der Tierärztlichen Hochschule Hannover
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Konstruktion und Charakterisierung einer isogenen Actinobacillus pleuropneumoniae hlyX- Mutante
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Mohamed N’diaye
Kayes, Mali
Hannover 2005
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. G.-F. Gerlach
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. rer. nat. T. Leeb 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. G.-F. Gerlach Tag der mündlichen Prüfung: 26.05.2005
Gefördert durch ein Stipendium des Projekts “Programme d’Appui aux Services Agricoles et aux Organisations Paysannes (PASAOP)" des Institut D’Economie Rurale, Mali
meiner Familie
1 Einleitung ... 11
2 Literaturübersicht... 12
2.1 Actinobacillus pleuropneumoniae... 12
2.1.1 Bedeutung und Verbreitung ... 12
2.1.2 Taxonomie ... 13
2.1.3 Virulenzfaktoren ... 14
2.1.4 Immunität und Vakzination ... 19
2.2 Anaerobe Genregulation... 20
3 Material und Methoden... 23
3.1 Bakterienkulturen ... 23
3.1.1 Bakterien und Plasmide ... 23
3.1.2 Kultivierungsbedingungen ... 23
3.2 Ermittlung der Zelldichte... 23
3.3 Isolierung, Reinigung und Quantifizierung von DNA ... 24
3.3.1 Präparation chromosomaler DNA von A. pleuropneumoniae ... 24
3.3.2 Alkalilysis-Verfahren zur Präparation von Plasmid DNA... 27
3.3.3 DNA-Aufreinigung mit “Nucleospin-Extract” (Macherey-NAGEL GmbH&CO. Düren Deutschland)... 27
3.3.4 Aufreinigung mit dem „ GENE Clean“-KIT ... 28
3.3.5 Bestimmung der DNA-Konzentration ... 28
3.3.6 Anaerobe Anzucht zum Vergleich verschiedener Stämme und Bestimmung des Trocknengewichts der Pellet ... 28
3.4 Plasmidkonstruktion ... 29
3.4.1 PCR 2.1-TOPO-Cloning ... 29
3.4.2 Restriktionsenzymverdau... 30
3.4.3 Auffüllen von Enden mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase... 30
3.4.4 Agarosegelelektrophorese... 30
3.4.5 Ligation ... 31
3.5 Transformation ... 31
3.5.1 Herstellen von chemisch kompetenten Zellen ... 31
Plasmiden ... 32
3.5.3 Elektrotransformation von Actinobacillus pleuropneumoniae... 33
3.6 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ... 34
3.7 Konjugation von E. coli und A. pleuropneumoniae... 35
3.8 Saccharose-Gegenselektion ... 36
3.9 Southern Hybridisierung... 36
3.9.1 Southern Blot ... 36
3.9.2 Herstellen einer Gensonde nach der „Random-Priming“ Methode ... 38
3.10 Pulsfeld-Gel-Elektrophorese (PFGE) ... 38
3.11 Sequenzierung... 40
3.12 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS) –Page ... 40
3.13 Western Blot ... 41
3.14 Aspartase Test... 42
3.15 Tierversuch ... 42
3.15.1 Versuchstiere... 42
3.15.2 Herstellen der Bakteriensuspension für die Aerosolbelastung ... 43
3.15.3 Aerosolkammer und Infektion ... 43
3.15.4 Überwachung und Erhebung klinischer Parameter... 43
3.15.5 Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit (BALF)... 44
3.15.6 Bakteriologischer Erregernachweis aus BALF... 44
3.15.7 Sektion ... 44
3.15.8 Bakteriologische Organuntersuchung ... 45
3.15.9 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay ) ... 45
3.15.10 Statistik... 46
4 Ergebnisse ... 47
4.1 Konstruktion und Charakterisierung der A. pleuropneumoniae hlyX Deletionsmutante ... 47
4.1.1 Konstruktion des Plasmids pHLYX701 für die Konjugation ... 47
4.1.2 Konstruktion der isogenen A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante... 49
4.1.3 Analyse der isogenen A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante... 49
4.2 Überprüfung von A. pleuropneumoniae ∆hlyX in der experimentellen Aerosolinfektion... 54
5 Diskussion ... 58
6 Zusammenfassung... 62
7 Summary ... 63
8 Literaturverzeichnis... 64
9 Anhang ... 74
9.1 Material und Geräte ... 74
9.2 Zusammensetzung von Medien, Medienzusätzen und Puffer ... 75
9.3 Lösungen und Puffer... 77
9.3.1 Plasmidpräparation... 77
9.3.2 Präparation von chromosomaler DNA von Bakterien (A. pleuropneumoniae)... 78
9.4 Restriktionsverdau ... 79
9.5 Gel-Elektrophorese ... 79
9.6 Transformation ... 80
9.7 Konjugation ... 80
9.8 DNA-Transfer (Southern Blot)... 80
9.9 Herstellen einer Gensonde nach der „Random-Priming“ Methode... 81
9.10 Southern-Hybridisierung ... 81
9.11 SDS-Page ( Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel)... 82
9.12 Western Blot ... 82
9.13 Aspartase-Essay... 83
9.14 Pulsfeldgelelektrophorese... 83
9.15 Enzyme ... 84
9.16 Chemikalien... 85
9.17 Nukleotid- und Aminosäuresequenz des hlyX Gens von A. pleuropneumoniae... 87
8.14. Rohdaten ... 93
9.18 Index der Abbildungen ... 94
9.19 Index der Tabellen ... 95
A. bidest. Aqua bidestillata (zweifach destilliertes Wasser) A. pleuropneumoniae Actinobacillus pleuropneumoniae
ATCC “American Type Culture Collection”
BALF bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit
BCIP 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat p-Toluidin
BSA bovines Serumalbumin
Bp Basenpaare
DAPI Diaminopimelinsäure
CAMP Christie, Atkins, Munch-Petersen
cDNA Komplementäre DNA
dATP Deoxyadenosintriphosphat
dCTP Deoxycytidintriphosphat
dGTP Deoxyguanosintriphosphat
dTTP Desoxythymidintriphosphat
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
DNase Desoxyribonuklease
dNTP Desoxynukleotidtriphosphat
E. coli Escherichia coli
et al. et alii
EDTA Ethylendiamin-Tetraessigsäure
EIVX Ersatz-IsoVitalex
ELISA engl. enzyme-linked immunosorbent assay (Enzymgekoppelter Immunabsorptionstest)
KBE Koloniebildende Einheiten
kbp Kilobasenpaare
IgG Immunglobulin G
LB Luria- Bertani
Lsg. Lösung
min Minute
M Molar
NaCl Natriumchlorid (Kochsalz)
NEB New England Biolabs
OD Optische Dichte
OLB Oligo Labeling Buffer
PBS Phosphate Buffered Saline
PCR Polymerase chain reaction
PFGE Pulsfeldgel-Elektrophorese
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
PPLO “Pleuropneumoniae Like Organism”
RFLP Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus
RNA Ribonukleinsäure
RNase Ribonuklease
rpm rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)
RT-PCR Reverse-Transkriptase-PCR
SDS Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-
Elektrophorese
Sek Sekunde
Stammlsg. Stammlösung
SSC Sodium chloride Sodium citrate
TbpA Transferrin bindendes Protein A
TAE Tris Acetat EDTA
TBE Tris Borat EDTA
TE Tris EDTA
Tris Tris-(Hydroxymethyl)-Aminomethan
U Unit
UV Ultraviolet
vol Volumen
v/v Volumen pro Volumen
w/v Gewicht pro Volumen
1 Einleitung
Actinobacillus (A.) pleuropneumoniae ist der Erreger der wirtschaftlich bedeutsamen Pleuropneumonie der Schweine, die mit zunehmender Intensivierung der Schweinehaltung an Bedeutung gewonnen hat. Die Erkrankung verursacht infolge der hohen Mortalität und der verminderten Gewichtzunahme chronisch kranker Tiere große wirtschaftliche Verluste. Die Erkrankung verläuft perakut bis chronisch. Beim perakuten Verlauf stehen Apathie, Erbrechen und plötzliche Todesfälle im Vordergrund. Hohes Fieber und ausgeprägte respiratorische Störungen dominieren das klinische Bild in der akuten Phase. Die Ansteckung erfolgt über Aerosole, wobei insbesondere chronisch infizierte Tiere Erregerreservoir und Überträger sind.
Das Überstehen einer natürlichen Infektion hinterlässt einen serotypübergreifenden Schutz vor Reinfektion, der Erreger persistiert jedoch über Monate hinweg in den Lungenveränderungen, den Tonsillen und auf der Schleimhaut der Bronchien. Die Anwendung der herkömmlichen serotypspezifischen Vakzinen reduziert die Morbidität und die Mortalität, verhindert aber nicht die Kolonisierung der Lunge durch den Erreger. Der Erreger überlebt trotz der verminderten Sauerstoffversorgung in nekrotischem Lungengewebe. Diese Persistenz der Erreger in Geweben mit reduzierter Sauerstoffspannung führte zu der Hypothese, dass die Fähigkeit des Erregers in anaeroben Sequestern zu überleben, Virulenz und Erregerpersistenz beeinflusst.
Vorangegangene Arbeiten zeigten, dass Enzyme des anaeroben Stoffwechsels, z.B. eine anaerobe Dimethylsulfoxidreduktase sowie eine Aspartase nach Zugabe von bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit zum Kulturmedium vom Erreger vermehrt exprimiert werden. Beide Enzyme werden vermutlich unter anaeroben Bedingungen durch das HlyX- Protein reguliert. Das HlyX-Protein ist A. pleuropneumoniae-Homolog zu FNR („fumarate and nitrate reduction“), einem globaler anaeroben Regulator von Escherichia (E.) coli. Da eine Deletion der Dimethylsulfoxidreduktase- und Aspartase-kodierenden Gene zu einer deutlichen Attenuierung von A. pleuropneumoniae führte, soll in der vorliegenden Arbeit untersucht werden, welchen Einfluss die HlyX-vermittelte Genregulation auf die Überlebensfähigkeit des Erregers unter Bedingungen mit verminderter Sauerstoffspannung und auf die Virulenz hat.
2 Literaturübersicht
2.1 Actinobacillus pleuropneumoniae 2.1.1 Bedeutung und Verbreitung
Actinobacillus pleuropneumoniae ist ein obligat pathogener Erreger des Respirationstraktes von Schweinen (TAYLOR 1999). Er wurde 1957 in Großbritannien als Verursacher der kontagiösen Pleuropneumonie beim Schwein identifiziert (PATTISON et al. 1957). Der Erreger ist streng wirtsspezifisch und kann aus Nasenhöhlen, Tonsillen und Lungen infizierter Tiere isoliert werden (DOM et al. 1994). Der Erreger überlebt nicht lange in der Umwelt (FENWICK u. HENRY 1994; TAYLOR 1999). Die Übertragung erfolgt per Aerosol oder mittels Tröpfchen bei direktem Kontakt (JENSEN et al. 1999; LECHTENBERG et al. 1994).
Die indirekte Übertragung durch unbelebte oder belebte Vektoren spielt in der Verbreitung der Erkrankung eine geringere Rolle (FENWICK u. HENRY 1994). Zwei Biotypen wurden beschrieben, wobei der Biotyp I auf Nikotinamid-Adenindinukleotid (NAD; V-Faktor) angewiesen ist (TAYLOR 1999). Fünfzehn Serotypen werden aufgrund der unterschiedlichen Polysaccharidantigene dem Biotyp I zugeordnet (BLACKALL et al. 2002; MACLEAN et al.
2004). In Deutschland treten vor allem die Serotypen 2, 3, 7 und 9 auf (BUNKA et al. 1990).
Actinobacillus pleuropneumoniae-Erkrankungen wurden bisher in allen europäischen Ländern, den USA, Kanada, Mexiko, Japan Taiwan und Australien registriert (NICOLET 1992).
Die Actinobacillus-Pleuropneumonie ist eine hämorrhagisch-nekrotisierende Pleuro- pneumonie mit adhäsiver Pleuritis (SEBUNYA u. SAUNDERS 1983). Die Erkrankung verläuft perakut bis chronisch; alle Altersgruppen können betroffen werden. Die Heftigkeit des Verlaufs hängt vom infizierenden Serotyp, vom Immunstatus des Wirtstieres und von der Erregerzahl ab (ROGERS et al. 1990). Beim perakuten Verlauf stehen Apathie, Erbrechen und plötzliche Todesfälle im Vordergrund. Hohes Fieber und ausgeprägte respiratorische Störungen dominieren das klinische Bild in der akuten Phase. Bei einem typischen Actinobacillus.pleuropneumoniae-Ausbruch kann die Morbidität bei über 50% liegen, wobei die Mortalität von 1 bis 10% schwankt (FENWICK u. HENRY 1994). Chronisch infizierte Tiere zeigen ein vermindertes Wachstum und geringere Gewichtszunahmen. Bei adäquaten Management- und Umweltfaktoren in Abwesenheit anderer Erkrankungen ist die Wahrscheinlichkeit des Auftretens einer A. pleuropneumoniae-Erkrankung reduziert
(FENWICK u. HENRY 1994). Das Überstehen einer natürlichen Infektion hinterlässt einen soliden Schutz wobei der Erreger jedoch in den Lungenveränderungen, den Tonsillen und auf der Schleimhaut der Bronchien persistiert und weiterhin ausgeschieden wird (FENWICK u.
HENRY 1994). Diese rekonvaleszenten wie auch chronisch und latent infizierte Tiere spielen epidemiologisch eine große Rolle bei der Verbreitung des Erregers in bisher Actinobacillus. pleuropneumoniae-freie Bestände (FENWICK u. HENRY 1994).
2.1.2 Taxonomie
Actinobacillus pleuropneumoniae ist ein gram-negatives, fakultativ anaerobes Stäbchen aus der Familie der Pasteurellaceae (MANNHEIM 1994). Zwei Biotypen werden beschrieben.
Isolate des Biotyps I sind auf NAD (V-Faktor) angewiesen (NIVEN u. LÉVESQUE 1988).
Isolate des Biotyps II können in Anwesenheit von spezifischen Pyridinnucleotiden NAD synthetisieren (NIVEN u. LÉVESQUE 1988). Zwei Serotypen (2 und 9) sind bei Biotyp II bekannt (NIELSEN 1988). Serotype 13 und 14 wurden später zu Biotyp II zugeordnet (NIELSEN et al. 1997). Der Serotyp 15 wurde bei Biotyp I beschrieben (BLACKALL et al.
2002); Die Serotypenunterteilung beruht auf Kapselpolysacchariden und auf zellulären Lipopolysacchariden (BLACKALL et al. 2002; MACLEAN et al. 2004; NICOLET 1992).
Die Serotypen 1 und 5 wurden jeweils aufgrund von Unterschieden in der Polysaccharidstruktur in die Subtypen 1a, 1b, 5a und 5b unterteilt (JOLIE et al. 1994).
Weiterhin kommen zwischen verschiedenen Serotypen Kreuzreaktivitäten vor (EUZÉBY 1998; JOLIE et al. 1994). Alle Serotypen sind hämolytisch, zeigen ein positives Christie- Atkins-Munch-Petersen (CAMP)-Phänomen mit Staphylococcus aureus (EUZÉBY 1998;
TAYLOR 1999) und sind in der Lage, eine Pleuropneumonie hervorzurufen; dabei unterscheiden sich die einzelnen Serotypen in ihrer Virulenz (FREY 1995; ROSENDAL et al.
1981). Die Virulenzunterschiede der Serotypen sind unter anderem auf die Produktion von verschiedenen Kombinationen von APX-Toxinen zurückzuführen (FREY 1995). Die Oberflächen-Polysaccharide tragen ebenfalls hierzu bei (ROSENDAL u. MACINNES 1990).
Isolate der Spezies A. pleuropneumoniae können anhand biochemischer Eigenschaften von anderen Actinobacillus-Spezies unterschieden werden (EUZÉBY 1998). So ist die Spezies Actinobacillus.pleuropneumoniae durch eine starke Ureaseaktivität sowie durch das Vermögen, Nitrat, Nitrit, Glucose, Saccharose, Mannit und Xylose abzubauen, charakterisiert.
Reaktionen mit Indol und Katalase sind negativ (EUZÉBY 1998). Isolate des Biotyps I sind
H2S positiv, Isolate des Biotyps II sind H2S und Laktose negativ sowie Galaktose positiv (EUZÉBY 1998).
2.1.3 Virulenzfaktoren 2.1.3.1 Kapsel
Die Kapsel von A. pleuropneumoniae besteht meist aus nur einem Polysaccharidbaustein und bildet eine Hülle um die Bakterienzelle. Die meisten Kapselpolysaccharide sind stark hydrophil und haben eine negative Oberflächenladung, die zur Verhinderung der Aufnahme der Bakterien durch die ebenso geladenen Phagozyten führt (HACKER u. HEESEMANN 2000). Die Kapsel verhindert die Auflagerung des Komplementfaktors C3b auf die Bakterienoberfläche somit wird einerseits die Komplement-vermittelte Lyse durch den terminalen membranan-greifenden Komplex (MAC) verhindert, anderseits die Opsonierung durch Komplement und Antikörper mit anschließender Phagocytose umgangen (HACKER u.
HEESEMANN 2000). Somit schützt die Kapsel A. pleuropneumoniae vor bakteriziden Serumbestandteilen und verhindert die frühzeitige Eliminierung des Erregers (FENWICK u.
HENRY 1994; INZANA et al. 1988). Sie spielt weiterhin eine Rolle in der Virulenz (JACQUES et al. 1988). So soll die Variation in der Virulenz der einzelnen Serotypen zum Teil auf Unterschieden in der Kapselstruktur beruhen (JACQUES et al. 1988). Es wurde gezeigt, dass A. pleuropneumoniae Stämme mit dickeren Kapseln virulenter sind als die mit dünneren Kapseln (JENSEN u. BERTRAM 1986; ROSENDAL u. MACINNES 1990).
2.1.3.2 RTX-Toxine
RTX-Toxine sind porenformende, zytolytische Proteine, die bei vielen pathogenen gram- negativen Bakterien vorkommen (FREY 1995). Sie besitzen die Fähigkeit, Erythrozyten und kernhaltige Zellen zu lysieren (JANSEN et al. 1995; THOMPSON et al. 1993). Die von Actinobacillus.pleuropneumoniae gebildeten RTX- Toxine werden als Apx-Toxine bezeichnet.
Das ApxI-Toxin wird von den Serotypen 1, 5a, 5b, 9, 10 und 11 produziert. Das ApxII-Toxin wird von allen Serotypen außer Serotyp 10 produziert. Das ApxIII-Toxin wird von den Serotypen 2, 3, 4, 6 und 8 produziert (FREY et al. 1993b; SCHALLER et al. 1999). Das ApxIV-Toxin wird von allen Serotypen produziert (BOSSE et al. 2002; SCHALLER et al.
1999).
Tabelle 1.: Apx-Toxin Produktion der verschiedenen A. pleuropneumoniae Serotypen (BOSSE et al. 2002)
Operon Aktivität Aktivator Struktur Export hämolytisch zytotoxisch
MW
(kDa) Serotypen ApxI ApxI C ApxI A ApxIBD stark stark 105-110 1, 5a,5b, 9,
10, 11 ApxII ApxII C ApxII A Nein schwach mild 103-105 alle außer
10 ApxIII ApxII C ApxIII ApxIIIBD kein stark 120 2, 3, 4, 6, 8 ApxIV ORF 1?C ApxIVa Kein schwach unbestimmt 200 alle Das ApxI-Toxin ist stark hämolytisch, das ApxII-Toxin zeigt eine langsamere hämolytische Aktivität. Beide Toxine sind auch zytotoxisch (FREY et al. 1993a; PRIDEAUX et al. 1999).
Das ApxIII-Toxin ist nicht hämolytisch aber stark zytotoxisch (KAMP et al. 1991; MAIER et al. 1996; RYCROFT et al. 1991a). Das ApxI-Toxin zeigt die höchste porenbildende Aktivität, gefolgt von dem nicht hämolytisch aber stark zytotoxisch wirkenden ApxIII- und dem ApxII- Toxin (MAIER et al. 1996). Das ApxIV-Toxin ist schwach hämolytisch (BOSSE et al. 2002;
SCHALLER et al. 1999). Die Apx -Toxine sind verantwortlich für die charakteristischen hämorrhagischen Läsionen der A. pleuropneumoniae-Erkrankung (FREY et al. 1993b). Sie sind für die Virulenz von A. pleuropneumoniae sowie für die Pathogenese von großer Bedeutung (FREY 1995; FREY u. NICOLET 1988). Unterschiede in der Virulenz der Actino- bacillus. pleuropneumoniae Serotypen sind zum Teil auf die verschiedenen Kombinationen von Apx-Toxinen zurückzuführen, wobei die virulentesten Serotypen ApxI und ApxII produzieren (FREY 1995). Serotypen, die zusätzlich zum ApxIV-Toxin noch zwei andere Apx-Toxine bilden, sind stärker virulent als jene, welche nur ein zusätzliches Apx-Toxin sezernieren (FREY u. NICOLET 1988; KAMP et al. 1991). Die ApxI- und ApxII-Toxine induzieren einen oxidativen “burst“ der neutrophilen Granulozyten (JANSEN et al. 1995).
Eine spontan aufgetretene Serotyp 7 Mutante von A. pleuropneumoniae ohne die Fähigkeit ApxII zu sezernieren, ist apathogen für Schweine (ANDERSON et al. 1991). Eine chemisch induzierte A. pleuropneumoniae Serotyp 2 Mutante, die nur ApxIII sezeniert, ist weniger virulent als der Wildtyp (RYCROFT et al. 1991b; TONPITAK et al. 2002).
Für die Produktion und Sekretion von Apx-Toxinen im Allgemeinen wird die Aktivität von vier Genen (apxC, apxA, apxB und apxD) benötigt (ISSARTEL et al. 1991). Die für die Synthese von ApxI- und ApxII-Toxin verantwortlichen Gene sind in Operons kodiert, die aus vier durchgängigen Genen (apxCABD) bestehen und von einem am 5’-Ende vor dem apxC-
Gen gelegenen Promotor kontrolliert werden. Das ApxII-Operon enthält nur die apxA- und apxC-Gene; für den Membrantransport sind die apxBD Gene des apxI- oder apxIII-Operons erforderlich.
Die Apx-Toxine sind für die Induktion einer protektiven Immunität von Bedeutung (DEVENISH et al. 1990). Rekonvaleszente Schweine sind nach einer Infektion mit Actinobacillus. pleuropneumoniae gegen die Infektion mit einem homologen Serotyp geschützt, ebenso, jedoch weniger effektiv, gegen Infektionen mit heterologen Actinobacillus. pleuropneumoniae-Serotypen (CRUIJSEN et al. 1995). Nicht hämolysierende Mutanten können diese kreuzprotektive Immunität nicht induzieren (INZANA et al. 1988).
2.1.3.3 Äußere Membranproteine (OMP)
Zahlreiche äußere Membranproteine wurden identifiziert und einige davon sind stamm- oder serotypspezifisch (FENWICK u. HENRY 1994). Manche dieser Proteine sind nur unter bestimmten spezifischen Wachstumsbedingungen exprimiert, so dass sie nicht in den gebräuchlichen Vakzinen enthalten sind (FENWICK u. HENRY 1994). Zwei eisenregulierte Membranproteine (TbpA und TbpB) wurden identifiziert (NIVEN u. LÉVESQUE 1988), die eine wesentliche Rolle bei der Verwertung von Transferrin-gebundenem Eisen und beim Vermitteln einer protektiven Immunität spielen (GERLACH et al. 1992; GONZALEZ et al.
1990; RAPP u. ROSS 1986; WILKE et al. 1997) haben verschiedene äußere Membranproteine (OMPs) zwischen 45 und 67 kDa, und über 94 kDa nachgewiesen. Diese Proteine wurden im Western Blot von Rekonvaleszentenseren erkannt. Ein weiteres OMP von 40 kDa, OmlA („outer membrane lipoprotein A“) genannt, wurde von GERLACH et al.
(GERLACH et al. 1993) für Serotyp 1, später für Serotyp 5 beschrieben (BUNKA et al.
1995).
Die OMPs können auch zur Typisierung benutzt werden (RAPP u. ROSS 1986). So lassen sich innerhalb der Referenzstämme für die Serotypen 1 bis 9 sieben verschiedene Proteinmuster der äußeren Membran unterscheiden (RAPP u. ROSS 1986). Dabei weisen die Stämme eines Serotyps ähnliche oder identische OMP-Muster auf. Diese OMPs erwiesen sich weiterhin als immunogen (RAPP u. ROSS 1986). Bei den Serotypen 1 bis 8 wurden drei immunologisch dominierende äußere Membranproteine von 17, 32, und 42 kDa nachgewiesen (MACINNES u. ROSENDAL 1987). Ein OMP von 42 kDa wurde bei einigen Serotypen nachgewiesen und wird auch in vivo exprimiert (DENEER u. POTTER 1989).
2.1.3.4 Adhäsine
Infektiöse Prozesse beginnen in der Regel mit der Kolonisierung von Wirtsgeweben und Zellverbänden durch pathogene Mikroorganismen. Bei dieser Kolonisierung kommt es zu einer Haftung der Erreger an spezifische Wirtsrezeptoren, die durch Adhäsine vermittelt werden (HACKER u. HEESEMANN 2000). Bei dieser Besiedlung sind Gewebespezifität und Wirtsspezifität sehr entscheidend (MADIGAN et al. 2003). Adhäsine werden von allen pathogenen Erregern produziert und stellen Proteine dar, die spezifisch mit Kohlenhydratrezeptoren von Wirtszellen interagieren (HACKER u. HEESEMANN 2000;
SAUER et al. 2000).
Nach HACKER 2000 sind folgende Adhärenzfaktoren zu unterscheiden:
- Fimbrienadhäsine (Pili) sind ungefähr 2 µm lange und 2-8 nm dicke filamentöse Strukture aus ca. 1000 Proteinuntereinheiten. Fimbrienadhäsine werden oft von großen Genclustern kodiert, die auf Plasmiden oder auf dem Chromosom lokalisiert sein können.
- Fibrillen. Es sind Zellwandanhänge mit dünnerer und feinerer Struktur als bei den Fimbrien.
- Nicht-Fimbrienadhäsine (NFA) oder „A-Fimbrienadhäsine“ (AFA). Es sind adhäsive Proteine, die als integrale Membranproteine oder Proteine, die der bakteriellen Membran aufgelagert sind, vorkommen.
- Mikrobielle Saccharide: Lipopolysaccharide (LPSs) oder Lipooligosaccharide (LOSs) können mit Rezeptoren interagieren.
- Lipoteichonsäure (LTAs); Sie spielen eine Rolle bei der Adhärenz von Streptokokken an Wirtszellen.
Fimbrien exprimierende Stämme von E. coli sind viel häufiger Ursache von Harnwegsinfektionen als Stämme ohne Fimbrien. Enteropathogene E. coli Stämme besitzen spezifische Oberflächenstrukturen (Kolonisierungsfaktorantigene [CFA]), die die Kolonisierung des Dünndarmes ermöglichen und zu Diarrhoe führen (MADIGAN et al.
2003).
Versuche haben gezeigt, dass A. pleuropneumoniae besser den unteren Teil des Respirationstrakts (Bronchen und Alveolen) als den oberen Teil besiedeln kann (DOM et al.
1994). Die Ausbildung von Fimbrien durch Isolate von A. pleuropneumoniae zeigte keine lokalisationsbedingten Unterschiede zwischen der Lunge, den Nasenhöhlen und den
Tonsillen. Die Fimbrien scheinen die gleiche Bedeutung an diesen verschiedenen Stellen zu haben (BOSSE u. MACINNES 2000).
2.1.3.5 Lipopolysaccharide
Lipopolysaccharide (LPS) sind Bestandteile der äußeren Membran gramnegativer Bakterien und bestehen aus dem O-Antigen, dem „core“-Zucker (HACKER u. HEESEMANN 2000) und dem Lipid A (BAARSCH et al. 1995) und besitzen immunogene Eigenschaften (HACKER u. HEESEMANN 2000). Die als O-Antigen-Einheiten bezeichneten Module aus drei bis sechs Zuckern können ein- bis 40-fach wiederholt vorkommen und bestimmen damit die Länge des LPS-Moleküls. (HACKER u. HEESEMANN 2000). Der starke Polymorphismus des O-Antigens innerhalb einer bakteriellen Spezies führt zur Bildung verschiedener Serotypen; Bakterienmutanten mit verkürztem O-Antigen besitzen eine verminderte Virulenz im Infektionsmodell (HACKER u. HEESEMANN 2000). So haben virulente A. pleuropneumoniae Serotyp 5 Isolate 10 mg LPS mehr pro g Erregertrockenmasse als die avirulenten Isolate vom gleichen Serotyp (JENSEN u. BERTRAM 1986).
Untersuchungen an Teilen von LPS haben gezeigt, dass die Lipidfraktion für die Toxizität verantwortlich ist, während der Polysaccharidanteil die Wasserlöslichkeit und die Immunogenität des Komplexes bedingt (MADIGAN et al. 2003). Lipid A ist auch an der Bindung von Hämoglobin an die LPS-Oberfläche beteiligt und trägt damit zur Eisenversorgung von Actinobacillus. pleuropneumoniae bei (BELANGER et al. 1995). Die Freisetzung von LPS aus lysierten Bakterien bei Infektionen mit gramnegativen Erregern stimuliert eine übermäßige Auschüttung von Zytokinen, die zum septischen Schock führen kann (HACKER u. HEESEMANN 2000).
LPS spielt auch eine Rolle bei der Adhärenz von A. pleuropneumoniae an Schweinetrachealringen (BELANGER et al. 1990). Dabei hängt die Stärke der Adhärenz von der Struktur der Lipopolysaccharide ab. Die A. pleuropneumoniae-Serotypen 2, 4 und 7 mit glatter LPS heften stärker an Wirtszellen an als Serotyp 1 mit LPS mit semi-rauhen Kulturen oder die Serotypen 3 und 6 mit mit rauhen Kulturen (EUZÉBY 1998). Actinobacillus pleuropneumoniae-Stämme mit glatter Koloniemorphologie zeigten auch eine stärke Anheftung an Trachealringe (BELANGER et al. 1990). Zwei Mutanten von Actinobacillus. pleuropneumoniae-Serotyp 1 mit strukturellen LPS-Anomalien zeigten eine verminderte Adhärenz und abgeschwächte Virulenz (EUZÉBY 1998).
2.1.3.6 Urease
Die Urease wird von mehreren pathogenen und apathogenen Bakterien gebildet. Sie spaltet durch Hydrolysierung Harnstoff, was zu einer Alkalisierung des Milieus und damit zu einer Verbesserung der Wachstumbedingungen für die Mikroorganismen in Habitaten wie Harnwegen (Staphylococcus saprophyticus) oder Magen (Helicobacter pylori) führt (HACKER u. HEESEMANN 2000).
Actinobacillus pleuropneumoniae-Feldisolate sind in der Regel stark ureasepositiv (BLANCHARD et al. 1993). Urease ist nicht notwendig für die Entstehung einer Actinobacluus.pleuropneumoniae-Infektion (TASCON CABRERO et al. 1997). Dieses wurde durch die Isolierung eines ureasenegativen A. pleuropneumoniae Wildtypstamms bei einem akuten Infektionsgeschehen mit A. pleuropneumoniae bewiesen (BLANCHARD et al. 1993).
Die genaue Rolle der Urease in chronischen A. pleuropneumoniae Infektionen ist nicht vollständig geklärt. Allerdings konnte die ureasenegative isogene Mutante Actinobacillus. pleuropneumoniae ∆ureC 21 Tage nach der Belastung in intaktem Lungengeweben nicht mehr nachgewiesen werden, was auf eine Bedeutung bei der Besiedlung intakten Epithels hinweist (BALTES et al. 2001). Ureasenegative Actinobacillus. pleuropneumoniae konnte keine Infektion bei einer geringeren Belastungsdosis hervorrufen (BOSSE u. MACINNES 2000). GATERMANN et al.
(GATERMANN et al. 1989) zeigten, dass ureasepositive Organismen im experimentellen Tiermodell besser als die isogene ureasenegative Mutante kolonisieren und überleben.
2.1.4 Immunität und Vakzination
Natürliche Infektionen mit A. pleuropneumoniae führen zur Bildung von Antikörpern, die als maternale Antikörper auch saugende Ferkel mehrere Wochen über das Kolostrum weitgehend schützen (BOSSE et al. 1992; HAESEBROUCK et al. 1997). Es handelt sich in erster Linie um gegen Apx-Toxine gerichtete, neutralisierende Antikörper (CRUIJSEN et al. 1995). Die durch die Infektion erworbene Immunität schützt zuverlässig vor einer erneuten Infektion durch einen homologen Serotyp, aber nicht unbedingt gegen eine Infektion mit einem heterologen Serotyp (CRUIJSEN et al. 1995; FENWICK u. HENRY 1994). Tiere, die eine Actinobacillus pleuropneumoniae-Infektion überstanden haben, beherbergen weiterhin Actinobacillus. pleuropneumoniae im nekrotischen Gewebe (Sequester) in den Lungen und
sind ernstzunehmende Infektionsquellen für einen erneuten Ausbruch der Krankheit (EUZÉBY 1998; FENWICK u. HENRY 1994; RIOUX et al. 1997).
Durch die herkömmlichen Serotyp-spezifischen Vakzinen können die Morbidität, die Mortalität und das Ausmaß der Lungenveränderungen reduziert werden, aber die Besiedlung der Lungengewebe durch den Erreger wird nicht verhindert (FENWICK u. HENRY 1994).
Weiterhin führt die Immunisierung mit einem Inaktivatimpfstoff aus einem Serotyp nicht zu einer protektiven Immunität gegen heterologe Serotypen (JOLIE et al. 1992). Eine orale Immunisierung mit inaktiviertem und lebendem bzw. attenuiertem A. pleuropneumoniae Serotyp 9 führte zu einer Reduzierung der Morbidität nach Belastung mit dem homologen Serotyp (HENSEL et al. 1995). Eine Immunisierung per Aerosol mit einer Actinobacillus pleuropneumoniae Serotyp 2 Inaktivatvakzine führt zu einer starken, IgA-geprägten Immunantwort in bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BALF), in Nasalflüssigkeit und im Serum, die geimpfte Tiere nach Belastung mit homologen Serotypen gegen eine schwerwiegende Pleuropneumonie schützt (LOFTAGER et al. 1993).Tiere, die mit einer lebenden bzw. attenuierten A. pleuropneumoniae Vakzine immunisiert wurden, zeigten höhere Antikörpertiter (IgA, IgM und IgG) als Tiere, die mit Inaktivatvakzinen immunisiert wurden (HENSEL et al. 1995). Mit lebendem, nicht bekapselten A. pleuropneumoniae Serotyp 1 oder Serotyp 5 Impfung waren die Tiere vor klinischer Erkrankung nach Belastung mit homologen oder heterologen Serotypen geschützt, während Tiere in den Kontrollgruppen starben (INZANA et al. 1993). Eine aerosole Immunisierung mit A. pleuropneumoniae ureC und apxIIA Doppelmutante schützt vor Lungenkolonisierung.und die Doppelmutante war attenuiert (TONPITAK et al. 2002). Immunisierte Schweine mit rekombinantem OmlA- Protein von A. pleuropneumoniae Serotyp 1 immunisierte Schweine zeigten nach Belastung mit dem homologen Serotyp signifikant niedrigere Mortalität, mildere klinische Symptome sowie geringer ausgeprägte Lungenläsionen als Tiere der Kontrollgruppe. Allerdings konnte Actinobacillus. pleuropneumoniae aus der Lunge aller immunisierten Schweinen isoliert werden (GERLACH et al. 1993).
2.2 Anaerobe Genregulation
Eine Möglichkeit der Energieerzeugung in Abwesenheit von Sauerstoff ist eine Variation der Atmung, bei der andere Elektronenakzeptoren als Sauerstoff verwendet werden. Zu diesen Elektronenakzeptoren gehören Nitrat (NO3-), dreiwertiges Eisen (Fe3+), Sulfat (SO42-), Carbonat (CO32-) und bestimmte organische Verbindungen (MADIGAN et al. 2003).
Bakterien, die zu anaerober Atmung befähigt sind, besitzen im allgemeinen Elektronentransportsysteme, die Cytochrome, Chinone, Eisenschwefelproteine und andere typische Elektronentransportproteine enthalten (MADIGAN et al. 2003).
In E. coli werden viele unter anaeroben Bedingungen exprimierte Gene vom globalen Regulator FNR reguliert (SHAW u. GUEST 1982). Das FNR (fumarate and nitrate reduction)-Protein von E. coli ist ein ca. 30 kDa großes Protein; es enthält vier Eisen- Schwefel-Gruppen und induziert die Regulation vieler Gene, wie z. B. der DMSO-Reduktase (SPIRO u. GUEST 1990; UNDEN u. DUCHENE 1987; WEINER et al. 1992), die am anaeroben Stoffwechsel beteiligt sind; gleichzeitig wird die Expression von Genen, die am aeroben Metabolismus beteiligt sind unterdrückt. Escherichia coli besitzt Enzyme zur Nutzung von DMSO und anderen Substraten als Elektronenakzeptoren und wächst unter anaeroben Bedingungen auf Minimalmedium mit Glyzerol als Kohlenstoff- und Energiequelle sowie DMSO als terminalem Elektronenakzeptor (BILOUS u. WEINER 1985). Die DMSO- Reduktaseaktivität kann durch die Anwesenheit von Nitrat oder Sauerstoff unterdrückt werden. Andererseits induziert anaerobes Wachstum auf DMSO als terminalem Elektronenakzeptor die Aktivität von Nitrat, Fumarat und Trimethylamin-N-Oxid Reduktase (BILOUS u. WEINER 1985). Ein Abfall des Sauerstoffspiegels, aber auch andere Faktoren wie Wachstumsphase und Kohlenstoffquelle spielen eine wichtige Rolle bei der FNR- Expression von E. coli (SOLTES u. MACINNES 1994).
Das HlyX Protein von A. pleuropneumoniae ist homolog zum FNR-Protein von E. coli (JERLSTROEM et al. 1987; MACINNES et al. 1990; WOODS u. GUEST 1987). Wie FNR enthält auch HlyX vier Eisen-Schwefel-Gruppen, die für das DNA-Bindungsvermögen des Proteins verantwortlich sind (GREEN u. BALDWIN 1997). MACINNES et al. (1990) haben die Nukleotidensequenz des hlyX-Gens analysiert und dabei einen offenen Leserahmen mit einer Länge von 720 bp identifiziert, der von Länge und Sequenz her dem des fnr-Gens entspricht. Der offene Leserahmen kodiert für ein Protein mit einer molekularen Masse von 27,1 kDa. Die Nukleotidsequenz liegt unter der Zugangsnummer M34443 bei GenBank vor.
Der Vergleich der Nukleotidsequenz von hlyX mit der von fnr zeigt, dass beide zu 65%
identisch sind. Im hlyX-Gen sind Glycin, Isoleucin und Leucin vorwiegend durch CAA, ATT und TTA kodiert, während bei fnr GAG, ATG und CTG die häufigsten Kodierungstripletts sind. Die abgeleiteten Proteinsequenzen von FNR und HlyX sind sehr ähnlich, 71% von 239 Aminosäuren sind identisch. Vier Cysteinreste (Positionen 14, 18, 21 und 27) sind am aminoterminalen Ende von sowohl HlyX als auch FNR vorhanden. Weiterhin ist auch die Erkennungssequenz von HlyX der von FNR sehr ähnlich (15 von 18 Basen sind identisch).
Die Konsensussequenz für HlyX-Bindungsstellen ist TTGAT----ATCAA und die Erkennungssequenz von FNR ist TTGAT----ATCAG (GREEN u. BALDWIN 1997). Die vergleichbare Aktivität von HlyX und FNR wurde auch dadurch bestätigt, dass eine FNR- Mutante mit HlyX komplementiert werden konnte (GREEN u. BALDWIN 1997;
MACINNES et al. 1990). Anders als das FNR-Protein war das HlyX-Protein aber in der Lage, die Synthese einer hämolytischen Aktivität bei E. coli unter anaeroben Bedingungen zu induzieren (SOLTES u. MACINNES 1994); dieses Ergebnis weist auf Unterschiede der beiden Proteine in ihrem DNA-Bindungsvermögen hin. Die Anwesenheit von HlyX oder FNR sind für das Wachstum von E. coli (∆fnr) auf einem Glycerol-Nitrat Minimalmedium unter anaeroben Bedingungen essentiell. Im Gegensatz dazu werden weder HlyX noch FNR beim Wachstum auf demselben Medium mit Fumarat gebraucht (SOLTES u. MACINNES 1994).
Es wird vermutet, dass A. pleuropneumoniae ein ähnliches hierarchisches System für die Expression der Gene im sauerstoffarmen Milieu wie E. coli hat (MACINNES et al. 1990).
Bisher wurde gezeigt, dass die DMSO-Reduktase und die Aspartase bei A. pleuropneumoniae im ex vivo Modell (Zusatz von BALF zum Kulturmedium) hochreguliert sind und dass die kodierenden Gene über potentielle HlyX-Bindungsstellen verfügen (BALTES et al. 2003;
JACOBSEN et al. 2005). Die Deletion des dmsA-Genes führt zur Attenuierung von Actinobacillus. pleuropneumoniae in der akuten Phase der Infektion (BALTES et al. 2003).
Eine A. pleuropneumoniae ∆aspA∆dmsA Doppelmutante zeigte in Kultur reduziertes Wachstum unter anaeroben Bedingungen sowie einen milderen klinischen Verlauf nach Aerosol-Infektion als der Wildtypstamm und konnte nur selten in intakten Lungengeweben nachgewiesen werden (JACOBSEN et al. 2005). Der A. pleuropneumoniae Wildtypstamm konnte jedoch in großer Anzahl aus unverändertem Lungengeweben isoliert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass mit der DMSO-Reduktase und der Aspartase zwei mögliche Vertreter des HlyX-Regulons an Pathogenese und Persistenz beteiligt sind. Daraus lässt sich die Hypothese ableiten, dass HlyX-regulierte Gene allgemein von grosser Bedeutung für die Pathogenese und Persistenz von A. pleuropneumoniae im Respirationstrakt sind. In der vorliegenden Arbeit sollte diese Hypothese überprüft werden. Dazu sollte eine hlyX-negative Mutante von A. pleuropneumoniae erstellt und im Aerosolinfektionsmodell am Schwein auf ihre Virulenz hin überprüft werden.
3 Material und Methoden
Die Zusammensetzung von Medien, Medienzusätzen und Puffern ist im Anhang aufgeführt (Kapitel 9.2). Die benutzten Geräte, Enzyme und Chemikalien sind ebenfalls im Anhang aufgeführt (Kapitel 9.1, 9.15 und 9.16)
3.1 Bakterienkulturen 3.1.1 Bakterien und Plasmide
Die in der Arbeit verwendeten Bakterienstämme und Plasmide sind in der Tabelle 2 aufgeführt.
3.1.2 Kultivierungsbedingungen
E. coli wurde in Luria-Bertani (LB) Medium im Schüttelinkubator (Incubator Shaker Series 25, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) oder auf LB-Agar im Brutschrank (Memmert GmbH + Co. KG, Schwalbach) kultiviert. Je nach Kultivierungsziel wurden Zusätze hinzugefügt.
Actinobacillus. pleuropneumoniae wurde in PPLO-Medium bzw auf PPLO-Agar mit bestimmten Zusätzen kultiviert.
Für anaerobe Kulturen wurden 36 ml Medium mit 4 ml einer Übernachtkultur beimpft und im Schüttler bis zu einer optischen Dichte bei 660 nm (OD660) von 0,3 inkubiert. Anschließend wurde die Kultur in zwei Aliquots von 20 ml aufgeteilt. Ein Aliquot wurde normal im Schüttler als aerobe Kontrolle weiter bebrütet und das zweite Aliquot wurde als anaerobe Anzucht im Anaerobiertopf (OXOID, Wesel, Deutschland) für 3 Stunden inkubiert. Für die Trockengewichtegewinnung wurden die Kulturen 16 Stunden in der Anaerobierkammer inkubiert.
3.2 Ermittlung der Zelldichte
Die Zelldichte wurde durch die Messung der optischen Dichte der Flüssigkulturen bei 660 nm (OD660) bestimmt.
3.3 Isolierung, Reinigung und Quantifizierung von DNA
Puffer und Lösungen zur Reinigung und Quantifizierung der DNA sind im Anhang aufgeführt (Kapitel 9.3)
3.3.1 Präparation chromosomaler DNA von A. pleuropneumoniae
1. Bakterien von einer gut bewachsenen Platte wurden in 2,5 ml TE-Puffer resuspendiert.
2. EDTA (10 mM, 25 µl), SDS (1%, 125 µl) und Proteinase K (500 µg/ml, 32 µl) wurden zugegeben, gemischt und bei 55°C im Wasserbad inkubiert.
3. RNAse (100 µg/ml, 19 µl) wurde zugegeben und 30 min im Wasserbad 37°C inkubiert.
4. Phenol (250 µl) in TE-Puffer wurde hinzugefügt, gemischt und bei -70°C über Nacht eingefroren.
5. Das Gemisch wurde vorsichtig bei 55°C aufgetaut und Chloroform:Isoamylalkahol (24:1)–Gemisch (500 µl) wurde anschließend zur Trennung der Phasen dazugegeben.
6. Der Ansatz wurde bei 10.000 rpm (SA600-Rotor), bei 4°C für 5 min zentrifugiert, der Überstand wurde mit einer Plastik-Pasteurpipette entnommen und in ein neues Polypropylen-Röhrchen pipettiert.
7. Die Phenol/Chloroform Extraktion mit 500 µl (ca. 1/5 des Volumens) Chloroform:Isoamyl (24/1)-Gemisch wurde wiederholt und bei 10.000 rpm, 4°C 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Plastikröhrchen überführt.
8. Die DNA wurde mit 3M Na-Acetat pH 5,2 (250 µl, ca. 1/10 des Volumens) und Isopropanol (2,5 ml, ca. 1 Volumen) ausgefällt.
9. DNA-Fasern wurden mittels einer Pipettenspitze aufgewickelt, in 70% Ethanol für 5 min gewaschen und luftgetrocknet.
10. Die DNA wurde in 200 µl A. bidest. resuspendiert.
11. Die DNA wurde anschließend im Kühlschrank über Nacht aufbewahrt.
12. Die DNA wurde durch Elektrophorese von 1 µl der Präparation auf einem Agarosegel quantifiziert.
Tabelle 2: Verwendete Bakterienstämme und Plasmide
3.3.2 Alkalilysis-Verfahren zur Präparation von Plasmid DNA Drei ml Übernachtkultur (Schüttler) wurden abzentrifugiert.
1. Das Pellet wurde in 300 µl Tris-EDTA ( 50 mM Tris-HCl [pH 8,0]; 10 mM EDTA, 1 mg/ml RNAse) resuspendiert.
2. Dreihundert µl NaOH-SDS-Lösung (0,2 M NaOH, 1% [w/v] SDS) wurden hinzugegeben und bis zur Lyse der Bakterien bei Raumtemperatur (längstens 3 min) inkubiert.
3. Dreihundert µl 3,2 M K-Acetat-Puffer (pH 5,5) wurden zugegeben, die Suspension wurde gründlich gemischt und für 10 min bei 13.000 rpm zentrifugiert.
4. Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt.
5. Die Präzipitation erfolgte durch Zugabe von 600 µl eiskaltem Isopropanol bei Raumtemperatur.
6. Nach 10 min Zentrifugation bei 13.000 rpm wurde das Pellet getrocknet.
7. Das Pellet wurde in 25 µl A. dest. resuspendiert.
3.3.3 DNA-Aufreinigung mit “Nucleospin-Extract” (Macherey-NAGEL GmbH&CO.
Düren Deutschland)
1. Das DNA Fragment wurde unter UV-Licht (280 nm) aus einem TAE-Agarosegel ausgeschnitten und gewogen.
2. Dreihundert µl NT1-Puffer/100 mg Gel wurden zugegeben und im Wasserbad bei 50°C bis zum vollständigen Lösen des Gels inkubiert.
3. Das aufgelöste Gel wurde auf ein Nucleospin-Säulchen geladen bei 10.000 rpm für 1 min zentrifugiert und die Flüssigkeit verworfen.
4. Fünfhundert µl NT2-Puffer wurden zugegeben und bei 13.000 rpm für 1 min zentrifugiert und das Eluat verworfen.
5. Sechshundert µl NT3-Puffer wurden zugegeben, bei 13.000 rpm für 1 min zentrifugiert und das Eluat verworfen.
6. Zweihundert µl NT3-Puffer wurden zugegeben und bei 13.000 rpm für 5 min zentrifugiert und das Eluat verworfen.
7. Das Säulchen wurde in neues Reagenzgefäss überführt, 25-50 µl A. bidest. wurden hinzugegeben und 2 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die aufgereinigte DNA wurde durch Zentrifugieren bei 11.000 rpm für 1 min eluiert.
3.3.4 Aufreinigung mit dem „ GENE Clean“-KIT
1. Mit steriler Skalpellklinge wurden die Blöckchen möglichst „knapp“ aus dem Agarosegel ausgeschnitten und in ein Reaktionsgefäß überführt.
2. Das Reaktionsgefäß mit Blöckchen wurde gewogen, das Gewicht des Blöckchens wurde als Differenz zum Leergewicht ermittelt.
3. Die dreifache Menge des Blöckchengewichtes an Natriumjodidlösung wurden zugegeben und ca 3 min bei 55°C inkubiert (bis zum Auslösen der Blöckchen).
4. Drei µl vollständig in Suspension gebrachte Glassmilch wurden zugegeben und 30 min bei Raumtemperatur stehengelassen.
5. Es wurde 20 sek. mit voller Geschwindigkeit (13000 rpm) zentrifugiert.
6. Der Überstand wurde abgenommen und verworfen, 500 µl „New Wash“ wurden zugegeben und die Glassmilk wurde durch gründliches Pipettieren resuspendiert.
7. Es wurde wieder 20 sek. zentrifugiert und der Überstand verworfen.
8. Das Waschen mit „New Wash“ wurde noch 2 mal wiederholt.
9. Nach dem letzten Abpipettieren des Überstands wurde 3 min mit voller Geschwindigkeit zentrifugiert und der Überstand mit einer gelben Pipettenspitze restlos abgenommen.
10. Die Glassmilch wurde in 27 µl A. dest. resuspendiert und 3 min bei 55°C inkubiert.
11. Es wurde 3 min mit voller Geschwindigkeit zentrifugiert und 25 µl Überstand wurden in ein neues Reaktionsgefäß überführt.
3.3.5 Bestimmung der DNA-Konzentration
Die DNA–Konzentration wurde im Spektrophotometer Ultrospec III bei 260 nm gemessen.
Der Leerwert wurde mit A. dest. eingestellt.
3.3.6 Anaerobe Anzucht zum Vergleich verschiedener Stämme und Bestimmung des Trocknengewichts der Pellet
Tag 1:
1. PPLO-Medium wurde mit der adäquaten Menge EIVX und Tween 80 versetzt, 100 ml wurden mit einem Messzylinder abgemessen und in 200 ml Kolben gefüllt.
2. Das Medium wurde in die Anaerobenkammer eingeschleust, die Deckel wurden etwas gelockert und das Medium wurde dort für mindestens 2 Tage stehen gelassen.
Tag 2:
PPLO-Platten wurden mit den zu untersuchenden A. pleuropneumoniae wt und Actinobacillus pleuropneumoniae ∆hlyX-Stämmen beimpft.
Tag 3:
Beimpfte Platten und sterile Ösen wurden in die Kammer eingeschleust und das Medium wurde beimpft.
Tag 4:
1. Nach 16 Stunden Inkubation wurden die Kulturen ausgeschleust.
2. Zur Reinheitskontrolle wurde eine Öse des Kulturmaterials auf Blutagar ausgestrichen.
3. Kulturen wurden in Zentrifugenbecher überführt und bei 4°C, 8.000 rpm für 10 min abzentrifugiert. Kulturmaterial, dass am Kolbenboden klebte, wurde mittels abgeflammter Glaspipette gründlich abgeschwemmt
4. Die gummiartigen Pellets wurden nach dem Zentrifugieren mit 5 ml steriler physiologischer NaCl-Lösung in zuvor gewogene Polypropylenröhrchen überführt.
5. Röhrchen wurden bei 4°C, 8,000 rpm, 10 min zentrifugiert.
6. Der Überstand wurde verworfen und die Röhrchen wurden 24 Stunden bei 80°C inkubiert.
Tag 5:
1. Die Reinheitskontrolle wurde überprüft.
2. Die Röhrchen mit den getrockneten Pellets wurden gewogen und die Trockengewichte der Pellets wurden anschließend berechnet.
3.4 Plasmidkonstruktion 3.4.1 PCR 2.1-TOPO-Cloning
1. Zu 2 µl des PCR 2.1-TOPO -Produkts wurden 1 µl Salzlösung, 1 µl steriles A. dest und 1 µl Vektor 2.1- TOPO hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 10 min inkubiert.
2. Fünfzig µl kompetenter E. coli wurden in ein Reaktionsgefäß pipettiert, die oben inkubierte Lösung wurde hinzugegeben und auf Eis für 10 min stehen gelassen.
3. Das Gemisch wurde anschließend im Thermoblock bei 42°C für 20 sek. Inkubiert und anschlissend auf Eis gestellt.
4. Zweihundertfünfzig µl SOC-Medium (Zusammensetzung im Anhang, Chapitel 8.2) wurden nach dem Hitzeschock dazu pipettiert und dann wurden die Zellen für 1 Stunde bei 37°C geschüttelt.
5. Auf LB-Platten mit Ampicillinzusatz wurden 25 µl X-Gal Lösung (25 mg/l,Verdünnung:
25 µl X-Gal Stammlösung + 125 µl A. dest) ausplattiert.
6. Die Bakterien wurden auf Platten (Platte 1: 200 µl, Platte 2: 100 µl) ausplattiert und im Brutschrank bei 37°C über Nacht inkubiert.
7. Am nächsten Tag wurden die Platten überprüft und an weiβen Kolonien wurde eine PCR zum Nachweis des Inserts durchgeführt.
3.4.2 Restriktionsenzymverdau
Die Zusammensetzung der angewendeten Puffer sind im Anhang aufgeführt (Chapitel 8.4).
Die Restriktionsenzymverdaus wurden in 25 µl Ansätzen (0,5 bis 1 µg DNA) durchgeführt.
Die DNA wurde mit A. dest., den jeweiligen Restriktionsendonukleasen, 10 × Carlos Puffer und DTT-Puffer (10 mM) und BSA (1 mg/ml) gemischt und bei 37°C für 2 Stunden inkubiert.
Der Verdau wurde anschließend auf ein Agarosegel geladen und bewertet.
3.4.3 Auffüllen von Enden mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase
Nach dem Restriktionsverdau mit den Enzymen BglII und XcmI wurden 0,5 µl einer dNTP- Stammlösung (je 10 mM dATP, dCTP, dTTP und dGTP) und 0,4 µl T4 – Polymerase/Klenow Fragment (Biolabs, Schwalbach Taunus, England) in den Ansatz (25 µl) gegeben und im Wasserbad (12°C) für 20 min inkubiert.
3.4.4 Agarosegelelektrophorese
Die Puffer, die Lösungen und der Marker sind im Anhang aufgeführt (Kapitel 9.5) 1. Je nach Größe wurden die DNA-Fragmente im 0,8-1,5 %igen Gel aufgetrennt.
2. Für das Gießen eines Gels wurde die erforderliche Menge der Agarose in entsprechendem Puffer (1 x TAE/0,5 x TBE) unter Kochen gelöst, in einem 55°C Wasserbad abgekühlt und mit Ethidiumbromid (1 µl Stammlösung [10 mg/ml] pro 50 ml) versetzt.
3. Das Gel wurde in eine Gelkammer gegossen
4. Nach dem Erstarren wurde das Gel in eine Elektrophoresekammer mit Laufpuffer eingelegt.
5. Die Proben wurden mit entsprechenden Ladepuffer versetzt und, genauso wie HindIII- verdaute λ-DNA als Größenstandard, in die Geltaschen geladen.
6. Die Stromspannung und die Zeit der Auftrennung wurden entsprechend Größe und Konzentration des Gels und der Größe der DNA-Fragmente eingestellt (180V für große und 80V für kleine Gele und 1 Stunde).
7. Nach Auftrennung wurden die DNA-Fragmente unter UV-Licht beurteilt oder mit einer Polaroid-Kamera bzw. mit dem Biorad MultiAnalyst-System fotografiert.
3.4.5 Ligation
Zur Ligation wurden Vektor (0,1 µg DNA), Insert (im Überschuss), A. dest., 2 x Ligasepuffer und T4-DNA-Ligase in einem 20 µl Ansatz gemischt und bei 16°C für über Nacht inkubiert.
Ein Ansatz ohne Insert mit Ligase diente als negative Kontrolle.
Tabelle 3: Zusammensetzung des Ligationsgemisches
Ansätze 1 2 3 4
Vektor 2,5 µl 2,5 µl 2,5 µl 2,5 µl
Insert 7,5 µl 2,5 µl - -
A. dest - 5 µl 7,5 µl 7,5 µl
2 x Ligasepuffer 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl
Ligase + + + -
3.5 Transformation
Die Puffer und die Medien zur Transformationsdurchführung sind im Anhang aufgeführt (Kapitel 9.2 und 9.6).
3.5.1 Herstellen von chemisch kompetenten Zellen
1. Escherichia coli DH5α wurde auf LB-Agar ausplattiert und im Brutschrank bei 37°C über Nacht bebrütet.
2. Eine Einzelkolonie wurde in 3 ml LB-Medium mit 20 mM MgCl2 angeimpft und als Standkultur bei 37°C über Nacht inkubiert.
3. 150 ml LB-Medium mit 20 mM MgCl2 (über Nacht vorgewärmt) wurden mit der Standkultur beimpft und bei starkem Schütteln bebrütet.
4. Bei OD660 von 0,3-0,4 wurde die Kultur auf Eis gestellt und in vorgekühlter Zentrifuge (4°C) 4000 x G, 10 min pellettiert.
5. Der Überstand wurde verworfen; das nach dem Abgießen verbleibende Restmedium wurde vorsichtig mit einer Pipette entfernt.
6. Das Pellet wurde in 30 ml TFB1 (eiskalt, pH 5,8) resuspendiert und mindestens 90 min auf Eis gestellt.
7. Die Bakterien wurde bei 4°C 4000 x G, 10 min pelletiert, der Überstand verworfen und das Restmedium mit einer Pipette abgenommen.
8. Das Pellet wurde in 5 ml TFB2 Lösung (pH 6,5) resuspendiert und für maximal 30 min auf Eis gehalten.
9. Das Abfüllen erfolgte in vorgekühlte Eppendorfreaktionsgefäße (Aliquots ca.250 µl/- Reaktionsgefäß) und die Aliquots wurden bei – 70°C eingefroren.
3.5.2 Transformation von chemisch kompetenten E. coli DH5α Zellen mit Plasmiden 1. Kompetente Zellen (DH5αF’) wurden aus – 70°C entnommen und auf Eis aufgetaut.
2. Zu 100 µl kompetenten Zellen wurden 10 µl Ligationsansatz gegeben.
3. Das Gemisch wurde für 1 Stunde auf Eis gestellt und anschließend im Thermoblock bei 42°C für 3 min inkubiert.
4. Nach dem Hitzeschock wurden die Ansätze für 2 min auf Eis gestellt.
5. Zweihundert µl LB-Medium wurden zugegeben und die Suspension wurde im Brutschrank bei 37°C für eine Stunde inkubiert.
6. Die Bakterien wurden auf ½ vorgetrocknete Agarplatte mit entsprechendem Antibiotikum ausplattiert und mit der Öse fraktioniert.
7. Die Platten wurden bei 37°C inkubiert und Kolonien nach 12 – 16 Stunden beurteilt.
3.5.3 Elektrotransformation von Actinobacillus pleuropneumoniae 3.5.3.1 Herstellen elektrokompetenter Zellen
1. Fünfzig ml supplementiertes PPLO-Medium mit 0,1% Tween80 wurden mit einer Einzelkolonie beimpft und über Nacht bei 37°C mit 5% CO2 inkubiert; 250 ml supplementiertes PPLO-Medium mit 0,1 % Tween80 wurden über Nacht bei 37% mit 5% CO2 vorgewärmt.
2. Die 250 ml Medium wurden mit 25 ml der Übernachtkultur beimpft und bei 37°C im Schüttler bis zu einer OD600 von 0,3 – 0,4 inkubiert.
3. GYTT-Medium wurde für 20-30 min zum Vorkühlen auf Eis gestellt.
4. Die Bakterien wurden bei 4°C in der vorgekühlten Zentrifuge bei 5.000 rpm für 10 min abzentrifugiert, der Überstand wurde verworfen.
5. Das Bakterienpellet wurde dreimal vorsichtig mit eiskaltem GYTT-Medium (50 ml, 30 ml, 20 ml) gewaschen und der Überstand wurde nach dem Zentrifugieren (5.000 rpm, 4°C, 10 min) jeweils mit einer Pipette abgenommen.
6. Die Bakterien wurden in einem Endvolumen von 1,5-2 ml eiskaltem GYTT aufgenommen und am selben Tag transformiert.
7. Die Reinheit der transformierten Bakterien wurde auf supplementiertem PPLO-Agar und auf Blutagar überprüft.
3.5.3.2 Durchführung der Elektrotransformation von Actinobacillus pleuropneumoniae 1. Die Elektroporationsküvetten wurden auf Eis gestellt, supplementiertes PPLO-Medium
wurde in 5% CO2 bei 37°C vorgewärmt (1 ml je Ansatz).
2. 2-5 µg (10 µl) dialysierte DNA und 200-300 µl kompetente Zellen wurden in die vorgekühlten Küvetten gegeben und 20-30 min auf Eis gestellt.
3. Der Genpulser wurde auf 2,5 KV, 25 µFD und 1000 Ω eingestellt.
4. Wassertropfen an der Außenseite der Küvette wurden vor dem Einstellen in den Gen- Pulser getrocknet und die Elektroporation wurde durchgeführt.
5. Sofort nach der Elektroporation wurde 1 ml vorgewärmtes PPLO-Medium in die Küvetten gegeben und gemischt. Der Gesamtinhalt wurde in Polypropylen-Röhrchen überführt und für 2 – 3 Stunden bei 37°C bebrütet.
6. Transformierte Zellen wurden anschließend auf Agar mit den entsprechenden Antibiotika ausplattiert und über Nacht bei 37°C, 5% CO2 inkubiert.
7. Platten wurden am nächsten Tag beurteilt.
3.6 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Verwendete Primer sind in der Tabelle 2 aufgeführt.
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde wie folgende durchgeführt:
1. Fünf µl Template (DNA oder Kolonie [in 100 µl 0,1% TE]) wurden in PCR-Gefäße pipettiert.
2. Der Mastermix wurde erstellt (Tabelle 4); 0,1 µl Taq-Polymerase pro Ansatz wurde zum auf Eis gekühlten Mastermix gegeben.
3. Zwanzig µl Mastermix mit Taq-Polymerase wurden in die PCR-Gefäße pipettiert.
4. Die PCR-Reaktionen (mit Positiv- und Negativkontrollen) wurden in den Thermocycler gestellt und das HLYX5 Programm (94°C 3 min; [94°C 30 sek., 55°C 1 min, 72°C 2 min 30 sek.] x 32 Zyklen; 72°C 10 min) wurde anschließend gestartet.
5. Nach Beendigung der PCR wurden die Proben entnommen und auf Agarose Gele (1,5 %) geladen oder bei – 20°C eingefroren.
Tabelle 4: Mastermix-Zusammensetzung
Datum: Template:
[ ] Plasmid [ ] chrom.
DNA [ ] Kolonie
Primer:
Volumen und benötigte Mengen/ Ansatz:
Mastermix
[ ] 25 µl
[ ] 50 µl
[ ] anderes:
_____ µl
benötigte Ansätze:
____
PCR- Puffer 10
x 2,5 µl 5 µl ___ µl ___ µl MgCl 0, 75 µl 1,5 µl ___ µl ___ µl dNTPs 10
mM/each 0,5 µl 1 µl ___ µl ___ µl Primer 1
5 pM/each 2,5 µl 5 µl ___ µl ___ µl Primer 2
5 pM/each 2,5 µl 5 µl ___ µl ___ µl
Bemerkungen:
H2O 11,15
µl 27,3 µl ___ µl ___ µl Cycler:
Taq 0,1 µl 0, 2 µl ___ µl ___ µl Programm:
Template 5 µl 5 µl ___ µl ___ µl Start: ___:___ Uhr
3.7 Konjugation von E. coli und A. pleuropneumoniae Die verwendeten Puffer sind im Anhang aufgeführt (Kapitel 9.7).
1. Donorstamm (E. coli ß2155 mit pEMOC2-Derivat) und Rezipientenstamm (A. pleuropneumoniae wt) wurden auf festem Nährboden über Nacht (max. 14 Stunden) kultiviert.
2. Die Kulturen wurden mit einem Wattetupfer von der Platte abgenommen, in 3 ml vorgewärmtem TNM-Puffer resuspendiert und auf eine OD600 von 2 eingestellt.
3. Nitrozellulosefilter (Durchmesser 2,5 cm; Porenweite 0,45 µm) wurden auf Whatman 3MM Filterpapier gelegt (erwärmt auf 37°C); 50 µl Donorzellen und 400 µl Rezipientenzellen wurden vorsichtig gemischt, auf die Nitrozellulosemembran aufgebracht, über die gesamte Membran verteilt, und inkubiert, bis die auf der Membran stehende Flüssigkeit in das darunterliegende Filterpapier gesaugt worden war.
4. Die noch leicht feuchten Membranen wurden auf vorgewärmtem PPLO Agar, supplementiert mit 1% EIVX, 1 mM DAPI, 10 mM MgSO4 gelegt und ca. 7 Stunden bei 37°C und 5% CO2 inkubiert; für jede Membran wurde eine PPLO-EIVX- Chloramphenicol (Cm, 5 µg/ml) Platte zum Vortrocknen in Inkubator gelegt.
5. Die Filter wurden abgenommen, in ERG verbracht und mit ca. 650 µl PPLO Medium (supplementiert mit EIVX) durch vortexen abgewaschen.
6. Der Inhalt wurde auf eine vorgetrocknete supplementierte PPLO-EIVX-Cm-Platte aufgebracht und bei 37°C, 5% CO2 inkubiert.
7. Die Trankonjuganten wurden durch PCR überprüft
3.8 Saccharose-Gegenselektion
Die verwendete Medien sind im Anhang aufgeführt (Chapitel 9.2).
1. Eine chloramphenicolresistente Kolonie wurde morgens in 1 ml vorgewärmtem supplementiertem PPLO-Medium inokuliert und im Schüttler (37°C) für 2 Stunden (bis zum Auftreten einer leichten Trübung) inkubiert.
2. Vierhundert µl 2,5-fach konzentriertes PPLO Medium 500 µl 40% Saccharose, 100 µl steriles Pferdeserum und 10 µl EIVX wurden zugegeben.
3. Die Kultur wurde für 5-6 Stunden weiter geschüttelt. Im Anschluss wurden 50 µl von der Kultur auf einer halben supplementierten PPLO-Platte ausplattiert, über die restliche Hälfte der Platte fraktioniert und über Nacht bei 37°C im CO2-Inkubator (5 % CO2) bebrütet.
3.9 Southern Hybridisierung
Puffer und Lösungen zum DNA-Transfer, zur Herstellung einer Gensonde und zur Southern- Hybridisierung sind im Anhang aufgeführt (Kapitel 9.8, 9.9 und 9.10).
3.9.1 Southern Blot
1. Die Depurinierung wurde in Depurinierungslösung für 15 min durchgeführt
2. Die Denaturierung der DNA erfolgte in Denaturierungslösung für 1 Stunde (3 x 20 min) 3. Die Neutralisation wurde in Neutralisierungslösung für 1 Stunde (3 x 20 min)
vorgenommen.
4. Der Unterbau in einer Plastikschale wurde mit 2 Lagen 3MM Filterpapier bedeckt und unter Puffer gesetzt (10 × SSC) ; das Filterpapier wurde mit Puffer bedeckt.
5. Das Gel wurde mit Unterseite nach oben auf das Filterpapier gelegt.
6. Ein genügend großes Stück Tropilon–45 Membran (rundum ca. 2 mm größer als das Gel) wurde mit A. dest. angefeuchtet und unter Vermeidung von Luftblasen aufgelegt.
7. Zwei Lagen Filterpapier (2 mm < Membran) wurden trocken aufgelegt.
8. Mehrere Lagen Papierhandtücher wurden als Saugkissen aufgelegt.
9. Ca. 500 g Gewicht wurde aufgelegt (je nach Gelgrösse; das Gewicht wurde so bemessen, dass Papierhandtücher gerade eben zusammengedrückt sind).
10. Nach einer Blottingdauer von 0,5-15 Stunden wurden die Auflagen entfernt.
11. Das Gel wurde mit der Membran zusammen umgedreht, die Geltaschen (mit Bleistift) und Seiten (Ecke abgeschnitten) wurden markiert.
12. Das Gel wurde abgezogen und entsorgt.
13. Die Membran wurde 5 min in 5 x SSC geschwenkt.
14. Die Membran wurde in Papierhandtüchern getrocknet und 2 Stunden bei 90°C gebacken.
15. Die gebackene Membran wurde in A. dest. angefeuchtet und in 6 x SSC Lösung für 2 min geschwenkt.
16. Die Membran wurde eingerollt und mit ausreichend Hybrisierungspuffer (50 ml) in einer Glasröhre für ca. 2 Stunden im Hybrisierungsofen inkubiert (Prähybridisierung).
17. Die Flüssigkeit wurde abgegossen, Hybrisierungspuffer (50 ml) und 5 min gekochte Gensonde (ca. 50 µl) wurden dazugegeben, und die Membran wurde über Nacht (bei ca.
60 °C) hybridisiert.
Nach Abgießen des Hybridisierungspuffers und der Sonde wurde die Membran mit 1 x SSC + 0,5 % SDS ca. 1 Stunde (Waschpuffer 3 x gewechselt) gewaschen.
Zur Exposition der Membran auf Röntgenfilm wurde folgendermaßen vorgegangen:
1. Ein alter Film wurde als Unterlage mit Frischhaltefolie überzogen; die Blots wurden darauf aufgelegt und mit Folie bedeckt.
2. Auf diese zweite Lage Frischhaltefolie wurden drei Stückchen Klebeband geklebt und mit radioaktiver Tinte Kreuze als Markierung gemacht.
3. Die Blots wurden in eine Röntgenkassette eingelegt; der Film (Kodak X-OMAT AR, SIGMA, Deisenhofen) wurde direkt auf Blots gelegt; eine Verstärkerfolie wurde darauf gelegt, und der Film bei -70°C exponiert (Dauer je nach Aktivität des Blots).
3.9.2 Herstellen einer Gensonde nach der „Random-Priming“ Methode Es wurden zusammenpipettiert:
5 µl OLB
1 µl acetyliertes BSA (10 mg / ml)
5 µl DNA (20 -30 ng ) vorher 5 min bei 100 °C, kurz auf Eis 10.5 µl A. dest.
1 µl T4-DNA-Polymerase (Klenow-Fragment) 2.5 µl dCTP-32*
25 µl Gesamtansatz
Das Gemisch wurde 4 -5 Stunden bei RT inkubiert, dann werden 100 µl STOP-Puffer hinzugefügt.
3.10 Pulsfeld-Gel-Elektrophorese (PFGE)
Puffer, Lösungen und Marker sind im Anhang aufgeführt (Kapitel 9.14)
1. Eine Platte supplementierte PPLO-Agar wurde am ersten Tag mit A. pleuropneumoniae beimpft und im Brutschrank bei 37°C und 5 % CO2 bebrütet.
2. Das Koloniematerial wurde am zweiten Tag von der Platte abgeschwemmt und in 3 ml Pett IV resuspendiert.
3. Die Suspension wurde auf eine OD600von 0,3 eingestellt.
4. Fünf ml Bakteriensuspension in Pett IV wurden bei 4°C und 4.000 rpm für 10 min abzentrifugiert, der Überstand wurde abgegossen und das Pellet in 0,5 ml Pett IV resuspendiert und gut durch Vortexen gemischt.
5. Das Röhrchen mit Bakteriensuspension wurde auf Eis gestellt.
6. Für je 10 Blöckchen wurde 1 ml einer 1,2% igen Agarose ( Biorad # 162-0135; Agarose Chromosomal Grade Biorad, 25 g) angefertig und in einem 55°C Wasserbad aufbewahrt.
7. 0,5 ml warme Agarose wurde schnell in das Röhrchen mit der vorher vorgewärmten Bakteriensuspension überführt und vorsichtig gemischt.
8. Mit einer 1 ml-Pipette wurden je 100 µl der agarosehaltigen Suspension in gereinigte Gießförmchen pipettiert.
9. Die Förmchen wurden für 10 min in den Kühlschrank gestellt.
10. Nach Entfernung von überstehender Agarose von den Gießförmchen wurden je 5 Blöckchen mit umgebogenem Glas-„Pasteurhäkchen“ aus dem Gießstand gestoßen in ein Röhrchen mit 3 ml Lysepuffer überführt
11. Die Blöckchen wurden in der Lysepufferlösung für 2 Stunden bei 37°C im Brutschrank in Schräglage ohne schütteln inkubiert.
12. Die Lyselösung wurde abgegossen, jedem Röhrchen wurden 3 ml ESP-Puffer zugegeben und über Nacht bei 55°C im Wasserbad ohne Schütteln inkubiert.
13. Der ESP-Puffer wurde abgegossen, die Blöckchen wurden mit 3 ml A. dest. gewaschen und bei Raumtemperatur 15 min waagerecht sanft geschwenkt.
14. Das A. dest. wurde abgegossen und in jedes Röhrchen wurden 2 ml TE-PMSF-Gemisch gegeben und 30 min bei Raumtemperatur sanft geschwenkt.
15. Der TE-PMSF-Puffer wurde abgegossen, 3 ml A. dest. wurden zugegeben und die Röhrchen für 15 min bei Raumtemperatur sanft geschwenkt.
16. Das A. dest. wurde abgegossen, 3 ml TE-Puffer wurden hinzugefügt und die Röhrchen wurden für 30 min bei Raumtemperatur waagerecht geschwenkt.
17. Der TE-Puffer wurde abgegossen und frischer TE-Puffer zugegeben und 30 min bei Raumtemperatur geschwenkt.
18. Der TE-Puffer wurde abgegossen.
19. Fünf ml TE-Puffer wurden hinzugefügt und die Blöckchen über Nacht (oder länger) im Kühlschrank aufbewahrt und anschließend verdaut (Tabelle 5).
20. Die Auftrennung der Makrorestriktionsfragmente erfolgte in einem 1%-igen TBE- Agarose-Gel.
21. Zur Herstellung des Geles wurde die erforderliche Menge Agarose in 0,5 x TBE durch Aufkochen gelöst und nach Abkühlen bei 55°C in eine Flachbettapparatur mit eingesetztem PVC-Kamm zur Erzeugung der Probentaschen gegossen.
22. Der Kamm wurde nach Erstarren des Gels entfernt und die verdauten Blöckchen wurden vorsichtig in die Slots eingesetzt.
23. Eine dünne Scheibe von Lambda Ladder PFG-Marker ( 50 µg/ml von NEB, Schwalbach, Taunus, England) wurde als Größenstandard genutzt.
24. Befüllte Slots wurden mit erwärmter Agarose versiegelt und 15 min stehen gelassen.
25. Nach Befestigung der Umrandung in der PFGE-Kammer wurde das Gel in die Kammer gelegt.
26. Der Laufpuffer wurde vorsichtig in die Kammer gegossen.
27. Das Programm wurde anschließend bei einer Temperatur von 12°C, einem Spannungsgradienten von 6 V/cm bei eingeschlossenem Winkel von 120° auf Pulszeiten von 10 bis 20 sek. (Block I, 14 Stunden) sowie von 35 bis 70 sek. (Block II, 12 Stunden) eingestellt.
28. Nach der Beendigung der Auftrennung wurde das Gel in Ethidiumbromidlösung (1:20.000; 25 µl Ethidiumbromidstocklösung [10 mg/ml] auf 500 ml A. dest.) für 15 min gefärbt.
29. Das Entfärben erfolgte danach in A. dest. für 15 min.
Tabelle 5: Verdau der Blöckchen
ApaI Verdau AscI Verdau NotI Verdau
Puffer (NEB) 25 µl 25 µl 25 µl
BSA (NEB) 2,5 µl - 2,5 µl
ApaI 10 UI - -
AscI - 10 UI _
NotI - - 10 UI
A. dest ad. 250 µl 250 µl 250 µl
Ansätze mit ApaI wurden jeweils bei 25°C und Ansätze mit AscI und NotI bei 37°C über Nacht inkubiert.
3.11 Sequenzierung
Die Nukleotidsequenzierung wurde von der Firma Seqlab (Göttingen, Deutschland) an einem ABI-PRISM-Sequenziergerät (Modell 3700) mit der Kettenabbruchmethode nach SANGER (SANGER et al. 1992) durchgeführt. Die Sequenzanalyse wurde mit dem HUSAR Programm des deutschen Krebsforschungszentrums Heidelberg, Deutschland, durchgeführt.
3.12 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS) –Page
Die Puffer und die Lösungen zur SDS-Page Durchführung sind im Anhang aufgeführt (Kapitel 9.11)
1. Supplementiertes PPLO-Medium mit 0,1% Tween80 (10 ml) wurde mit Actinobacillus.
pleuropneumonie AP76 und A. pleuropneumonie ∆hlyX beimpft und über Nacht inkubiert.
2. 40 ml vorgewärmtes Medium wurden mit 10 ml einer Übernachtkultur beimpft und im Schüttler bis zu einer OD660 von 0,3 geschwenkt.
3. Bei Erreichen einer OD660 von 0,3 wurde eine Reinheitskontrolle durch Ausstreichen auf Blutagar durchgeführt.
4. Zwanzig ml aerobe Kultur wurden abzentrifugiert und das Pellet wurde bei – 20°C aufbewahrt; die verbleibenden 20 ml wurden für 3 Stunden in einen Anaerobiertopf (OXOID, Wesel, Deutschland) verbracht.
5. Nach Messung der OD660 der anaeroben Kulturen wurde der Koeffizient berechnet, um die OD an die der homologen aeroben Kulturen anzupassen.
6. Pellets der aeroben und anaeroben Kulturen wurden je in 200 µl A. dest resuspendiert;
7. Die Glasplatten wurden in einem Gießstand zusammengebaut.
8. Die Anfertigung der Gele erfolgte wie in Tabelle 6 beschrieben.
9. Die Gele wurden gegossen.
10. Zehn µl von jeder Bakteriensuspension und 10 µl Spaltpuffer wurden vermischt und bei 100°C für 5 min gekocht und anschliessend auf Eis gestellt.
11. Die Proben wurden geladen und die Elektrophorese im Mini-Protean II von BioRad bei 150 V für 1 Stunde durchgeführt.
Tabelle 6: Zusammensetzung des Polyacrylamidgeles
Trenngel Sammelgel
A. dest.
1,5 Tris (pH 8,8) 0,5 Tris (pH 6,8)
SDS (10%) TEMED Acrylamidlösung
10% APS
3,9 ml 2,5 mi
- 100 µl
10 µl 3,8 ml 100 µl
3,05 ml - 1,25 ml
50 µl 10 µl 0,65 ml
50 µl 3.13 Western Blot
Die Puffer, Lösungen und die Molekularmassenstandards sind im Anhang aufgeführt (Kapitel 9.12)
1. Die Gele wurden mittels Elektrotransfer in einer Biorad Transblot Apparatur auf Nitrozellulosemembranen geblottet; die Membranen wurden in Blockpuffer gelegt und im Kühlschrank über Nacht gelagert.
2. Der Blockpuffer wurde abgegossen und die Membran (ca. 100 cm2) wurde in 10 ml Blockpuffer und 50 µl Kaninchen-anti-DmsA-Antiserum (Endkonzentration: 1:2000,
BALTES et al. 2003) eingelegt und auf dem Schüttler für 1 Stunde bei Raumtemperatur geschwenkt.
3. Der Blockpuffer wurde abgegossen.
4. Die Membran wurde 3 x 5 min mit Waschpuffer gewaschen.
5. Zehn ml Waschpuffer und 20 µl 1 : 10 vorverdünntes alkalische Phosphatase-gekoppeltes Ziege-anti-Kaninchen-Konjugat (Dianova, Hamburg) wurden auf die Membran gegeben und auf dem Schüttler für 1 Stunde bei Raumtemperatur geschwenkt.
6. Die Membran wurde 2 x mit Waschpuffer gewaschen und anschließend 5 min mit Substratpuffer gewaschen.
7. 10 ml Substratpuffer + 100 µl 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat [(BCIP), 5 mg/ml] + 100 µl Nitroblau Tetrazolium [(NBT), 10 mg/ml) wurden auf die Membran gegeben und bis zum Erscheinen der Banden inkubiert.
3.14 Aspartase Test
Die Zusammensetzung des Aspartase-Puffers ist im Anhang aufgeführt (Kapitel 9.13).
1. Der Test-Puffer wurde im Wasserbad auf 37°C vorgewärmt.
2. Das Photometer wurde auf 240 nm einstellt.
3. Ein ml Aspartase-Puffer wurde in Quarzküvetten eingefüllt und die Absorption gemessen und notiert.
4. Es erfolgte die Zugabe von 50 µl Ganzzelllysat mit 1 mg /ml Proteingehalt.
5. Nach Messen des Nullwertes (Puffer) wurden die Werte alle 60 sek. gemessen.
3.15 Tierversuch 3.15.1 Versuchstiere
Die Untersuchungen wurden an 18 Schweinen der Rasse „Deutsche Landrasse“ im Alter von 7 bis 9 Wochen durchgeführt (Genehmigungsnummer für den Tierversuch: 009i-[neu]42502- 98/45). Die Tiere wurden durch Randomisierung in zwei Gruppen von je 9 Tieren eingeteilt und in Isolierställen mit separatem Lüftungssystem gehalten. Die Luftfeuchtigkeit und Temperatur wurden täglich kontrolliert. Die Tiere waren klinisch gesund und frei von Actinobacillus. pleuropneumoniae. Die serologische Untersuchung der Versuchstiere auf eine Actinobacillus. pleuropneumoniae Infektion erfolgte durch einen Enzyme-linked
