Sektion nach Infektion mit S.-suis-Serotyp-2-Stamm 10 (Kapitel 3)

In der Sektion wurden alle Tiere systematisch auf pathologische Veränderungen untersucht, die mit der experimentellen S.-suis-Infektion in Zusammenhang stehen konnten. Die Untersuchung erfolgte dabei nach einem standardisierten Protokoll (Bennecke 2008), das eine makroskopische Beurteilung von Organen und eine Entnahme von mindestens 12 Organ- bzw. Gewebeproben für histopathologische und mikrobiologische Untersuchungen beinhaltet.

Als erstes wurde mittels Punktion Synovia für die bakteriologische Untersuchung aus den beiden Karpal- und Tarsalgelenken gewonnen und auch makroskopisch beurteilt. Standen noch andere Gelenke im Verdacht, an einer Lahmheit beteiligt zu sein, wurden diese auch punktiert. Die Entnahme von Liquor cerebrospinalis erfolgte über das Foramen atlanto-occipitale. Alle Punktionsstellen mussten im Vorfeld rasiert und mit 80% Ethanol desinfiziert werden. Die Eröffnung der Bauchhöhle erfolgte in der Linea alba. Hier wurde zuerst nur durch einen kleinen Schnitt von der ventralen Bauchwand eine Tupferprobe (Peritoneum) für die bakteriologische Untersuchung entnommen. Nach der vollständigen Eröffnung konnten dann die Bauchhöhle und deren Organe adspektorisch untersucht werden, bevor für die histopathologischen und bakteriologischen Untersuchungen Organproben (ca. 2 - 3 cm in der Länge/Breite/Höhe) von Leber, Milz und Peritoneum entnommen wurden. Nach der

vorsichtigen Eröffnung des Thorax erfolgte auch hier die Entnahme einer Tupferprobe aus der Pleura- und der Perikardhöhle. Danach konnten die Brustorgane inklusive Zunge, Waldeyerschen Rachenring, Trachea und Ösophagus exzenteriert und adspektorisch und palpatorisch untersucht werden, außerdem konnte nach der Exzenteration des Herzens eine Tupferprobe der Valvula bicuspidalis genommen werden. Für die histopathologische und bakteriologische Untersuchung wurden ein Stück vom linken Lobus cranialis der Lunge, Pleura costalis aus dem vierten rechten Interkostalspalt, ein Stück des linken Herzventrikels mit Valvula bicuspidalis und die Tonsilla veli palatini entnommen. Ein Stück der Synovialmembran zusammen mit artikulärem Knorpel- und Kapselgewebe für die Histopathologie wurde von den Gelenken entnommen, die bereits für die bakteriologische Untersuchung punktiert worden waren. Im letzten Schritt konnte dann das Gehirn, nach dem Eröffnen des Schädeldaches und der Dura mater, exzenteriert werden. Vor dem vollständigen Eröffnen der Dura mater wurde noch eine Tupferprobe von der Großhirnoberfläche entnommen. Alle entnommenen Organproben wurden in etwa 300 ml 10%igem Formaldehyd fixiert und für die pathohistologische Untersuchung an das Institut für Pathologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover weitergeleitet. Hier wurden die pathohistologischen Untersuchungen freundlicherweise von Herrn Prof. Dr. Andreas Beinecke durchgeführt. Die Ergebnisse wurden dann, wie bei Baums et al. (2006) beschrieben mit einem Pathoscore bewertet (Tab. E2). Mittelgradige bis hochgradige, multifokale oder diffuse, fibrinös-eitrige Veränderungen am Gehirn wurden mit einem Score von 5, bei allen anderen Organen mit einem Score von 4 beurteilt. Im Fall einer geringgradigen, fokalen, fibrinös-eitrigen Meningitis oder Plexus chorioiditis wurde der Score 3 vergeben. Geringradige, fokale, fibrinös-eitrige Veränderungen aller Organe außer dem Gehirn resultierten in einem Score von 2 und minimale fibrinös–

eitrige Veränderungen erhielten einen Score von 1. Lymphoplasmazelluläre Infiltrationen und granulomatöse Entzündungen wurden in diesem Score nicht mit berücksichtigt. Der höchste Score der einzelnen Tiere wurde in der jeweiligen Gruppe addiert und durch die Tierzahl der Gruppe dividiert (ω = ΣScoremax/nTiere), um so einen Vergleich der beiden Gruppen zu ermöglichen.

Material und Methoden

B.27

B.28

Bakteriologische Untersuchung der Organ- und Tupferproben (Kapitel 3)

Sofort nach der Sektion wurden von jedem Tier die entnommenen bakteriologischen Proben auf einer Columbia-Blutplatte in einem fraktionierten Ausstrich ausgestrichen.

Bei den Proben handelte es sich um die Gelenkpunktate, den Liquor cerebrospinalis, die Tupferproben von Peritoneum, Pleura, Gehirn und Valvula bicuspidalis, einem Ausstrich von Milz, Leber, Lunge und der Tonsille. Alle Organproben, außer der Lunge, wurden hierfür in 80%iges Ethanol getaucht und danach in der Bunsenbrennerflamme von außen sterilisiert, danach wurde das Organ durchschnitten und der Abdruck der Schnittfläche auf der Blutplatte fraktioniert ausgestrichen. Nach 24 Stunden wurden alle Blutplatten makroskopisch auf α-hämolysierende Streptokokken untersucht. Im Fall einer Mischkultur musste zur Subkultivierung ein fraktionierter Ausstrich der α-hämolysierende Streptokokken durchgeführt werden. Zeigte sich nach 24 h kein Wachstum auf einer Platte wurde diese erneut für 24 h bebrütet. Alle α-hämolysierenden Streptokokken wurden in einer S.-suis-Multiplex–PCR (Silva et al., 2006) genotypisch untersucht (s. unten).

Genotypische Differenzierung der putativen S.-suis-Reisolate (Kapitel 3)

Zur Genotypisierung der α-hämolysierenden Streptokokken musste zuvor die chromosomale DNA präpariert werden. Jeweils 10 ml THB-Medium wurden mit einem α-hämolysierenden Streptokokken Isolat angeimpft und über Nacht bei 37°C bebrütet. Am nächsten Tag wurde die Bakterien bei 5.000 g und 4°C abzentrifugiert und in 500 µl 50 mM Tris HCl; 1 mM EDTA; 100 mM NaCl-Puffer (TEN) mit 10 mg/ml Lysozym und 0,18 mg/ml RNAse resuspendiert und für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Nach der Zugabe von 15 µl 20%iger Natriumdodecylsulfat-Lösung (SDS) und 0,3 mg/ml Proteinase-K-Lösung erfolgte eine erneute Inkubation für eine Stunde bei 37°C. In jeden Ansatz wurden anschließend 125 µl 4 M NaCl und 80 µl von einer 10%igen CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid) Lösung zugegeben und für 10 Minuten bei 60°C inkubiert. Danach erfolgte die Extraktion der DNA durch die Zugabe von 780 µl Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis von 24:1) und anschließend die Zentrifugation bei 10.000 g für 10 Minuten. Der Überstand konnte

abgenommen und in ein neues Reaktionsgefäß überführt werden. Zu dem Extrakt wurden 780 µl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol in einem Verhältnis von 25:24:1 gegeben. Nach erneuter Zentrifugation bei 10.000 g für 10 min konnte der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt werden. Ein Fällen der DNA wurde durch die Zugabe von 500 µl Isopropanol und anschließendem Mischen erreicht. Eine Zentrifugation bei 10.000 g für 30 min und 4°C schloss sich an. Der Überstand wurde verworfen und die DNA mit 500 µl 80%igem Ethanol mit einer Temperatur von -20°C bei 10.000 g für 30 min gewaschen. Nach dem Abnehmen des Überstandes konnte die DNA über Nacht trocknen und danach in 50 µl Wasser (Sigma Aldrich, München, Deutschland) aufgenommen werden.

B.29 Multiplex-PCR (Kapitel 3)

Von der aufgereinigten DNA wurde durch eine 1:50 Verdünnung eine Lösung mit einer DNA-Konzentration von ungefähr 50 ng/µl hergestellt. Für jeden Reaktionsansatz wurden in 0,2 ml PCR-Multiply-Pro-Gefäße (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) jeweils 35 µl Wasser (Sigma Aldrich), 5 µl der 1:50 DNA-Verdünnung und 10 µl Mastermix gegeben.

Der Mastermix setzte sich zusammen aus: 50 % (v/v) 10x PCR-Puffer (bestehend aus 200 mM TRIS-HCl pH = 8,4, 500 mM KCl), 15% (v/v) 50 µM MgCl2, 10% (v/v), 10 µM dNTP (dATP, dCTP, dGTP und dTTP), 10 % (v/v) Wasser (Sigma Aldrich, München, Deutschland), 10% (v/v) einer 25 µM Primer-Stammlösung mit folgenden Konzentrationen: mrpL/mrpR 31,3 nM, epf1BR/epfL 72,9 nMcpsJ1L/ cpsJ1R 104,1 nM, cpsJ2L/cpsJ2R 83,3 nM, cpsH7L/cpsH7R 62,5 nM, cpsH9L/cpsH9R 62,5 nM, slyL/slyR 20,8 nM, adiSnL/adiSnR 31,3 nM, gdhsuisL/gdhsuisR 31,3 nM und als letztes wurden noch 2 Units der Taq-DNA-Polymerase 5% (v/v) dazugegeben.

Danach durchliefen die Proben im Mastercycler der Firma Eppendorf noch folgendes Programm: initiale Denaturierung für 2 min bei 94°C, 36 Zyklen mit 1 min bei 94°C, 1 min bei 58°C und 1,30 min bei 72°C und noch eine finale Extension für 2 min bei 72°C. Zur Darstellung der Amplifikate wurden 15 µl der PCR-Produkte zusammen mit 3 µl von einem 6 x Blaupuffer (s. Anhang) auf ein 1,5%iges Agarosegel aufgetragen und in der Gelelektrophorese aufgetrennt. Als Größenstandard wurde eine 100 bp Leiter (Fermentas, Deutschland) mitgeführt. Schließlich wurde das Gel im Stick (INTAS, Göttingen, Deutschland) digital verarbeitet. Die Sequenzen der aufgeführten

Material und Methoden

Primer sowie weitere Angaben zu dieser Multiplex-PCR wurden bereits von (Silva et al., 2006) publiziert.

B.30 ELISA zur Detektion S.-suis-Serotyp 2 Kapselpolysaccharid spezifischer Antikörper (Kapitel 3)

Für den ELISA zur Detektion von S.-suis-Serotyp-2-Kapselpolysaccharid-spezifischen Antikörpern wurden die Mikrotitierplatten „Maxisorb Nunc-Immuno-Plates“ (Firma Nunc, Dänemark) eingesetzt, die zuvor mit gereinigten Serotyp 2 Kapselpolysacchariden beschichtet wurden. In jeder Vertiefung wurden dafür 5 µg Kapselpolysaccharide gelöst in 100 µl Carbonatpuffer (s. Anhang) pH 9,5 gegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Platten fünfmal mit TBST (Anhang) im BioTek ELx405-Washer gewaschen und anschließend geblockt.

Hierzu wurden in jede Vertiefung 200 µl 5%iges Milchpulver in 1x TBST gegeben und die Platte für 2 h bei 37°C schüttelnd inkubiert. Bevor die Platten im ELISA eingesetzt werden konnten, wurden sie fünfmal mit TBST gewaschen.

Auf einer ELISA-Mikrotiterplatte wurden von jedem Tier sowohl das Prä- als auch das Postimmunserum untersucht. Dabei wurden die Seren jeweils als Duplikate in vier Verdünnungsstufen aufgetragen. Die Postimmunseren wurden von 1:200 bis 1:1600 untersucht. Bei den Präimmunseren sollte als erste Verdünnungsstufe eine 1:100 Verdünnung aufgetragen werden. Pro Vertiefung wurden 100 µl der Serumverdünnung eingesetzt und für eine Stunde bei 37°C schüttelnd inkubiert.

Nach anschließendem fünfmaligem Waschen mit TBST im BioTek EL x 405 ELISA-Washer wurden pro Vertiefung 100 µl von einem anti-Schwein-IgG-Peroxidase (POD)-markiertem Antikörper (Dianova, Hamburg, Deutschland) in einer Verdünnung von 1:10.000 in TBST dazugegeben und für eine Stunde bei 37°C schüttelnd inkubiert. Es erfolgte erneut fünfmaliges Waschen mit TBST. Anschließend wurden 100 µl einer 0,8 mg/ml (w/v) ABTS-Lösung (2,2-Azino-di-(3-Ethylbenzthiazolin)-6-sulfonsäure) in Zitrat-Phosphat-Puffer (s. Anhang) mit 0,002%igem (w/v) Wasserstoffperoxid in jede Vertiefung gegeben. Die Inkubation erfolgte dann für 15 min bei 37°C schüttelnd. Abschließend konnte die Absorption im Photometer (Tecan GeniosPro) bei einer OD405 gemessen werden. Der Antikörpertiter des Standardserums wurde als 100 ELISA-Units definiert. Für die Bestimmung der ELISA Units legt das Programm einen Messbereich nach linearer Regressionsanalyse der

Messwerte des Standardserums fest. Die Steigung der Regressionsgeraden sollte Werte zwischen 0,9 und 1,1 annehmen und der Korrelationskoeffizient Werte über 0,95. Die Regressionsgeraden wurden für jeden ELISA ausgedruckt und überprüft.

Zur Korrektur von unspezifischen Bindungen wurde jeder Messwert der Standard- und Testseren mit der Hintergrundabsorption auf Dextrin beschichteten Vertiefungen korrigiert. Dafür wurden die Spalten 11 und 12 jeder Mikrotiterplatte mit Dextrin beschichtet und mit den entsprechenden Verdünnungen des Standardserums versetzt und gemessen. Die ELISA-Units für ein Tier ergaben sich aus dem Mittelwert der durchschnittlichen ELISA-Units von zwei identischen Verdünnungsreihen. Die Abweichung der Duplikate sollte dabei im Mittelwert nicht mehr als 15% betragen. Seren mit Werten <min wurden als negativ gewertet und mit einem Wert von 5 ELISA-Units angegeben. Bei Messwerten oberhalb des Wertebereiches der Regressionsgeraden (Angabe >max), wurden die Messung der Seren in einer höheren Verdünnungsstufe wiederholt.

Die Seren für den Standard und die Kontrollen stammten von zwei Schweinen, die im Rahmen der Dissertation von Christoph Kock (Tierärztliche Hochschule Hannover) mit BSA-konjugierten Serotyp-2-Kapselpolysacchariden immunisiert wurden. Als Negativkontrolle diente das Präimmunserum eines dieser beiden Schweine.

B.31

B.32

Statistische Auswertung (Kapitel 2 und 3)

Die statistische Auswertung der Unterschiede zwischen zwei verschiedenen Gruppen wurde mit dem Mann-Whitney-Test durchgeführt. Für den Vergleich von Werten unterschiedlicher Zeitpunkte einer Gruppe wurde der Wilcoxon-Test eingesetzt (z. B. für Messwerte von Proben, die vor und nach der Immunisierung gewonnen wurden).

Puffer und Lösungen für den ELISA (Kapitel 2 und 3)

ABTS-Lösung:

Zitrat-Phosphat-Puffer pH 4,25:

0,1 M Zitronensäure

mit 0,075 M NaH2PO4-Puffer pH-Wert auf 4,25 einstellen 400 mg ABTS in 500 ml Zitrat-Phosphat-Puffer lösen

Material und Methoden

BSA-Stammlösung (100x):

40 mg BSA in 8 ml PBS lösen BSA-Lösung:

100 µl BSA-Stammlösung mit 9,9 ml Karbonatpuffer verdünnen Karbonat-Puffer:

0,05 M NaHCO3

0,05 M Na2CO3

10x TBST:

0,1 M Tris 1,5 M NaCl

1% (v/v) Tween20 pH 8,0

PBS-Puffer:

137 mM NaCl 2,7 mM KCl 2 mM KH2PO4

10 mM Na2HPO4 x 2H2O

B.33 Puffer zur Aufreinigung der rekombinanten Proteine (Kapitel 2)

LEW-Puffer:

0,065 M NaH2PO4 0,3 M NaCl

pH 8,0

Elutionspuffer:

0,065 M NaH2PO4 0,3 M NaCl

0,5b M Immidazol

B.34 Puffer für den Westernblot (Kapitel 2 und 3)

Transferpuffer:

0,1 M Tris 0,192 M Gycin 0,315 % (w/v) SDS 20 % (v/v) Methanol Laufpuffer (10x):

0,25 M Tris 1,92 M Glycin 1% (w/v) SDS

2x Probenpuffer reduzierend:

1,5 ml Tris pH 6,8 (0,5 M) 6 ml SDS (10 %)

3 ml Glycin

100 µl Bromphenolblau (1 %) 1 ml 2-Mercaptoethanol Gelelektrophorese

4 % Sammelgel 8% Trenngel

Wasser 1,75 ml 2,3 ml

30% Acrylamid 0,4 ml 1,35 ml

1,5 M Tris ph 8,8 1,25

0,5 M Tris pH 6,8 0,75 ml

20% SDS 12,5 µl 25 µl

TEMED 2,5 µl 3 µl

10% APS 50 µl 100 µl

Material und Methoden

Zusammensetzung des Mastermixes für 60 Ansätze

10 x PCR-Puffer (200mM Tris-HCl pH 8,4; 500mM KCl) 300 µl

50 mM MgCl2 90 µl

100 mM dNTP Stammlösung 60 µl

26,1nM cps9HR 6 µl

26,1nM cps9HL 6 µl

Wasser (Sigma^R) 108 µl

5 U/µl Taq DNA-Polymerase (Invitrogen, Karlsruhe) 30 µl 1% Agarosegel:

1 g Agarose (Serva) 100 ml TBE

Probenpuffer (6x Blaupuffer):

3,73 M Bromphenolblau 15 % Ficoll

B.35 Immunisierung (Kapitel 3)

1. Immunisierung

Ansatz Volumen Konzentration Menge Bemerkung

CPS-2

Präparation 6 ml 2 mg / ml 12 mg

CPS-2 verdünnt

6 ml CPS-2 + 3,6 ml PBS = 9,6 ml

CPS-2 verdünnt

1,25 mg / ml 12 mg

von den 9,6 ml 1,6 ml asserviert

verwendet

8 ml CPS-2 verdünnt +

2 ml Emulsigen 1 mg / ml 10 mg pro Tier 1 ml eingesetzt

2. Immunisierung

Ansatz Volumen Konzentration Menge Bemerkung

CPS-2

Präparation 5 ml 2 mg / ml 10 mg

3 ml verwendet, 2 ml asserviert

verwendet

3 ml CPS-2 + 2,4 ml Emulsigen +

6 ml PBS

0,5 mg / ml 6 mg pro Tier 1 ml eingesetzt

C Kapitel 1: Streptococcus suis serotype 9 bacterin

immunogenicity and protective efficacy

D Kapitel 2: Untersuchungen zur immunogenen Wirkung einer Streptococcus-suis-Serotyp-2- und 9-Kombinationsvakzine

D.1 Einleitung

Streptococcus suis ist ein pathogener Erreger beim Schwein, der verschiedene Krankheitserscheinungen wie Meningitis, Arthritis, Polyserositis, Septikämie, Pneumonie und plötzliche Todesfälle bei jungen Schweinen auslösen kann.

Es konnten bisher 35 verschiedene Serotypen beschrieben werden, die sich auf Grund ihrer Kapsel unterscheiden (Gottschalk et al. 1991; Higgins et al. 1995). In Europa sind Serotyp 2, mit einer Prävalenz von 32%, Serotyp 9 (20%) und Serotyp 1 (12%) vorherrschend. Serotyp 2 wird dabei häufig in Frankreich, Italien und Spanien isoliert, während Serotyp 9 vorwiegend in den Niederlanden, Deutschland und Belgien vorkommt (Wisselink et al. 2000). Für die prophylaktische Behandlung von Beständen steht in Europa kein zugelassener Impfstoff zur Verfügung (Baums and Valentin-Weigand 2009) und so bleibt bislang der Einsatz von bestandsspezifischen Vakzinen das Mittel der Wahl.

Die einzelnen Serotypen unterscheiden sich nicht nur im Hinblick auf die Kapsel, sondern auch in der Ausbildung virulenzassoziierter Faktoren. Das muramidase-released protein (MRP) mit einer Größe von 136 kDa und der 110 kDa große extracellular factor (EF) werden nur von den virulenten Serotyp 1 und 2 Stämmen exprimiert. Invasive Serotyp-9-Stämme bilden häufig eine hochmolekulare Variante vom MRP, genannt MRP*, mit Homologie zu dem MRP von Serotyp-2-Stämmen (Silva et al. 2006). Es wurden bereits zahlreiche Proteine von S. suis auf eine mögliche protektive Funktion als Impfantigen hin untersucht (Baums and Valentin-Weigand 2009). Eine Immunisierung mit MRP im Vergleich zu einer Serotyp-2-Ganzzellvakzine zeigte nur eine geringe protektive Wirkung. Durch den Einsatz einer Kombination von EF und MRP konnte die Wirkung verbessert werden (Wisselink et al. 2001), aber viele Serotypen exprimieren EF nicht. Auch der Einsatz einer MAP (murein-associated proteins)-Subunitvakzine bestehend aus verschiedenen Oberflächenproteinen wie MRP, SAO (surface antigen one) und FBPS (fibronectin- and fibrinogen-binding protein of S. suis) erzielte keine Protektion im Gegensatz zu einer Serotyp-2-Ganzzellvakzine (Baums et al. 2009).

Kapitel 2: Untersuchungen zur immunogenen Wirkung einer Streptococcus suis Serotyp-2- und 9-Kombinationsvakzine

Die qualitativen Unterschiede einer Immunantwort auf eine S.-suis-Immunisierung kommen unter anderem in der Ausbildung opsonisierender Antikörper zum Ausdruck (Baums et al. 2009). Es ist bekannt, dass neutrophile Granulozyten bei einer S.-suis-Infektion eine wichtige Rolle spielen, da sie die betroffenen Gebiete stark infiltrieren (Beineke et al. 2008; Chabot-Roy et al. 2006). Opsonisierende Antikörper vermitteln die Opsonophagozytose und das Abtöten von S. suis durch neutrophile Granulozyten. Die Induktion von opsonisierenden Antikörpern hat sich als ein guter prognostischer Indikator für die protektive Wirkung von Immunisierungen gegen S. suis bei Schweinen erwiesen (Baums et al. 2009).

Ein weiterer wichtiger Aspekt für eine erfolgreiche Immunisierung ist das Impfprotokoll und dabei auch insbesondere das Alter der Tiere zum Zeitpunkt der Impfstoffapplikation. Es ist zu berücksichtigen, dass bei dem Einsatz von S.-suis-Vakzinen Interferenzen mit maternalen Antikörpern auftreten können, insbesondere im Zusammenhang mit Muttertierimmunisierungen. So beobachteten Baums et al.

(2010) bei kombinierten Muttertier- und Ferkelimmunisierungen nur einen Schutz vor einer S.-suis-Infektion in der sechsten Lebenswoche, nicht aber in der achten Lebenswoche. Dies spricht für den maternalen Einfluss, der eine aktive Immunantwort nach der Immunisierung der abgesetzten Ferkel unterdrückte (Baums et al. 2010).

Ein partieller Schutz bei einer homologen Belastung konnte bei Absatzferkeln mit einer Serotyp-2-Ganzzellvakzine erreicht werden (Baums et al. 2009; Wisselink et al.

2001), ebenso war auch mit einer Serotyp-9-Ganzzellvakzine nach der Belastung mit dem gleichen Serotyp, aber einem anderen Stamm, ein gewisser Schutz vorhanden (Büttner et al. 2012). Ziel der hier vorgestellten Versuche war es, die humorale Immunantwort auf eine Kombinationsvakzine zu charakterisieren. Die Kombinationsvakzine enthielt die beiden wichtigsten in Europa vorkommenden Pathotypen, Serotyp 2 und Serotyp 9, in inaktivierter Form. Weiterhin sollten unterschiedliche Adjuvantien evaluiert werden. Die Versuche wurden am Impfstoffwerk Dessau Tornau Biologika GmbH durchgeführt und waren damit ein erster Schritt der industriellen Entwicklung einer S.-suis-Kombinationsvakzine.

D.2 Ergebnisse

D.2.1 Adjuvantienversuch

Vergleichende Evaluation der Adjuvantien für die Kombinationsvakzinen im November 2010 in der IDT Biologika GmbH (Kurzbezeichnung: Adjuvantienversuch).

In diesem Versuch wurden Vakzinen getestet, die aus einer Kombination von zwei S.-suis–Stämmen bestanden. Dem Kombinationsimpfstoff wurde jeweils eins von vier verschiedenen Adjuvantien zugesetzt. Die vier verschiedenen Impfstoffe wurden in vier Gruppen bestehend aus jeweils zehn Tieren eingesetzt. Die Seren der Tiere konnten daraufhin bezüglich der humoralen Immunantwort, induziert durch die unterschiedlichen Impfstoffe, miteinander verglichen werden.

D.2.1.1 Untersuchung der Schweine auf die Bildung von MRP-spezifischen Antikörpern

MRP ist ein 196 kDa großes, immunogenes, virulenzassoziiertes Oberflächenprotein (Smith et al. 1996; Vecht et al. 1991). Die virulenten Serotyp-9-Stämme exprimieren eine hochmolekulare, homologe Variante vom MRP (Silva et al. 2006).

In diesem Versuch wurde rekombinantes MRP von einem virulenten Serotyp-2-Stamm als Antigen eingesetzt, um die Immunantwort der Versuchstiere auf die unterschiedlichen Ganzzellvakzinen zu untersuchen. In allen vier Gruppen, in denen die Ferkel mit den Kombinationsvakzinen immunisiert wurden, hatten sich in den Postimmunseren im Vergleich zu den Präimmunseren und der Kontrollgruppe hohe IgG-Antikörpertiter gegen MRP entwickelt (Abb. 1). Während die durchschnittlichen MRP-spezifischen Antikörperspiegel in der Kontrollgruppe bei 14,9 ELISA-Units vor der Placeboapplikation und bei 15,7 ELISA-Units zwei Wochen nach der 2.

Placeboapplikation lagen, stiegen sie in den vier Kombinationsvakzinegruppen deutlich über 100 ELISA-Units an. Die Immunisierung mit der Kombinationsvakzine, versetzt mit dem Adjuvans Quil A, verzeichnete einen Anstieg des durchschnittlichen MRP-spezifischen Antikörperspiegels von 19 ELISA-Units vor der Immunisierung auf 190 ELISA-Units zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung. Unter Verwendung des Adjuvans Montanide Gel01 gingen die Werte von 17 ELISA-Units in den Präimmunseren auf 115 ELISA-Units in den Postimmunseren hoch. In der Gruppe, die als Adjuvans Emulsigen erhalten hatte, kam es zu einem Titeranstieg von

Kapitel 2: Untersuchungen zur immunogenen Wirkung einer Streptococcus suis Serotyp-2- und 9-Kombinationsvakzine

durchschnittlich 5 auf 844 ELISA-Units. Bei 4 Tieren dieser Gruppe lagen die Werte deutlich über 1.000 ELISA-Units. Die MRP-spezifischen Antikörperspiegel nach der Immunisierung mit der Kombinationsvakzine versehen mit dem Adjuvans Montanide IMS lagen im Durchschnitt bei 677 ELISA-Units. Alle vier Gruppen hatten in ihren Postimmunseren signifikant höhere MRP-spezifische Antikörperspiegel im Vergleich zu ihren Präimmunseren (Tab. 2). In der Kontrollgruppe hatten sich hingegen die Titer vor und nach der Placeboapplikation nicht verändert. Vergleicht man die Postimmunseren der einzelnen Gruppen mit dem der Kontrollgruppe waren auch hier die Unterschiede signifikant. Besonders die Tiere, die als Adjuvans Emulsigen oder Montanide IMS erhalten hatten, entwickelten hohe Antikörperspiegel gegen MRP.

Zwischen diesen beiden Gruppen gab es in den Postimmunseren keine signifikanten Unterschiede (p= 0,55). Allerdings wiesen die Postimmunseren der Emulsigen-Gruppe im Vergleich zur Montanide Gel01-Emulsigen-Gruppe signifikant höhere MRP-spezifische Antikörpertiter (p= 0,0002) auf (Tab. 2). Drei Tiere aus der Emulsigen-Gruppe hatten mit 1.400 ELISA-Units die höchsten Titer und auch in der Montanide IMS-Gruppe war ein Tier mit einem Wert von 1149 ELISA-Units auffällig hoch.

Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass zwischen den vier getesteten Adjuvantien erhebliche Unterschiede in Bezug auf die immunogene Wirkung einer S.-suis-Kombinationsvakzine bestehen (Kombination von zwei S.-suis-Stämmen).

MRP-spezifische Titer waren am höchsten bei Schweinen, bei denen die Kombinationsvakzinen mit den Adjuvantien Emulsigen oder mit Montanide IMS versehen wurden. Eine Serokonversion gegen MRP wurde bei der Immunisierung mit den Kombinationsvakzinen unter Verwendung aller vier getesteten Adjuvantien (Quil A, Emulsigen, Montanide Gel01, Montanide IMS) beobachtet.

D.2.1.2 Adjuvantienversuch: Untersuchung der Schweine auf die Ausbildung opsonisierender Antikörper

In einer vorangegangenen Studie (Baums et al. 2009) konnte ein Zusammenhang zwischen den Titern opsonisierender Antikörper und der protektiven Wirkung einer S.-suis-Serotyp-2-Ganzzellvakzine im Schwein aufgezeigt werden. Aus diesem Grund wurden die Seren der Tiere dieses Versuchsvorhabens auf die Ausbildung von opsonisierenden Antikörpern, die sich gegen Serotyp 2 und/oder gegen Serotyp 9 richteten, untersucht. Der Quotient aus den Überlebensfaktoren des

entsprechenden S.-suis-Stammes in Anwesenheit des Post– bzw. Präimmunserums eines Tieres wurde als Faktor F definiert. Der Faktor F ist ein Maß für die Induktion opsonisierender Antikörper (Baums et al. 2006). Ist der Wert größer oder gleich eins bedeutet dies, dass keine opsonisierenden Antikörper in Folge der Immunisierung

Im Dokument Streptococcus-suis-Serotyp-9-Ganzzellvakzine (Seite 50-0)