Für die Reinigung der Kapselpolysaccharide wurde S.-suis Stamm 10 in 1 l THB-Medium bis zu einer OD600 von 0,8 bei 37°C angezüchtet. Nach der anschließenden Zentrifugation für 20 min bei 5.000 g wurde der Überstand verworfen und das Sediment in 200 ml 0,9% NaCl aufgenommen und erneut zentrifugiert. Danach wurde das Sediment in 100 ml 0,1 M Glycin-Puffer mit einem pH-Wert von 9,2 resuspendiert und mit 10 mg/ml Lysozym versetzt und bei 37°C über Nacht gerührt.
Nach dieser Inkubation und der anschließenden Abzentrifugation des Zelldebris für 30 min bei 10.000 g erfolgte die Lyophilisierung des Überstandes. Das Lyophilisat wurde in 10 ml 0,1 M CaCl2 gelöst und zur Ausfällung der Nukleinsäuren für acht Stunden auf eine Alkoholkonzentration von 25% eingestellt. Auch hier wurden anschließend wieder die Zellbestandbestandteile für 30 min bei 10.000 g abzentrifugiert und der Überstand weiter verwendet. Die Alkoholkonzentration sollte auf 80% erhöht werden, um ein Ausfallen der Polysaccharide zu ermöglichen (Inkubation über Nacht bei 4°C rotierend). Das Sediment wurde nach dem Abzentrifugieren für 30 min bei 10.000 g in 10 ml 50 µM sterilem TRIS mit einem pH-Wert von 7,5 resuspendiert und eventuell unlösliche Bestandteile erneut für 30 min bei 10.000 g abzentrifugiert. Anschließend konnten die Polysaccharide durch einen DNAse-, RNAse- und Proteinase-K-Verdau und Phenolextraktion weiter aufgereinigt werden. Dabei wurde von der RNAse 10 µg/ml (Sigma Aldrich Typ I-A) und von der DNAse 1,5 µg/ml (Sigma-Aldrich DN-25) eingesetzt. Dieser Verdau erfolgte für acht Stunden rotierend. Die Proteinase K (Roth, Karlsruhe, Deutschland) wurde in einer finalen Konzentration von 0,4 µg/ml dazugegeben und über Nacht bei 37°C auf dem Rotator inkubiert. Das Abzentrifugieren erfolgte dann für 10 min bei 10.000 g.
Danach wurde Phenol in einem Verhältnis von 1:2 dazugegeben und 30 min bei 10.000 g zentrifugiert (langsames Auslaufen der Zentrifuge, um eine Phasentrennung beizubehalten). Die obere Phase wurde abgenommen und von kleineren Bestandteilen durch eine Dialyse mit einem cutoff von 8000-10.000 kDa
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befreit (Dialyseschlauch Zellu Trans von Roth, Karlsruhe, Deutschland). Nach einer zweitägigen Dialyse gegen 2 l steriles A. bidest, wurden die Kapselpolysaccharide lyophilisiert und in 1 ml PBS resuspendiert. Unlösliche Bestandteile waren durch Zentrifugation für 30 min bei 24.000 g zu entfernen (Elliott & Tai, 1978).
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Messung des Zuckergehalts (Kapitel 3)
Der Zuckergehalt wurde mit der Phenol-Schwefelsäure-Methode nach Fox & Robyt (1991) bestimmt.
Der Test wurde in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) durchgeführt. In der Reihe A lag die Probe unverdünnt vor und wurde dann von Reihe B bis H mit PBS in einem Verhältnis 1:2 sequentiell verdünnt. In der ersten Spalte wurde ein Glukosestandard mitgeführt mit einer Ausgangskonzentration von 200 µg/ml, mit dem genauso wie mit den Proben verfahren wurde. In alle Vertiefungen wurde 5%iges Phenol in einem Verhältnis von 1:2 dazugegeben und danach die Mikrotiterplatte für 30 sec auf einem Vortexer durchmischt. Auf Eis gekühlt wurde in jede Vertiefung konzentrierte Schwefelsäure in einem Verhältnis 1:3,5 gegeben und wieder für 30 sec auf einem Vortexer durchmischt. Danach wurde die Mikrotiterplatte im Wasserbad bei 80°C für 30 min inkubiert, bevor nach kurzem Abkühlen im Photometer (Tecan, GeniosPro, Schweiz) die Absorption bei einer Wellenlänge von 492 nm gemessen werden konnte.
SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektropho-rese) der Kapselpolysaccharide (Kapitel 3)
Für die Auftrennung der Kapselpolysaccharide und anschließende Silberfärbung oder Western Blot Analyse wurde eine SDS-Page durchgeführt. Dafür erfolgte zunächst das Gießen eines 5% Polyacrylamid-Trenngels ohne Sammelgel mit 1,25 ml 10 x TBE, 8,3 ml 30% Acrylamid, 250 µl 20% SDS, 38 µl TEMED, 380 µl 10%
APS aufgefüllt auf 50 ml A. bidest (s. Anhang). Die Proben wurden mit einem 2 x Probenpuffer (s. Anhang) versetzt und anschließend in einem Heizblock für 20 min bei 100°C erhitzt. Dies diente der vollständigen Denaturierung der Proteine. Die glykosidischen Bindungen der Kapselpolysaccharide sind bei diesen Temperaturbedingungen weitgehend stabil. In einer Elektrophoresekammer (Biorad,
Material und Methoden
München, Deutschland), die mit einem SDS-Laufpuffer (s. Anhang) gefüllt war, wurden die Proben auf das Gel geladen und für eine Stunde bei 150 V aufgetrennt.
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Silberfärbung zum Nachweis der Kapelpolysaccharide (Kapitel 3)
Die Darstellung der Kapselpolysaccharide durch eine Silberfärbung erfolgte nach vorausgegangener SDS-PAGE. Das SDS-Polyacrylamidgel wurde nach dem Lauf über Nacht fixiert. Die Fixationslösung (20ml) bestand aus 40% (v/v) Ethanol und 5%
(v/v) konzentrierter Essigsäure. Darin musste das Gel in einer Glasschale auf einem Schüttler in Bewegung gehalten werden. Am nächsten Tag wurde die Fixationslösung gegen eine Oxidationslösung ausgetauscht. Diese setzte sich aus 0,7% (w/v) Perjodsäure, 20% (v/v) Ethanol, 2,5% (v/v) konzentrierter Essigsäure zusammen und wurde darin für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde dreimal für 10 min mit A. bidest gewaschen und das Gel bei Raumtemperatur mit einer Silberfärbelösung, bestehend aus 1,3% (v/v) konzentrierter Ammoniak-Lösung mit 0,66% (w/v) Silbernitrat in 0,0186 M Natronlauge, für 10 min bei Raumtemperatur gefärbt. Ein Waschschritt und die Behandlung mit einem Formaldehydentwickler mit einer Zusammensetzung von 0,005% (w/v) Zitronensäure und 0,05% (v/v) Formaldehyd schlossen sich an. Schließlich wurde die Reaktion mit einer Lösung, bestehend aus 50% Methanol und 12% Essigsäure, gestoppt (Rabilloud, 1999).
Konjugation der Kapselpolysaccharide (Kapitel 3)
Für die Konjugation der Kapselpolysaccharide kam das Material aus zwei verschiedenen Präparationen von S.-suis-Serotyp-2 Stamm 10 (CPS 2) zum Einsatz.
Zur Aktivierung der Kapselpolysaccharide wurde 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridium Tetrafluroborate (CDAP) (100 mg/ml in Azetonitril) in einem Verhältnis von 1:1,5 (CPS:CDAP) dazugegeben und langsam für 30 sec auf einem Vortexer durchmischt.
Danach war 0,2 M Triethylamin mit gleichem Volumen wie vorher das CDAP hinzuzufügen. Nach 2 min leichtem Vortexen erfolgte die Kopplung durch Zugabe von BSA in einem Verhältnis von 1:2 (CPS:BSA), der sich eine 3 stündige Inkubation bei 37°C auf dem Rotator anschloss. Durch Zugabe von 1 M sterilem Glycinpuffer mit einem pH-Wert von 9 wurde eine Endkonzentration von 0,1 M Glycin eingestellt.
Dieses Material wurde über Nacht bei 4°C rotierend inkubiert. Hierdurch konnte ein
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Besetzen der freien Bindungsstellen erreicht werden. Danach schloss sich eine zweitägige Dialyse gegen 2 l PBS in einer Dialysekassette (G2 Slide-A-Lyzer 20K, Thermo Scientific, Schwerte, Deutschland) mit einem cut off von 20 kDa an, bevor das konjugierte Kapselmaterial eingesetzt werden konnte (Lees et al., 1996).
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Western-Blot-Analyse zur Überprüfung der Konjugation der Kapselpolysaccharide mit BSA (Kapitel 3)
Die Überprüfung der Konjugation erfolgte mittels Western-Blot. Es wurde ein großes 5%iges Acrylamidgel ohne Sammelgel gegossen. Jeweils 45 µl der Probe wurde mit 15 µl Probenpuffer gemischt und 30 min bei 100°C gekocht. Danach wurden 30 µl Probe in jede Vertiefung gegeben und bei 100 V für etwa 2 h durch Elektrophorese aufgetrennt. Das Blotten auf eine Nitrozellulosemembran (Schleicher & Schuell BioScience, Dassel, Deutschland) erfolgte für 70 min bei 15 V. Über Nacht wurde die Membran in 5% Magermilchpulver in TBST geblockt und am nächsten Tag dreimal in TBST gewaschen, bevor sie für einen Stunde mit dem Kaninchen-anti-BSA-Antikörper (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland), 1:1000 verdünnt in 1% Magermilchpulver, in TBST inkubiert wurde. Ein viermaliges Waschen der Membran für 10 min mit TBST schloss sich an. Danach erfolgte die Inkubation der Membran mit anti-Kaninchen-IgG-POD-Konjugat (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) in einer Konzentration von 1:15.000 in 1% Magermilchpulver in TBST bei Raumtemperatur, schwenkend. Es erfolgte erneut ein viermaliges Waschen für 10 min mit TBST, bevor die Membran schließlich mit einer Chemilumineszenzlösung (Luminol) (Thermo Scientific Super SignalR, Schwerte, Deutschland) für 4 min überschichtet wurde. Nach dem Trocknen mit Filterpapier erfolgte das Belichten eines Röntgenfilms (Biomax, Kodak, Sigma aldrich, München Deutschland) durch die Membran jeweils für 30 sec und 1 min.
Herstellung der Kapselkonjugatvakzine für die Immunisierung der Tiere (Kapitel 3)
Die Immunisierungsdosis pro Ferkel betrug bei der Grundimmunisierung 1 mg Kapselpolysaccharide von S.-suis-Serotyp-2-Stamm 10 (CPS-2), das zur Kon-jugation eingesetzt worden war. Die Mengenbestimmung der CPS-2 erfolgte direkt
Material und Methoden
nach der Dialyse und vor der Konjugation. Zu dem konjugierten CPS-2-Material in PBS wurden 2 ml Emulsigen (20% (v/v)) dazugegeben. Nach Zugabe des Emulsigens kam der Impfstoff für 24 Stunden bei 8°C auf den Rotator. Jedes Tier bekam 1 ml des Impfstoffes verabreicht. Für die zweite Immunisierung wurden 3 ml des konjugierten CPS-2 Materials (2 mg CPS-2/ml vor der Konjugation) zusammen mit 6,6 ml PBS und 2,4 ml Emulsigen für 24 Stunden bei 8°C durchmischt, bevor jedem Tier hiervon 1 ml verabreicht werden konnte. Die Immunisierungsdosis betrug hierbei 0,5 mg CPS-2, das zur Konjugation eingesetzt wurde für jedes Ferkel. Der Placebo setzte sich aus 75,4% (v/v) PBS, 20% (v/v) Emulsigen und 4,6% (v/v) BSA zusammen (Übersichtstabelle s. Anhang).
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Versuchstiere und Immunisierung (Kapitel 3)
Die Tiere wurden mit vier Wochen abgesetzt und am gleichen Tag in den Versuchsställen des Instituts für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover eingestallt. Die Aufteilung in zwei Gruppen erfolgte randomisiert. Am 6.
und 20. Tag nach dem Absetzen bekamen die Tiere aus jeder Gruppe 1 ml der Kapselkonjugatvakzine bzw. des Placebos intramuskulär injiziert. Dabei erhielt jedes Tier aus der Vakzinegruppe bei der ersten und zweiten Immunisierung konjugierte Kapselpolysaccharide vom Serotyp 2. Für die erste Immunisierung wurde 1 mg CPS-2- und für die zweite 0,5 mg CPS-2-Material zur Konjugation eingesetzt. Die Tiere aus der Kontrollgruppe erhielten zweimal einen Placebo bestehend aus 75,4% (v/v) PBS, 20% (v/v) Emulsigen und 4,6% (v/v) BSA. Die Tiere wurden zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung experimentell infiziert.
Herstellung der Infektionskultur (Kapitel 3)
Für die Infektion wurden jeweils 100 ml TSB (Tryptic Soy Broth) ohne Dextrose (Difco) mit 500 µl einer Übernachtkultur von S.-suis-Serotyp-2-Stamm 10 angeimpft und bei 37°C und 10% CO2 bis zu einer OD600 von 0,312 angezüchtet. Je 10 ml der Kultur wurden in 10 ml Plastikröhrchen (Greiner) gegeben und für 15 min bei 5.000 g zentrifugiert. Der Überstand konnte verworfen und das Sediment in 3 ml PBS resuspendiert werden. Jedem Tier wurden 1,8 ml dieser Bakteriensuspension intranasal appliziert (s. unten). Zur genauen Ermittlung der Infektionsdosis pro Tier
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wurde die Infektionskultur sequentiell mit PBS verdünnt. Die verschiedenen Verdünnungsstufen waren auf Columbia-Blutplatten zu plattieren. Das Ergebnis lag bei 37x106 KBE/60 µl. Dies entsprach einer Infektionsdosis von 1,11 x 109 KBE/Tier.
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Intranasale Infektion der Tiere mit S.-suis-Serotyp 2 (Kapitel 3)
Am Tag der intranasalen Infektion wurden die Tiere zweimal im Abstand von 4 Stunden in Narkose gelegt. Die vor der Infektion bei allen Tieren entnommenen Tonsillentupfer dienten zur Überprüfung der Tiere auf ihren S.-suis-Serotyp-2-Status.
In der ersten Narkose erfolgte die intranasale Applikation von 1%iger Essigsäure (3 ml pro Tier, 1,5 ml pro Nasenloch) mit einem Feinzerstäuber (Vaporator von Valois).
Das Anästhetikum, bestehend aus einer Kombination von 2 mg Azaperon/kg Körpergewicht (KGW) und 10 mg Ketamin/kg KGW, wurde intramuskulär am Ohrgrund appliziert. Während der zweiten Anästhesie erfolgte die Infektion der Tiere.
Die Dosis von 1,11x109 KBE S.-suis-Stamm 10/Tier wurde mit einem Feinzerstäuber (Vaporator von Valois) auf beide Nasenhöhlen gleichmäßig verteilt.
Der Gesundheitsstatus der Tiere wurde nach der Infektion alle 8 Stunden untersucht und in einem Protokoll vermerkt. Insbesondere an den klinischen Parametern, wie der Körpertemperatur, dem Verhalten, der Körperhaltung, der Futteraufnahme, eventuell vorhandener Lahmheit, der Kopfhaltung und dem Atemtyp, war der Gesundheitsstatus der Tiere zu beurteilen. Im Fall einer schweren Symptomatik, wie beispielsweise einem Körpertemperaturanstieg auf > 41°C in Verbindung mit Apathie und fehlender Futteraufnahme, sowie bei einer Polyarthritis- oder Meningitissymptomatik wurden die Tiere aus Gründen des Tierschutzes umgehend getötet. Dafür wurde das Tier wieder in Narkose gelegt (s. o.) und anschließend mit 45 mg Pentobarbital-Natrium/kg KGW (Release) euthanasiert. 19 Tage nach der experimentellen Infektion wurden alle bis dahin überlebenden Tiere euthanasiert und seziert.
Entnahme von Blutproben zur Serumgewinnung (Kapitel 3)
Im Verlauf des Versuches standen für jedes Versuchstier insgesamt vier Blutabnahmen an. Der Zeitpunkt der ersten Blutabnahme (Alter der Tiere durchschnittlich 33 Tage), bei dem das Präimmunserum gewonnen wurde, war auch
Material und Methoden
der Tag, an dem die Tiere die erste Immunisierung erhielten. Am Tag der zweiten Immunisierung erfolgte eine weitere Blutabnahme (Alter der Tiere: 47 Tage). Das Postimmunserum wurde den Tieren zwei Wochen nach der letzten Immunisierung, kurz vor der Infektion abgenommen. Die letzte Blutprobe wurde kurz vor der Euthanasie von jedem Tier abgenommen. Für die Blutentnahme mussten die Tiere in Rückenlage fixiert werden, so dass nach einem Überstrecken des Halses die Vena cava cranialis punktiert werden konnte. Die Einstichstelle lag dabei auf der rechten oder linken Seite dicht neben dem Manubrium sterni und kranial der ersten Rippe.
Mit einer Kanüle 1,2 x 100 mm und aufgesetztem Serum-Röhrchen (Sarstedt) wurde unmittelbar neben dem Manubrium sterni in leicht medianer Stichrichtung senkrecht eingestochen. Nach der Blutabnahme wurde das Blut in den Serumröhrchen für einige Stunden bei 8°C gekühlt, bevor es zur Serumgewinnung für 15 min bei 3.000 g zentrifugiert werden konnte.
B.26 Sektion nach Infektion mit S.-suis-Serotyp-2 Stamm 10 (Kapitel 3)
In der Sektion wurden alle Tiere systematisch auf pathologische Veränderungen untersucht, die mit der experimentellen S.-suis-Infektion in Zusammenhang stehen konnten. Die Untersuchung erfolgte dabei nach einem standardisierten Protokoll (Bennecke 2008), das eine makroskopische Beurteilung von Organen und eine Entnahme von mindestens 12 Organ- bzw. Gewebeproben für histopathologische und mikrobiologische Untersuchungen beinhaltet.
Als erstes wurde mittels Punktion Synovia für die bakteriologische Untersuchung aus den beiden Karpal- und Tarsalgelenken gewonnen und auch makroskopisch beurteilt. Standen noch andere Gelenke im Verdacht, an einer Lahmheit beteiligt zu sein, wurden diese auch punktiert. Die Entnahme von Liquor cerebrospinalis erfolgte über das Foramen atlanto-occipitale. Alle Punktionsstellen mussten im Vorfeld rasiert und mit 80% Ethanol desinfiziert werden. Die Eröffnung der Bauchhöhle erfolgte in der Linea alba. Hier wurde zuerst nur durch einen kleinen Schnitt von der ventralen Bauchwand eine Tupferprobe (Peritoneum) für die bakteriologische Untersuchung entnommen. Nach der vollständigen Eröffnung konnten dann die Bauchhöhle und deren Organe adspektorisch untersucht werden, bevor für die histopathologischen und bakteriologischen Untersuchungen Organproben (ca. 2 - 3 cm in der Länge/Breite/Höhe) von Leber, Milz und Peritoneum entnommen wurden. Nach der
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vorsichtigen Eröffnung des Thorax erfolgte auch hier die Entnahme einer Tupferprobe aus der Pleura- und der Perikardhöhle. Danach konnten die Brustorgane inklusive Zunge, Waldeyerschen Rachenring, Trachea und Ösophagus exzenteriert und adspektorisch und palpatorisch untersucht werden, außerdem konnte nach der Exzenteration des Herzens eine Tupferprobe der Valvula bicuspidalis genommen werden. Für die histopathologische und bakteriologische Untersuchung wurden ein Stück vom linken Lobus cranialis der Lunge, Pleura costalis aus dem vierten rechten Interkostalspalt, ein Stück des linken Herzventrikels mit Valvula bicuspidalis und die Tonsilla veli palatini entnommen. Ein Stück der Synovialmembran zusammen mit artikulärem Knorpel- und Kapselgewebe für die Histopathologie wurde von den Gelenken entnommen, die bereits für die bakteriologische Untersuchung punktiert worden waren. Im letzten Schritt konnte dann das Gehirn, nach dem Eröffnen des Schädeldaches und der Dura mater, exzenteriert werden. Vor dem vollständigen Eröffnen der Dura mater wurde noch eine Tupferprobe von der Großhirnoberfläche entnommen. Alle entnommenen Organproben wurden in etwa 300 ml 10%igem Formaldehyd fixiert und für die pathohistologische Untersuchung an das Institut für Pathologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover weitergeleitet. Hier wurden die pathohistologischen Untersuchungen freundlicherweise von Herrn Prof. Dr. Andreas Beinecke durchgeführt. Die Ergebnisse wurden dann, wie bei Baums et al. (2006) beschrieben mit einem Pathoscore bewertet (Tab. E2). Mittelgradige bis hochgradige, multifokale oder diffuse, fibrinös-eitrige Veränderungen am Gehirn wurden mit einem Score von 5, bei allen anderen Organen mit einem Score von 4 beurteilt. Im Fall einer geringgradigen, fokalen, fibrinös-eitrigen Meningitis oder Plexus chorioiditis wurde der Score 3 vergeben. Geringradige, fokale, fibrinös-eitrige Veränderungen aller Organe außer dem Gehirn resultierten in einem Score von 2 und minimale fibrinös–
eitrige Veränderungen erhielten einen Score von 1. Lymphoplasmazelluläre Infiltrationen und granulomatöse Entzündungen wurden in diesem Score nicht mit berücksichtigt. Der höchste Score der einzelnen Tiere wurde in der jeweiligen Gruppe addiert und durch die Tierzahl der Gruppe dividiert (ω = ΣScoremax/nTiere), um so einen Vergleich der beiden Gruppen zu ermöglichen.
Material und Methoden
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Bakteriologische Untersuchung der Organ- und Tupferproben (Kapitel 3)
Sofort nach der Sektion wurden von jedem Tier die entnommenen bakteriologischen Proben auf einer Columbia-Blutplatte in einem fraktionierten Ausstrich ausgestrichen.
Bei den Proben handelte es sich um die Gelenkpunktate, den Liquor cerebrospinalis, die Tupferproben von Peritoneum, Pleura, Gehirn und Valvula bicuspidalis, einem Ausstrich von Milz, Leber, Lunge und der Tonsille. Alle Organproben, außer der Lunge, wurden hierfür in 80%iges Ethanol getaucht und danach in der Bunsenbrennerflamme von außen sterilisiert, danach wurde das Organ durchschnitten und der Abdruck der Schnittfläche auf der Blutplatte fraktioniert ausgestrichen. Nach 24 Stunden wurden alle Blutplatten makroskopisch auf α-hämolysierende Streptokokken untersucht. Im Fall einer Mischkultur musste zur Subkultivierung ein fraktionierter Ausstrich der α-hämolysierende Streptokokken durchgeführt werden. Zeigte sich nach 24 h kein Wachstum auf einer Platte wurde diese erneut für 24 h bebrütet. Alle α-hämolysierenden Streptokokken wurden in einer S.-suis-Multiplex–PCR (Silva et al., 2006) genotypisch untersucht (s. unten).
Genotypische Differenzierung der putativen S.-suis-Reisolate (Kapitel 3)
Zur Genotypisierung der α-hämolysierenden Streptokokken musste zuvor die chromosomale DNA präpariert werden. Jeweils 10 ml THB-Medium wurden mit einem α-hämolysierenden Streptokokken Isolat angeimpft und über Nacht bei 37°C bebrütet. Am nächsten Tag wurde die Bakterien bei 5.000 g und 4°C abzentrifugiert und in 500 µl 50 mM Tris HCl; 1 mM EDTA; 100 mM NaCl-Puffer (TEN) mit 10 mg/ml Lysozym und 0,18 mg/ml RNAse resuspendiert und für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Nach der Zugabe von 15 µl 20%iger Natriumdodecylsulfat-Lösung (SDS) und 0,3 mg/ml Proteinase-K-Lösung erfolgte eine erneute Inkubation für eine Stunde bei 37°C. In jeden Ansatz wurden anschließend 125 µl 4 M NaCl und 80 µl von einer 10%igen CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid) Lösung zugegeben und für 10 Minuten bei 60°C inkubiert. Danach erfolgte die Extraktion der DNA durch die Zugabe von 780 µl Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis von 24:1) und anschließend die Zentrifugation bei 10.000 g für 10 Minuten. Der Überstand konnte
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abgenommen und in ein neues Reaktionsgefäß überführt werden. Zu dem Extrakt wurden 780 µl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol in einem Verhältnis von 25:24:1 gegeben. Nach erneuter Zentrifugation bei 10.000 g für 10 min konnte der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt werden. Ein Fällen der DNA wurde durch die Zugabe von 500 µl Isopropanol und anschließendem Mischen erreicht. Eine Zentrifugation bei 10.000 g für 30 min und 4°C schloss sich an. Der Überstand wurde verworfen und die DNA mit 500 µl 80%igem Ethanol mit einer Temperatur von -20°C bei 10.000 g für 30 min gewaschen. Nach dem Abnehmen des Überstandes konnte die DNA über Nacht trocknen und danach in 50 µl Wasser (Sigma Aldrich, München, Deutschland) aufgenommen werden.
B.29 Multiplex-PCR (Kapitel 3)
Von der aufgereinigten DNA wurde durch eine 1:50 Verdünnung eine Lösung mit einer DNA-Konzentration von ungefähr 50 ng/µl hergestellt. Für jeden Reaktionsansatz wurden in 0,2 ml PCR-Multiply-Pro-Gefäße (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) jeweils 35 µl Wasser (Sigma Aldrich), 5 µl der 1:50 DNA-Verdünnung und 10 µl Mastermix gegeben.
Der Mastermix setzte sich zusammen aus: 50 % (v/v) 10x PCR-Puffer (bestehend aus 200 mM TRIS-HCl pH = 8,4, 500 mM KCl), 15% (v/v) 50 µM MgCl2, 10% (v/v), 10 µM dNTP (dATP, dCTP, dGTP und dTTP), 10 % (v/v) Wasser (Sigma Aldrich, München, Deutschland), 10% (v/v) einer 25 µM Primer-Stammlösung mit folgenden Konzentrationen: mrpL/mrpR 31,3 nM, epf1BR/epfL 72,9 nMcpsJ1L/ cpsJ1R 104,1 nM, cpsJ2L/cpsJ2R 83,3 nM, cpsH7L/cpsH7R 62,5 nM, cpsH9L/cpsH9R 62,5 nM, slyL/slyR 20,8 nM, adiSnL/adiSnR 31,3 nM, gdhsuisL/gdhsuisR 31,3 nM und als letztes wurden noch 2 Units der Taq-DNA-Polymerase 5% (v/v) dazugegeben.
Danach durchliefen die Proben im Mastercycler der Firma Eppendorf noch folgendes Programm: initiale Denaturierung für 2 min bei 94°C, 36 Zyklen mit 1 min bei 94°C, 1 min bei 58°C und 1,30 min bei 72°C und noch eine finale Extension für 2 min bei 72°C. Zur Darstellung der Amplifikate wurden 15 µl der PCR-Produkte zusammen mit 3 µl von einem 6 x Blaupuffer (s. Anhang) auf ein 1,5%iges Agarosegel aufgetragen und in der Gelelektrophorese aufgetrennt. Als Größenstandard wurde eine 100 bp Leiter (Fermentas, Deutschland) mitgeführt. Schließlich wurde das Gel im Stick (INTAS, Göttingen, Deutschland) digital verarbeitet. Die Sequenzen der aufgeführten
Material und Methoden
Primer sowie weitere Angaben zu dieser Multiplex-PCR wurden bereits von (Silva et al., 2006) publiziert.
B.30 ELISA zur Detektion S.-suis-Serotyp 2 Kapselpolysaccharid spezifischer Antikörper (Kapitel 3)
Für den ELISA zur Detektion von S.-suis-Serotyp-2-Kapselpolysaccharid-spezifischen Antikörpern wurden die Mikrotitierplatten „Maxisorb Nunc-Immuno-Plates“ (Firma Nunc, Dänemark) eingesetzt, die zuvor mit gereinigten Serotyp 2 Kapselpolysacchariden beschichtet wurden. In jeder Vertiefung wurden dafür 5 µg Kapselpolysaccharide gelöst in 100 µl Carbonatpuffer (s. Anhang) pH 9,5 gegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Platten fünfmal mit TBST (Anhang) im BioTek ELx405-Washer gewaschen und anschließend geblockt.
Hierzu wurden in jede Vertiefung 200 µl 5%iges Milchpulver in 1x TBST gegeben und die Platte für 2 h bei 37°C schüttelnd inkubiert. Bevor die Platten im ELISA eingesetzt werden konnten, wurden sie fünfmal mit TBST gewaschen.
Auf einer ELISA-Mikrotiterplatte wurden von jedem Tier sowohl das Prä- als auch das Postimmunserum untersucht. Dabei wurden die Seren jeweils als Duplikate in vier Verdünnungsstufen aufgetragen. Die Postimmunseren wurden von 1:200 bis
Auf einer ELISA-Mikrotiterplatte wurden von jedem Tier sowohl das Prä- als auch das Postimmunserum untersucht. Dabei wurden die Seren jeweils als Duplikate in vier Verdünnungsstufen aufgetragen. Die Postimmunseren wurden von 1:200 bis