S.-suis-Immunisierungsversuche (Tabelle 1)

A.2 Literaturübersicht

A.2.10 S.-suis-Immunisierungsversuche (Tabelle 1)

Die Suche nach einem Antigen, das einen serotypübergreifenden Schutz bietet, ist ein wichtiges Ziel bei der Forschung zur Entwicklung eines Impfstoffes gegen S. suis (Baums et al., 2009). In Immunisierungsversuchen wurden einige mit der Zellwand assoziierte Oberflächenproteine von S. suis als mögliche Impfstoffkandidaten getestet. In den meisten Arbeiten sind aber nur Belastungen mit einem Stamm des gleichen Serotyps durchgeführt worden, so dass die serotypübergreifende Schutzwirkung ungeklärt ist. Hinzu kommt, dass viele Impfstoffkandidaten nur in Tierversuchen mit Mäusen getestet wurden. Auch wenn diese Versuche mit Protektion vor Mortalität und zum Teil auch Morbidität einhergingen (Tab.1), lässt sich daraus nicht ohne weiteres eine Schutzwirkung für das Schwein ableiten, da

Einleitung

Mäuse und Schweine eine unterschiedliche Empfänglichkeit für S. suis besitzen (Vecht et al., 1997a; Vecht et al., 1997b).

2007 wurde in einem Immunisierungsversuch von Li et al. als Immunogen rekombinates SAO eingesetzt. Zusammen mit Emulsigen verabreicht, konnte kein signifikanter Schutz gegen eine experimentelle S.-suis-Infektion erreicht werden.

Dieses Ergebnis ging einher mit der mangelnden Induktion opsonisierender Antikörper. Bei der Verabreichung von rekombinantem SAO zusammen mit dem Adjuvants Quil A konnte hingegen eine protektive Wirkung erzielt werden. Die mit QuilA und SAO vakzinierten Schweine zeigten eine höhere Überlebensrate und es traten weniger klinische Erscheinungen auf.

SsPepO ist stark konserviert unter S.-suis-Serotyp-2-Stämmen. Immunisierungs-experimente, bei denen sowohl Mäusen als auch Schweinen rekombinant hergestelltes SsPepO verabreicht worden war, zeigten, dass dieses Protein eine starke humorale Immunantwort auslöst und zu einem partiellen Schutz der Tiere vor Mortalität, nicht aber vor Morbidität führt (s. Tab. 1). Darüber hinaus hemmen Antiseren gegen SsPepO das Wachstum von S. suis in vitro und führten bei einer passiven Immunisierung von Mäusen zur Protektion. Das macht SsPepO zu einem potentiellen Kandidaten für eine Subunitvakzine (Li et al., 2011a).

Das Oberflächenprotein HP0245EC von S.-suis-Serotyp-2 wurde als Impfantigen im Tierversuch in der Maus getestet (Li et al., 2011b). In einem Belastungsversuch mit einer LD50 konnte bei 80% der Tiere ein Schutz vor Morbidität erreicht werden. Im Gegensatz dazu zeigte die Gruppe, die zum Vergleich eine Serotyp-2-Ganzzellvakzine erhalten hatte, bei homologer Belastung eine Morbiditätsrate von 50%.

HP0197, ein weiteres Oberflächenprotein von S. suis, wurde im Schwein als Vakzinekandidat getestet (Zhang et al., 2009a). In einem Belastungsversuch mit S.-suis-Serotyp-2 zeigte sich bei 75% der mit HP0197 immunisierten Schweine ein Schutz vor Mortalität. In der mit einer Serotyp-2-Ganzzellvakzine immunisierten Gruppe waren jedoch alle Tiere gegen Mortalität als Folge einer homologen S.-suis-Infektion geschützt. Allerdings bestand in beiden Gruppen kein Schutz vor Morbidität.

Das Enzym 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase wird von S.-suis-Serotyp-2 auch auf der Oberfläche exprimiert. Als Immunisierungsantigen erzielte es bei 50% der Versuchsschweine einen Schutz vor Morbidität und Mortalität im Zusammenhang mit einer Serotyp-2-Belastung (Tan et al., 2009).

Auch Lebendvakzinen wurden, als potentielle Impfstoffkandidaten für S .suis, bereits in unterschiedlichen Immunisierungsexperimenten auf ihre protektive Wirkung im Schwein getestet. Sie aktivieren sowohl die humorale als auch die zelluläre Immunabwehr. In einer Studie unserer Arbeitsgruppe war nach einer Immunisierung mit einem attenuierten S.-suis-Serotyp-2-Stamm kein signifikanter Schutz bei einer homologen und heterologen Belastung vorhanden (Kock et al., 2009). Auch durch die Immunisierung mit einer kapsellosen S.-suis-Serotyp-2-Mutante konnte kein Schutz vor einer Infektion mit dem Wildtyp erreicht werden (Wisselink et al., 2002).

Lediglich Fittipaldi et al. (2007) konnten mit einer nicht virulenten, für aromatische Aminosäuren auxotrophen, unbekapselten Mutante einen Schutz vor Mortalität und eine Reduktion der klinischen Symptome nach einer Belastung mit dem Wildtyp auslösen.

In zwei vorausgegangenen Dissertationen wurde die protektive (Bennecke, 2008) und immunogene (Kock, 2009) Wirkung einer Serotyp-2-Subunitvakzine, bestehend aus verschiedenen Oberflächenproteinen wie MRP, SAO und dem fibronectin and fibrinogen binding protein of S. suis (FBPS), im Schwein untersucht. Die homologe und heterologe Schutzwirkung gegen einen Serotyp-2- bzw. 9-Belastungsstamm wurde im Vergleich zu einer Ganzzellvakzine ermittelt. Eine protektive Wirkung gegen eine homologe Infektion mit dem Serotyp-2-Stamm konnte nur mit der Ganzellvakzine (s.o) erreicht werden. Bei einer heterologen Infektion mit einem Serotyp-9-Stamm konnte mit keinem der beiden Impfstoffe eine ausreichende protektive Wirkung erzielt werden (Baums et al., 2009).

Eine Immunisierung mit S.-suis-Enolase wurde bei Mäusen durchgeführt. Die Ergebnisse von zwei Studien hierzu fielen unterschiedlich aus. Während Esgleas et al. (2009) keine protektive Wirkung, weder in Bezug auf Morbidität noch auf Mortalität, erreichen konnten, waren bei Zhang et al. (2009b) die Tiere nach der Immunisierung vor einer Erkrankung mit S. suis geschützt.

In der Mehrzahl der S.-suis-Immunisierungsexperimente wurden Serotyp-2-Antigene getestet und die protektive Wirkung gegen Serotyp 2 ermittelt. Die Wirkung einer S.-suis-Serotyp-9-Ganzzellvakzine wurde erstmalig von Dekker et al. (2011) experimentell untersucht. In dieser Arbeit wurde nicht die protektive Wirkung gegenüber einer letalen Infektion untersucht, sondern die Auswirkung der Immunisierung auf die Transmission des Erregers. Aus diesem Grund wurde ein nasales Serotyp-9-Infektionsmodell gewählt, bei dem die Mortalitätsrate unter 10%

Einleitung

lag. Die von Dekker et al. (2011) eingesetzte inaktivierte Serotyp-9-Ganzzellvakzine enthielt α-Tocopherolacetat als Adjuvans und wurde zweimal im Alter von 3 und 5 Wochen appliziert. Durch die Immunisierung kam es nicht zu einer Reduzierung der Übertragung des Erregers von infizierten auf nicht infizierte Tiere. Alle Gruppen zeigten nach der Infektion einen vergleichbaren Kolonisationsgrad mit dem Erreger auf den Tonsillen und im Speichel. Auch die Morbiditätsrate lag in der immunisierten Gruppe und der Kontrollgruppe bei 92%. Dieses Ergebnis sprach gegen eine protektive Wirkung der Serotyp-9-Ganzzellvakzine.

Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass im Mausmodell Subunitvakzinen auf der Grundlage einzelner Oberflächenproteine von S.-suis-Serotyp-2 eine gute Protektion gegenüber einer homologen Belastung erzielten. Ob diese Ergebnisse sich auf das Schwein übertragen lassen, ist sehr umstritten. Für das Schwein konnte bis heute für keine Subunitvakzine eine protektive Wirkung aufgezeigt werden, die der einer Ganzzellvakzine überlegen war. Hinweise für die Bedeutung von Adjuvantien für die protektive Wirkung von S.-suis-Ganzzell- und Subunitvakzinen liegen vor. Demnach ist Emulsigen ein geeignetes Adjuvans für eine Ganzzellvakzine und Quil A für eine SAO-Subunitvakzine. Ein großer Forschungsbedarf besteht noch für Vakzinen gegen andere Serotypen, insbesondere Serotyp 9, denn bis heute wurde noch keine Vakzine beschrieben, die zu einer Protektion gegen eine Seroyp-9-Belastung führt.

Tabelle A-1: Ergebnisse von Immunisierungsversuchen mit experimentellen Belastungsinfektionen

Einleitung

Fortsetzung Tabelle A-1

Einleitung

Fortsetzung Tabelle A-1

B Material und Methoden

B.1

B.2

Versuchstiere (Kapitel 2 und 3)

Die Absatzferkel der beiden Tierversuchsvorhaben stammten aus dem SPF-Schweinezuchtbestand Garlitz des Bundes Hybrid Zucht Programmes. Dieser Betrieb ist frei von sly+ mrp+ epf+ cps2+ und cps9+ S.suis-Stämmen (Baums, C., 2009 persönliche Mitteilung).

Der tierexperimentelle Teil von Kapitel 2 wurde mit Impfstoffwerk Dessau Tornau Biologika GmbH (Aktenzeichen IDT A04/2004) und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der European Connvention for Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes durchgeführt. Der erste Teil des Tierversuches wurde mit fünf Gruppen mit zehn Tieren pro Gruppe durchgeführt. Im zweiten Teil wurden für den Tierversuch drei Gruppen mit zehn Tieren eingestallt.

Der tierexperimentelle Teil von Kapitel 3 wurde vom Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES) genehmigt (Aktenzeichen 09/1674) und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der European Connvention for Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes durchgeführt. Der Tierversuch wurde in zwei Gruppen mit jeweils neun Tieren durchgeführt.

S.-suis-Stämme (Kapitel 2)

Für die Herstellung der Ganzzellimpfstoffe (Einzel- und Kombinationsvakzinen) wurden ausschließlich der S.-suis-Serotyp-2-Stamm I9841/1 und der Serotyp-9-Stamm A5683/94 eingesetzt. Der S.-suis-Serotyp-2-Serotyp-9-Stamm I9841/1 wurde ursprünglich aus dem ZNS eines an Meninigitis erkrankten Schweines isoliert. Er gehört zum klonalen Komplex 1 (Rehm et al. 2007) und exprimiert die Proteine Suilysin, EF und MRP (Allgaier et al. 2001). S. suis A5683/94 bildet Suilysin (Allgaier et al. 2001) sowie eine hochmolekulare Variante von MRP (Silva et al. 2006). Dieser Stamm wurde ursprünglich aus der Milz von einem Schwein mit Septikämie isoliert (Allgaier et al. 2001) und gehört zum klonalen Komplex 16, der von Rehm et al.

(2007) noch als klonaler Komplex 87 bezeichnet wurde. Für die Durchführung des Opsonophagozytosetests wurde der S.-suis-Serotyp-2-Stamm 10 und der

Material und Methoden

Stamm A3286/94 eingesetzt. Stamm 10 ist wiederholt von unterschiedlichen Gruppen erfolgreich in experimentellen Infektionen von Schweinen zur Induktion von Meningitiden und anderen Erkrankungen eingesetzt worden (Baums et al. 2006;

Baums et al. 2009; Beineke et al. 2008; Smith et al. 1999). Er exprimiert zahlreiche virulenzassoziierte Faktoren wie MRP, EF, SLY, den opacity factor of S. suis (OFS) (Baums et al. 2006) und das fibronectin and fibrinogen binding protein of S. suis (FBPS) (de Greeff et al. 2002). Stamm 10 lässt sich in der AFLP-Analyse nicht von dem Impfstamm I9841/1 unterscheiden (Rehm et al. 2007). Der Serotyp-9-Stamm A3286/94 wurde aus dem ZNS eines Schweines mit Meningitis isoliert. Er exprimiert Suilysin und eine hochmolekulare Variante von MRP. Wie der Serotyp-9-Vakzinestamm A5683/94 gehört A3286/94 zum klonalen Komplex 16 (früher 87), allerdings zu einem anderen Sequenztyp innerhalb dieses klonalen Komplexes.

Stamm A3286/94 führt in experimentellen Infektionen von Absatzferkeln nur nach intravenöser und nicht, wie Stamm 10, auch nach intranasaler Applikation zu Erkrankungen (Beineke et al. 2008).

Die Anzucht beider Stämme erfolgte bei 37°C in 30 ml Todd Hewitt Broth (THB, Bacto), anschließend wurde jeweils mit 10 ml der Übernachtkultur 1000 ml THB angeimpft und bei 37°C bis zu einer OD600 von 0,8 kultiviert.

Die Anzucht von E. coli M15 pQEmrp für die Expression von rMRP erfolgte auf festem LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin und 25 µg/ml Kanamycin.

B.3 Herstellung der Ganzzellimpfstoffe für die vergleichende Evaluation der Adjuvantien im November 2010 in der IDT Biologika GmbH (Kurzbezeichnung: Adjuvantienversuch) (Kapitel 2)

Die Herstellung der Kombinationsganzzellvakzinen unter Zusatz der verschiedenen Adjuvantien wurde im Impfstoffwerk Dessau Tornau Biologika GmbH durchgeführt (Tab.1). Ein Lyophylisat von beiden Bakterienstämmen wurde dazu in 10 ml THB für 7 h und 30 min bei 37°C angezogen und als erste Vorkultur bezeichnet. Danach wurden 95 ml THB mit 5 ml aus der ersten Vorkultur angeimpft und für 16 h und 10 min bei 37°C inkubiert. Zur Herstellung der Hauptkultur wurden 50 ml aus der zweiten Vorkultur mit 450 ml THB-Medium versetzt. In der Hauptkultur vom Serotyp 2 (I9841/1) befand sich eine Lebendkeimzahl von 1,12 x 10⁹KBE/ml. In der Kultur von Serotyp 9 (A5683/94) war die Lebendkeimzahl 6 x 10⁸/ml. Die Inaktivierung der

Hauptkultur erfolgte anschließend mit 0,15%igem Formaldehyd. Für jeden Impfstoff wurden die inaktivierten Kulturen der beiden Serotypen in gleichen Volumina eingesetzt und mit 2,2%igem Thiomersal zu einer finalen Konzentration von 0,23%

versetzt. Es wurden vier Impfstoffe mit vier verschiedenen Adjuvantien hergestellt.

Dabei hatten die Adjuvantien in den vier verschiedenen Impfstoffen folgende finale Konzentrationen: QuilA (10%ige Stammlösung) 0,025% (v/v), Emulsigen^R 20% (v/v) (Technical Bulletin, Omaha), Montanide Gel01 10% (v/v) (SEPPIC^R, Frankreich) und Montanide IMS 15% (v/v) (SEPPIC^R, Frankreich). Die Impfstoffe wurden in vier verschiedenen Tiergruppen eingesetzt, wobei jedem Tier 2 ml intramuskulär verabreicht wurden. Darin enthalten waren 3 x 10⁸ inaktivierte KBE des Serotyp 9 und 6 x 10⁸ inaktivierte KBE des Serotyp 2.

B.4 Herstellung der Impfstoffe für den Vergleich der Einzel- und Kombinationsvakzinen im Mai 2011 in der IDT Biologika GmbH (Kurzbezeichnung: Kombinationsvakzineversuch) (Kapitel 2)

Für diesen Versuch wurden drei verschiedene Impfstoffe hergestellt: eine Serotyp-2-Einzelganzzellvakzine, eine Serotyp-9-Einzelganzzellvakzine und eine Kombinationsvakzine bestehend aus Serotyp 2 und 9. Die Kultivierung von S.-suis-Serotyp-2-Stamm I9841/1 und Serotyp-9-Stamm A5863/93 erfolgte auf Columbia-Nährböden mit 6% Schafblut. Hierfür wurden jeweils 10 ml THB mit dem Serotyp-9-Stamm A5863/93 und mit dem Serotyp-2-Serotyp-9-Stamm I9841/1 angeimpft und über Nacht bei 37°C inkubiert. Am nächsten Tag wurden 1,25 l THB Medium mit jeweils 5 ml Übernachtkultur (ÜNK) angeimpft , bis zu einer OD600 von 0,8 bei 37°C wachsen gelassen und durch eine finale Formaldehydkonzentration von 0,1% inaktiviert. Die inaktivierten Kulturen wurden zwei Tage lang bei 8°C auf dem Rührer durchmischt.

Zur Sterilitätsüberprüfung erfolgte das Ausplattieren der Suspension auf Blutagar.

Danach wurden die inaktivierten Kulturen zur weiteren Bearbeitung zur IDT Biologika GmbH transportiert. Dort erfolgte das Zusammenführen der beiden inaktivierten Kulturen in gleichen Volumina für die Herstellung der Kombinationsvakzine, die Zugabe des Adjuvans Emulsigen zu einer finalen Konzentration von 20% (v/v) und schließlich die Einstellung des pH-Wertes von 6 auf 7,4 mit NaOH. Für die Herstellung der Serotyp-2- und Serotyp-9-Einzelganzzellvakzinen wurde Material aus

Material und Methoden

den jeweiligen Kulturen vor dem Zusammengeben abgenommen und auf die gleiche Weise wie die Kombinationsvakzine weiterbehandelt.

Das Placebo für die Kontrollgruppe wurde auf die gleiche Weise hergestellt, nur mit dem Unterschied, dass hier, statt der Bakterienkultur, steriles THB verwendet wurde.

Jedem Tier wurden 2 ml des Impfstoffes bzw. des Placebos verabreicht. Die berechnete Impfdosis pro Applikation betrug 6 x 10⁸inaktivierte Bakterien für die Serotyp-9-Einzelvakzine, 1 x 10⁹ inaktivierte Bakterien für die Serotyp-2-Einzel-vakzine, sowie 3 x 10⁸ inaktivierte Bakterien des Serotyp 9, zusammen mit 6 x 10⁸ inaktivierten Bakterien des Serotyp 2 in der Kombinationsvakzine.

B.5 Expression und Aufreinigung von rekombinantem MRP (rMRP) (Kapitel 2)

Zur Expression von rMRP wurde der E.-coli-Stamm M15 pQEmrp eingesetzt (Beineke et al. 2008). Dieser Bakterienstamm enthält einen Vektor, in den die Sequenz des Gens mrp kloniert wurde. Nach dem Wachstum der Bakterien bis zu einer OD600 von 0,4 wurden 500 µl 1M IPTG zu den 500 ml Kultur hinzugegeben und für 3 h schüttelnd inkubiert, um die Expression des rekombinanten Proteins zu induzieren. Es erfolgte eine anschließende Zentrifugation für 20 min bei 3800 x g.

Der Überstand wurde verworfen und das Gewicht des Sediments bestimmt, dass dann über Nacht bei -20°C lagerte. Mit Hilfe des Protino Ni-TED-Systems von Macherey-Nagel (Düren, Deutschland) erfolgte am nächsten Tag die Aufreinigung von rMRP über Ni²⁺-Affinitätschromatographie unter nativen Bedingungen. Hierzu wurde 1 g Sediment in 4 ml 1x Puffer (s. Anhang) resuspendiert. Dem LEW-Puffer wurde zuvor Lysozym in einer finalen Konzentration von 1 mg/ml und 100 µl pro 2 g Sediment Protease Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich, München Deutschland) zugesetzt. Es schloss sich eine Inkubation für eine Stunde bei 4°C schwenkend an, bevor dann eine Sonifizierung im Sonifier cell distruptor (Firma Heinemann, Schwäbisch Gmünd, Deutschland)) für 10 x 15 sec bei 70 Watt durchgeführt wurde.

Nachdem das Lysat für 30 min bei 10.000 x g und 4°C zentrifugiert worden war, konnte der Überstand gewonnen und zur Aufreinigung über die Protino® Ni²⁺-TED 2000 Säulen gegeben werden. Die Elution der Proteine erfolgte durch Zugabe von dreimal 3 ml Elutionspuffer (Anhang). Die aufgereinigten Proteine wurden anschließend in einer SDS (Natriumdodecylsulfat)-PAGE und in einem Western Blot

mit monoklonalen Anti-Penta His Antikörpern (Qiagen, Hilden, Deutschland) bestätigt.

B.6

B.7

Westernblot (Kapitel 2)

Im Anschluss an die gelelektrophoretische Auftrennung der Proteine erfolgte die Übertragung der Proteine auf eine Nitrozellulosemembran durch Blotten für 70 min bei einer Spannung von 12 V nach dem semi-dry-Verfahren. Nach dem Blotten wurden unspezifische Bindungsstellen auf der Membran durch Übernachtinkubation derselben in TBST-Puffer (s. Anhang) mit 3% BSA blockiert. Darauf folgten drei Waschschritte mit TBST für jeweils zehn Minuten. Anschließend wurde die Membran eine Stunde bei Raumtemperatur mit einem Maus-anti-His-Antikörper Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg, Deutschland), 1:2000 in TBST mit 3% BSA) inkubiert.

Nach dreimaligem Waschen mit TBST erfolgte die Inkubation der Membran mit einem konjugiertem Sekundärantikörper (Ziege-anti-Maus-Antikörper von Amersham Pharmacia Biotech, 1:10.000 in TBST mit 1% Magermilch). Hieran schloss sich ein dreimaliges Waschen für zehn Minuten mit TBST an. Die Detektion erfolgte anschießend durch Chemilumineszenz. Dazu wurde die Oxidationslösung A mit der Lösung B (Luminol) (Thermo Scientific Super Signal^R, Schwerte, Deutschland) in einem Verhältnis 1:2 gemischt, auf die Membran gegeben und für drei Minuten inkubiert. Anschließend erfolgte die Detektion der Lumineszenz über einen Röntgenfilm (Biomax, Kodak, Sigma Aldrich, München, Deutschland). Dazu wurde die Membran für jeweils 30 sec und 1 min auf den Röntgenfilm aufgelegt.

Messung des Proteingehalts (Kapitel 2 und 3)

Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte mit dem BioRad DC^TM Proteinassay (München, Deutschland). In eine 96er Mikrotiterplatte wurde in jede zu belegende Vertiefung, außer in Reihe B, 25 µl Lösung A + 5 µl bidestilliertes Wasser pipettiert. In die Reihe B kamen 50 µl von Lösung A in jede Vertiefung. Eine Standardkonzentration BSA von 2.000 µg/ml wurde in die Vertiefung B1 pipettiert. In die restlichen Vertiefungen der Reihe B kamen 10 µl, der zu untersuchenden Proben im Doppelansatz. Von Reihe B bis Reihe H wurden daraufhin die Proben in einem Verhältnis von 1:2 sequentiell verdünnt. Danach erfolgte die Zugabe von 200 µl

Material und Methoden

Lösung B in jede Vertiefung. Der Ansatz wurde für 10 min im Dunkeln inkubiert und dann photometrisch (Tecan, GeniosPro, Schweiz) bei einer Wellenlänge von 595 nm gemessen.

B.8 Durchführung des ELISA (Kapitel 2)

Die Untersuchung der Versuchstiere auf Serokonversion in Folge der Immunisierung wurde im anti-MRP-ELISA durchgeführt. Für den anti-MRP-ELISA wurden Maxisorb Nunc-Immuno-Platten (Firma Nunc Dänemark) eingesetzt und mit rMRP beschichtet.

Pro Vertiefung wurden dafür 5 µg rMRP/100µl Carbonatpuffer (s. Anhang) pH 9,5 eingesetzt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Mikrotiterplatten fünfmal mit TBST (s. Anhang) im BioTek Elx405-Washer gewaschen und anschließend geblockt. Hierzu wurden in jede Vertiefung 200 µl 5% Milchpulver in PBS (s. Anhang) gegeben und die Platte für 2h bei 37°C schüttelnd inkubiert.

Bevor die Platten im ELISA eingesetzt werden konnten, wurden sie erneut fünfmal mit TBST gewaschen. Auf jeder Platte wurden von jedem Tier sowohl das Prä- als auch das Postimmunserum untersucht. Dabei wurden die Seren in jeweils vier Verdünnungsstufen in Duplikaten auf die Platte aufgetragen. Die Postimmunseren wurden von 1:200 bis zu 1:1600 verdünnt und untersucht. Bei den Präimmunseren lag die erste Verdünnungsstufe bei 1:100. Pro Vertiefung wurden 100 µl der Serumverdünnung eingesetzt und für 1 h bei 37°C schüttelnd inkubiert. Nach anschließendem fünfmaligem Waschen mit TBST im BioTek EL x 405 ELISA washer wurden pro Vertiefung 100 µl von einem anti-Schwein-IgG POD (Peroxidase) markiertem Antikörper (Dianova, Hamburg, Deutschland) in einer Verdünnung von 1:10.000 in TBST dazugegeben und für eine Stunde bei 37°C schüttelnd inkubiert.

Es folgte erneut fünfmaliges Waschen mit TBST. Anschließend wurden 100 µl einer 1:1500 Verdünnung von 3%igem Wasserstoffperoxid in einer ABTS-Lösung (2,2`-Azino-di-(3-Ethylbenzthiazolin)-6-Sulfonsäure) in jede Vertiefung gegeben, bevor sich eine Inkubation für 15 min bei 37°C schüttelnd anschloss. Die Peroxidase reduzierte hierbei H2O2 und oxidierte das Substrat ABTS, wobei ein grüngefärbtes ABTS-Radikalkation gebildet wurde. Abschließend wurde die Absorption im Photometer (Tecan, Schweiz) bei einer OD⁴⁰⁵ gemessen.

Der Antikörpertiter des Standardserums wurde als 100 ELISA-Units definiert. Für die Bestimmung der ELISA-Units legt das Programm einen Messbereich nach linearer

Regressionsanalyse der Messwerte des Standardserums fest. Die Steigung der Regressionsgeraden sollte Werte zwischen 0,9 und 1,1 annehmen und der Korrelationskoeffizient Werte über 0,95. Die Regressionsgeraden wurden für jeden ELISA ausgedruckt und überprüft. Zur Korrektur von unspezifischen Bindungen wurde jeder Messwert der Standard- und Testseren mit der Hintergrundabsorption auf BSA beschichteten Vertiefungen korrigiert. Dafür wurden die Spalten 11 und 12 jeder Mikrotiterplatte mit BSA beschichtet und mit den entsprechenden Verdünnungen des Standardserums versetzt und gemessen. Die ELISA-Units für ein Tier ergaben sich aus dem Mittelwert der durchschnittlichen ELISA-Units von zwei identischen Verdünnungsreihen. Die Abweichung der Duplikate sollte dabei im Mittelwert nicht mehr als 15% betragen. Seren, die im ELISA keine detektierbaren Titer zeigten (Angabe: < min), wurden zur logarithmischen Darstellung mit 5 ELISA-Units angegeben. Bei Messwerten oberhalb des Wertebereiches der Regressionsgeraden (Angabe: > max), wurde die Messung der Seren in einer höheren Verdünnungsstufe wiederholt. Für die Positivkontrolle wurde das Serum eines Schweines verwendet, das in einem vorangegangenen Experiment mit rMRP immunisiert worden war. Diese Kontrolle musste Werte zwischen 100 und 130 ELISA-Units annehmen. Das Negativkontrollserum stammte von einem nicht immunisierten Tier aus dem Herkunftsbestand der Versuchstiere.

B.9 Aufreinigung der neutrophilen Granulozyten für den Opsonophagozytosetest (Kapitel 2)

Die neutrophilen Granulozyten wurden aus heparinisiertem Schweineblut, unter Verwendung von 7,5 ml mit Heparin beschichteten Serummonovetten mit Gel gewonnen (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland).

Für die Isolierung der neutrophilen Granulozyten wurden 13 ml des frisch entnommenen Blutes mit 13 ml sterilem 0,9% NaCl versetzt. Von dieser Suspension wurden zweimal 12 ml vorsichtig auf je 12 ml Biocoll Trennungslösung (Biochrom AG) pipettiert, die in einem 50 ml Röhrchen (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) vorgelegt waren (Verhinderung einer Phasenvermischung). Anschließend erfolgte eine Zentrifugation für 32 min bei 420 g und einer Temperatur von 21°C sowie ungebremsten Auslaufen. Nach der Abnahme des Überstandes wurde das Sediment in 8 ml eisgekühltem 0,8% NaCl aufgenommen, um eine Lyse der Erythrozyten zu

Material und Methoden

bewirken. Nach 30 sec wurde die Lyse durch Zugabe von 8 ml eisgekühltem 1,6%

NaCl abgestoppt. Die Suspension wurde für 6 min bei 420 g und 6°C zentrifugiert.

Nach dem Verwerfen des Überstandes wurde das Zellsediment einer Wiederholung der Erythrozytenlyse unterworfen. Dies wurde drei- bis viermal wiederholt, bis die Erythrozyten weitgehend entfernt waren und das Sediment eine weiße Farbe angenommen hatte. Danach erfolgte die Aufnahme des Sediments in 1000 µl kaltem RPMI-Medium (Sigma Aldrich, München, Deutschland). Die Auszählung der Neutrophilen in einer Neubauerzählkammer schloss sich an, hierbei wurde von der

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