Zur Expression von rMRP wurde der E.-coli-Stamm M15 pQEmrp eingesetzt (Beineke et al. 2008). Dieser Bakterienstamm enthält einen Vektor, in den die Sequenz des Gens mrp kloniert wurde. Nach dem Wachstum der Bakterien bis zu einer OD600 von 0,4 wurden 500 µl 1M IPTG zu den 500 ml Kultur hinzugegeben und für 3 h schüttelnd inkubiert, um die Expression des rekombinanten Proteins zu induzieren. Es erfolgte eine anschließende Zentrifugation für 20 min bei 3800 x g.
Der Überstand wurde verworfen und das Gewicht des Sediments bestimmt, dass dann über Nacht bei -20°C lagerte. Mit Hilfe des Protino Ni-TED-Systems von Macherey-Nagel (Düren, Deutschland) erfolgte am nächsten Tag die Aufreinigung von rMRP über Ni2+-Affinitätschromatographie unter nativen Bedingungen. Hierzu wurde 1 g Sediment in 4 ml 1x Puffer (s. Anhang) resuspendiert. Dem LEW-Puffer wurde zuvor Lysozym in einer finalen Konzentration von 1 mg/ml und 100 µl pro 2 g Sediment Protease Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich, München Deutschland) zugesetzt. Es schloss sich eine Inkubation für eine Stunde bei 4°C schwenkend an, bevor dann eine Sonifizierung im Sonifier cell distruptor (Firma Heinemann, Schwäbisch Gmünd, Deutschland)) für 10 x 15 sec bei 70 Watt durchgeführt wurde.
Nachdem das Lysat für 30 min bei 10.000 x g und 4°C zentrifugiert worden war, konnte der Überstand gewonnen und zur Aufreinigung über die Protino® Ni2+-TED 2000 Säulen gegeben werden. Die Elution der Proteine erfolgte durch Zugabe von dreimal 3 ml Elutionspuffer (Anhang). Die aufgereinigten Proteine wurden anschließend in einer SDS (Natriumdodecylsulfat)-PAGE und in einem Western Blot
36
mit monoklonalen Anti-Penta His Antikörpern (Qiagen, Hilden, Deutschland) bestätigt.
B.6
B.7
Westernblot (Kapitel 2)
Im Anschluss an die gelelektrophoretische Auftrennung der Proteine erfolgte die Übertragung der Proteine auf eine Nitrozellulosemembran durch Blotten für 70 min bei einer Spannung von 12 V nach dem semi-dry-Verfahren. Nach dem Blotten wurden unspezifische Bindungsstellen auf der Membran durch Übernachtinkubation derselben in TBST-Puffer (s. Anhang) mit 3% BSA blockiert. Darauf folgten drei Waschschritte mit TBST für jeweils zehn Minuten. Anschließend wurde die Membran eine Stunde bei Raumtemperatur mit einem Maus-anti-His-Antikörper Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg, Deutschland), 1:2000 in TBST mit 3% BSA) inkubiert.
Nach dreimaligem Waschen mit TBST erfolgte die Inkubation der Membran mit einem konjugiertem Sekundärantikörper (Ziege-anti-Maus-Antikörper von Amersham Pharmacia Biotech, 1:10.000 in TBST mit 1% Magermilch). Hieran schloss sich ein dreimaliges Waschen für zehn Minuten mit TBST an. Die Detektion erfolgte anschießend durch Chemilumineszenz. Dazu wurde die Oxidationslösung A mit der Lösung B (Luminol) (Thermo Scientific Super SignalR, Schwerte, Deutschland) in einem Verhältnis 1:2 gemischt, auf die Membran gegeben und für drei Minuten inkubiert. Anschließend erfolgte die Detektion der Lumineszenz über einen Röntgenfilm (Biomax, Kodak, Sigma Aldrich, München, Deutschland). Dazu wurde die Membran für jeweils 30 sec und 1 min auf den Röntgenfilm aufgelegt.
Messung des Proteingehalts (Kapitel 2 und 3)
Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte mit dem BioRad DCTM Proteinassay (München, Deutschland). In eine 96er Mikrotiterplatte wurde in jede zu belegende Vertiefung, außer in Reihe B, 25 µl Lösung A + 5 µl bidestilliertes Wasser pipettiert. In die Reihe B kamen 50 µl von Lösung A in jede Vertiefung. Eine Standardkonzentration BSA von 2.000 µg/ml wurde in die Vertiefung B1 pipettiert. In die restlichen Vertiefungen der Reihe B kamen 10 µl, der zu untersuchenden Proben im Doppelansatz. Von Reihe B bis Reihe H wurden daraufhin die Proben in einem Verhältnis von 1:2 sequentiell verdünnt. Danach erfolgte die Zugabe von 200 µl
Material und Methoden
Lösung B in jede Vertiefung. Der Ansatz wurde für 10 min im Dunkeln inkubiert und dann photometrisch (Tecan, GeniosPro, Schweiz) bei einer Wellenlänge von 595 nm gemessen.
B.8 Durchführung des ELISA (Kapitel 2)
Die Untersuchung der Versuchstiere auf Serokonversion in Folge der Immunisierung wurde im anti-MRP-ELISA durchgeführt. Für den anti-MRP-ELISA wurden Maxisorb Nunc-Immuno-Platten (Firma Nunc Dänemark) eingesetzt und mit rMRP beschichtet.
Pro Vertiefung wurden dafür 5 µg rMRP/100µl Carbonatpuffer (s. Anhang) pH 9,5 eingesetzt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Mikrotiterplatten fünfmal mit TBST (s. Anhang) im BioTek Elx405-Washer gewaschen und anschließend geblockt. Hierzu wurden in jede Vertiefung 200 µl 5% Milchpulver in PBS (s. Anhang) gegeben und die Platte für 2h bei 37°C schüttelnd inkubiert.
Bevor die Platten im ELISA eingesetzt werden konnten, wurden sie erneut fünfmal mit TBST gewaschen. Auf jeder Platte wurden von jedem Tier sowohl das Prä- als auch das Postimmunserum untersucht. Dabei wurden die Seren in jeweils vier Verdünnungsstufen in Duplikaten auf die Platte aufgetragen. Die Postimmunseren wurden von 1:200 bis zu 1:1600 verdünnt und untersucht. Bei den Präimmunseren lag die erste Verdünnungsstufe bei 1:100. Pro Vertiefung wurden 100 µl der Serumverdünnung eingesetzt und für 1 h bei 37°C schüttelnd inkubiert. Nach anschließendem fünfmaligem Waschen mit TBST im BioTek EL x 405 ELISA washer wurden pro Vertiefung 100 µl von einem anti-Schwein-IgG POD (Peroxidase) markiertem Antikörper (Dianova, Hamburg, Deutschland) in einer Verdünnung von 1:10.000 in TBST dazugegeben und für eine Stunde bei 37°C schüttelnd inkubiert.
Es folgte erneut fünfmaliges Waschen mit TBST. Anschließend wurden 100 µl einer 1:1500 Verdünnung von 3%igem Wasserstoffperoxid in einer ABTS-Lösung (2,2`-Azino-di-(3-Ethylbenzthiazolin)-6-Sulfonsäure) in jede Vertiefung gegeben, bevor sich eine Inkubation für 15 min bei 37°C schüttelnd anschloss. Die Peroxidase reduzierte hierbei H2O2 und oxidierte das Substrat ABTS, wobei ein grüngefärbtes ABTS-Radikalkation gebildet wurde. Abschließend wurde die Absorption im Photometer (Tecan, Schweiz) bei einer OD405 gemessen.
Der Antikörpertiter des Standardserums wurde als 100 ELISA-Units definiert. Für die Bestimmung der ELISA-Units legt das Programm einen Messbereich nach linearer
38
Regressionsanalyse der Messwerte des Standardserums fest. Die Steigung der Regressionsgeraden sollte Werte zwischen 0,9 und 1,1 annehmen und der Korrelationskoeffizient Werte über 0,95. Die Regressionsgeraden wurden für jeden ELISA ausgedruckt und überprüft. Zur Korrektur von unspezifischen Bindungen wurde jeder Messwert der Standard- und Testseren mit der Hintergrundabsorption auf BSA beschichteten Vertiefungen korrigiert. Dafür wurden die Spalten 11 und 12 jeder Mikrotiterplatte mit BSA beschichtet und mit den entsprechenden Verdünnungen des Standardserums versetzt und gemessen. Die ELISA-Units für ein Tier ergaben sich aus dem Mittelwert der durchschnittlichen ELISA-Units von zwei identischen Verdünnungsreihen. Die Abweichung der Duplikate sollte dabei im Mittelwert nicht mehr als 15% betragen. Seren, die im ELISA keine detektierbaren Titer zeigten (Angabe: < min), wurden zur logarithmischen Darstellung mit 5 ELISA-Units angegeben. Bei Messwerten oberhalb des Wertebereiches der Regressionsgeraden (Angabe: > max), wurde die Messung der Seren in einer höheren Verdünnungsstufe wiederholt. Für die Positivkontrolle wurde das Serum eines Schweines verwendet, das in einem vorangegangenen Experiment mit rMRP immunisiert worden war. Diese Kontrolle musste Werte zwischen 100 und 130 ELISA-Units annehmen. Das Negativkontrollserum stammte von einem nicht immunisierten Tier aus dem Herkunftsbestand der Versuchstiere.
B.9 Aufreinigung der neutrophilen Granulozyten für den Opsonophagozytosetest (Kapitel 2)
Die neutrophilen Granulozyten wurden aus heparinisiertem Schweineblut, unter Verwendung von 7,5 ml mit Heparin beschichteten Serummonovetten mit Gel gewonnen (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland).
Für die Isolierung der neutrophilen Granulozyten wurden 13 ml des frisch entnommenen Blutes mit 13 ml sterilem 0,9% NaCl versetzt. Von dieser Suspension wurden zweimal 12 ml vorsichtig auf je 12 ml Biocoll Trennungslösung (Biochrom AG) pipettiert, die in einem 50 ml Röhrchen (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) vorgelegt waren (Verhinderung einer Phasenvermischung). Anschließend erfolgte eine Zentrifugation für 32 min bei 420 g und einer Temperatur von 21°C sowie ungebremsten Auslaufen. Nach der Abnahme des Überstandes wurde das Sediment in 8 ml eisgekühltem 0,8% NaCl aufgenommen, um eine Lyse der Erythrozyten zu
Material und Methoden
bewirken. Nach 30 sec wurde die Lyse durch Zugabe von 8 ml eisgekühltem 1,6%
NaCl abgestoppt. Die Suspension wurde für 6 min bei 420 g und 6°C zentrifugiert.
Nach dem Verwerfen des Überstandes wurde das Zellsediment einer Wiederholung der Erythrozytenlyse unterworfen. Dies wurde drei- bis viermal wiederholt, bis die Erythrozyten weitgehend entfernt waren und das Sediment eine weiße Farbe angenommen hatte. Danach erfolgte die Aufnahme des Sediments in 1000 µl kaltem RPMI-Medium (Sigma Aldrich, München, Deutschland). Die Auszählung der Neutrophilen in einer Neubauerzählkammer schloss sich an, hierbei wurde von der Neutrophilensuspension eine 1:5 Verdünnung hergestellt und mindestens 10 Quadrate in der Neubauerzählkammer ausgezählt. Die durchschnittliche Zahl an neutrophilen Granulozyten pro Quadrat wurde zunächst mit 5 und dann mit 160000 multipliziert, das Ergebnis hieraus war die Anzahl an Neutrophilen pro ml. In den Testansätzen mit dem Serotyp-2-Stamm 10 wurden pro Opsonophagozytoseansatz (s. u.) 400 µl RPMI-Suspension mit einer Neutrophilenzahl von 2 x 106/ml eingesetzt, während für den Serotyp-9-Stamm A3286/94 4,5x 106 Neutrophile/ml verwendet wurden.
B.10 Opsonophagozytosetest (Kapitel 2)
Die Prä- und Postimmunseren der Versuchsschweine wurden auf ihre Fähigkeit, die Opsonophagozytose der Serotyp-2- und 9-Referenzstämme 10 bzw. A3286/94 in vitro durch porzine primäre neutrophile Granulozyten zu vermitteln, untersucht. Das Präimmunserum wurde dabei vor der ersten Immunisierung der Tiere (Durchschnittsalter der Tiere 25 Tage) entnommen und das Postimmunserum zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung (Durchschnittsalter der Tiere 53 Tage).
Im Testansatz wurden dafür zuerst 100 µl Serum vorgelegt und auf Eis kühl gehalten, danach wurden 10 µl einer eingefrorenen aliquotierten Bakterienkultur von S.-suis-Serotyp-2-Stamm 10 oder Serotyp-9-Stamm A3286/94 hinzugefügt (s. u.) und mit 400 µl einer eingestellten Suspension von neutrophilen Granulozyten (s. 2.9) versetzt.
Die standardisierte Herstellung der eingefrorenen aliquotierten Bakterienkultur der beiden Stämme erfolgte einige Tage vorher und ging auf eine Veröffentlichung von Romero-Steiner et al. (1997) zurück. Dafür wurden S.-suis-Serotyp-2-Stamm 10 und Serotyp-9-Stamm A3286/94 auf Columbia-Nährböden mit 6% Schafblut
ausge-40
strichen. 10 ml THB wurden jeweils mit einer Kolonie angeimpft und über Nacht bei 37°C kultiviert. Am nächsten Tag wurden 100 ml THB mit 1 ml der Übernachtkultur angeimpft und bei 37°C bis zu einer OD600 von 0,5 - 0,6 kutiviert. Hiervon wurden 34 ml abgenommen und auf Eis heruntergekühlt. Durch den Zusatz von 6 ml Glycerol (15% v/v) konnten die Standardkulturen alliquotiert und in flüssigem Stickstoff schockgefroren werden. Die Anzahl der koloniebildenden Einheit in 10 µl konnte mit einem Plattenverdünnungstest ermitttelt werden.
Als letzte Komponente wurde jedem Testansatz 400 µl der Neutrophilensuspension in einer bestimmten Konzentration hinzugefügt. Wie schon in vorhergehenden Studien (Baums et al. 2009) wurde dabei im Opsonophagozytosetest gegen den Serotyp-9-Stamm A3286/94 ein Verhältnis von Bakterien zu neutrophilen Granulozyten von 5,6:1 (multiplicity of infection, MOI) gewählt, hierbei wurden in einem Testansatz 4,5 x 106 KBE S. suis A3286/94 zu 0,8 x106 neutrophilen Granulozyten gegeben. Im Opsonophagozytosetest gegen den Serotyp-2-Stamm 10 wurden 2 x 106 KBE S. suis mit 2 x 106 neutrophilen Granulozyten inkubiert. Damit lag die MOI bei 1:1. Nach der Zugabe der neutrophilen Granulozyten wurde jeder Testansatz durch vorsichtiges auf und ab Pipettieren miteinander vermischt. Ein 20 µl Aliquot des Testansatzes wurden zum Zeitpunkt t0 (direkt nach dem Mischen) und zum Zeitpunkt t60 (nach 60 min Inkubation) mit PBS in 1:10-Schritten in einer gekühlten Mikrotiterplatte verdünnt und in geeigneten Verdünnungsstufen auf vorgetrockneten Blutplatten ausplattiert. Die 60 min Inkubation erfolgte im 1,5 ml Reaktionsgefäß (Sarstedt) bei 37°C auf einem Rotator. Der Überlebensfaktor ergab sich aus dem Quotient der KBE zum Zeitpunkt t60 und t0. Als Maß für die Induktion opsonisierender Antikörper wurde in Übereinstimmung mit einer vorausgegangenen Dissertation (Kock 2009) der Faktor F als Quotient aus den Überlebensfaktoren für das Post- und Präimmunserum definiert. Ein niedriger Faktor F (kleiner 1) sprach für eine Induktion opsonisierender Antikörper. Als Positivkontrollen für den Opsonophagozytosetest mit dem Serotyp-9-Stamm A3286/94 wurde unter anderem das Hyperimmunserum eines Kaninchens gegen den Stamm A3286/94 verwendet (dreimalige Immunisierung mit einer Ganzzellvakzine auf der Grundlage von Stamm A3286/94). Als weitere Kontrolle kam das Serum eines rekonvaleszenten und immunisierten Schweines zum Einsatz, das 11 Tage nach der experimentellen Infektion mit dem Serotyp-9-Stamm A3286/94 gewonnen wurde, nachdem es zwei und vier Wochen vor der Infektion mit einer Serotyp-9-Ganzzellvakzine auf der
Material und Methoden
Grundlage des Seroytp-9-Stammes A5683/94 immunisiert worden war (Büttner et al., 2012). Die Ergebnisse eines Opsonophagozytosetests wurden nur akzeptiert, wenn der Wertebereich des Überlebensfaktors des rekonvaleszenten Serums zwischen 0,07 - 0,22 und des Hyperimmunserums vom Kaninchen zwischen 0,04 – 0,15 lag.
Im Test gegen den Serotyp 2 wurde das Rekonvaleszenzserum eines experimentell mit Stamm 10 infizierten Schweines (177) eingesetzt. In diesem Testansatz sollte der Überlebensfaktor von Stamm 10 kleiner 0,2 sein. Ein Serum von einem Kontrollschwein (233) aus demselben Herkunftbestand diente als Negativkontrolle (Überlebensfaktor von Stamm 10 mit Werten zwischen 1,28 und 2,26).
B.11
B.12
Herstellung eines Anti-Stamm A3286/94 Antiserums (Kapitel 2)
Für die Herstellung eines polyklonalen Antiserums gegen den Stamm A3286/94 wurde ein Kaninchen dreimal mit einer Ganzzellvakzine auf der Grundlage von Stamm A3286/94 mit 50% „Freud`s incomplete Adjuvans“ (Difco, USA) immunisiert.
Die Immunisierungen erfolgten im Abstand von zehn Tagen subkutan. Vor und nach den Immunisierungen wurden Serumproben für Untersuchungen im Westernblot entnommen. Das polyklonale Antiserum gegen Stamm A3286/94 wurde durch Entblutung des Kaninchens gewonnen.
Tonsillentupferentnahme (Kapitel 2)
Die Entnahme von Tonsillentupfern erfolgte bei den Tieren aus den beiden Gruppen, die ein drittes Mal mit der Kombinationsvakzine bzw. dem Placebo immunisiert worden waren. Hierbei sollte ihr S.-suis-Serotyp-2 und 9-Status überprüft werden.
Dafür wurden die Tiere zunächst in Narkose gelegt. Das Anästhetikum, bestehend aus einer Kombination von 2 mg Azaperon/kg Körpergewicht (KGW) und 10 mg Ketamin/kg KGW, wurde dafür intramuskulär am Ohrgrund appliziert. Zur Probenentnahme wurden die Tiere auf dem Bauch gelagert. Mittels eines Maulgatters konnten die Kiefer geöffnet und gleichzeitig der Zungengrund mit einem Laryngoskop nach unten gedrückt werden. Die Tupferproben wurden an der rechten Tonsilla veli palatini unter Sichtkontrolle entnommen.
42
B.13
B.14
Monoplex-PCR (Kapitel 2)
Nach der dritten Immunisierung wurden die Tiere aus dem Kombinationsvakzineversuch, die die Kombinationsvakzine oder den Placebo erhalten hatten, mit einem Tonsillentupfer auf ihren S.-suis-Serotyp-2 und 9-Status genotypisch überprüft. Dafür wurde eine cps2 und eine cps9 Monoplex PCR mit isolierten α-hämolysierenden Streptokokken durchgeführt. In 200 µl Eppendorfgefäßen wurde 100 µl SigmaR-Wasser (Sigma Aldrich, München, Deutschland) vorgelegt und pro Ansatz 1-2 Kolonien der isolierten α-hämolysierenden Streptokokken eingerührt. Die Streptokokken wurden dann in der Mikrowelle bei 900 Watt für 8 min lysiert. Anschließend wurden hiervon 5 µl in 35 µl Aqua bidest. verdünnt. Zu diesem Reaktionsansatz wurden 10 µl Mastermix hinzugefügt (s. Anhang). Für die cps-2-PCR wurde das Primerpaar TTTGTCGGGAGGGTTACTTG und TTTGGAAGCGATTCATCTCC sowie für die cps-9-PCR das Primerpaar GGGATGATTGCTCGACAGAT und CCGAAGTATCTGGGCTACTGA verwendet (Silva et al. 2006). Die PCR erfolgte im Mastercycler der Firma Eppendorf (Deutschland) nach folgendem Programm: Initiale Denaturierung für 2 min bei 94°C, 36 Zyklen mit 1 min 94°C Denaturierung, 1 min 58°C Hybridisierung, 1.30 min. 72°C Replikation und eine finale Extension für 2 min.
bei 72°C. Zur Darstellung der Amplifikate wurden 15 µl der PCR-Produkte zusammen mit 3 µl von einem 6 x Blaupuffer (s. Anhang) auf ein 1% Agarosegel (s. Anhang) aufgetragen und in der Gelelektrophorese aufgetrennt. Als Größenstandard wurde eine 100 bp Leiter mitgeführt. Schließlich wurde das Gel im Stick (INTAS, Göttingen, Deutschland) digital verarbeitet.
Bakterienstämme und Kultivierung (Kapitel 3)
Für die Immunisierung und Infektion wurde der S.-suis-Serotyp-2-Stamm 10 eingesetzt. Dieser Stamm exprimiert als virulenzassoziierte Faktoren das muraminidase-released protein (MRP), den extracellular factor (EF) und das Suilysin (SLY) (Gottschalk & Segura, 2000; Smith et al., 1999; Vecht et al., 1991; Wisselink et al., 2000) und ist in experimentellen Infektionen ein hochvirulenter Infektionserreger (Baums et al., 2006; de Greeff et al., 2002; Smith et al., 1999). Die Kultivierung von S.-suis-Serotyp-2 Stamm 10 erfolgte auf Columbia-Nährböden mit 6% Schafblut. Die
Material und Methoden
Primäranzucht in einer Flüssigkultur von S.-suis-Serotyp-2 Stamm 10 erfolgte bei 37°C in 30 ml Todd Hewitt Broth (THB-Medium) über Nacht. Anschließend wurden mit 10 ml dieser Übernachtkultur 1000 ml THB-Medium angeimpft und bei 37°C bis zu einer OD600 von 0,8 kultiviert.
B.15 Reinigung der Kapselpolysaccharide (Kapitel 3)
Für die Reinigung der Kapselpolysaccharide wurde S.-suis Stamm 10 in 1 l THB-Medium bis zu einer OD600 von 0,8 bei 37°C angezüchtet. Nach der anschließenden Zentrifugation für 20 min bei 5.000 g wurde der Überstand verworfen und das Sediment in 200 ml 0,9% NaCl aufgenommen und erneut zentrifugiert. Danach wurde das Sediment in 100 ml 0,1 M Glycin-Puffer mit einem pH-Wert von 9,2 resuspendiert und mit 10 mg/ml Lysozym versetzt und bei 37°C über Nacht gerührt.
Nach dieser Inkubation und der anschließenden Abzentrifugation des Zelldebris für 30 min bei 10.000 g erfolgte die Lyophilisierung des Überstandes. Das Lyophilisat wurde in 10 ml 0,1 M CaCl2 gelöst und zur Ausfällung der Nukleinsäuren für acht Stunden auf eine Alkoholkonzentration von 25% eingestellt. Auch hier wurden anschließend wieder die Zellbestandbestandteile für 30 min bei 10.000 g abzentrifugiert und der Überstand weiter verwendet. Die Alkoholkonzentration sollte auf 80% erhöht werden, um ein Ausfallen der Polysaccharide zu ermöglichen (Inkubation über Nacht bei 4°C rotierend). Das Sediment wurde nach dem Abzentrifugieren für 30 min bei 10.000 g in 10 ml 50 µM sterilem TRIS mit einem pH-Wert von 7,5 resuspendiert und eventuell unlösliche Bestandteile erneut für 30 min bei 10.000 g abzentrifugiert. Anschließend konnten die Polysaccharide durch einen DNAse-, RNAse- und Proteinase-K-Verdau und Phenolextraktion weiter aufgereinigt werden. Dabei wurde von der RNAse 10 µg/ml (Sigma Aldrich Typ I-A) und von der DNAse 1,5 µg/ml (Sigma-Aldrich DN-25) eingesetzt. Dieser Verdau erfolgte für acht Stunden rotierend. Die Proteinase K (Roth, Karlsruhe, Deutschland) wurde in einer finalen Konzentration von 0,4 µg/ml dazugegeben und über Nacht bei 37°C auf dem Rotator inkubiert. Das Abzentrifugieren erfolgte dann für 10 min bei 10.000 g.
Danach wurde Phenol in einem Verhältnis von 1:2 dazugegeben und 30 min bei 10.000 g zentrifugiert (langsames Auslaufen der Zentrifuge, um eine Phasentrennung beizubehalten). Die obere Phase wurde abgenommen und von kleineren Bestandteilen durch eine Dialyse mit einem cutoff von 8000-10.000 kDa
44
befreit (Dialyseschlauch Zellu Trans von Roth, Karlsruhe, Deutschland). Nach einer zweitägigen Dialyse gegen 2 l steriles A. bidest, wurden die Kapselpolysaccharide lyophilisiert und in 1 ml PBS resuspendiert. Unlösliche Bestandteile waren durch Zentrifugation für 30 min bei 24.000 g zu entfernen (Elliott & Tai, 1978).
B.16
B.17
Messung des Zuckergehalts (Kapitel 3)
Der Zuckergehalt wurde mit der Phenol-Schwefelsäure-Methode nach Fox & Robyt (1991) bestimmt.
Der Test wurde in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) durchgeführt. In der Reihe A lag die Probe unverdünnt vor und wurde dann von Reihe B bis H mit PBS in einem Verhältnis 1:2 sequentiell verdünnt. In der ersten Spalte wurde ein Glukosestandard mitgeführt mit einer Ausgangskonzentration von 200 µg/ml, mit dem genauso wie mit den Proben verfahren wurde. In alle Vertiefungen wurde 5%iges Phenol in einem Verhältnis von 1:2 dazugegeben und danach die Mikrotiterplatte für 30 sec auf einem Vortexer durchmischt. Auf Eis gekühlt wurde in jede Vertiefung konzentrierte Schwefelsäure in einem Verhältnis 1:3,5 gegeben und wieder für 30 sec auf einem Vortexer durchmischt. Danach wurde die Mikrotiterplatte im Wasserbad bei 80°C für 30 min inkubiert, bevor nach kurzem Abkühlen im Photometer (Tecan, GeniosPro, Schweiz) die Absorption bei einer Wellenlänge von 492 nm gemessen werden konnte.
SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektropho-rese) der Kapselpolysaccharide (Kapitel 3)
Für die Auftrennung der Kapselpolysaccharide und anschließende Silberfärbung oder Western Blot Analyse wurde eine SDS-Page durchgeführt. Dafür erfolgte zunächst das Gießen eines 5% Polyacrylamid-Trenngels ohne Sammelgel mit 1,25 ml 10 x TBE, 8,3 ml 30% Acrylamid, 250 µl 20% SDS, 38 µl TEMED, 380 µl 10%
APS aufgefüllt auf 50 ml A. bidest (s. Anhang). Die Proben wurden mit einem 2 x Probenpuffer (s. Anhang) versetzt und anschließend in einem Heizblock für 20 min bei 100°C erhitzt. Dies diente der vollständigen Denaturierung der Proteine. Die glykosidischen Bindungen der Kapselpolysaccharide sind bei diesen Temperaturbedingungen weitgehend stabil. In einer Elektrophoresekammer (Biorad,
Material und Methoden
München, Deutschland), die mit einem SDS-Laufpuffer (s. Anhang) gefüllt war, wurden die Proben auf das Gel geladen und für eine Stunde bei 150 V aufgetrennt.
B.18
B.19
Silberfärbung zum Nachweis der Kapelpolysaccharide (Kapitel 3)
Die Darstellung der Kapselpolysaccharide durch eine Silberfärbung erfolgte nach vorausgegangener SDS-PAGE. Das SDS-Polyacrylamidgel wurde nach dem Lauf über Nacht fixiert. Die Fixationslösung (20ml) bestand aus 40% (v/v) Ethanol und 5%
(v/v) konzentrierter Essigsäure. Darin musste das Gel in einer Glasschale auf einem Schüttler in Bewegung gehalten werden. Am nächsten Tag wurde die Fixationslösung gegen eine Oxidationslösung ausgetauscht. Diese setzte sich aus 0,7% (w/v) Perjodsäure, 20% (v/v) Ethanol, 2,5% (v/v) konzentrierter Essigsäure zusammen und wurde darin für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde dreimal für 10 min mit A. bidest gewaschen und das Gel bei Raumtemperatur mit einer Silberfärbelösung, bestehend aus 1,3% (v/v) konzentrierter Ammoniak-Lösung mit 0,66% (w/v) Silbernitrat in 0,0186 M Natronlauge, für 10 min bei Raumtemperatur gefärbt. Ein Waschschritt und die Behandlung mit einem Formaldehydentwickler mit einer Zusammensetzung von 0,005% (w/v) Zitronensäure und 0,05% (v/v) Formaldehyd schlossen sich an. Schließlich wurde die Reaktion mit einer Lösung, bestehend aus 50% Methanol und 12% Essigsäure, gestoppt (Rabilloud, 1999).
Konjugation der Kapselpolysaccharide (Kapitel 3)
Für die Konjugation der Kapselpolysaccharide kam das Material aus zwei verschiedenen Präparationen von S.-suis-Serotyp-2 Stamm 10 (CPS 2) zum Einsatz.
Zur Aktivierung der Kapselpolysaccharide wurde 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridium Tetrafluroborate (CDAP) (100 mg/ml in Azetonitril) in einem Verhältnis von 1:1,5 (CPS:CDAP) dazugegeben und langsam für 30 sec auf einem Vortexer durchmischt.
Danach war 0,2 M Triethylamin mit gleichem Volumen wie vorher das CDAP hinzuzufügen. Nach 2 min leichtem Vortexen erfolgte die Kopplung durch Zugabe von BSA in einem Verhältnis von 1:2 (CPS:BSA), der sich eine 3 stündige Inkubation bei 37°C auf dem Rotator anschloss. Durch Zugabe von 1 M sterilem Glycinpuffer mit einem pH-Wert von 9 wurde eine Endkonzentration von 0,1 M Glycin eingestellt.
Dieses Material wurde über Nacht bei 4°C rotierend inkubiert. Hierdurch konnte ein
46
Besetzen der freien Bindungsstellen erreicht werden. Danach schloss sich eine zweitägige Dialyse gegen 2 l PBS in einer Dialysekassette (G2 Slide-A-Lyzer 20K, Thermo Scientific, Schwerte, Deutschland) mit einem cut off von 20 kDa an, bevor
Besetzen der freien Bindungsstellen erreicht werden. Danach schloss sich eine zweitägige Dialyse gegen 2 l PBS in einer Dialysekassette (G2 Slide-A-Lyzer 20K, Thermo Scientific, Schwerte, Deutschland) mit einem cut off von 20 kDa an, bevor