers durch neutrophile Granulozyten in vitro nachgewiesen werden. (Chabot-Roy et al., 2006).
Einleitung
Die Polysaccharidkapsel von S. suis ist ein Hauptvirulenzfaktor und spielt für die Pathogenese eine wichtige Rolle (Baums & Valentin-Weigand, 2009; Charland et al., 1996; Gottschalk & Segura, 2000; Smith et al., 1999). Sie ist hauptsächlich am Schutz vor Phagozytose beteiligt und verhindert außerdem, dass die bakteriellen Oberflächenproteine von den Immunzellrezeptoren (T-Zell-Rezeptoren) erkannt werden können (Dominguez-Punaro et al., 2010; Graveline et al., 2007; Segura et al., 2004; Smith et al., 1999). Die Kapselpolysaccharide können auch Ähnlichkeit zu Wirtsantigenen aufweisen und wirken oft nur schwach immunogen (Kasper, 1986;
Severi et al., 2007). Die Polysaccharidkapsel von Serotyp 2 enthält als endständigen Zucker Sialinsäure, die ein Anheften der Bakterien an die Monozyten vermittelt. Dies führt jedoch nicht zu einer Aufnahme der Bakterien (Segura & Gottschalk, 2002).
Durch die Adhärenz von S. suis wird die Signaltransduktion in der Wirtszelle beeinflusst (Segura et al., 2004). Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass die Kapsel nicht allein als passives Schutzschild fungiert (Houde et al., 2011). Tatsächlich spielen die Kapselpolysaccharide eine sehr spezifische und aktive Rolle, in dem sie eine Destabilisierung der Lipidmikrodomänen hervorrufen. Dies verhindert, dass sich PRRs (pattern recognition receptors) wie insbesondere Lactosylceramid in der Membranregion akkumulieren, die mit den adhärenten Streptokokken interagiert. Es liegen Hinweise aus Inhibitionsexperimenten vor, dass diese Funktion der Kapselpolysaccharide wesentlich zum Phagozytoseschutz von S. suis beiträgt (Houde et al., 2011).
A.2.7 Immunogenität der Kapselpolysaccharide von S. suis
Die Kapselpolysaccharide von S. suis verhindern auch die Phagozytose durch die dendritischen Zellen (Lecours et al., 2011). Dendritische Zellen sind darauf spezialisiert, Antigene aufzunehmen und den Lymphozyten zur Erkennung zu präsentieren. Sobald sie auf ein Pathogen treffen, reifen sie und wandern zu den Lymphknoten. In in-vitro-Experimenten konnte gezeigt werden, dass S. suis mit dendritischen Zellen aus dem Knochenmark interagiert und dies zur Freisetzung verschiedener Zytokine, wie TNF-α, IL-6, IL-8 und IL-12p40, führt (Lecours et al., 2011). Für diese Aktivierung sind vor allem die Kapselpolysaccharide von S. suis verantwortlich, denn sie fördern u. a. die Ausbildung der costimulierenden Moleküle CD-80 und MHC-II auf den dendritischen Zellen (Lecours et al., 2011). Es wird
20
deshalb angenommen, dass diese Zellen eine wichtige Rolle für die Entwicklung der adaptiven und angeborenen Immunantwort während einer S.-suis-Serotyp-2- Infektion spielen (Lecours et al., 2011).
Die Kapselpolysaccharide gehören zu den T-Zell-unabhängigen Antigenen (Llull et al., 2001). T-Helferzellen können die Peptidfragmente von Antigenen, die von der B- Zelle aufgenommen wurden und über den MHC-Klasse-II-Komplex präsentiert werden, erkennen. Die MHC-Moleküle besitzen eine peptidbindende Furche, die zwar eine Vielzahl verschiedener Peptide aufnehmen kann, nicht aber Polysaccharide. Durch die Wechselwirkungen zwischen B- und T-Zellen kommt es zu einer B-Zell-Proliferation und zum Antikörperisotypenwechsel.
Gerade bei Neugeborenen wird durch T-Zell-unabhängige Antigene nur eine unzureichende Immunantwort ausgelöst, die nicht zu einem hinreichenden Schutz durch protektive Antikörper führt (Lees et al., 1996). Bei diversen Erregern wie S.
pneumoniae, Haemophilus influenzae und Neisseria meningitidis wurde gezeigt, dass Kapselantigene durch Kopplung an Trägerproteine in T-Zell-abhängige Antigene umgewandelt werden können (Goldblatt, 1998). Dies hat in der Humanmedizin die Entwicklung sehr erfolgreicher Konjugatimpfstoffe ermöglicht. So konnte nach der Einführung einer Pneumokokkenkonjugatvakzine in den USA ein Erkrankungsrückgang von 60% bei Kindern unter 5 Jahren verzeichnet werden (Makwana & Riordan, 2007).
A.2.8 Immunoproteomics-Studien zur Identifikation immunogener S.-suis- Proteine
In den letzten Jahren sind einige Studien veröffentlicht worden, die darauf abzielten, immunogene Proteine von S. suis zu identifizieren, die sich potentiell zur Vakzinierung einsetzen lassen (Wu et al., 2008; Zhang et al., 2008; Zhang & Lu, 2007). Solche Proteine sollten sezerniert oder oberflächenassoziiert sein, damit sie leicht vom Immunsystem des Wirtes erkannt werden können und die Bindung von Antikörpern ermöglichen. Wu et al. (2008) trennten Zellwandproteine von S.-suis- Serotyp-9 mittels 2-dimensionaler Gelektrophorese auf und untersuchten diese anschließend im Western Blot mit Seren von Mäusen, die zuvor mit diesen Zellwandproteinen immunisiert worden waren. Dabei wurden folgende immunogene Proteine identifiziert: Arginin Deiminase, extracellular solute-binding protein,
Einleitung
Translationselongationsfaktor, Neprilysin, ABC-Transporter, Peptid-bindendes Protein, Pyruvatkinase, Phosphat-Acetyltransferase und Fruktose-bisphosphat- Aldolase (Wu et al., 2008). In einem methodisch vergleichbaren Ansatz, bei dem immunogene Proteine von S.-suis-Serotyp-2 identifiziert werden sollten, wurden statt Hyperimmunseren von Mäusen sowohl Hyperimmunseren von Schweinen als auch Seren rekonvaleszenter Schweine eingesetzt. Im Vergleich zu Hyperimmunseren haben Seren rekonvaleszenter Schweine den Vorteil, dass die darin enthaltenen Antikörper als Reaktion auf eine Infektion gebildet wurden und somit sichergestellt ist, dass die entsprechenden Antigene während einer Infektion exprimiert und durch das Immunsystem erkannt werden können. Es konnten unter anderem die bereits bekannten Proteine MRP, surface antigen one (SAO) und Glycerinaldehyd-3- phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) als Immunogene bestätigt werden (Zhang et al., 2008). MRP und SAO wurden als Subunit-Vakzinen untersucht und zeichneten sich durch eine schwache (MRP) bzw. deutliche protektive (SAO) Wirkung aus (Li et al., 2007; Wisselink et al., 2001). Die von Zhang et al. (2008) identifizierten neuen immunogenen Proteine sind bisher noch nicht näher für ihre Verwendbarkeit als Vakzinebestandteile untersucht worden. In einer weiteren immunoproteomics Studie, bei der sezernierte Proteine von S.-suis-Serotyp-2 mit dem rekonvaleszenten Schweineserum untersucht wurden, konnte eine S.-suis-Endopeptidase (SsPepO) als immunogenes Protein identifiziert werden (Zhang & Lu, 2007).
A.2.9 Adjuvantien
Gereinigte Antigene sind für sich allein genommen nicht besonders immunogen (Murphy et al., 2005) daher werden Impfstoffen Ajuvantien zugesetzt, um eine frühe, hohe und langanhaltende Immunantwort zu erzielen. Der Antigenzusatz im Impfstoff ermöglicht es ferner, die Antigendosis zu verringern (Gupta et al., 1993). Adjuvantien können auf unterschiedliche Weise wirken: Sie können eine Immunmodulation bewirken, zur Antigenpräsentation beitragen, zytotoxische-T-Lymphozyten aktivieren, Immunzellen anlocken oder einen Depoteffekt des Impfstoffes erzeugen (Cox &
Coulter, 1997). Einige Adjuvantien beinhalten Zellwände von Bakterien als nicht infektiöse Bestandteile. Ein häufig eingesetztes Adjuvans, besonders bei Versuchstieren, ist das komplette Freund-Adjuvans, hierbei handelt es sich um eine Öl- und Wasseremulsion, die abgetötete Mykobakterien enthält. Andere bakterielle
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Adjuvantien sind abgetötete Bordetella-pertussis-Bakterien, bakterielle Polysaccharide, bakterielle Hitzeschockproteine und bakterielle DNA (Murphy et al., 2005). Die bakteriellen Zusätze in den Adjuvantien induzieren unter anderem die Produktion entzündungsfördernder Zytokine und führen dadurch zu starken Entzündungsreaktionen. Dieser Effekt verstärkt wahrscheinlich die Immunreaktion, schließt allerdings eine Anwendung beim Menschen aus (Murphy et al., 2005).
Weitere gebräuchliche Adjuvantien (s. Tabelle 1) sind das inkomplette Freund- Adjuvans, eine Öl-in-Wasser-Emulsion, das eine verzögerte Antigenfreisetzung und eine verstärkte Aufnahme durch Makrophagen erzeugt. Alminiumhydroxid lagert die Antigene beispielsweise an Aluminiumpartikel an und wandelt so die löslichen Proteine in partikuläres Material um. Ähnlich wirken auch immunstimulatorische Komplexe (ISCOMs), die sich aus einer Matrix aus Quil A mit viralen Proteinen zusammensetzen, sie bringen die Antigene ins Zytosol und ermöglichen auf diese Weise die Induktion der zytotoxischen T-Zellen (Murphy et al., 2005). Während es sich bei den Adjuvantien Montanide und Marcol 52 um Wasser-in-Öl-Adjuvantien handelt, stellt Emulsigen eine Öl-in-Wasser-Emulsion dar. Dabei bildet das Öl-in- Wasser-Adjuvans ein mobiles Depot und setzt die Antigene nur langsam frei. Dies führt zu hohen Titern und langanhaltenden Immunantworten gegen das Antigen.
Emulsigen bewirkt außerdem eine zellvermittelte Immunität und eine Aktivierung der zytotoxischen T-Lymphocyten (EmulsigenR-BCL Technical Bulletin).
A.2.10 S.-suis-Immunisierungsversuche (Tabelle 1)
Die Suche nach einem Antigen, das einen serotypübergreifenden Schutz bietet, ist ein wichtiges Ziel bei der Forschung zur Entwicklung eines Impfstoffes gegen S. suis (Baums et al., 2009). In Immunisierungsversuchen wurden einige mit der Zellwand assoziierte Oberflächenproteine von S. suis als mögliche Impfstoffkandidaten getestet. In den meisten Arbeiten sind aber nur Belastungen mit einem Stamm des gleichen Serotyps durchgeführt worden, so dass die serotypübergreifende Schutzwirkung ungeklärt ist. Hinzu kommt, dass viele Impfstoffkandidaten nur in Tierversuchen mit Mäusen getestet wurden. Auch wenn diese Versuche mit Protektion vor Mortalität und zum Teil auch Morbidität einhergingen (Tab.1), lässt sich daraus nicht ohne weiteres eine Schutzwirkung für das Schwein ableiten, da
Einleitung
Mäuse und Schweine eine unterschiedliche Empfänglichkeit für S. suis besitzen (Vecht et al., 1997a; Vecht et al., 1997b).
2007 wurde in einem Immunisierungsversuch von Li et al. als Immunogen rekombinates SAO eingesetzt. Zusammen mit Emulsigen verabreicht, konnte kein signifikanter Schutz gegen eine experimentelle S.-suis-Infektion erreicht werden.
Dieses Ergebnis ging einher mit der mangelnden Induktion opsonisierender Antikörper. Bei der Verabreichung von rekombinantem SAO zusammen mit dem Adjuvants Quil A konnte hingegen eine protektive Wirkung erzielt werden. Die mit QuilA und SAO vakzinierten Schweine zeigten eine höhere Überlebensrate und es traten weniger klinische Erscheinungen auf.
SsPepO ist stark konserviert unter S.-suis-Serotyp-2-Stämmen. Immunisierungs- experimente, bei denen sowohl Mäusen als auch Schweinen rekombinant hergestelltes SsPepO verabreicht worden war, zeigten, dass dieses Protein eine starke humorale Immunantwort auslöst und zu einem partiellen Schutz der Tiere vor Mortalität, nicht aber vor Morbidität führt (s. Tab. 1). Darüber hinaus hemmen Antiseren gegen SsPepO das Wachstum von S. suis in vitro und führten bei einer passiven Immunisierung von Mäusen zur Protektion. Das macht SsPepO zu einem potentiellen Kandidaten für eine Subunitvakzine (Li et al., 2011a).
Das Oberflächenprotein HP0245EC von S.-suis-Serotyp-2 wurde als Impfantigen im Tierversuch in der Maus getestet (Li et al., 2011b). In einem Belastungsversuch mit einer LD50 konnte bei 80% der Tiere ein Schutz vor Morbidität erreicht werden. Im Gegensatz dazu zeigte die Gruppe, die zum Vergleich eine Serotyp-2- Ganzzellvakzine erhalten hatte, bei homologer Belastung eine Morbiditätsrate von 50%.
HP0197, ein weiteres Oberflächenprotein von S. suis, wurde im Schwein als Vakzinekandidat getestet (Zhang et al., 2009a). In einem Belastungsversuch mit S.- suis-Serotyp-2 zeigte sich bei 75% der mit HP0197 immunisierten Schweine ein Schutz vor Mortalität. In der mit einer Serotyp-2-Ganzzellvakzine immunisierten Gruppe waren jedoch alle Tiere gegen Mortalität als Folge einer homologen S.-suis- Infektion geschützt. Allerdings bestand in beiden Gruppen kein Schutz vor Morbidität.
Das Enzym 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase wird von S.-suis-Serotyp-2 auch auf der Oberfläche exprimiert. Als Immunisierungsantigen erzielte es bei 50% der Versuchsschweine einen Schutz vor Morbidität und Mortalität im Zusammenhang mit einer Serotyp-2-Belastung (Tan et al., 2009).
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Auch Lebendvakzinen wurden, als potentielle Impfstoffkandidaten für S .suis, bereits in unterschiedlichen Immunisierungsexperimenten auf ihre protektive Wirkung im Schwein getestet. Sie aktivieren sowohl die humorale als auch die zelluläre Immunabwehr. In einer Studie unserer Arbeitsgruppe war nach einer Immunisierung mit einem attenuierten S.-suis-Serotyp-2-Stamm kein signifikanter Schutz bei einer homologen und heterologen Belastung vorhanden (Kock et al., 2009). Auch durch die Immunisierung mit einer kapsellosen S.-suis-Serotyp-2-Mutante konnte kein Schutz vor einer Infektion mit dem Wildtyp erreicht werden (Wisselink et al., 2002).
Lediglich Fittipaldi et al. (2007) konnten mit einer nicht virulenten, für aromatische Aminosäuren auxotrophen, unbekapselten Mutante einen Schutz vor Mortalität und eine Reduktion der klinischen Symptome nach einer Belastung mit dem Wildtyp auslösen.
In zwei vorausgegangenen Dissertationen wurde die protektive (Bennecke, 2008) und immunogene (Kock, 2009) Wirkung einer Serotyp-2-Subunitvakzine, bestehend aus verschiedenen Oberflächenproteinen wie MRP, SAO und dem fibronectin and fibrinogen binding protein of S. suis (FBPS), im Schwein untersucht. Die homologe und heterologe Schutzwirkung gegen einen Serotyp-2- bzw. 9-Belastungsstamm wurde im Vergleich zu einer Ganzzellvakzine ermittelt. Eine protektive Wirkung gegen eine homologe Infektion mit dem Serotyp-2-Stamm konnte nur mit der Ganzellvakzine (s.o) erreicht werden. Bei einer heterologen Infektion mit einem Serotyp-9-Stamm konnte mit keinem der beiden Impfstoffe eine ausreichende protektive Wirkung erzielt werden (Baums et al., 2009).
Eine Immunisierung mit S.-suis-Enolase wurde bei Mäusen durchgeführt. Die Ergebnisse von zwei Studien hierzu fielen unterschiedlich aus. Während Esgleas et al. (2009) keine protektive Wirkung, weder in Bezug auf Morbidität noch auf Mortalität, erreichen konnten, waren bei Zhang et al. (2009b) die Tiere nach der Immunisierung vor einer Erkrankung mit S. suis geschützt.
In der Mehrzahl der S.-suis-Immunisierungsexperimente wurden Serotyp-2-Antigene getestet und die protektive Wirkung gegen Serotyp 2 ermittelt. Die Wirkung einer S.- suis-Serotyp-9-Ganzzellvakzine wurde erstmalig von Dekker et al. (2011) experimentell untersucht. In dieser Arbeit wurde nicht die protektive Wirkung gegenüber einer letalen Infektion untersucht, sondern die Auswirkung der Immunisierung auf die Transmission des Erregers. Aus diesem Grund wurde ein nasales Serotyp-9-Infektionsmodell gewählt, bei dem die Mortalitätsrate unter 10%
Einleitung
lag. Die von Dekker et al. (2011) eingesetzte inaktivierte Serotyp-9-Ganzzellvakzine enthielt α-Tocopherolacetat als Adjuvans und wurde zweimal im Alter von 3 und 5 Wochen appliziert. Durch die Immunisierung kam es nicht zu einer Reduzierung der Übertragung des Erregers von infizierten auf nicht infizierte Tiere. Alle Gruppen zeigten nach der Infektion einen vergleichbaren Kolonisationsgrad mit dem Erreger auf den Tonsillen und im Speichel. Auch die Morbiditätsrate lag in der immunisierten Gruppe und der Kontrollgruppe bei 92%. Dieses Ergebnis sprach gegen eine protektive Wirkung der Serotyp-9-Ganzzellvakzine.
Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass im Mausmodell Subunitvakzinen auf der Grundlage einzelner Oberflächenproteine von S.-suis-Serotyp-2 eine gute Protektion gegenüber einer homologen Belastung erzielten. Ob diese Ergebnisse sich auf das Schwein übertragen lassen, ist sehr umstritten. Für das Schwein konnte bis heute für keine Subunitvakzine eine protektive Wirkung aufgezeigt werden, die der einer Ganzzellvakzine überlegen war. Hinweise für die Bedeutung von Adjuvantien für die protektive Wirkung von S.-suis-Ganzzell- und Subunitvakzinen liegen vor. Demnach ist Emulsigen ein geeignetes Adjuvans für eine Ganzzellvakzine und Quil A für eine SAO-Subunitvakzine. Ein großer Forschungsbedarf besteht noch für Vakzinen gegen andere Serotypen, insbesondere Serotyp 9, denn bis heute wurde noch keine Vakzine beschrieben, die zu einer Protektion gegen eine Seroyp- 9-Belastung führt.
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Tabelle A-1: Ergebnisse von Immunisierungsversuchen mit experimentellen Belastungsinfektionen
Einleitung
Fortsetzung Tabelle A-1
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Fortsetzung Tabelle A-1
Einleitung
Fortsetzung Tabelle A-1
30
Fortsetzung Tabelle A-1
B Material und Methoden
B.1
B.2
Versuchstiere (Kapitel 2 und 3)
Die Absatzferkel der beiden Tierversuchsvorhaben stammten aus dem SPF- Schweinezuchtbestand Garlitz des Bundes Hybrid Zucht Programmes. Dieser Betrieb ist frei von sly+ mrp+ epf+ cps2+ und cps9+ S.suis-Stämmen (Baums, C., 2009 persönliche Mitteilung).
Der tierexperimentelle Teil von Kapitel 2 wurde mit Impfstoffwerk Dessau Tornau Biologika GmbH (Aktenzeichen IDT A04/2004) und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der European Connvention for Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes durchgeführt. Der erste Teil des Tierversuches wurde mit fünf Gruppen mit zehn Tieren pro Gruppe durchgeführt. Im zweiten Teil wurden für den Tierversuch drei Gruppen mit zehn Tieren eingestallt.
Der tierexperimentelle Teil von Kapitel 3 wurde vom Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES) genehmigt (Aktenzeichen 09/1674) und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der European Connvention for Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes durchgeführt. Der Tierversuch wurde in zwei Gruppen mit jeweils neun Tieren durchgeführt.
S.-suis-Stämme (Kapitel 2)
Für die Herstellung der Ganzzellimpfstoffe (Einzel- und Kombinationsvakzinen) wurden ausschließlich der S.-suis-Serotyp-2-Stamm I9841/1 und der Serotyp-9- Stamm A5683/94 eingesetzt. Der S.-suis-Serotyp-2-Stamm I9841/1 wurde ursprünglich aus dem ZNS eines an Meninigitis erkrankten Schweines isoliert. Er gehört zum klonalen Komplex 1 (Rehm et al. 2007) und exprimiert die Proteine Suilysin, EF und MRP (Allgaier et al. 2001). S. suis A5683/94 bildet Suilysin (Allgaier et al. 2001) sowie eine hochmolekulare Variante von MRP (Silva et al. 2006). Dieser Stamm wurde ursprünglich aus der Milz von einem Schwein mit Septikämie isoliert (Allgaier et al. 2001) und gehört zum klonalen Komplex 16, der von Rehm et al.
(2007) noch als klonaler Komplex 87 bezeichnet wurde. Für die Durchführung des Opsonophagozytosetests wurde der S.-suis-Serotyp-2-Stamm 10 und der Serotyp-9-
Material und Methoden
Stamm A3286/94 eingesetzt. Stamm 10 ist wiederholt von unterschiedlichen Gruppen erfolgreich in experimentellen Infektionen von Schweinen zur Induktion von Meningitiden und anderen Erkrankungen eingesetzt worden (Baums et al. 2006;
Baums et al. 2009; Beineke et al. 2008; Smith et al. 1999). Er exprimiert zahlreiche virulenzassoziierte Faktoren wie MRP, EF, SLY, den opacity factor of S. suis (OFS) (Baums et al. 2006) und das fibronectin and fibrinogen binding protein of S. suis (FBPS) (de Greeff et al. 2002). Stamm 10 lässt sich in der AFLP-Analyse nicht von dem Impfstamm I9841/1 unterscheiden (Rehm et al. 2007). Der Serotyp-9-Stamm A3286/94 wurde aus dem ZNS eines Schweines mit Meningitis isoliert. Er exprimiert Suilysin und eine hochmolekulare Variante von MRP. Wie der Serotyp-9- Vakzinestamm A5683/94 gehört A3286/94 zum klonalen Komplex 16 (früher 87), allerdings zu einem anderen Sequenztyp innerhalb dieses klonalen Komplexes.
Stamm A3286/94 führt in experimentellen Infektionen von Absatzferkeln nur nach intravenöser und nicht, wie Stamm 10, auch nach intranasaler Applikation zu Erkrankungen (Beineke et al. 2008).
Die Anzucht beider Stämme erfolgte bei 37°C in 30 ml Todd Hewitt Broth (THB, Bacto), anschließend wurde jeweils mit 10 ml der Übernachtkultur 1000 ml THB angeimpft und bei 37°C bis zu einer OD600 von 0,8 kultiviert.
Die Anzucht von E. coli M15 pQEmrp für die Expression von rMRP erfolgte auf festem LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin und 25 µg/ml Kanamycin.
B.3 Herstellung der Ganzzellimpfstoffe für die vergleichende Evaluation der Adjuvantien im November 2010 in der IDT Biologika GmbH (Kurzbezeichnung: Adjuvantienversuch) (Kapitel 2)
Die Herstellung der Kombinationsganzzellvakzinen unter Zusatz der verschiedenen Adjuvantien wurde im Impfstoffwerk Dessau Tornau Biologika GmbH durchgeführt (Tab.1). Ein Lyophylisat von beiden Bakterienstämmen wurde dazu in 10 ml THB für 7 h und 30 min bei 37°C angezogen und als erste Vorkultur bezeichnet. Danach wurden 95 ml THB mit 5 ml aus der ersten Vorkultur angeimpft und für 16 h und 10 min bei 37°C inkubiert. Zur Herstellung der Hauptkultur wurden 50 ml aus der zweiten Vorkultur mit 450 ml THB-Medium versetzt. In der Hauptkultur vom Serotyp 2 (I9841/1) befand sich eine Lebendkeimzahl von 1,12 x 109 KBE/ml. In der Kultur von Serotyp 9 (A5683/94) war die Lebendkeimzahl 6 x 108/ml. Die Inaktivierung der
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Hauptkultur erfolgte anschließend mit 0,15%igem Formaldehyd. Für jeden Impfstoff wurden die inaktivierten Kulturen der beiden Serotypen in gleichen Volumina eingesetzt und mit 2,2%igem Thiomersal zu einer finalen Konzentration von 0,23%
versetzt. Es wurden vier Impfstoffe mit vier verschiedenen Adjuvantien hergestellt.
Dabei hatten die Adjuvantien in den vier verschiedenen Impfstoffen folgende finale Konzentrationen: QuilA (10%ige Stammlösung) 0,025% (v/v), EmulsigenR 20% (v/v) (Technical Bulletin, Omaha), Montanide Gel01 10% (v/v) (SEPPICR, Frankreich) und Montanide IMS 15% (v/v) (SEPPICR, Frankreich). Die Impfstoffe wurden in vier verschiedenen Tiergruppen eingesetzt, wobei jedem Tier 2 ml intramuskulär verabreicht wurden. Darin enthalten waren 3 x 108 inaktivierte KBE des Serotyp 9 und 6 x 108 inaktivierte KBE des Serotyp 2.
B.4 Herstellung der Impfstoffe für den Vergleich der Einzel- und Kombinationsvakzinen im Mai 2011 in der IDT Biologika GmbH (Kurzbezeichnung: Kombinationsvakzineversuch) (Kapitel 2)
Für diesen Versuch wurden drei verschiedene Impfstoffe hergestellt: eine Serotyp-2- Einzelganzzellvakzine, eine Serotyp-9-Einzelganzzellvakzine und eine Kombinationsvakzine bestehend aus Serotyp 2 und 9. Die Kultivierung von S.-suis- Serotyp-2-Stamm I9841/1 und Serotyp-9-Stamm A5863/93 erfolgte auf Columbia- Nährböden mit 6% Schafblut. Hierfür wurden jeweils 10 ml THB mit dem Serotyp-9- Stamm A5863/93 und mit dem Serotyp-2-Stamm I9841/1 angeimpft und über Nacht bei 37°C inkubiert. Am nächsten Tag wurden 1,25 l THB Medium mit jeweils 5 ml Übernachtkultur (ÜNK) angeimpft , bis zu einer OD600 von 0,8 bei 37°C wachsen gelassen und durch eine finale Formaldehydkonzentration von 0,1% inaktiviert. Die inaktivierten Kulturen wurden zwei Tage lang bei 8°C auf dem Rührer durchmischt.
Zur Sterilitätsüberprüfung erfolgte das Ausplattieren der Suspension auf Blutagar.
Danach wurden die inaktivierten Kulturen zur weiteren Bearbeitung zur IDT Biologika GmbH transportiert. Dort erfolgte das Zusammenführen der beiden inaktivierten Kulturen in gleichen Volumina für die Herstellung der Kombinationsvakzine, die Zugabe des Adjuvans Emulsigen zu einer finalen Konzentration von 20% (v/v) und schließlich die Einstellung des pH-Wertes von 6 auf 7,4 mit NaOH. Für die Herstellung der Serotyp-2- und Serotyp-9-Einzelganzzellvakzinen wurde Material aus
Material und Methoden
den jeweiligen Kulturen vor dem Zusammengeben abgenommen und auf die gleiche Weise wie die Kombinationsvakzine weiterbehandelt.
Das Placebo für die Kontrollgruppe wurde auf die gleiche Weise hergestellt, nur mit dem Unterschied, dass hier, statt der Bakterienkultur, steriles THB verwendet wurde.
Jedem Tier wurden 2 ml des Impfstoffes bzw. des Placebos verabreicht. Die berechnete Impfdosis pro Applikation betrug 6 x 108 inaktivierte Bakterien für die Serotyp-9-Einzelvakzine, 1 x 109 inaktivierte Bakterien für die Serotyp-2-Einzel- vakzine, sowie 3 x 108 inaktivierte Bakterien des Serotyp 9, zusammen mit 6 x 108 inaktivierten Bakterien des Serotyp 2 in der Kombinationsvakzine.
B.5 Expression und Aufreinigung von rekombinantem MRP (rMRP) (Kapitel 2)
Zur Expression von rMRP wurde der E.-coli-Stamm M15 pQEmrp eingesetzt (Beineke et al. 2008). Dieser Bakterienstamm enthält einen Vektor, in den die Sequenz des Gens mrp kloniert wurde. Nach dem Wachstum der Bakterien bis zu einer OD600 von 0,4 wurden 500 µl 1M IPTG zu den 500 ml Kultur hinzugegeben und für 3 h schüttelnd inkubiert, um die Expression des rekombinanten Proteins zu induzieren. Es erfolgte eine anschließende Zentrifugation für 20 min bei 3800 x g.
Der Überstand wurde verworfen und das Gewicht des Sediments bestimmt, dass dann über Nacht bei -20°C lagerte. Mit Hilfe des Protino Ni-TED-Systems von Macherey-Nagel (Düren, Deutschland) erfolgte am nächsten Tag die Aufreinigung von rMRP über Ni2+-Affinitätschromatographie unter nativen Bedingungen. Hierzu wurde 1 g Sediment in 4 ml 1x LEW-Puffer (s. Anhang) resuspendiert. Dem LEW- Puffer wurde zuvor Lysozym in einer finalen Konzentration von 1 mg/ml und 100 µl pro 2 g Sediment Protease Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich, München Deutschland) zugesetzt. Es schloss sich eine Inkubation für eine Stunde bei 4°C schwenkend an, bevor dann eine Sonifizierung im Sonifier cell distruptor (Firma Heinemann, Schwäbisch Gmünd, Deutschland)) für 10 x 15 sec bei 70 Watt durchgeführt wurde.
Nachdem das Lysat für 30 min bei 10.000 x g und 4°C zentrifugiert worden war, konnte der Überstand gewonnen und zur Aufreinigung über die Protino® Ni2+-TED 2000 Säulen gegeben werden. Die Elution der Proteine erfolgte durch Zugabe von dreimal 3 ml Elutionspuffer (Anhang). Die aufgereinigten Proteine wurden anschließend in einer SDS (Natriumdodecylsulfat)-PAGE und in einem Western Blot
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mit monoklonalen Anti-Penta His Antikörpern (Qiagen, Hilden, Deutschland) bestätigt.
B.6
B.7
Westernblot (Kapitel 2)
Im Anschluss an die gelelektrophoretische Auftrennung der Proteine erfolgte die Übertragung der Proteine auf eine Nitrozellulosemembran durch Blotten für 70 min bei einer Spannung von 12 V nach dem semi-dry-Verfahren. Nach dem Blotten wurden unspezifische Bindungsstellen auf der Membran durch Übernachtinkubation derselben in TBST-Puffer (s. Anhang) mit 3% BSA blockiert. Darauf folgten drei Waschschritte mit TBST für jeweils zehn Minuten. Anschließend wurde die Membran eine Stunde bei Raumtemperatur mit einem Maus-anti-His-Antikörper Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg, Deutschland), 1:2000 in TBST mit 3% BSA) inkubiert.
Nach dreimaligem Waschen mit TBST erfolgte die Inkubation der Membran mit einem konjugiertem Sekundärantikörper (Ziege-anti-Maus-Antikörper von Amersham Pharmacia Biotech, 1:10.000 in TBST mit 1% Magermilch). Hieran schloss sich ein dreimaliges Waschen für zehn Minuten mit TBST an. Die Detektion erfolgte anschießend durch Chemilumineszenz. Dazu wurde die Oxidationslösung A mit der Lösung B (Luminol) (Thermo Scientific Super SignalR, Schwerte, Deutschland) in einem Verhältnis 1:2 gemischt, auf die Membran gegeben und für drei Minuten inkubiert. Anschließend erfolgte die Detektion der Lumineszenz über einen Röntgenfilm (Biomax, Kodak, Sigma Aldrich, München, Deutschland). Dazu wurde die Membran für jeweils 30 sec und 1 min auf den Röntgenfilm aufgelegt.
Messung des Proteingehalts (Kapitel 2 und 3)
Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte mit dem BioRad DCTM Proteinassay (München, Deutschland). In eine 96er Mikrotiterplatte wurde in jede zu belegende Vertiefung, außer in Reihe B, 25 µl Lösung A + 5 µl bidestilliertes Wasser pipettiert. In die Reihe B kamen 50 µl von Lösung A in jede Vertiefung. Eine Standardkonzentration BSA von 2.000 µg/ml wurde in die Vertiefung B1 pipettiert. In die restlichen Vertiefungen der Reihe B kamen 10 µl, der zu untersuchenden Proben im Doppelansatz. Von Reihe B bis Reihe H wurden daraufhin die Proben in einem Verhältnis von 1:2 sequentiell verdünnt. Danach erfolgte die Zugabe von 200 µl
Material und Methoden
Lösung B in jede Vertiefung. Der Ansatz wurde für 10 min im Dunkeln inkubiert und dann photometrisch (Tecan, GeniosPro, Schweiz) bei einer Wellenlänge von 595 nm gemessen.
B.8 Durchführung des ELISA (Kapitel 2)
Die Untersuchung der Versuchstiere auf Serokonversion in Folge der Immunisierung wurde im anti-MRP-ELISA durchgeführt. Für den anti-MRP-ELISA wurden Maxisorb Nunc-Immuno-Platten (Firma Nunc Dänemark) eingesetzt und mit rMRP beschichtet.
Pro Vertiefung wurden dafür 5 µg rMRP/100µl Carbonatpuffer (s. Anhang) pH 9,5 eingesetzt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Mikrotiterplatten fünfmal mit TBST (s. Anhang) im BioTek Elx405-Washer gewaschen und anschließend geblockt. Hierzu wurden in jede Vertiefung 200 µl 5% Milchpulver in PBS (s. Anhang) gegeben und die Platte für 2h bei 37°C schüttelnd inkubiert.
Bevor die Platten im ELISA eingesetzt werden konnten, wurden sie erneut fünfmal mit TBST gewaschen. Auf jeder Platte wurden von jedem Tier sowohl das Prä- als auch das Postimmunserum untersucht. Dabei wurden die Seren in jeweils vier Verdünnungsstufen in Duplikaten auf die Platte aufgetragen. Die Postimmunseren wurden von 1:200 bis zu 1:1600 verdünnt und untersucht. Bei den Präimmunseren lag die erste Verdünnungsstufe bei 1:100. Pro Vertiefung wurden 100 µl der Serumverdünnung eingesetzt und für 1 h bei 37°C schüttelnd inkubiert. Nach anschließendem fünfmaligem Waschen mit TBST im BioTek EL x 405 ELISA washer wurden pro Vertiefung 100 µl von einem anti-Schwein-IgG POD (Peroxidase) markiertem Antikörper (Dianova, Hamburg, Deutschland) in einer Verdünnung von 1:10.000 in TBST dazugegeben und für eine Stunde bei 37°C schüttelnd inkubiert.
Es folgte erneut fünfmaliges Waschen mit TBST. Anschließend wurden 100 µl einer 1:1500 Verdünnung von 3%igem Wasserstoffperoxid in einer ABTS-Lösung (2,2`- Azino-di-(3-Ethylbenzthiazolin)-6-Sulfonsäure) in jede Vertiefung gegeben, bevor sich eine Inkubation für 15 min bei 37°C schüttelnd anschloss. Die Peroxidase reduzierte hierbei H2O2 und oxidierte das Substrat ABTS, wobei ein grüngefärbtes ABTS-Radikalkation gebildet wurde. Abschließend wurde die Absorption im Photometer (Tecan, Schweiz) bei einer OD405 gemessen.
Der Antikörpertiter des Standardserums wurde als 100 ELISA-Units definiert. Für die Bestimmung der ELISA-Units legt das Programm einen Messbereich nach linearer
38
Regressionsanalyse der Messwerte des Standardserums fest. Die Steigung der Regressionsgeraden sollte Werte zwischen 0,9 und 1,1 annehmen und der Korrelationskoeffizient Werte über 0,95. Die Regressionsgeraden wurden für jeden ELISA ausgedruckt und überprüft. Zur Korrektur von unspezifischen Bindungen wurde jeder Messwert der Standard- und Testseren mit der Hintergrundabsorption auf BSA beschichteten Vertiefungen korrigiert. Dafür wurden die Spalten 11 und 12 jeder Mikrotiterplatte mit BSA beschichtet und mit den entsprechenden Verdünnungen des Standardserums versetzt und gemessen. Die ELISA-Units für ein Tier ergaben sich aus dem Mittelwert der durchschnittlichen ELISA-Units von zwei identischen Verdünnungsreihen. Die Abweichung der Duplikate sollte dabei im Mittelwert nicht mehr als 15% betragen. Seren, die im ELISA keine detektierbaren Titer zeigten (Angabe: < min), wurden zur logarithmischen Darstellung mit 5 ELISA- Units angegeben. Bei Messwerten oberhalb des Wertebereiches der Regressionsgeraden (Angabe: > max), wurde die Messung der Seren in einer höheren Verdünnungsstufe wiederholt. Für die Positivkontrolle wurde das Serum eines Schweines verwendet, das in einem vorangegangenen Experiment mit rMRP immunisiert worden war. Diese Kontrolle musste Werte zwischen 100 und 130 ELISA-Units annehmen. Das Negativkontrollserum stammte von einem nicht immunisierten Tier aus dem Herkunftsbestand der Versuchstiere.
B.9 Aufreinigung der neutrophilen Granulozyten für den Opsonophagozytosetest (Kapitel 2)
Die neutrophilen Granulozyten wurden aus heparinisiertem Schweineblut, unter Verwendung von 7,5 ml mit Heparin beschichteten Serummonovetten mit Gel gewonnen (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland).
Für die Isolierung der neutrophilen Granulozyten wurden 13 ml des frisch entnommenen Blutes mit 13 ml sterilem 0,9% NaCl versetzt. Von dieser Suspension wurden zweimal 12 ml vorsichtig auf je 12 ml Biocoll Trennungslösung (Biochrom AG) pipettiert, die in einem 50 ml Röhrchen (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) vorgelegt waren (Verhinderung einer Phasenvermischung). Anschließend erfolgte eine Zentrifugation für 32 min bei 420 g und einer Temperatur von 21°C sowie ungebremsten Auslaufen. Nach der Abnahme des Überstandes wurde das Sediment in 8 ml eisgekühltem 0,8% NaCl aufgenommen, um eine Lyse der Erythrozyten zu
Material und Methoden
bewirken. Nach 30 sec wurde die Lyse durch Zugabe von 8 ml eisgekühltem 1,6%
NaCl abgestoppt. Die Suspension wurde für 6 min bei 420 g und 6°C zentrifugiert.
Nach dem Verwerfen des Überstandes wurde das Zellsediment einer Wiederholung der Erythrozytenlyse unterworfen. Dies wurde drei- bis viermal wiederholt, bis die Erythrozyten weitgehend entfernt waren und das Sediment eine weiße Farbe angenommen hatte. Danach erfolgte die Aufnahme des Sediments in 1000 µl kaltem RPMI-Medium (Sigma Aldrich, München, Deutschland). Die Auszählung der Neutrophilen in einer Neubauerzählkammer schloss sich an, hierbei wurde von der Neutrophilensuspension eine 1:5 Verdünnung hergestellt und mindestens 10 Quadrate in der Neubauerzählkammer ausgezählt. Die durchschnittliche Zahl an neutrophilen Granulozyten pro Quadrat wurde zunächst mit 5 und dann mit 160000 multipliziert, das Ergebnis hieraus war die Anzahl an Neutrophilen pro ml. In den Testansätzen mit dem Serotyp-2-Stamm 10 wurden pro Opsonophagozytoseansatz (s. u.) 400 µl RPMI-Suspension mit einer Neutrophilenzahl von 2 x 106/ml eingesetzt, während für den Serotyp-9-Stamm A3286/94 4,5x 106 Neutrophile/ml verwendet wurden.
B.10 Opsonophagozytosetest (Kapitel 2)
Die Prä- und Postimmunseren der Versuchsschweine wurden auf ihre Fähigkeit, die Opsonophagozytose der Serotyp-2- und 9-Referenzstämme 10 bzw. A3286/94 in vitro durch porzine primäre neutrophile Granulozyten zu vermitteln, untersucht. Das Präimmunserum wurde dabei vor der ersten Immunisierung der Tiere (Durchschnittsalter der Tiere 25 Tage) entnommen und das Postimmunserum zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung (Durchschnittsalter der Tiere 53 Tage).
Im Testansatz wurden dafür zuerst 100 µl Serum vorgelegt und auf Eis kühl gehalten, danach wurden 10 µl einer eingefrorenen aliquotierten Bakterienkultur von S.-suis-Serotyp-2-Stamm 10 oder Serotyp-9-Stamm A3286/94 hinzugefügt (s. u.) und mit 400 µl einer eingestellten Suspension von neutrophilen Granulozyten (s. 2.9) versetzt.
Die standardisierte Herstellung der eingefrorenen aliquotierten Bakterienkultur der beiden Stämme erfolgte einige Tage vorher und ging auf eine Veröffentlichung von Romero-Steiner et al. (1997) zurück. Dafür wurden S.-suis-Serotyp-2-Stamm 10 und Serotyp-9-Stamm A3286/94 auf Columbia-Nährböden mit 6% Schafblut ausge-
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strichen. 10 ml THB wurden jeweils mit einer Kolonie angeimpft und über Nacht bei 37°C kultiviert. Am nächsten Tag wurden 100 ml THB mit 1 ml der Übernachtkultur angeimpft und bei 37°C bis zu einer OD600 von 0,5 - 0,6 kutiviert. Hiervon wurden 34 ml abgenommen und auf Eis heruntergekühlt. Durch den Zusatz von 6 ml Glycerol (15% v/v) konnten die Standardkulturen alliquotiert und in flüssigem Stickstoff schockgefroren werden. Die Anzahl der koloniebildenden Einheit in 10 µl konnte mit einem Plattenverdünnungstest ermitttelt werden.
Als letzte Komponente wurde jedem Testansatz 400 µl der Neutrophilensuspension in einer bestimmten Konzentration hinzugefügt. Wie schon in vorhergehenden Studien (Baums et al. 2009) wurde dabei im Opsonophagozytosetest gegen den Serotyp-9-Stamm A3286/94 ein Verhältnis von Bakterien zu neutrophilen Granulozyten von 5,6:1 (multiplicity of infection, MOI) gewählt, hierbei wurden in einem Testansatz 4,5 x 106 KBE S. suis A3286/94 zu 0,8 x106 neutrophilen Granulozyten gegeben. Im Opsonophagozytosetest gegen den Serotyp-2-Stamm 10 wurden 2 x 106 KBE S. suis mit 2 x 106 neutrophilen Granulozyten inkubiert. Damit lag die MOI bei 1:1. Nach der Zugabe der neutrophilen Granulozyten wurde jeder Testansatz durch vorsichtiges auf und ab Pipettieren miteinander vermischt. Ein 20 µl Aliquot des Testansatzes wurden zum Zeitpunkt t0 (direkt nach dem Mischen) und zum Zeitpunkt t60 (nach 60 min Inkubation) mit PBS in 1:10-Schritten in einer gekühlten Mikrotiterplatte verdünnt und in geeigneten Verdünnungsstufen auf vorgetrockneten Blutplatten ausplattiert. Die 60 min Inkubation erfolgte im 1,5 ml Reaktionsgefäß (Sarstedt) bei 37°C auf einem Rotator. Der Überlebensfaktor ergab sich aus dem Quotient der KBE zum Zeitpunkt t60 und t0. Als Maß für die Induktion opsonisierender Antikörper wurde in Übereinstimmung mit einer vorausgegangenen Dissertation (Kock 2009) der Faktor F als Quotient aus den Überlebensfaktoren für das Post- und Präimmunserum definiert. Ein niedriger Faktor F (kleiner 1) sprach für eine Induktion opsonisierender Antikörper. Als Positivkontrollen für den Opsonophagozytosetest mit dem Serotyp-9-Stamm A3286/94 wurde unter anderem das Hyperimmunserum eines Kaninchens gegen den Stamm A3286/94 verwendet (dreimalige Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine auf der Grundlage von Stamm A3286/94). Als weitere Kontrolle kam das Serum eines rekonvaleszenten und immunisierten Schweines zum Einsatz, das 11 Tage nach der experimentellen Infektion mit dem Serotyp-9-Stamm A3286/94 gewonnen wurde, nachdem es zwei und vier Wochen vor der Infektion mit einer Serotyp-9-Ganzzellvakzine auf der
