Die Puffer und die Lösungen zur SDS-Page Durchführung sind im Anhang aufgeführt (Kapitel 9.11)
1. Supplementiertes PPLO-Medium mit 0,1% Tween80 (10 ml) wurde mit Actinobacillus.
pleuropneumonie AP76 und A. pleuropneumonie ∆hlyX beimpft und über Nacht inkubiert.
2. 40 ml vorgewärmtes Medium wurden mit 10 ml einer Übernachtkultur beimpft und im Schüttler bis zu einer OD660 von 0,3 geschwenkt.
3. Bei Erreichen einer OD660 von 0,3 wurde eine Reinheitskontrolle durch Ausstreichen auf Blutagar durchgeführt.
4. Zwanzig ml aerobe Kultur wurden abzentrifugiert und das Pellet wurde bei – 20°C aufbewahrt; die verbleibenden 20 ml wurden für 3 Stunden in einen Anaerobiertopf (OXOID, Wesel, Deutschland) verbracht.
5. Nach Messung der OD660 der anaeroben Kulturen wurde der Koeffizient berechnet, um die OD an die der homologen aeroben Kulturen anzupassen.
6. Pellets der aeroben und anaeroben Kulturen wurden je in 200 µl A. dest resuspendiert;
7. Die Glasplatten wurden in einem Gießstand zusammengebaut.
8. Die Anfertigung der Gele erfolgte wie in Tabelle 6 beschrieben.
9. Die Gele wurden gegossen.
10. Zehn µl von jeder Bakteriensuspension und 10 µl Spaltpuffer wurden vermischt und bei 100°C für 5 min gekocht und anschliessend auf Eis gestellt.
11. Die Proben wurden geladen und die Elektrophorese im Mini-Protean II von BioRad bei 150 V für 1 Stunde durchgeführt.
Tabelle 6: Zusammensetzung des Polyacrylamidgeles
Trenngel Sammelgel
A. dest.
Die Puffer, Lösungen und die Molekularmassenstandards sind im Anhang aufgeführt (Kapitel 9.12)
1. Die Gele wurden mittels Elektrotransfer in einer Biorad Transblot Apparatur auf Nitrozellulosemembranen geblottet; die Membranen wurden in Blockpuffer gelegt und im Kühlschrank über Nacht gelagert.
2. Der Blockpuffer wurde abgegossen und die Membran (ca. 100 cm2) wurde in 10 ml Blockpuffer und 50 µl Kaninchen-anti-DmsA-Antiserum (Endkonzentration: 1:2000,
BALTES et al. 2003) eingelegt und auf dem Schüttler für 1 Stunde bei Raumtemperatur geschwenkt.
3. Der Blockpuffer wurde abgegossen.
4. Die Membran wurde 3 x 5 min mit Waschpuffer gewaschen.
5. Zehn ml Waschpuffer und 20 µl 1 : 10 vorverdünntes alkalische Phosphatase-gekoppeltes Ziege-anti-Kaninchen-Konjugat (Dianova, Hamburg) wurden auf die Membran gegeben und auf dem Schüttler für 1 Stunde bei Raumtemperatur geschwenkt.
6. Die Membran wurde 2 x mit Waschpuffer gewaschen und anschließend 5 min mit Substratpuffer gewaschen.
7. 10 ml Substratpuffer + 100 µl 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat [(BCIP), 5 mg/ml] + 100 µl Nitroblau Tetrazolium [(NBT), 10 mg/ml) wurden auf die Membran gegeben und bis zum Erscheinen der Banden inkubiert.
3.14 Aspartase Test
Die Zusammensetzung des Aspartase-Puffers ist im Anhang aufgeführt (Kapitel 9.13).
1. Der Test-Puffer wurde im Wasserbad auf 37°C vorgewärmt.
2. Das Photometer wurde auf 240 nm einstellt.
3. Ein ml Aspartase-Puffer wurde in Quarzküvetten eingefüllt und die Absorption gemessen und notiert.
4. Es erfolgte die Zugabe von 50 µl Ganzzelllysat mit 1 mg /ml Proteingehalt.
5. Nach Messen des Nullwertes (Puffer) wurden die Werte alle 60 sek. gemessen.
3.15 Tierversuch 3.15.1 Versuchstiere
Die Untersuchungen wurden an 18 Schweinen der Rasse „Deutsche Landrasse“ im Alter von 7 bis 9 Wochen durchgeführt (Genehmigungsnummer für den Tierversuch: 009i-[neu]42502-98/45). Die Tiere wurden durch Randomisierung in zwei Gruppen von je 9 Tieren eingeteilt und in Isolierställen mit separatem Lüftungssystem gehalten. Die Luftfeuchtigkeit und Temperatur wurden täglich kontrolliert. Die Tiere waren klinisch gesund und frei von Actinobacillus. pleuropneumoniae. Die serologische Untersuchung der Versuchstiere auf eine Actinobacillus. pleuropneumoniae Infektion erfolgte durch einen Enzyme-linked
Immunosorbent Assay (ELISA; (LEINER et al. 1999)). Sie wurden einmal täglich gefüttert und erhielten Wasser ad libitum.
3.15.2 Herstellen der Bakteriensuspension für die Aerosolbelastung
Supplementiertes PPLO-Medium (je 10 ml) mit 0,1 % Tween 80 wurde jeweils mit Actinobacillus. pleuropneumoniae wt und der A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante beimpft und im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 über Nacht inkubiert. Diese Standkulturen von Actinobacillus. pleuropneumoniae wt und A. pleuropneumoniae∆hlyX wurden am nächsten Tag zur Inokulation von 90 ml supplementiertem PPLO-Medium mit 0,1 % Tween 80 verwendet; die Kulturen wurden im Schüttler bei 37°C bis zum Erreichen einer OD660 von 0,4 angezüchtet. Die Kulturen wurden auf Eis gestellt, mit eiskaltem NaCl (150 mM) 1:300 verdünnt und bis zur Belastung auf Eis aufbewahrt. Kurz vor der Belastung wurde eine weitere Verdünnung 1:100 mit eiskaltem NaCl (150 mM) angefertigt; dann wurden 13 ml dieser Bakteriensuspension pro 4 Schweine vernebelt (das enspricht etwa 1 x 105 Erreger/ml).
Bei dieser Vorgehensweise wird eine Erregerdichte von etwa 1 x 103 A. pleuropneumoniae pro Liter Aerosol in der Kammer (siehe unten) erreicht.
3.15.3 Aerosolkammer und Infektion
Die Infektion erfolgte in einer Aerosolkammer, die vom Impfstoffwerk Dessau nach Beschreibungen von JACOBSEN et al. (1996) gebaut wurde. Die Tiere wurden jeweils in Gruppen von 4 oder 5 Tiere belastet, wobei 13 ml Bakteriensuspension (ca. 1 x 105 /ml) mit einem Druck von 2 bar in ca. 2 min vernebelt wurden. Für das Vernebeln wurde die Düse Modell Nr. 97058 (Schlick Duesen, Untersiemau, Deutschland) auf Position „5“ und das Ventil auf Position „75“ eingestellt. Nach weiteren 10 min wurde das Aerosol mittels eines Kompressors 20 min lang aus der Kammer abgepumpt. Anschließend wurden die Tiere in die Ställe zurückgetrieben.
3.15.4 Überwachung und Erhebung klinischer Parameter
Einen Tag vor der Belastung wurde mit der Erhebung der klinischen Parameter begonnen;
dies wurde täglich bis Tag 7 nach der Belastung weitergeführt. Die klinischen Parameter Körpertemperatur, Husten, Dyspnoe, Lethargie und Grad der Inappetenz wurden erhoben.
3.15.5 Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit (BALF)
Zur Gewinnung der BALF wurden die Tiere mit einem Gemisch von Azaperon (Stresnil, Janssen GmbH, Neuss, Deutschland; 2mg/kg Körpergewicht) und Ketamin (Ursotamin, Serumwerk Bernburg Ag, Bernburg; 15 mg/kg Körpergewicht) intramuskulär anästhesiert.
Nach Fixierung der Tiere wurde die BALF mit Hilfe eines flexiblen Bronchoskops (Typ XP20, Fa. Olympus, Hamburg, Deutscland) nach Einführung bis zum Bronchus des rechten Kraniallappens gewonnen. Einhundert ml lauwarme (30°C) NaCl-Lösung wurden in Portionen von 20 ml eingegeben und wieder abgesaugt. Eine spezielle Saugpumpe (Endoaspirator, Fa Georg Paudrach, Hannover, Deutschland) erzeugte ein Vakum von 0,2 bis 0,5 bar und gewährleistete somit die Rückgewinnung der Spülflüssigkeit (ca. 90 ml BALF wurden pro Spülung und Tier gewonnen und bis zum Erregernachweis auf Eis gestellt).
3.15.6 Bakteriologischer Erregernachweis aus BALF
Ein ml BALF wurde bei 5.000 rpm für 2 Minuten zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde in 60 µl NaCl (150 mM) resuspendiert. Zwanzig µl dieser Suspension wurden auf Gassner-Platte, Columbia Schafblut (CSB)-Agar und auf supplementiertem PPLO-Agar ausplattiert.
Die Platten wurden am nächsten Tag ausgewertet. A. pleuropneumoniae zeigt ein minimales Wachstum mit Hämolyse auf der CSB-Platte und ein gutes Wachstum auf der supplementierten PPLO-Agar-Platte. Erhaltene A. pleuropneumoniae-Kolonien wurden gezählt, auf supplementiertem PPLO-Agar subkultiviert und mittels PCR-Analyse unter Verwendung der Primer oHLYX6 und oHLYX7 bestätigt.
3.15.7 Sektion
Die Versuchtiere wurden nach BALF Gewinnung am Tag 21 mit einer intravenöse Injektion von 10 ml Eutha 77 (Pentobarbital, Essex Pharma, München, Deutschland) euthanasiert.
Nach Eröffnung des Brustkorbes wurden die Organe entnommen und die Veränderungen makroskopisch durch Adspektion und Palpation bewertet. Von jedem Lungenlappen wurde eine Probe für die bakteriologische Untersuchung entnommen. Die Lungenveränderungen wurden nach der Methode von HANNAN et al. (HANNAN et al. 1982) beurteilt. Die Methode beruht auf einem “scoring“-System, wobei “scores“ von maximal 5 (komplett verändert) für jeden Lappen und somit 35 (maximal) pro Lunge zu erreichen sind. Zur Ermittlung des Lungen-„score“ sind die einzelnen Lungenlappen in Dreiecksfelder unterteilt
und einzelne Lungenläsionen werden auf den korrespondierenden Dreiecksfeldern markiert.
Die Zählung der veränderten Dreiecken ergibt den Grad der Läsion, der dann als „score“
ausgedrückt wird. Die Summe aller Lappen- „scores“ ergibt den “lung lesion score“
(HANNAN et al. 1982). Die Europäische Pharmakopoe schreibt diese Methode für Impfstoff-Versuche mit A. pleuropneumoniae vor.
3.15.8 Bakteriologische Organuntersuchung
Proben von verändertem und intaktem Lungegewebe, von Tonsillen und von Tracheobronchallymphknoten wurden zum bakteriologischen Erregernachweis verwendet.
Die Gewebeproben wurden nach dem Abflammen angeschnitten und auf CBS und Selektivagar (Zusammensetzung im Anhang, Kapitel 9.2) fraktioniert ausgestrichen. Die Platten wurden im Brutschrank bei 37°C, 5% CO2 über Nacht bebrütet. Die Platten wurden folgendermaßen ausgewertet: (-) keine A. pleuropneumoniae -verdächtigen Kolonien, (+) Actinobacillus. pleuropneumoniae-Kolonien nur im direkt beimpfen Bereich, (+ +) Actinobacillus. pleuropneumoniae-Kolonien auch im Bereich der 1 Fraktionierung und (+ + +) A. pleuropneumoniae-Kolonien auch im Bereich der 2. Fraktionierung).
Für die semiquantitative Bestimmung von A. pleuropneumoniae aus Lungenläsionen wurden 2 g Sequesternmaterial pro Tier aus 2 Läsionen entnommen und auf Eis gestellt. Hundert mg des Materials wurden in Schraubdeckeleppendorfreaktionsgefäße abgefüllt und 5-6 große Glaskugeln und 1 ml physiologische Kochsalzlösung wurden hinzugegeben. Das Gewebe wurde mit dem FastPrep Gerät aufgeschlossen (Stufe 3, 40 sec). Von der Suspension wurden 20 µl entnommen und eine logarithmische Verdünnungsreihe (Doppelansatz) wurde angelegt.
Von den Verdünnungsstufen (unverdünnt bis 10-7) wurden je 25 µl auf supplementierten PPLO-Agar aufgetropft und über Nacht inkubiert. Erhaltene A. pleuropneumoniae-Kolonien wurden gezählt, auf supplementiertem PPLO-Agar subkultiviert und mittels PCR-Analyse unter Verwendung der Primer oHLYX6 und oHLYX7 bestätigt.
3.15.9 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay )
Die Immunantwort der Versuchtiere wurde mittels eines ELISA ermittelt. Die Methode zur Bestimmung des ApxIIA-Toxin-Antikörpertiters beruht auf einem standardisierten ELISA mit einem rekombinanten A. pleuropneumoniae ApxIIA-Protein als Antigen (LEINER et al.
1999). Der ELISA wurde von der IVD (Innovative Veterinärdiagnostik, GmbH, Aninstitut, Tierärztliche Hochschule Hannover) duchgeführt.
3.15.10 Statistik
Für die statistische Auswertung wurde das WinStat Plug-in Modul (R. Fitch Software, Staufen, Deutschland) für Excel benutzt. Werte von p < 0,05 im Wilcoxon-Test wurden als signifikant bewertet.
4 Ergebnisse
4.1 Konstruktion und Charakterisierung der A. pleuropneumoniae hlyX Deletionsmutante
4.1.1 Konstruktion des Plasmids pHLYX701 für die Konjugation
Das hlyX-Gen wurde mit den Primern oHLYX5 und oHLYX6 innerhalb eines 2338 bp großen Fragment amplifiziert (Abb. 1) und über eine Zwischenklonierung in einen pCR-2.1 TOPO Vektor in pBluescript Sk+ zur Konstruktion von pHLYX110 eingebaut. Dann wurden 883 bp des hlyX-Genes in pHLYX110 mit den Enzymen BglII und XcmI ausgeschnitten (Abb. 1). Die Überhänge wurden mit Klenow-Fragment aufgefüllt und zu pHLYX111 ligiert (Abb.2). Das deletierte hlyX-Gen wurde anschließend mit ApaI und NotI aus pHLYX111 herausgeschnitten und in den ebenso geschnittenen Konjugationsvektor pEMOC2 ligiert.
Hierbei entstand das Plasmid pHLYX701(Abb. 2).
Abbildung 1: hlyX Gen mit Primern und Restriktionssenzymschnittstellen
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Konstruktion von pHLYX701
4.1.2 Konstruktion der isogenen A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante
Das Plasmid pHLYX701 wurde in E. coli β2155 transformiert und anschließend in
Actinobacillus. pleuropneumoniae wt konjugiert. Transkonjuganden (chloramphenicolresistente A. pleuropneumoniae Kolonien mit dem in das Chromosom
integrierten Plasmid) wurden mittels PCR mit den Primern oHLYX7 und oHLYX8 bestätigt;
diese Transkonjuganden wurden dann für die Saccharose Gegenselektion verwendet.
Saccharoseresistente Kolonien wurden auf Chloramphenicolsensitivität hin untersucht.
Saccharoseresistente, chloramphenicolsensitive Kolonien wurden mittels PCR auf die Anwesenheit des deletierten hlyX-Gens hin überprüft.
4.1.3 Analyse der isogenen A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante 4.1.3.1 Genetische Überprüfung von A. pleuropneumoniae ∆hlyX
Saccharoseresistente chloramphenicolsensitive A. pleuropneumoniae ∆hlyX wurden mittels PCR mit den Primern oHLYX6 und oHLYX7 mit dem Elternstamm A. pleuropneumoniae wt
Abbildung 3: A, PCR mit Primer oHLYX5 und oHLYX6; B, PFGE Analyse von A. pleuropneumoniae wt und A. pleuropneumoniae ∆hlyX ; C, Southern Blot nach Verdau mit DraI; 1, A. pleuropneumoniae AP76; 2, A. pleuropneumoniae ∆hlyX.
verglichen. Die korrekte Lokalisation der Deletion wurde am PCR-Produkt mittels Nukleotidsequenzierung überprüft. Das deletierte hlyX-Gen weist eine Größe von 578 bp gegenüber 1461 bp beim Wildtyp auf (Abb. 3A). Zusätzlich wurde eine Pulsfeldgelelektrophorese nach Restriktionsverdau mit ApaI, AscI und NotI durchgeführt. Es zeigte sich eine Übereinstimmung des Bandenmusters der A. pleuropneumoniae ∆hlyX-Mutante mit dem von A. pleuropneumoniae wt (Abb. 3B). Weiterhin wurde genomische DNA von A. pleuropneumoniae wt und A. pleuropneumoniae ∆hlyX mit DraI verdaut und im Southern Blot durch Hybridisierung einer mit den Primern oHLYX5 und oHLYX6 konstruierten Gensonde überprüft. Die DraI-Schnittstelle liegt innerhalb der Deletion, was dazu führt, dass im Blot beim A. pleuropneumoniae wt zwei (979 bp und 1368 bp) und bei Actinobacillus pleuropneumoniae ∆hlyX nur eine Bande (1455 bp) zu sehen sind (Fig. 3C).
Eine anschließende Southern Blot Analyse erlaubte, die Lage des hlyX-Gen im Bereich der Überlappung der Fragmente Asc3, ApaI und Not8 auf der physikalischen Genkarte zu lokalisieren (Abb. 4).
Abbildung 4: Position des hlyX-Gen auf der physikalischen Karte von A. pleuropneumoniae AP76
4.1.3.2 Funktionelle Überprüfung der A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante
Da A. pleuropneumoniae unter anaeroben Bedingungen zur Verklumpung neigt, wurden die Trockengewichte der Pellets für den Wachstumsvergleich herangezogen. Unter anaeroben Verhältnissen zeigte A. pleuropneumoniae ∆hlyX ein signifikant reduziertes Wachstum nach 16 h Inkubationszeit zum Vergleich zu A pleuropneumoniae wt (p< 0,01). Das Trockengewicht des Pellets der Mutante war im Vergleich zum Wildtyp um 37,3 % reduziert (A. pleuropneumoniae wt 21,7 mg ± 1,15; A. pleuropneumoniae ∆hlyX 13,6 mg ± 0,5; p <
0,01; Abb. 5).
0 5 10 15 20 25
mg
Mittelwert
Pelletgewicht
A. pp hlyX
Abbildung 5: Vergleich der Trockengewichte von A. pleuropneumoniae wt (A.pp) und A. pleuropneumoniae ∆hlyX (hlyX) nach Kultivierung unter anaeroben Bedingungen;
dargestellt ist der Mittelwert aus 5 Untersuchungen.
Um die Spezifität der hlyX-Mutation zu überprüfen und um eventuelle polare Effekte auszuschließen, wurde eine Komplementierung von A. pleuropneumoniae ∆hlyX mit dem ganzen hlyX-Gen vorgenommen. Dazu wurde das hlyX-Gen mittels PCR mit den Primern oHLYX9 und oHLYX10 auf einem 747 bp großen Fragment amplifiziert und in den Plasmidvektor pLS88 transformiert; dieser Vektor hat ein breites Wirtsspektrum und kann in E. coli und in A. pleuropneumoniae replizieren. Die beiden aus der Ligation resultierenden Plasmide, pHLYX1300 (Orientierung in Richtung des vor der Ligationsstelle liegenden
Promotors) und pHLYX1301 (umgekehrte Orientierung) mit dem intakten hlyX-Gen, dienten zur Komplementierung von A pleuropneumoniae ∆hlyX (Abb. 6).
Abbildung 6: Konstruktion der Plasmide für die Komplementierung der A. pleuropneumoniae lyX-Mutante
Zur Überprüfung der Wiederherstellung der HlyX-Aktivität wurde zum einen die Anwesenheit der DMSO-Reduktase durch Western Blot Analyse nach Anzucht unter anaeroben Bedingungen geprüft; dabei wurde festgestellt, dass beide Plasmide eine Transkription des dmsA Gens vermittelten (Abb. 7).
Abbildung 7: Western Blot Analyse der anaeroben DmsaA-Expression. A: Coomassie Blau gefärbtes Gel; B: Western Blot Analyse; 1 A; pleuropneumoniae wt; 2 A. pleuropneumonie ∆hlyX, 3 A. pleuropneumonie ∆hlyX + pHLYX1300;
A. pleuropneumonie ∆hlyX + pHLYX1301 (links unter Standardbedingungen und rechts unter anaeroben Bedingungen gewachsen).
Zum anderen wurde die Aktivität der Aspartase nach Anzucht unter anaeroben Bedingungen untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass die Aspartase-Aktivität nur durch die Komplementierung mit dem Plasmid pHLYX1300 (Orientierung in Richtung des vor der Ligationsstelle liegenden Promotors) rekonstituiert werden konnte (Tabelle 7).
Tabelle 7: Überprüfung der Aspartaseaktivität in A. pleuropneumoniae wt, A. pleuropneumoniae
∆hlyX und A. pleuropneumoniae ∆hlyX komplementiert „in trans“ unter Verwendung der Plasmide pHLYX1300 und pHLYX1301
Stämme Aspartaseaktivität anaerob
(relative Aktivität) A. pleuropneumoniae wt
A. pleuropneumoniae ∆hlyX
A. pleuropneumoniae ∆hlyX + pHLYX1300 A. pleuropneumoniae ∆hlyX + pHLYX1301
191a 106a 213 118
a Arithmetischer Mittelschnittwert von 3 unabhängigen Messungen von A. pleuropneumoniae wt und A. pleuropneumoniae ∆hlyX
4.2 Überprüfung von A. pleuropneumoniae ∆hlyX in der experimentellen Aerosolinfektion
Die A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante wurde durch Aerosolinfektion im Tierversuch mit Actinobacillus. pleuropneumoniae wt verglichen. Die Belastungsdosis betrug 6,76 x 104 Bakterien für 4 Schweine in der Aerosolkammer in der A. pleuropneumoniae Wt-Gruppe und 5,98 x 104 in der A. pleuropneumoniae ∆hlyX-Gruppe. Die Infektion führte zu einer Erhöhung der Körpertemperatur auf 40°C oder höher am Tag 1 nach der Infektion bei 4 von 9 Tieren in der A. pleuropneumoniae ∆hlyX-Gruppe gegenüber 6 von 8 Schweinen in der Actinobacillus. pleuropneumoniae wt-Gruppe. An den Tagen 2, 3 und 4 nach der Infektion waren die Körpertemperaturen in der A. pleuropneumoniae ∆hlyX –Gruppe signifikant niedriger ( p< 0,05) als in der A. pleuropneumoniae wt-Gruppe (Abb. 8). In der an Tag 21 post infectionem entnommenen BALF von Tieren in der A. pleuropneumoniae ∆hlyX–Gruppe konnte A. pleuropneumoniae ∆hlyX nicht nachgewiesen werden. Dagegen wurde Actinobacillus. pleuropneumoniae wt aus der BALF von 5 Tieren in der A. pleuropneumoniae wt-Gruppe reisoliert.
In der Wildtypgruppe starb ein Tier an infektionsbedingtem Kreislaufversagen 2 Tage nach der Belastung. Alle überlebenden Tiere wurden 21 Tage nach der Belastung euthanasiert. Bei der Obduktion wiesen 6 von 9 Tieren aus der A. pleuropneumoniae ∆hlyX -Gruppe keinerlei makroskopisch erkennbaren Lungenläsionen auf; dagegen hatten nur 2 von 8 Tiere in der Actinobacillus. pleuropneumoniae wt-Gruppe keine sichtbaren Lungenveränderungen. Die vorhandenen Läsionen bei den verbleibenden Schweinen waren weniger ausgeprägt nach der Infektion mit A. pleuropneumoniae ∆hlyX. Die histologische Untersuchungen zeigte keine
signifikanten Unterschiede zwischen beiden Gruppen. Die Unterschiede in den „lung lesion scores“ waren statistisch signifikant (p< 0,05; Abb. 8).
Abbildung 8: Vergleich der Körpertemperaturen und „lung-scores“ bei Schweinen mit A. pleuropneumoniae wt (AP76) und A. pleuropneumoniae ∆hlyX (hlyX) Infektionen;
A : Körpertemperatur der Tiere der A. pleuropneumoniae ∆hlyX und A. pleuropneumoniae wt Gruppen nach der Infektion. Tag 0 ist der Tag der Infektion;
B: „lung-scores“ der Schweine der A. pleuropneumoniae ∆hlyX und A. pleuropneumoniae wt Gruppen 21 Tage nach der Infektion; Sternchen zeigen signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen an (p < 0,05).
Die A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante konnte nach der Infektion nur in verändertem Lungengeweben von 2 der 3 Tiere mit Lungenläsionen in Anzahlen von 2,6 x 105 und 3,4 x 105 KBE pro Gramm Gewebe reisoliert werden. Aus Tonsille und makroskopisch intakter Lunge konnte A. pleuropneumoniae ∆hlyX nicht nachgewiesen werden. In der Actinobacillus. pleuropneumoniae Wildtypgruppe wurde A. pleuropneumoniae in allen veränderten Lungengeweben von den 6 Tieren mit Lungenläsionen reisoliert. Die Anzahl der Erreger im veränderten Gewewebe war deutlich geringer bei Tieren aus der Actinobacillus. pleuropneumoniae hlyX-Gruppe als bei Tieren aus der A. pleuropneumoniae Wt-Gruppe. Die Bestimmung der Reisolierungskeimzahl war aufgrund des Vorliegens von Mischkulturen nur bei 4 Tieren erfolgreich und lag zwischen 4,6 x 106 und 4,0 x 107 koloniebildenden Einheiten (KBE) pro Gramm Gewebe. Zusätzlich konnten von den 8 Tieren in der Wildtypgruppe A. pleuropneumoniae in makroskopisch unveränderten Lungen bei 7 Tieren, in tracheobronchalen Lymphknoten bei 4 Tiere und in den Tonsillen bei 6 Tiere nachgewiesen werden (von 6,2 x 104 KBE/g bis 3,0 x 107 KBE/g).
Tabelle 8: Virulenzvergleich zwischen A. pleuropmeumoniaewt und A. pleuropmeumoniae ∆hlyX
4.3 Humorale Immunantwort
Eine Woche vor und 3 Wochen nach der Infektion wurden Serumproben gewonnen. In der App∆hlyX-Gruppe waren nur die 3 Tiere mit Lungenläsionen serologisch positiv im ApxIIA-ELISA-Test; dagegen waren alle überlebenden Tiere aus der Appwt-Gruppe serologisch positiv.
5 Diskussion
Der Erreger A. pleuropneumoniae verursacht eine Pleuropneumonie, die infolge der hohen Mortalität und der verminderten Gewichtzuhname chronisch kranker Tiere eine wirtschaftlich bedeutsame Erkrankung in der Schweinehaltung darstellt. Die Persistenz von A. pleuro- pneumoniae auch bei geimpften Tieren (FENWICK u. HENRY 1994) und die mangelnde Kreuzprotektivität der Impfstoffe sind zwei Faktoren, die zunehmend an Bedeutung gewonnen haben. Auch Tiere, die eine A. pleuropneumoniae-Erkrankung überlebt haben, beherbergen trotz einer belastbaren Immunität weiterhin den Erreger und spielen als „Carrier“
eine entscheidende Rolle in der Verbreitung der Schweinepleuropneumonie (EUZÉBY 1998;
FENWICK u. HENRY 1994; RIOUX et al. 1997).
Im Rahmen der Entwicklung von Lebend-Markerimpfstoffen wurden bisher unter anderem Deletionen in folgenden Genen erstellt und überprüft: eine nicht hämolysierende Mutante (INZANA et al. 1991), eine ureasenegative Mutante (BALTES 2002; TASCON CABRERO et al. 1997), eine ApxII-Toxin Mutante (PRIDEAUX et al. 1999), eine Urease und ApxII Doppelmutante (TONPITAK et al. 2002), eine Urease- und ExbB-negative Doppelmutante (BALTES 2002); eine dmsA Mutante (BALTES et al. 2003), eine hybB Mutante (BALTES u.
GERLACH 2004), eine TbpA und TbpB Doppelmutante (BALTES 2002), eine dmsA aspA Doppelmutante (JACOBSEN et al. 2005).
Wie von BALTES et al. (2003) und von JACOBSEN et al. (2005) gezeigt wurde, werden die Actinobacillus. pleuropneumoniae DMSO Reduktase und die Aspartase unter dem Einfluss von BALF hochreguliert. Beide Enzymen sind an der anaerober Atmung beteiligt. Putative HlyX-Bindungsstellen wurden bei dmsA und aspA gefunden. Die Deletion des dmsA und des aspA Gens führen zur Attenuierung von A. pleuropneumoniae im Organismus (BALTES et al.
2003; JACOBSEN et al. 2005). Bei E. coli werden diese beiden Enzyme durch den globalen Regulator FNR reguliert (COTTER u. GUNSALUS 1989; JERLSTROEM et al. 1987;
WOODS u. GUEST 1987). Das FNR-Protein enthält bei E. coli vier Eisen-Schwefel-Gruppen und induziert die Expression vieler Gene, deren Produkte am anaeroben Stoffwechsel beteiligt sind, bei gleichzeitiger Senkung der Expression von Genen, deren Produkte am aeroben Stoffwechsel beteiligt sind (BAUER et al. 1999).
Bei A. pleuropneumoniae wurde HlyX als das Homolog von FNR identifiziert (MACINNES et al. 1990). Die Analyse der Aminosäuresequenz von HlyX zeigt eine Region, die praktisch identisch mit der DNA-Bindungsregion von FNR ist, und sich nur in einem einfachen konservativen Aminosäureaustausch unterscheidet (MACINNES et al. 1990). Die
Hochregulierung von DMSO-Reduktase und Aspartase im ex vivo Modell (BALTES et al.
2003; JACOBSEN et al. 2005) führte zu der Hypothese, dass eine hlyX-Deletion eine Attenuierung und Verhinderung der Persistenz herbeiführen könnte.Das Ziel der Arbeit war es somit, die Rolle des hlyX-Genes in der Virulenz von A. pleuropneumoniae und bei der Kolonisierung zu ermitteln.
Die Arbeit beruht auf der Konstruktion einer isogenen hlyX Mutante mit einer Deletion von 883 bp, die mittels Rekombination und anschließender Saccharose-Gegenselektion (OSWALD et al. 1999) durchgeführt wurde. Die Deletion wurde durch PCR-Analyse und nachfolgende Nukleotidsequenzierung des PCR-Produktes von A. pleuropneumoniae ∆hlyX überprüft. Das deletierte hlyX-Gen hatte die vorhergesagte Grösse von 578 bp gegenüber 1461 bp beim Wildtyp. Der Verdau der genomischen DNA von A. pleuropneumoniae ∆hlyX und von A. pleuropneumoniae wt mit DraI zeigte im Southern Blot wie erwartet zwei Banden von 979 bp und 1368 bp bei dem Elternstamm und eine Bande von 1455 bp bei der Mutante.
Gleichzeitig zeigte die Übereinstimmung des Bandenmusters von A. pleuropneumoniae ∆hlyX und A. pleuropneumoniae wt in der Pulsfeldgelelektrophorese, dass keine starken genomischen Umlagerungen stattgefunden haben. Diese Ergebnisse belegen auf DNA-Ebene, dass die gewünschte Mutante vorliegt.
Die isogene A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante zeigte ein reduziertes Wachstum in vitro
Die isogene A. pleuropneumoniae hlyX-Mutante zeigte ein reduziertes Wachstum in vitro