Für den ELISA zur Detektion von S.-suis-Serotyp-2-Kapselpolysaccharid-spezifischen Antikörpern wurden die Mikrotitierplatten „Maxisorb Nunc-Immuno-Plates“ (Firma Nunc, Dänemark) eingesetzt, die zuvor mit gereinigten Serotyp 2 Kapselpolysacchariden beschichtet wurden. In jeder Vertiefung wurden dafür 5 µg Kapselpolysaccharide gelöst in 100 µl Carbonatpuffer (s. Anhang) pH 9,5 gegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Platten fünfmal mit TBST (Anhang) im BioTek ELx405-Washer gewaschen und anschließend geblockt.
Hierzu wurden in jede Vertiefung 200 µl 5%iges Milchpulver in 1x TBST gegeben und die Platte für 2 h bei 37°C schüttelnd inkubiert. Bevor die Platten im ELISA eingesetzt werden konnten, wurden sie fünfmal mit TBST gewaschen.
Auf einer ELISA-Mikrotiterplatte wurden von jedem Tier sowohl das Prä- als auch das Postimmunserum untersucht. Dabei wurden die Seren jeweils als Duplikate in vier Verdünnungsstufen aufgetragen. Die Postimmunseren wurden von 1:200 bis 1:1600 untersucht. Bei den Präimmunseren sollte als erste Verdünnungsstufe eine 1:100 Verdünnung aufgetragen werden. Pro Vertiefung wurden 100 µl der Serumverdünnung eingesetzt und für eine Stunde bei 37°C schüttelnd inkubiert.
Nach anschließendem fünfmaligem Waschen mit TBST im BioTek EL x 405 ELISA-Washer wurden pro Vertiefung 100 µl von einem anti-Schwein-IgG-Peroxidase (POD)-markiertem Antikörper (Dianova, Hamburg, Deutschland) in einer Verdünnung von 1:10.000 in TBST dazugegeben und für eine Stunde bei 37°C schüttelnd inkubiert. Es erfolgte erneut fünfmaliges Waschen mit TBST. Anschließend wurden 100 µl einer 0,8 mg/ml (w/v) ABTS-Lösung (2,2-Azino-di-(3-Ethylbenzthiazolin)-6-sulfonsäure) in Zitrat-Phosphat-Puffer (s. Anhang) mit 0,002%igem (w/v) Wasserstoffperoxid in jede Vertiefung gegeben. Die Inkubation erfolgte dann für 15 min bei 37°C schüttelnd. Abschließend konnte die Absorption im Photometer (Tecan GeniosPro) bei einer OD405 gemessen werden. Der Antikörpertiter des Standardserums wurde als 100 ELISA-Units definiert. Für die Bestimmung der ELISA Units legt das Programm einen Messbereich nach linearer Regressionsanalyse der
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Messwerte des Standardserums fest. Die Steigung der Regressionsgeraden sollte Werte zwischen 0,9 und 1,1 annehmen und der Korrelationskoeffizient Werte über 0,95. Die Regressionsgeraden wurden für jeden ELISA ausgedruckt und überprüft.
Zur Korrektur von unspezifischen Bindungen wurde jeder Messwert der Standard- und Testseren mit der Hintergrundabsorption auf Dextrin beschichteten Vertiefungen korrigiert. Dafür wurden die Spalten 11 und 12 jeder Mikrotiterplatte mit Dextrin beschichtet und mit den entsprechenden Verdünnungen des Standardserums versetzt und gemessen. Die ELISA-Units für ein Tier ergaben sich aus dem Mittelwert der durchschnittlichen ELISA-Units von zwei identischen Verdünnungsreihen. Die Abweichung der Duplikate sollte dabei im Mittelwert nicht mehr als 15% betragen. Seren mit Werten <min wurden als negativ gewertet und mit einem Wert von 5 ELISA-Units angegeben. Bei Messwerten oberhalb des Wertebereiches der Regressionsgeraden (Angabe >max), wurden die Messung der Seren in einer höheren Verdünnungsstufe wiederholt.
Die Seren für den Standard und die Kontrollen stammten von zwei Schweinen, die im Rahmen der Dissertation von Christoph Kock (Tierärztliche Hochschule Hannover) mit BSA-konjugierten Serotyp-2-Kapselpolysacchariden immunisiert wurden. Als Negativkontrolle diente das Präimmunserum eines dieser beiden Schweine.
B.31
B.32
Statistische Auswertung (Kapitel 2 und 3)
Die statistische Auswertung der Unterschiede zwischen zwei verschiedenen Gruppen wurde mit dem Mann-Whitney-Test durchgeführt. Für den Vergleich von Werten unterschiedlicher Zeitpunkte einer Gruppe wurde der Wilcoxon-Test eingesetzt (z. B. für Messwerte von Proben, die vor und nach der Immunisierung gewonnen wurden).
Puffer und Lösungen für den ELISA (Kapitel 2 und 3)
ABTS-Lösung:
Zitrat-Phosphat-Puffer pH 4,25:
0,1 M Zitronensäure
mit 0,075 M NaH2PO4-Puffer pH-Wert auf 4,25 einstellen 400 mg ABTS in 500 ml Zitrat-Phosphat-Puffer lösen
Material und Methoden
BSA-Stammlösung (100x):
40 mg BSA in 8 ml PBS lösen BSA-Lösung:
100 µl BSA-Stammlösung mit 9,9 ml Karbonatpuffer verdünnen Karbonat-Puffer:
0,05 M NaHCO3
0,05 M Na2CO3
10x TBST:
0,1 M Tris 1,5 M NaCl
1% (v/v) Tween20 pH 8,0
PBS-Puffer:
137 mM NaCl 2,7 mM KCl 2 mM KH2PO4
10 mM Na2HPO4 x 2H2O
B.33 Puffer zur Aufreinigung der rekombinanten Proteine (Kapitel 2)
LEW-Puffer:
0,065 M NaH2PO4 0,3 M NaCl
pH 8,0
Elutionspuffer:
0,065 M NaH2PO4 0,3 M NaCl
0,5b M Immidazol
56
B.34 Puffer für den Westernblot (Kapitel 2 und 3)
Transferpuffer:
0,1 M Tris 0,192 M Gycin 0,315 % (w/v) SDS 20 % (v/v) Methanol Laufpuffer (10x):
0,25 M Tris 1,92 M Glycin 1% (w/v) SDS
2x Probenpuffer reduzierend:
1,5 ml Tris pH 6,8 (0,5 M) 6 ml SDS (10 %)
3 ml Glycin
100 µl Bromphenolblau (1 %) 1 ml 2-Mercaptoethanol Gelelektrophorese
4 % Sammelgel 8% Trenngel
Wasser 1,75 ml 2,3 ml
30% Acrylamid 0,4 ml 1,35 ml
1,5 M Tris ph 8,8 1,25
0,5 M Tris pH 6,8 0,75 ml
20% SDS 12,5 µl 25 µl
TEMED 2,5 µl 3 µl
10% APS 50 µl 100 µl
Material und Methoden
Zusammensetzung des Mastermixes für 60 Ansätze
10 x PCR-Puffer (200mM Tris-HCl pH 8,4; 500mM KCl) 300 µl
50 mM MgCl2 90 µl
100 mM dNTP Stammlösung 60 µl
26,1nM cps9HR 6 µl
26,1nM cps9HL 6 µl
Wasser (SigmaR) 108 µl
5 U/µl Taq DNA-Polymerase (Invitrogen, Karlsruhe) 30 µl 1% Agarosegel:
1 g Agarose (Serva) 100 ml TBE
Probenpuffer (6x Blaupuffer):
3,73 M Bromphenolblau 15 % Ficoll
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B.35 Immunisierung (Kapitel 3)
1. Immunisierung
Ansatz Volumen Konzentration Menge Bemerkung
CPS-2
Präparation 6 ml 2 mg / ml 12 mg
CPS-2 verdünnt
6 ml CPS-2 + 3,6 ml PBS = 9,6 ml
CPS-2 verdünnt
1,25 mg / ml 12 mg
von den 9,6 ml 1,6 ml asserviert
verwendet
8 ml CPS-2 verdünnt +
2 ml Emulsigen 1 mg / ml 10 mg pro Tier 1 ml eingesetzt
2. Immunisierung
Ansatz Volumen Konzentration Menge Bemerkung
CPS-2
Präparation 5 ml 2 mg / ml 10 mg
3 ml verwendet, 2 ml asserviert
verwendet
3 ml CPS-2 + 2,4 ml Emulsigen +
6 ml PBS
0,5 mg / ml 6 mg pro Tier 1 ml eingesetzt
C Kapitel 1: Streptococcus suis serotype 9 bacterin
immunogenicity and protective efficacy
D Kapitel 2: Untersuchungen zur immunogenen Wirkung einer Streptococcus-suis-Serotyp-2- und 9-Kombinationsvakzine
D.1 Einleitung
Streptococcus suis ist ein pathogener Erreger beim Schwein, der verschiedene Krankheitserscheinungen wie Meningitis, Arthritis, Polyserositis, Septikämie, Pneumonie und plötzliche Todesfälle bei jungen Schweinen auslösen kann.
Es konnten bisher 35 verschiedene Serotypen beschrieben werden, die sich auf Grund ihrer Kapsel unterscheiden (Gottschalk et al. 1991; Higgins et al. 1995). In Europa sind Serotyp 2, mit einer Prävalenz von 32%, Serotyp 9 (20%) und Serotyp 1 (12%) vorherrschend. Serotyp 2 wird dabei häufig in Frankreich, Italien und Spanien isoliert, während Serotyp 9 vorwiegend in den Niederlanden, Deutschland und Belgien vorkommt (Wisselink et al. 2000). Für die prophylaktische Behandlung von Beständen steht in Europa kein zugelassener Impfstoff zur Verfügung (Baums and Valentin-Weigand 2009) und so bleibt bislang der Einsatz von bestandsspezifischen Vakzinen das Mittel der Wahl.
Die einzelnen Serotypen unterscheiden sich nicht nur im Hinblick auf die Kapsel, sondern auch in der Ausbildung virulenzassoziierter Faktoren. Das muramidase-released protein (MRP) mit einer Größe von 136 kDa und der 110 kDa große extracellular factor (EF) werden nur von den virulenten Serotyp 1 und 2 Stämmen exprimiert. Invasive Serotyp-9-Stämme bilden häufig eine hochmolekulare Variante vom MRP, genannt MRP*, mit Homologie zu dem MRP von Serotyp-2-Stämmen (Silva et al. 2006). Es wurden bereits zahlreiche Proteine von S. suis auf eine mögliche protektive Funktion als Impfantigen hin untersucht (Baums and Valentin-Weigand 2009). Eine Immunisierung mit MRP im Vergleich zu einer Serotyp-2-Ganzzellvakzine zeigte nur eine geringe protektive Wirkung. Durch den Einsatz einer Kombination von EF und MRP konnte die Wirkung verbessert werden (Wisselink et al. 2001), aber viele Serotypen exprimieren EF nicht. Auch der Einsatz einer MAP (murein-associated proteins)-Subunitvakzine bestehend aus verschiedenen Oberflächenproteinen wie MRP, SAO (surface antigen one) und FBPS (fibronectin- and fibrinogen-binding protein of S. suis) erzielte keine Protektion im Gegensatz zu einer Serotyp-2-Ganzzellvakzine (Baums et al. 2009).
Kapitel 2: Untersuchungen zur immunogenen Wirkung einer Streptococcus suis Serotyp-2- und 9-Kombinationsvakzine
Die qualitativen Unterschiede einer Immunantwort auf eine S.-suis-Immunisierung kommen unter anderem in der Ausbildung opsonisierender Antikörper zum Ausdruck (Baums et al. 2009). Es ist bekannt, dass neutrophile Granulozyten bei einer S.-suis-Infektion eine wichtige Rolle spielen, da sie die betroffenen Gebiete stark infiltrieren (Beineke et al. 2008; Chabot-Roy et al. 2006). Opsonisierende Antikörper vermitteln die Opsonophagozytose und das Abtöten von S. suis durch neutrophile Granulozyten. Die Induktion von opsonisierenden Antikörpern hat sich als ein guter prognostischer Indikator für die protektive Wirkung von Immunisierungen gegen S. suis bei Schweinen erwiesen (Baums et al. 2009).
Ein weiterer wichtiger Aspekt für eine erfolgreiche Immunisierung ist das Impfprotokoll und dabei auch insbesondere das Alter der Tiere zum Zeitpunkt der Impfstoffapplikation. Es ist zu berücksichtigen, dass bei dem Einsatz von S.-suis-Vakzinen Interferenzen mit maternalen Antikörpern auftreten können, insbesondere im Zusammenhang mit Muttertierimmunisierungen. So beobachteten Baums et al.
(2010) bei kombinierten Muttertier- und Ferkelimmunisierungen nur einen Schutz vor einer S.-suis-Infektion in der sechsten Lebenswoche, nicht aber in der achten Lebenswoche. Dies spricht für den maternalen Einfluss, der eine aktive Immunantwort nach der Immunisierung der abgesetzten Ferkel unterdrückte (Baums et al. 2010).
Ein partieller Schutz bei einer homologen Belastung konnte bei Absatzferkeln mit einer Serotyp-2-Ganzzellvakzine erreicht werden (Baums et al. 2009; Wisselink et al.
2001), ebenso war auch mit einer Serotyp-9-Ganzzellvakzine nach der Belastung mit dem gleichen Serotyp, aber einem anderen Stamm, ein gewisser Schutz vorhanden (Büttner et al. 2012). Ziel der hier vorgestellten Versuche war es, die humorale Immunantwort auf eine Kombinationsvakzine zu charakterisieren. Die Kombinationsvakzine enthielt die beiden wichtigsten in Europa vorkommenden Pathotypen, Serotyp 2 und Serotyp 9, in inaktivierter Form. Weiterhin sollten unterschiedliche Adjuvantien evaluiert werden. Die Versuche wurden am Impfstoffwerk Dessau Tornau Biologika GmbH durchgeführt und waren damit ein erster Schritt der industriellen Entwicklung einer S.-suis-Kombinationsvakzine.
64
D.2 Ergebnisse
D.2.1 Adjuvantienversuch
Vergleichende Evaluation der Adjuvantien für die Kombinationsvakzinen im November 2010 in der IDT Biologika GmbH (Kurzbezeichnung: Adjuvantienversuch).
In diesem Versuch wurden Vakzinen getestet, die aus einer Kombination von zwei S.-suis–Stämmen bestanden. Dem Kombinationsimpfstoff wurde jeweils eins von vier verschiedenen Adjuvantien zugesetzt. Die vier verschiedenen Impfstoffe wurden in vier Gruppen bestehend aus jeweils zehn Tieren eingesetzt. Die Seren der Tiere konnten daraufhin bezüglich der humoralen Immunantwort, induziert durch die unterschiedlichen Impfstoffe, miteinander verglichen werden.
D.2.1.1 Untersuchung der Schweine auf die Bildung von MRP-spezifischen Antikörpern
MRP ist ein 196 kDa großes, immunogenes, virulenzassoziiertes Oberflächenprotein (Smith et al. 1996; Vecht et al. 1991). Die virulenten Serotyp-9-Stämme exprimieren eine hochmolekulare, homologe Variante vom MRP (Silva et al. 2006).
In diesem Versuch wurde rekombinantes MRP von einem virulenten Serotyp-2-Stamm als Antigen eingesetzt, um die Immunantwort der Versuchstiere auf die unterschiedlichen Ganzzellvakzinen zu untersuchen. In allen vier Gruppen, in denen die Ferkel mit den Kombinationsvakzinen immunisiert wurden, hatten sich in den Postimmunseren im Vergleich zu den Präimmunseren und der Kontrollgruppe hohe IgG-Antikörpertiter gegen MRP entwickelt (Abb. 1). Während die durchschnittlichen MRP-spezifischen Antikörperspiegel in der Kontrollgruppe bei 14,9 ELISA-Units vor der Placeboapplikation und bei 15,7 ELISA-Units zwei Wochen nach der 2.
Placeboapplikation lagen, stiegen sie in den vier Kombinationsvakzinegruppen deutlich über 100 ELISA-Units an. Die Immunisierung mit der Kombinationsvakzine, versetzt mit dem Adjuvans Quil A, verzeichnete einen Anstieg des durchschnittlichen MRP-spezifischen Antikörperspiegels von 19 ELISA-Units vor der Immunisierung auf 190 ELISA-Units zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung. Unter Verwendung des Adjuvans Montanide Gel01 gingen die Werte von 17 ELISA-Units in den Präimmunseren auf 115 ELISA-Units in den Postimmunseren hoch. In der Gruppe, die als Adjuvans Emulsigen erhalten hatte, kam es zu einem Titeranstieg von
Kapitel 2: Untersuchungen zur immunogenen Wirkung einer Streptococcus suis Serotyp-2- und 9-Kombinationsvakzine
durchschnittlich 5 auf 844 ELISA-Units. Bei 4 Tieren dieser Gruppe lagen die Werte deutlich über 1.000 ELISA-Units. Die MRP-spezifischen Antikörperspiegel nach der Immunisierung mit der Kombinationsvakzine versehen mit dem Adjuvans Montanide IMS lagen im Durchschnitt bei 677 ELISA-Units. Alle vier Gruppen hatten in ihren Postimmunseren signifikant höhere MRP-spezifische Antikörperspiegel im Vergleich zu ihren Präimmunseren (Tab. 2). In der Kontrollgruppe hatten sich hingegen die Titer vor und nach der Placeboapplikation nicht verändert. Vergleicht man die Postimmunseren der einzelnen Gruppen mit dem der Kontrollgruppe waren auch hier die Unterschiede signifikant. Besonders die Tiere, die als Adjuvans Emulsigen oder Montanide IMS erhalten hatten, entwickelten hohe Antikörperspiegel gegen MRP.
Zwischen diesen beiden Gruppen gab es in den Postimmunseren keine signifikanten Unterschiede (p= 0,55). Allerdings wiesen die Postimmunseren der Emulsigen-Gruppe im Vergleich zur Montanide Gel01-Emulsigen-Gruppe signifikant höhere MRP-spezifische Antikörpertiter (p= 0,0002) auf (Tab. 2). Drei Tiere aus der Emulsigen-Gruppe hatten mit 1.400 ELISA-Units die höchsten Titer und auch in der Montanide IMS-Gruppe war ein Tier mit einem Wert von 1149 ELISA-Units auffällig hoch.
Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass zwischen den vier getesteten Adjuvantien erhebliche Unterschiede in Bezug auf die immunogene Wirkung einer S.-suis-Kombinationsvakzine bestehen (Kombination von zwei S.-suis-Stämmen).
MRP-spezifische Titer waren am höchsten bei Schweinen, bei denen die Kombinationsvakzinen mit den Adjuvantien Emulsigen oder mit Montanide IMS versehen wurden. Eine Serokonversion gegen MRP wurde bei der Immunisierung mit den Kombinationsvakzinen unter Verwendung aller vier getesteten Adjuvantien (Quil A, Emulsigen, Montanide Gel01, Montanide IMS) beobachtet.
D.2.1.2 Adjuvantienversuch: Untersuchung der Schweine auf die Ausbildung opsonisierender Antikörper
In einer vorangegangenen Studie (Baums et al. 2009) konnte ein Zusammenhang zwischen den Titern opsonisierender Antikörper und der protektiven Wirkung einer S.-suis-Serotyp-2-Ganzzellvakzine im Schwein aufgezeigt werden. Aus diesem Grund wurden die Seren der Tiere dieses Versuchsvorhabens auf die Ausbildung von opsonisierenden Antikörpern, die sich gegen Serotyp 2 und/oder gegen Serotyp 9 richteten, untersucht. Der Quotient aus den Überlebensfaktoren des
66
entsprechenden S.-suis-Stammes in Anwesenheit des Post– bzw. Präimmunserums eines Tieres wurde als Faktor F definiert. Der Faktor F ist ein Maß für die Induktion opsonisierender Antikörper (Baums et al. 2006). Ist der Wert größer oder gleich eins bedeutet dies, dass keine opsonisierenden Antikörper in Folge der Immunisierung gebildet wurden.
Im Hinblick auf die Fähigkeit, den S.-suis-Serotyp-9-Stamm A3286/94 durch Opsonophagozytose abzutöten, zeigte sich in allen vier Gruppen kein signifikanter Unterschied zur Kontrollgruppe. Der Faktor F lag im Durchschnitt in allen fünf Gruppen über eins (Abbildung 2B). In der Gruppe, die als Adjuvans Emulsigen erhalten hatte, zeigten aber vier von zehn Tieren Faktor-F-Werte kleiner als 0,8. Auf der Grundlage der Ergebnisse der vorausgegangenen Arbeiten wurde erst für Faktor-F-Werte unter 0,8 von der Ausbildung opsonisierender, protektiver Antikörper ausgegangen (Baums et al. 2009). In der Montanide-Gel01-Gruppe waren es drei und in der Montanide-IMS- und QuilA-Gruppe jeweils nur ein Tier, die in diesen bzw.
unter diesen Bereich fielen.
Im Opsonophagozytosetest gegen den Serotyp-2-Stamm 10 lagen die durchschnittlichen Faktor-F-Werte in allen Gruppen über eins und sogar höher als in der Kontrollgruppe (Abbildung 2A). Einzelne Tiere hatten allerdings Faktor-F-Werte, die deutlich unter 1 waren. Einen Faktor F unter 0,8 hatten in der Montanide-Gel01-Gruppe drei Tiere, in der Emulsigengruppe ein Tier sowie in den QuilA- und Montanide-IMS-Gruppe jeweils zwei und drei Tiere.
Zusammenfassend ist festzuhalten, dass für keines der vier getesteten S.-suis-Kombinationsvakzinen, die sich nur durch die Verwendung des Adjuvans unterschieden, eine signifikante Induktion opsonisierender Antikörper gegen einen der beiden getesteten S.-suis-Pathotypen nachweisen ließ. Auffällig war allerdings, dass bei einzelnen Tieren aus unterschiedlichen Gruppen eine Induktion opsonisierender Antikörper nachweisbar war.
D.2.2 Kombinationsvakzineversuch
Da in dem voraus gegangenen Adjuvantienversuch keine Induktion opsonisierender Antikörper beobachtet wurde, sollte in diesem Versuchsvorhaben ein direkter Vergleich zwischen Kombinations- und Einzelganzzellvakzinen durchgeführt werden.
Als Adjuvans wurde Emulsigen eingesetzt, da in den vorausgegangenen
Kapitel 2: Untersuchungen zur immunogenen Wirkung einer Streptococcus suis Serotyp-2- und 9-Kombinationsvakzine
Einzelganzzellversuchen mit Emulsigen als Adjuvans eine Induktion opsonisierender Antikörper beobachtet werden konnte (Baums et al. 2009; Büttner et al. 2012).
D.2.2.1 Kombinationsvakzineversuch: Untersuchung der Schweine auf die Ausbildung opsonisierender Antikörper nach zweimaliger Impfstoffapplikation
Wie in dem Adjuvantienversuch wurden die Vakzinen auf der Grundlage der S.-suis-Stämme A5683/94 (Serotyp 9) und I9841/1 (Serotyp 2) hergestellt. Die Opsonophagozytosetests wurden mit den S.-suis-Stämmen A3286/94 (Serotyp 9) und 10 (Serotyp 2) durchgeführt. Für den Opsonophagozytosetest mit Stamm 10 erhielt die Kontrollgruppe einen Mittelwert für den Faktor F von 1,05. Dieser Wert zeigte, dass die Tiere keine opsonisierenden Antikörper in Folge der Placeboapplikation ausgebildet hatten. In der Gruppe, in der die Tiere, mit der Kombinationsvakzine immunisiert wurden, war der Faktor F mit 1,05 genauso hoch wie in der Kontrollgruppe. Vier Tiere fielen in dieser Gruppe aber auf, da sie F-Werte um 0,8 aufwiesen. Die Gruppe, die die Serotyp-2-Einzelganzzellvakzine erhalten hatte, lag mit einem durchschnittlichen F-Wert von 1,15 über dem von der Kontrollgruppe mit 1,05 (p = 0,84) (Abb.3 B). Der Vergleich der F-Werte aller drei Gruppen erlaubte die Schlussfolgerung, dass in diesem Versuch weder durch die Kombinationsvakzine noch durch die Serotyp-2-Einzelganzzellvakzine opsonisierende Antikörper gegen den S.-suis-Serotyp-2 Stamm 10 induziert wurden.
Im Opsonophagozytosetest gegen den S.-suis-Serotyp-9 Stamm A3286/94 wurden folgende drei Gruppen untersucht: die Kontroll-, die Kombinationsvakzine- und die Serotyp-9-Einzelganzzellvakzine-Gruppe. Die Kontroll- und die Kombinations-vakzine-Gruppe hatten beide einen durchschnittlichen F-Wert von 1,27 (Abb. 3 A).
Bei der Gruppe, die die Serotyp-9-Einzelganzzellvakzine erhalten hatte, lag der Durchschnittswert bei 0,97. In den drei untersuchten Gruppen des Kombinationsvakzineversuches kam es demnach gegen den Serotyp 9 nicht zu einer Induktion opsonisierender Antikörper.
Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass alle drei Impfstoffe nicht zu einer Ausbildung von opsonisierenden Antikörpern, weder gegen den Serotyp-2-Stamm 10 noch gegen den Serotyp-9-Stamm A3286/94, geführt hatten. Die drei immunisierten Gruppen zeigten in den Titern opsonisierender Antikörper keine signifikanten
68
Unterschiede zu der Kontrollgruppe (p-Werte lagen hier alle zwischen 0,64 und 0,99) (Abb. 3).
D.2.2.2 Kombinationsvakzineversuch: Untersuchung der Schweine auf die Ausbildung opsonisierender Antikörper nach dreimaliger Applikation der Kombinationsvakzine
Da sich nach zweimaliger Immunisierung mit der Kombinationsvakzine keine opsonisierenden Antikörper gebildet hatten, wurde diese Gruppe ein drittes Mal immunisiert. Zum Vergleich bekam auch die Kontrollgruppe den Placebo ein weiteres Mal verabreicht. Die Einzelganzzellvakzinegruppen wurden aus wirtschaftlichen Gründen frühzeitig aufgelöst.
Im Opsonophagozytosetest gegen den Serotyp-9-Stamm A3286/94 zeigte sich, dass der durchschnittliche Faktor-F-Wert in der Kontrollgruppe mit 0,73 nach der dritten Placeboapplikation signifikant niedriger war als nach der zweiten Placeboapplikation mit 1,27 (p-Wert 0,006; Abb. 4A). In der Kombinationsvakzinegruppe lag der F-Wert nach der 3. Immunisierung mit einem Durchschnittswert von 0,91 unter dem Wert von 1,27 nach der zweiten Immunisierung (p-Wert 0,028). In der Kombinationsvakzinegruppe konnte eine große Streuung der F-Werte zwischen den einzelnen Tieren beobachtet werden. So hatte ein Tier einen Faktor-F-Wert von 0,22 während bei sieben anderen Tieren die Werte teilweise deutlich über eins lagen (Standardabweichung 0,33). Der Überlebensfaktor in den Präimmunseren dieser Gruppe lag mit einem Mittelwert von 1,1 nur leicht über dem der Postimmunseren mit 0,99.
Der Überlebensfaktor für den S.-suis-Serotyp-2-Stamm 10 im Opsonophagozytosetest war in Anwesenheit der nach der dritten Immunisierung mit der Kombinationsvakzine gewonnenen Postimmunseren deutlich niedriger (0,91) als in den Ansätzen mit den Präimmunseren (1,28) und den nach der zweiten Immunisierung gewonnenen Postimmunseren (1,35). So lag der durchschnittliche F-Wert nach 3. Immunisierung bei 0,68 (Abb. 4B). Dieser Wert spricht für eine Induktion opsonisierender Antikörper gegen den Serotyp-2-Stamm 10 in Folge der dritten Applikationen der Kombinationsvakzine. In der Kontrollgruppe wurde keine Induktion opsonisierender Antikörper gegen den Serotyp-2-Stamm 10 beobachtet (F = 1,59).
Kapitel 2: Untersuchungen zur immunogenen Wirkung einer Streptococcus suis Serotyp-2- und 9-Kombinationsvakzine
D.2.2.3 Kombinationsvakzineversuch: Untersuchung der Tonsillen der Versuchsschweine auf das Vorkommen von S.-suis-Serotyp-2 und Serotyp-9
Um eine Beeinträchtigung des Versuchsverlaufes durch ein unbeabsichtigtes Infektionsgeschehen mit den beiden S.-suis-Pathotypen zu erkennen, wurden alle Versuchsschweine der Kontroll- und der Kombinationsvakzinegruppe nach der dritten Immunisierung kulturell auf diese beiden Pathotypen untersucht. Dafür wurden Tonsillentupfer genommen und die isolierten α-hämolysierenden Streptokokken auf einen cps2- und cps9-Genotyp untersucht. Bei keinem der Tiere konnten cps2- oder cps9-positive-Stämme nachgewiesen werden.
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Tabelle D-1: Zusammensetzung der verschiedenen Impfstoffe, die in der IDT Biologika GmbH für den Adjuvantienversuch hergestellt wurden.
Komponente
Impfstoff mit QuilA
[ml]
Impfstoff mit Emulsigen
[ml]
Impfstoff mit Mon. Gel01
[ml]
Impfstoff mit Mon. IMS
[ml]
S.-suis-ST-2a inakt.b 97,7 97,7 97,7 97,7
S.-suis-ST-9c inakt.d 97,7 97,7 97,7 97,7
Thiomersal 2,2% 0,57 0,57 0,57 0,57
QuilA (10%) 0,63 0 0 0
Emulsigen 0 50 0 0
Mon. Gel01 0 0 25 0
Mon. IMS 0 0 0 37,5
Todd Hewitt Broth 53,4 4 29 16,5
Gesamt 250 249,97 249,97 249,97
a Serotyp 2
b Lebendkeimzahl 1x109 KBE/ml
c Serotyp 9
d Lebendkeimzahl 6x108 KBE/ml
Kapitel 2: Untersuchungen zur immunogenen Wirkung einer Streptococcus suis Serotyp-2- und 9-Kombinationsvakzine
Tabelle D-2: Statistische Vergleiche der MRP-spezifischen Antikörperspiegel der unterschiedlichen Gruppen des Adjuvantienversuches mit Kombinationsvakzinen bestehend aus S.-suis-Serotyp-2 und -Serotyp-9 .
Variable 1 Variable 2
Gruppea Probe Gruppea Serum p-Wert statistischer Test
Kontrolle Kontrolle 0,69
Emulsigen Emulsigen 0,005
QuilA QuilA 0,005
Kontrolle Emulsigen 0,005
Kontrolle QuilA 0,0001
a Der Kontrollgruppe wurde ein Placebo appliziert. Alle anderen Gruppen erhielten eine S.-suis-Serotyp-2- und 9-Kombinationsvakzine mit der gleichen Impfdosis. Die Gruppenbezeichnung bezieht sich auf die unterschiedlich eingesetzten Adjuvantien.
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Tabelle D-3: Statistische Vergleiche der F-Werte (Quotient aus Überlebensfaktoren von Stamm 10 in Anwesenheit des Postimmunserums nach der 2. Impfstoffapplikation und des Präimmunserums), ermittelt im Opsonophagozytosetest, zur Evaluation der unterschiedlichen Kombinationsvakzinen im Adjuvantienversuch.
Variable 1 (F-Wert der Gruppea)
Variable 2
(F-Wert der Gruppea) p-Wert statistischer Test
Emulsigen 0,10 QuilA 0,31 Mon. Gel01 0,26
Kontrolle
Mon. IMS 0,34
Mann-Whitney U-Test
a Der Kontrollgruppe wurde ein Placebo appliziert. Alle anderen Gruppen erhielten eine S.-suis-Serotyp-2- und 9-Kombinationsvakzine mit der gleichen Impfdosis. Die
a Der Kontrollgruppe wurde ein Placebo appliziert. Alle anderen Gruppen erhielten eine S.-suis-Serotyp-2- und 9-Kombinationsvakzine mit der gleichen Impfdosis. Die