Untersuchungen zu Wirt-Erreger-Interaktionen bei der Pathogenese der porzinen Pleuropneumonie

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Aus der

Klinik für kleine Klauentiere

und forensische Medizin und Ambulatorischen Klinik der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Doris Höltig

Untersuchungen zu Wirt-Erreger-Interaktionen bei der Pathogenese der porzinen

Pleuropneumonie

Hannover, 2019

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Printed in Germany

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Aus der

Klinik für kleine Klauentiere und forensische Medizin und Ambulatorischen Klinik

der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Untersuchungen zu Wirt-Erreger-Interaktionen bei der Pathogenese der porzinen Pleuropneumonie

Habilitationsschrift zur Erlangung der Venia Legendi

an der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

vorgelegt von Doris Höltig, Dr. med. vet.

Hannover 2019

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Meiner Mutter

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„Sage, was du weißt, tue, was du musst, geschehe, was geschehen soll”.

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Vorwort

Vorwort

Die porzine Pleuropneumonie ist eine seit langem bekannte Atemwegserkrankung des Schweins mit weltweiter Verbreitung. Bereits um 1885 wurde die sog.

Brustentzündung des Schweins als Erkrankung von Lunge und Brustfell mit den für die Erkrankung typischen Symptomen und möglichen Erkrankungsverläufen in veterinärmedizinischen Lehrbüchern beschrieben. Trotz der Identifikation des verursachenden Erregers, Actinobacillus pleuropneumoniae, in 1957 und der Tatsache, dass der Erreger seit Mitte der 60er Jahre des 20. Jahrhunderts Gegenstand veterinärmedizinischer Forschung ist, gestaltet sich die Entwicklung von nachhaltigen und effizienten Bekämpfungsstrategien weiterhin als schwierig. Die antibiotische Therapie der klinisch manifesten Erkrankung stellt dabei weiterhin eine zentrale Methode zur Bekämpfung der porzinen Pleuropneumonie dar. Vor dem Hintergrund der stetig ansteigenden Zahl antibiotikaresistenter Isolate des Erregers ist es jedoch zwingend notwendig, alternative Therapiestrategien zu etablieren.

Hierfür sind jedoch detaillierte Kenntnisse der Wirt-Erreger-Interaktionen sowie die Identifikation zentraler Interaktionsknotenpunkte notwendig, um möglichst frühzeitig die Abläufe der Pathogenese unterbrechen zu können. Diese Habilitationsschrift fasst daher Untersuchungen zur Kolonisation verschiedener Organe des Schweins durch den Erreger, Untersuchungen zu Abwehrmechanismen des Wirtes als auch zur Etablierung der Infrarotthermographie zum berührungslosen Monitoring früher Entzündungsprozesse im Lungengewebe bei lebenden Schweinen zusammen. Die dargestellten Arbeiten bieten Erkenntnisse zur Identifikation der zentralen Interaktionsmechanismen zwischen Wirt und Bakterium, die die Effizienz der dauerhaften Besiedlung des Schweineorganismus durch das Bakterium aber auch den Schweregrad der entstehenden klinischen Erkrankung regulieren. Sie stellen somit eine Grundlage für die Entwicklung neuer, alternativer Therapien und Präventionsstrategien dar.

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Verzeichnisse

Inhaltsverzeichnis

Liste der verwendeten Publikationen ... 1

Einleitung und wissenschaftlicher Hintergrund ... 7

Krankheitsbilder ... 8

Actinobacillus pleuropneumoniae ... 11

Bekämpfungsstrategien ... 14

Aktuelle Strategien: Impfung oder Antibiose ... 15

Genetische Resistenz ... 19

Themenkomplexe ... 22

I. Nicht-invasive Diagnostik... 22

II. Kolonisationsverhalten von A. pleuropneumoniae ... 23

III. Mechanismen zur Abwehr einer A.-pleuropneumoniae-Infektion ... 23

Ergebnisse ... 24

I. Nicht-invasive Diagnostik... 24

II. Kolonisationsverhalten von A. pleuropneumoniae ... 29

III. Mechanismen zur Abwehr einer A.-pleuropneumoniae-Infektion ... 35

Übergreifende Diskussion ... 43

Zusammenfassung ... 63

Summary ... 66

Literaturverzeichnis ... 69

Danksagung ... 83

Anhang ... 85

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Verzeichnisse

Abkürzungsverzeichnis

A. pleuropneumoniae Actinobacillus pleuropneumoniae

Abd1 abdominale Messregion 1

Abd2 abdominale Messregion 2

ANGPT1 Angiopoietin 1

BALF Bronchoalveolar Lavage Fluid

°C Grad Celsius

CD3 Cluster of differentiation 3 CD14 Cluster of differentiation 14 CD79 Cluster of differentiation 79 CD164 Cluster of differentiation 164 CHI3L1 Chitinase 3 like 1 Protein Col21A1 Kollagen Typ XXI, alpha 1 Col4A3 Kollagen Typ IV, alpha 3

CT Computertomographie

C4A Komplement Faktor 4A

EFL Epithel lining fluid

eQTL Expression quantitative trait loci

FCGR2B Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b

Fe Eisen

F2 2. Filialgeneration

GSEA Gene Set Enrichment Analysis

HD Hohe Infektionsdosis

HP Haptoglobin

Iba-1 Ionized calcium-binding adapter molecule 1

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Verzeichnisse

ICAM-1 Intercellular adhesion molecule 1

ICR Intercostalraum

IgA Immunglobulin A

IgG Immunglobulin G

IHC Immunhistochemie

IKK IκB Kinase

IL-6 Interleukin 6

IL-10 Interleukin 10

IL-18 Interleukin 18

IRT Infrarotthermographie

KbE Kolonie-bildende Einheiten

lbl Lamellarkörperchen-artige Strukturen

LD Niedrige Infektionsdosis

LPS Lipopolysaccharide

MAdCAM-1 Mucosal vascular addressin cell adhesion molecule 1

ml Milliliter

mlv multilamellare Vesikel

Mn Mangan

MPO Myeloperoxidase

MYD88 Myeloid differentiation primary response 88

n Anzahl

NAD Nicotinamidadenindinukleotid

NF-κ-B nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells

OCS Organ-Care-System

OMPs Outer membrane proteins

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Verzeichnisse

PalA Peptidoglycan-assoziiertes Protein

PECAM-1 Thrombozyten-Endothel-Adhäsionsmolekül 1

p.inf. post infectionem

PRDC Porziner Respiratorischer Erkrankungskomplex QTL Quantitative trait loci

RAB6B Ras-related protein 6B

RHS Respiratory Health Score

RTX Repeat-in-toxin

ROI Region of interest

ROS Reactive oxygene species

RUNX1 Runt-related transcription factor 1 SLC39A14 Solute carrier family 39 member 14

SOD2 Superoxid Dismutase 2

sog. sogenannt

SP-A Surfaktantprotein A

SP-B Surfaktantprotein B

SP-C Surfaktantprotein C

SP-D Surfaktantprotein D

SSc Chromosom

STAT Signal transducer and activator of transcription S100A9 S100 Calcium-bindendes Protein A9

S100Z S100 Calcium-bindendes Protein Z TAA Trimerische Autotransportersysteme

TAK1 Transforming growth factor-β-Activated Kinase 1

TCN-1 Transcobalamin-1

TF Transferrin

TFRC Transferrin-Rezeptor 1

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Verzeichnisse

TLR-2 Toll-like Rezeptor 2 TLR-4 Toll-like Rezeptor 4

TRAF6 TNF Receptor-Associated Factor 6 TTF-1 Thyroid transcription factor 1

tm tubuläres Myelin

ulv unilamellare Vesikel

UBIQ Ubiquitin

UPK1B Uroplakin1B

VCAM Vascular cell adhesion protein 1

Vv Volumendichte

YadA Yersinia enterocolitica Adhäsin

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Verzeichnisse

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Makroskopische Gewebeveränderungen nach A.-pleuropneumoniae-Infektion.

... 10

Abbildung 2: Lungengewebsalterationen nach A.-pleuropneumoniae-Infektion (Hämatoxilin- Eosin-Färbung). ... 12

Abbildung 3: Extracorporale antibiotische Behandlung einer Schweinelunge im OCS nach P.-aeruginosa-Infektion. ... 17

Abbildung 4: Mechanismen der natürlich-vorkommenden Krankheitsresistenz. ... 21

Abbildung 5: Hauptinteraktionswege zwischen Erreger und Wirt zur Regulation der porzinen Pleuropneumonie.... 59

Abbildung 6: Interventionszeitpunkte von Bekämpfungsstrategien in Bezug zum

Krankheitsverlauf. ... 61

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: RTX-Toxine von Actinobacillus pleuropneumoniae………..…….….13

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Liste verwendeter Publikationen

Liste der verwendeten Publikationen

PUBLIKATION 1

Hoeltig D, Rohde J, Brunner B, Hellmann K, Grandemange E, Waldmann KH (2018).

Efficacy of a one-shot marbofloxacin treatment on acute pleuropneumonia after experimental aerosol inoculation of nursery pigs. Porcine Health Management 4:13.

DOI https://doi.org/10.1186/s40813-018-0089-2

Konzept, Versuchsplanung: Hoeltig D, Brunner B, Waldmann KH Praktische Durchführung: Hoeltig D, Rohde J

Diskussion, Beratung: Hoeltig D, Rohde J, Hellmann K, Waldmann KH, Grandemange E

Manuskript: Hoeltig D, Grandemange E

Korrespondenz: Hoeltig D

PUBLIKATION 2

Krüger M, Zinne N, Biancosino C, Höffler K, Rajab TK, Waldmann KH, Jonigk D, Avsar M, Haverich A, Hoeltig D (2016). Porcine pulmonary auto-transplantation for ex vivo therapy as a model for new treatment strategies. Interactive CardioVascular and Thoracic Surgery 23: 358 – 366.

DOI https://doi.org/10.1093/icvts/ivw160

Konzept, Versuchsplanung: Krüger M, Zinne N, Haverich A, Hoeltig D

Praktische Durchführung: Krüger M, Zinne N, Biancosino C, Höffler K, Rajab TK, Jonigk D, Avsar M, Hoeltig D

Diskussion, Beratung: Hoeltig D, Krüger M, Zinne N, Waldmann KH, Haverich A

Manuskript: Krüger M, Hoeltig D

Korrespondenz: Krüger M

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PUBLIKATION 3

Zinne N, Krueger M, Hoeltig D, Tuemmler B, Boyle EC, Biancosino C, Hoeffler K, Braubach P, Rajab TK, Ciubotaru A, Rohde J, Waldmann KH, Haverich A (2018).

Treatment of infected lungs by ex vivo perfusion with high dose antibiotics and autotransplantation: A pilot study in pigs. PLoS ONE 13 (3): e0193168.

DOI https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193168

Konzept, Versuchsplanung: Zinne N, Krueger M, Hoeltig D, Tuemmler B, Rohde J, Waldmann KH, Averich A

Praktische Durchführung: Zinne N, Krueger M, Hoeltig D, Biancosino C, Hoeffler K, Ciubotaru A, Rohde J

Diskussion, Beratung: Zinne N, Krueger M, Hoeltig D, Tummler B, Waldmann KH, Haverich A

Manuskript: Zinne N, Krueger M, Hoeltig D, Boyle EC, Rajab TK, Waldmann KH, Haverich A

Korrespondenz: Zinne N

PUBLIKATION 4

Menzel A, Siewert C, Gasse H, Seifert H, Hoeltig D, Hennig-Pauka I (2015). Infrared thermography of the pig thorax: An assessment of selected regions of interest by computed tomographical and anatomical parameters. Anatomia Histologia Embryologia 44: 107 – 117.

DOI https://doi.org/10.1111/ahe.12115

Konzept, Versuchsplanung: Siewert C, Hennig-Pauka I

Praktische Durchführung: Menzel A, Siewert C, Hoeltig D, Hennig-Pauka I Diskussion, Beratung: Gasse H, Hoeltig D, Seifert H, Hennig-Pauka I

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PUBLIKATION 5

Menzel A, Beyerbach M, Siewert C, Gundlach M, Hoeltig D, Graage R, Seifert H, Waldmann KH, Verspohl J, Hennig-Pauka I (2014). Actinobacillus pleuropneumoniae challenge in swine: diagnostic of lung alterations by infrared thermography. BMC Veterinary Research 10: 199.

Konzept, Versuchsplanung: Siewert C, Seifert H, Hennig-Pauka I

Praktische Durchführung: Menzel A, Siewert C, Gundlach M, Hoeltig D, Graage R, Verspohl J, Hennig-Pauka I

Diskussion, Beratung: Beyerbach M, Hoeltig D, Waldmann KH, Verspohl J Manuskript: Menzel A, Beyerbach M, Siewert C, Hoeltig D, Graage

R, Seifert H, Waldmann KH, Verspohl J, Hennig-Pauka I

Korrespondenz: Menzel A

PUBLIKATION 6

Hoeltig D, Nietfeld F, Strutzberg-Minder K, Rohde J (2018). Evaluation of the predictive value of tonsil examination by bacteriological culture for detecting positive lung colonization status of nursery pigs exposed to Actinobacillus pleuropneumoniae by experimental aerosol infection. BMC Veterinary Research 14: 211.

DOI https://doi.org/10.1186/s12917-018-1542-9 Konzept, Versuchsplanung: Hoeltig D, Rohde J

Praktische Durchführung: Hoeltig D, Nietfeld F, Strutzberg-Minder K, Rohde J Diskussion, Beratung: Hoeltig D, Rohde J

Manuskript: Hoeltig D

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PUBLIKATION 7

Hoeltig D, Seydel A, Hennig-Pauka I, Rohde J (2018). Identification of strain specific differences in incubation periods and distribution of lung lesions between Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 2 and serotype 7 after experimental infection of nursery pigs. Berliner und Muenchener Tierärztliche Wochenschrift – angenommen Oktober 2018

DOI https://doi.org/10.2376/0005-9366-17094

Konzept, Versuchsplanung: Hoeltig D

Praktische Durchführung: Hoeltig D, Seydel A, Hennig-Pauka I, Rohde J Diskussion, Beratung: Hoeltig D, Hennig-Pauka I, Rohde J

Manuskript: Hoeltig D

PUBLIKATION 8

Hoeltig D, Rohde J, Frase R, Nietfeld F, Waldmann KH, Valentin-Weigand P, Meens J (2018). Multi-organ spreading of Actinobacillus pleuropneumoniae serovar 7 in weaned pigs during the first week after experimental infection. Veterinary Research 2018, 49:97.

Konzept, Versuchsplanung: Hoeltig D, Rohde J, Meens J

Praktische Durchführung: Hoeltig D, Rohde J, Nietfeld F, Meens J

Diskussion, Beratung: Hoeltig D, Waldmann KH, Valentin-Weigand P, Meens J

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PUBLIKATION 9

Busley D, Ochs M, Hoeltig D, Ganter M, Acevedo C, Schmiedl A, Hennig-Pauka I (2016). Characterization of surfactant alterations in pigs infected with Actinobacillus pleuropneumoniae. Experimental Lung Research 1-13.

DOI https://doi.org/10.3109/01902148.2015.1123327

Konzept, Versuchsplanung: Schmiedl A, Hennig-Pauka I

Praktische Durchführung: Busley D, Ochs M, Hoeltig D, Acevedo C

Diskussion, Beratung: Hoeltig D, Ganter M, Schmiedl A, Hennig-Pauka I Manuskript: Busley D, Schmiedl A, Hennig-Pauka I

Korrespondenz: Schmiedl A

PUBLIKATION 10

Grabner S, Egerbacher M, Gasse H, Hewicker-Trautwein M, Höltig D, Waldmann KH, Blecha F, Saalmüller A, Hennig-Pauka I (2017). Detection of PR-39, a porcine host defence peptide, in different cell sub-linages in pigs infected with Actinobacillus pleuropneumoniae. Histology Histopathology 32: 1077 – 1088.

DOI https://doi.org/10.14670/HH-11-869

Konzept, Versuchsplanung: Waldmann KH, Hennig-Pauka I Praktische Durchführung: Höltig D, Grabner S, Egersbacher E,

Hennig-Pauka I

Diskussion, Beratung: Gasse H, Hewicker-Trautwein M, Blecha F, Saalmüller A Manuskript: Grabner S, Egersbacher E, Hennig-Pauka I

Korrespondenz: Hennig-Pauka I

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PUBLIKATION 11

Reiner G, Bertsch N, Hoeltig D, Selke M, Willems H, Gerlach GF, Tuemmler B, Probst I, Herwig R, Drungowski M, Waldmann KH (2014). Identification of QTL affecting resistance/susceptibility to acute Actinobacillus pleuropneumoniae infection in swine. Mammalian Genome 25: 180 – 191.

Konzept, Versuchsplanung: Reiner G, Hoeltig D, Gerlach GF, Herwig R

Praktische Durchführung: Hoeltig D, Bertsch N, Selke M, Willems H, Probst I, Drungowski M

Diskussion, Beratung: Reiner G, Willems H, Hoeltig D, Gerlach GF, Tuemmler B, Herwig R, Waldmann KH

Manuskript: Reiner G, Hoeltig D, Herwig R

Korrespondenz: Reiner G

PUBLIKATION 12

Reiner G, Dreher F, Drungowski M, Hoeltig D, Bertsch N, Selke M, Willems H, Gerlach GF, Probst I, Tuemmler B, Waldmann KH, Herwig R (2014). Pathway deregulation and expression QTLs in response to Actinobacillus pleuropneumoniae infection in swine. Mammalian Genome 25: 600 – 617.

Konzept, Versuchsplanung: Reiner G, Hoeltig D, Gerlach GF, Herwig R

Praktische Durchführung: Hoeltig D, Dreher F, Drungowski M, Bertsch N, Selke M, Willems H, Probst I

Diskussion, Beratung: Reiner G, Hoeltig D, Willems H, Gerlach GF, Tuemmler B, Waldmann KH, Herwig R

Manuskript: Reiner G, Hoeltig D, Herwig R

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Einleitung und wissenschaftlicher Hintergrund

modifiziert nach

PUBLIKATION 1

Hoeltig D, Rohde J, Brunner B, Hellmann K, Grandemange E, Waldmann KH (2018).

Efficacy of a one-shot marbofloxacin treatment on acute pleuropneumonia after experimental aerosol inoculation of nursery pigs. Porcine Health Management 4:13.

PUBLIKATION 2

Krüger M, Zinne N, Biancosino C, Höffler K, Rajab TK, Waldmann KH, Jonigk D, Avsar M, Haverich A, Hoeltig D (2016). Porcine pulmonary auto-transplantation for ex vivo therapy as a model for new treatment strategies. Interactive CardioVascular and Thoracic Surgery 23: 358 – 366.

PUBLIKATION 3

Zinne N, Krueger M, Hoeltig D, Tuemmler B, Boyle EC, Biancosino C, Hoeffler K, Braubach P, Rajab TK, Ciubotaru A, Rohde J, Waldmann KH, Haverich A (2018).

Treatment of infected lungs by ex vivo perfusion with high dose antibiotics and autotransplantation: A pilot study in pigs. PLoS ONE 13 (3): e0193168.

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Die porzine Pleuropneumonie, ausgelöst durch Actinobacillus (A.) pleuropneumoniae, ist eine weltweit verbreitete, bakterielle Atemwegsinfektion der Schweine, welche in den meisten Fällen, abgesehen von einer deutlichen Beeinträchtigung des Tierwohls, auch mit hohen wirtschaftlichen Verlusten einher- geht (Gottschalk, 2012a). Die wirtschaftlichen Verluste beruhen dabei sowohl auf direkten Kosten durch eine erhöhte Mortalitätsrate, anfallende Behandlungskosten, Kosten für vorbeugende Impfungen oder finanzielle Abzüge bei der Schlachtung als auch auf indirekten Kosten durch eine schlechtere Futterverwertung der erkrankten Tiere und daraus resultierenden verminderten Tageszunahmen und einer verlängerten Mastdauer (Fraile et al., 2009; Hoy et al., 1985a, b). Obwohl der Erreger erst in 1957 identifiziert wurde (Pattison et al., 1957), finden sich die ersten klinischen Beschreibungen der Erkrankung bereits gegen Ende des 19. Jahrhunderts unter dem Namen „Infektiöse Brustfellentzündung der Schweine“ (Zipperlen, 1885). Schweine aller Altersklassen können erkranken (Bossé et al., 2002; Sassu et al., 2018).

Krankheitsbilder

Das klassische Krankheitsbild der porzinen Pleuropneumonie variiert von subklinischen Infektionen über perakute und akute Erkrankungen bis hin zu chronischen Verläufen. Der individuelle Krankheitsverlauf und die Schwere der Erkrankung sind dabei abhängig von Co-Infektionen, Umweltbedingungen, aktueller Immunitätslage der Tiere sowie der Erregermenge bei der Infektion (Tobias, 2014).

Bei subklinischen Infektionen kommt es bei den Tieren vor allem zu einer Besiedelung des Oropharynx, genauer der Tonsillen, mit A. pleuropneumoniae.

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ihre Ferkel während der Säugephase (Tobias, 2014). Zum Zeitpunkt des Absetzens kann A. pleuropneumoniae bereits bei 30% der Ferkel von positiven Sauen nachgewiesen werden. Dieser Prozentsatz erhöht sich durch den Tier-zu-Tier- Kontakt bei der Neugruppierung nach dem Absetzen auf bis zu 50% in der 10.

Lebenswoche (Gottschalk, 2015; Klinkenberg et al., 2014). In einem positiv- getesteten Bestand mit subklinischem Krankheitsverlauf können dabei bis zu sieben Serovare des Erregers gleichzeitig nachgewiesen werden (Brackmann, 2015). Die Identifikation solcher subklinisch-infizierten Tiere ist daher von besonderer Bedeutung bei der Eindämmung der Erregerausbreitung (Gottschalk, 2015). Dabei wird die Identifikation dieser Schweine zusätzlich durch die Tatsache erschwert, dass es bei einem Großteil der subklinisch-infizierten Tiere, im Gegensatz zu den Tieren mit einer klinisch-manifesten Erkrankung, nach dem Kontakt mit dem Erreger nicht zu einer Serokonversion kommt (Kume et al., 1984; Sidibe et al., 1993).

Während bei einem perakuten Krankheitsverlauf oftmals nur eine hohe Mortalitätsrate basierend auf plötzlich verendeten Schweinen einhergehend mit einer systemischen Schocksymptomatik auftritt (Sassu et al., 2018), ist das akute Erkrankungsbild der porzinen Pleuropneumonie vor allem durch einen Anstieg der Körpertemperatur (>42,0°C), Dyspnoe, Husten, einer verminderten Futteraufnahme, Apathie und Zyanosen gekennzeichnet (Gottschalk, 2012a; Rosendal et al., 1985).

Diese Symptome können in unterschiedlichen Kombinationen auftreten (Bossé et al., 2002). Sie basieren auf der Entwicklung einer hämorrhagisch-nekrotisierenden Pleuropneumonie (Abbildung 1) beginnend mit einer Infiltration des Lungengewebes mit neutrophilen Granulozyten, gefolgt von einer Makrophagen-Infiltration, einer Degeneration des Lungenepithels, einer nekrostisierenden Vaskulitis (Abbildung 2) und in Folge dessen einem Zusammenbrechen der Blut-Lungen-Schranke (Ajito et al., 1996; Liggett et al., 1987). Auf Grund des parallelen Vorliegens eines Lungenödems und der Zerstörung von Lungengewebe können daher in der Agonie Maulatmung und blutig-schaumiger Nasenausfluss beobachtet werden (Gottschalk, 2012a; Rosendal et al., 1985). Zusätzlich zu den Veränderungen des Lungengewebes finden sich Pleuralergüsse mit starken Fibrinbeimengungen basierend auf einer diffusen fibrinösen Pleuritis und Perikarditis (Rosendal et al., 1985). Nach dem Abklingen der akuten Erkrankung kann es in Einzelfällen zu einem

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völligen Ausheilen der Erkrankung kommen (Bossé et al., 2002). In den meisten Fällen entwickelt sich jedoch eine chronische Verlaufsform. In einigen Fällen kann sich eine chronische Erkrankung jedoch auch ohne vorhergehendes akutes Erkrankungsstadium entwickeln (Sassu et al., 2018).

Abbildung 1: Makroskopische Gewebeveränderungen nach A.-pleuropneumoniae-Infektion.

A: Veränderungen der perakuten bis akuten Verlaufsform mit A.1 = akuter, mittelgradiger, diffuser hämorrhagisch- nekrotisierender Pleuropneumonie, A.2 = blutig-schaumigem Maul- und Nasenausfluss,

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Bei chronischen Erkrankungsverläufen entstehen, abgesehen von einer adhäsiven Pleuritis, aus den nekrotischen Bereichen des Lungengewebes fokale Sequester oder gut abgekapselte Abszesse mit umgebendem fibrotischem Gewebe, in denen der Erreger überleben kann. Auch die Tonsillen der Tiere bleiben oftmals latent besiedelt (Bossé et al., 2002; Liggett et al., 1987; Rosendal et al., 1985). Chronisch infizierte Tiere zeigen in der Regel Zeit ihres Lebens ein verzögertes Wachstum und eine schlechtere Futterverwertung (Holmgren et al., 1999).

Obwohl A. pleuropneumoniae bisher hauptsächlich als nicht-invasives, reines Lungenpathogen klassifiziert wird, das über Lymphgefäße von der infizierten Lunge ausgehend auf die parietale Pleura streut (Ajito et al., 1996), werden immer wieder Fälle anderer klinischer Erkrankungen beschrieben, bei denen A. pleuropneumoniae der einzig nachweisbare Erreger ist. Hierbei handelt es sich um Fälle von Endocarditis, Pericarditis und Peritonitis (Buttenschøn et al., 1997) sowie Osteomyelitis, Arthritis (Jensen et al., 1999), Meningitis, Nephritis (Madsen et al., 2001) und Hepatitis (Ohba et al., 2008).

Actinobacillus pleuropneumoniae

Das gram-negative Bakterium A. pleuropneumoniae stammt aus der Familie der Pasteurellaceae und gilt als obligater Infektionserreger des porzinen Respirationstraktes. Es sind bisher keine anderen potentiellen Wirte für den Erreger als Tiere der Spezies Sus scrofa bekannt (Gottschalk, 2012a). Als obligater Infektionserreger ist A. pleuropneumoniae in der Lage, allein, ohne das Vorliegen von Co-Infektionen, eine Erkrankung auszulösen (Gottschalk, 2012a). Zusätzlich zur klassischen porzinen Pleuropneumonie kann A. pleuropneumoniae jedoch auch an der Verursachung des porzinen respiratorischen Erkrankungskomplexes (PRDC) beteiligt sein. Bei dem PRDC handelt es sich um Atemwegserkrankungen des Schweins basierend auf einer Co-Infektion mit mehr als drei verschiedenen Infektionserregern (Moorkamp et al., 2008; Palzer et al., 2008; von Altrock, 1998).

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Abbildung 2: Lungengewebsalterationen nach A.-pleuropneumoniae-Infektion (Hämatoxilin-Eosin- Färbung). A: akute fibrinös-nekrotisierende Pleuropneumonie nach experimenteller Infektion: pleural reichlich Exsudat aus karyolytischen Leukozyten und Fibrin, alveolär multifokale Nester und bandartige subpleurale Infiltration von karyolytischen Leukozyten mit Nekrose der Alveolarwände sowie ein ausgeprägtes alveoläres Ödem mit Fibrinbeimengungen (Vergrößerung: 4er Objektiv); B: subpleurale bandartige Infiltration mit dicht gedrängten karyolytischen Leukozyten, die multifokal die für A.-pleuropneumoniae-typische Haferkorn-ähnliche Form annehmen (engl. oat cells) und sich häufig Fischschwarm-ähnlich anordnen (Vergrößerung: 10er Objektiv);

C: charakteristische Anordnung dicht gedrängter karyolytischer Leukozyten inkl. oat cells entlang eines perivaskulären Lymphgefäßes; innerhalb des Lymphgefäßes: Fibrin, einzelne Leukozyten sowie resorbierte Erythrozyten (Vergrößerung: 10er Objektiv); D: alveoläres Nest dicht gedrängter karyolytischer Leukozyten, darunter zentral auch einige längliche oat cells. Angrenzend ausgeprägte Hyperämie sowie Einzelzellnekrosen innerhalb der Alveolarwände, die mit einer erhöhten Gefäßpermeabilität und einem Austritt von Fibrin und

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Derzeit geht man von insgesamt 18 verschiedenen A.-pleuropneumoniae-Serovaren und zwei verschiedenen Biotypen des Erregers aus (Bossé et al., 2018; Gottschalk, 2012c; Sárközi et al., 2015). Die beiden Biotypen unterscheiden sich in der Abhängigkeit ihres Wachstums von Nicotinamidadenindinukleotid (NAD). Serovare des Biotyps 1 wachsen NAD-abhängig und gelten als typische Isolate, wohingegen atypische Serovare des Biotyps 2 keinen NAD-Zusatz für ein Wachstum benötigen (Gottschalk, 2012a). Die verschiedenen Serovare sind weltweit verbreitet. In Europa sind derzeit die Serovare (aufgeführt nach ihrer Häufigkeit) 2, 9, 11, 8, 5 und 4 vorherrschend, während in Nordamerika vor allem die Serovare 5, 7 und 8 und in Asien die Serovare 5, 2, 9 und 1 bei klinischen Fällen isoliert werden (Gottschalk, 2012b). Die Pathogenität des jeweiligen A.-pleuropneumoniae-Isolates wird dabei über die verschiedenen Virulenzfaktoren des Erregers bestimmt. Als Hauptvirulenzfaktoren von A. pleuropneumoniae gelten die repeat-in-toxin (RTX) Toxine ApxI, ApxII, ApxIII und ApxIV, welche sowohl hämolytisch als auch zytotoxisch wirken können (Tabelle 1). Verschiedene A.-pleuropneumoniae-Stämme exprimieren dabei verschiedene Toxinkombinationen. Obwohl Stämme des gleichen Serovars meistens über die gleichen Toxinkombinationen verfügen (Tabelle 1), kann es auch bei verschiedenen Stämmen eines Serovars zu Unterschieden in den produzierten Toxinsubtypen kommen (Gottschalk, 2012c). Obwohl für die Toxine ApxI und ApxIII gezeigt werden konnte, dass eine reine Inokulation dieser Toxine bereits klinische Symptome und Gewebeveränderungen der porzinen Pleuropneumonie verursachen kann (Kamp et al., 1997), wird die Gesamtvirulenz der unterschiedlichen A.-pleuropneumoniae-Stämme nicht allein durch die Apx-Toxine bestimmt (Gottschalk and Lacouture, 2014).

Tabelle 1: RTX-Toxine von Actinobacillus pleuropneumoniae*

RTX-Toxin Hämolyse Zytotoxizität Serovar

ApxI +++ +++ 1,5,9,10,11,14,16

ApxII + ++ 1,2,4,5,6,7,8,9,11,12,13,15,16,17,18

ApxIII - +++ 2,3,4,6,8,15

ApxIV (+) - alle

*nach Bossé et al., 2018; Yee et al., 2018; Frey, 2003; Schaller et al., 1999

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Weitere Virulenzfaktoren von A. pleuropneumoniae sind die bakteriellen Fimbrien, Äußere-Membrane-Proteine (OMPs), Lipopolysaccharide (LPS) und die bakterielle Kapsel (Dreckmann, 2008), welche ebenfalls einen signifikanten Einfluss auf die Schwere der sich entwickelnden Erkrankung und somit auf die Gesamtvirulenz der jeweiligen Erregerisolate haben (Chiers et al., 2010). Eine besondere Rolle scheint hierbei auch der Fähigkeit des Erregers zur Adhäsion an das Lungengewebe zuzukommen. Bei dieser Fähigkeit handelt es sich um eine stammspezifische Eigenschaft von A. pleuropneumoniae (Auger et al., 2009). Erste Untersuchungsergebnisse weisen darauf hin, dass die Fähigkeit des Erregers, sich an das Lungengewebe anzuheften, einen Einfluss auf die Menge der ausgeschütteten Toxine und somit das Ausmaß der entstehenden Gewebeschäden haben könnte (Auger et al., 2009).

Bekämpfungsstrategien

Bei der Bekämpfung der porzinen Pleuropneumonie stehen aktuell vorbeugende Impfungen und die Bekämpfung der Infektion mittels antibiotischer Behandlung im Vordergrund. Da jedoch beide Methoden auf Grund unterschiedlicher Nachteile keine vollständige und effektive Erradikation des Erregers gewährleisten können, ist ein weiterer wichtiger Punkt in der Bekämpfung der A.-pleuropneumoniae-Infektion das frühzeitige Erkennen subklinisch infizierter Tiere, um eine Ausbreitung des Erregers verhindern zu können. Auf Grund der unzuverlässigen Serokonversion nach dem Kontakt mit dem Erreger (Kume et al., 1984; Sidibe et al., 1993) und der Tatsache, dass die Zeitspanne zwischen Erregerkontakt und Nachweisbarkeit von Antikörpern mindestens 10 Tage beträgt (Gottschalk, 2012a), wird derzeit zur Identifikation subklinisch-infizierter Tiere oder Herden der direkte Erregernachweis aus Tonsillenmaterial empfohlen (Gottschalk, 2015). Dieser kann sowohl mittels bakteriologischer Untersuchung als auch mittels molekularer Detektion durchgeführt werden (Chiers et al., 2002; Chiers et al., 2001; Gram et al., 1996; Sidibe et al.,

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Aktuelle Strategien: Impfung oder Antibiose

Sowohl die Impfungen von Schweinen gegen A. pleuropneumoniae als auch die metaphylaktische oder therapeutische antibiotische Behandlung haben verschiedene Nachteile, die ihre Effizienz bei der Bekämpfung der Infektion einschränken. Eine Vakzination der Tiere mit den derzeit auf dem Markt verfügbaren Impfstoffen kann zwar eine klinische Erkrankung der Tiere verhindern, nicht jedoch die Besiedelung der Lunge mit dem Erreger (Velthuis et al., 2003). Dieses dürfte vor allem daran liegen, dass die auf dem Markt verfügbaren Vakzinen überwiegend die Bildung von neutralisierenden IgG-Antikörpern induzieren, welche eine Adhäsion von A. pleuropneumoniae an das Lungengewebe sowie teilweise auch Gewebeschäden durch die ausgeschütteten Toxine nicht verhindern können (Haesebrouck et al., 2004). Nach einer natürlichen Infektion werden hingegen auch erregerspezifische IgA-Antikörper gebildet, die in nasalen Sekreten und in der Bronchoalveolarflüssigkeit nachzuweisen sind und eine Ausbreitung der Bakterien vor der Adhäsion und Toxinausschüttung verhindern können (Bossé et al., 1992).

Zusätzlich zu der Tatsache, dass die Impfung die Kolonisation der Tiere nicht verhindern kann, so dass diese weiterhin eine Ansteckungsquelle für andere Schweine darstellen können (Velthuis et al., 2003), wird die Wirksamkeit der Impfung durch eine geringe Kreuzprotektivität der neutralisierenden Antikörper zwischen den verschiedenen A.-pleuropneumoniae-Stämmen eingeschränkt (Higgins et al., 1985).

Die Bekämpfung der Erkrankung mittels antibiotischer Behandlung von potentiell infizierten und erkrankten Tieren hat ebenfalls verschiedene Nachteile. Aus medizinisch-therapeutischer Sicht ist ein wesentlicher Nachteil, dass eine antibiotische Behandlung den Erreger nicht immer sicher zu eliminieren vermag (Angen et al., 2008; Hoeltig et al., 2018). Eine mögliche Ursache hierfür ist, dass in entzündlich verändertem Gewebe mit hohem Fibrinanteil und vor allem im Inneren von Abszessen oftmals nicht ausreichende hohe Wirkstoffspiegel erreicht werden können (Barza et al., 1974a; Barza et al., 1974b; Barza and Weinstein, 1974). Eine weitere Möglichkeit für die unvollständige Elimination des Erregers stellt auch die Bildung von Biofilmen auf der inneren Alveolar- und Bronchialoberfläche sowie auf der Oberfläche der Tonsillen dar. Solche Biofilme bestehen aus einer Biopolymermatrix, die auf feuchten Oberflächen von der dort vorhandenen lokalen

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Mikroflora gebildet wird. Bakterien, so auch A. pleuropneumoniae, bilden und nutzen diese Biopolymermatrix als Schutzschild, da der innerhalb der Matrix entstehende Diffusionsgradient sie vor schädigenden Wirkstoffspiegeln schützen kann (Høiby et al., 2010; Li et al., 2016). Außerdem hat auch die Applikation bzw. das jeweilige Applikationsschema einen Einfluss auf die Effizienz der antibiotischen Behandlung.

Bei einigen zur Behandlung der porzinen Pleuropneumonie zugelassenen Fluorchinolonantibiotika entspricht beispielsweise das von der Zulassung vorgegebene Applikationsschema mit vergleichsweise niedrigen Dosierungen und einer Verabreichung über mehrere Tage eher dem Prinzip eines zeitabhängigen Wirkmechanismus, obwohl die bakterizide Wirkung der Fluorchinolone dosisabhängig eintritt (Ahmad et al., 2016; Martinez et al., 2006; Zou and Zeng, 2012).

Doch auch bei ausreichend hoher Dosierung vermag eine antibiotische Behandlung nicht immer den Erreger vollständig und nachhaltig zu bekämpfen. Dieses konnte im Modell der extracorporalen Pneumoniebehandlung beim Schwein gezeigt werden (Zinne et al., 2018). Dieses Infektionsmodell, basierend auf einer Autotransplantation der Lunge (Krüger et al., 2016), wurde eigentlich zur Behandlung von therapieresistenten, beatmungsassoziierten Pneumonien (VAP) in der Humanmedizin entwickelt. Es ermöglicht, die Dosierung des Antibiotikums um ein Vielfaches zu erhöhen und gleichzeitig die daraus für andere Organsysteme entstehenden toxischen Nebenwirkungen dieser hohen Medikamentendosierungen zu umgehen. Hierzu wird beim Schwein zunächst mittels Endoskopie eine gezielte Infektion des linken Hauptlappens der Lunge mit einem bakteriellen Atemwegsinfektionserreger vorgenommen. Nach Auslösen der Pneumonie und klinischer Manifestation der Erkrankung wird dann die infizierte linke Lungenhälfte unter Narkose im Rahmen einer Thorakotomie und Pneumektomie entnommen und in ein Organ-Care-System^TM (OCS) verbracht (Abbildung 3). In dieser Apparatur kann dann die Pneumonie außerhalb des Tieres über eine dauerhafte Perfusion der Lunge mit Blut, Konservierungs- und Nährlösungen, versetzt mit dem Therapeutikum,

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Ausschalten einer potentiellen Beeinflussung der Therapie durch ungenügend hohe Wirkstoffspiegel im Zielgewebe oder die Abschwächung der Wirkung durch vorhandene Biofilme. Nach Abschluss der Behandlung wird die Lunge in den Patienten reimplantiert (Krüger et al., 2016; Zinne et al., 2018).

Abbildung 3: Extracorporale antibiotische Behandlung einer Schweinelunge im OCS nach P.-aeruginosa-Infektion. A: Lunge im offenen Organ-Care-System; B: doppelter Adapter für Ventilation und

Blutversorgung des entnommenen Lungenflügels; C: Zustand der Lunge 8 Tage p.inf. nach linksseitiger Infektion der Lunge / 7 Tage post OP.

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In der ersten in diesem Modell durchgeführten Studie wurde Pseudomonas (P.) aeruginosa als Pneumonieerreger verwendet. Hierbei handelt es sich ebenfalls um ein gram-negatives Bakterium, welches schwere hämorrhagische Pneumonien verursachen kann, und dessen Virulenz, ähnlich wie bei A. pleuropneumoniae, ebenfalls hauptsächlich über Fimbrien, LPS sowie ein zytotoxisches Exotoxin verursacht wird (Blackwood et al., 1983; Sadikot et al., 2005). Es konnte im Rahmen dieser ersten Studie unter anderem gezeigt werden, dass, wenn die antibiotische Behandlung erst bei Vorliegen schwerer Gewebeschäden erfolgt, trotz der Verwendung einer Dosierung eines Antibiotikums, die dem Fünffachen der zuvor ermittelten 100%-letal-Dosis für den Infektionsstamm entspricht, zwar das klinische Allgemeinbefinden der Patienten verbessert werden, jedoch eine Besiedlung der Lunge mit dem Erreger bestehen bleiben kann (Zinne et al., 2018). Diese Restbesiedlung war in der durchgeführten Studie fünf Tage nach der Operation nicht nur in den nicht-behandelten Lungenlappen, sondern auch in dem extracorporal behandelten linken Hauptlappen nachweisbar (Zinne et al., 2018).

Ein weiterer Nachteil des Einsatzes von Antibiotika zur Bekämpfung der porzinen Pleuropneumonie, vor allem vor dem Hintergrund einer unvollständigen Elimination des Erregers, ist das potentielle Risiko einer bakteriellen Resistenzentwicklung. Wie für andere bakterielle Erreger wird auch für A. pleuropneumoniae weltweit ein Anstieg der Resistenzraten beobachtet. Am häufigsten werden dabei Resistenzen gegen Tetracyklinen nachgewiesen, gefolgt von Resistenzen gegenüber Sulfonamiden, Ampicillin und Trimetoprim. Der Nachweis von Resistenzen gegenüber Fluorchinolonen, Cephalosporinen und Florfenicol erfolgt hingegen vergleichsweise selten (Bossé et al., 2015; Bossé et al., 2017; Dayao et al., 2016;

Dayao et al., 2014; Sweeney et al., 2017; White et al., 2002). Vor allem mit Fluorchinolonen konnten gute Ergebnisse bei der Erregereliminierung nach akuter A.-pleuropneumoniae-Infektion erzielt werden (Grandemange et al., 2017; Hoeltig et al., 2018; Thomas et al., 2000). Nichtsdestotrotz wurden in den letzten Jahren bei klinischen Fällen A.-pleuropneumoniae-Isolate mit Plasmiden nachgewiesen, die eine

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gezeigt werden, dass generell jeder Einsatz von Antibiotika bei der Therapie der porzinen Pleuropneumonie das Risiko der Erzeugung von resistenten A.-pleuropneumoniae-Isolaten birgt (Gutiérrez-Martín et al., 2006). Zwar hat aus Tierschutzgründen auf jeden Fall eine Behandlung der klinisch erkrankten Tiere zu erfolgen (Hoeltig et al., 2018), jedoch sollte der Einsatz von Antibiotika bei der Bekämpfung der porzinen Pleuropneumonie auf ein unumgängliches Mindestmaß reduziert werden. Dieses gilt insbesondere, da in einem positiven Bestand mit mehreren Serovaren oder Stämmen eine hohe Variation bezüglich der vorhandenen Resistenzen vorliegen kann (Dayao et al. 2015). Dieses bedeutet, dass auch die Durchführung einer Resistenztestung vor Beginn der Behandlung nicht gewährleistet, dass alle im Bestand bei A. pleuropneumoniae bereits vorhandenen Resistenzen erfasst werden.

Genetische Resistenz

Eine weitere Alternative zu den beiden Hauptbekämpfungsstrategien, welche eine Grundlage für eine effiziente Bekämpfung von A. pleuropneumoniae bieten könnte, stellt die genetisch-bedingte Resistenz von Schweinen gegenüber dem Erreger dar.

Der Ansatz, Infektionserkrankungen durch eine Selektion von Zuchttieren auf eine verminderte Anfälligkeit gegenüber spezifischen Erregern zu bekämpfen, ist nicht neu. So wurden bereits Mitte des letzten Jahrhunderts Unterschiede in der Empfänglichkeit von Schweinen gegenüber bakteriellen Erregern, wie Brucella suis, Mycoplasma suis und Brachyspira hyodysenteriae, beschrieben (Cameron et al., 1942; Hutt, 1958). Auch bei anderen Spezies, wie Geflügel, kleinen Wiederkäuern oder Rindern, konnten bereits genetisch-bedingte Resistenzen gegenüber verschiedenen Infektionskrankheiten nachgewiesen und in Selektionsprogramme übernommen werden (Cole, 1968; Heringstad et al., 2000; Stear and Wakelin, 1998).

Eine genetisch-bedingte Resistenz kann entweder absolut sein oder relativ (Abbildung 4). Bei einer absoluten Resistenz ist der Wirt nicht mehr für den Erreger empfänglich. Bei einer relativen Resistenz hingegen kann der Erreger den Wirt immer noch infizieren, die Erkrankung verläuft jedoch deutlich milder als bei anderen Wirten der gleichen Spezies. Eine solche verminderte Anfälligkeit wirkt über ein Herabsetzen des Infektionsdrucks und durch eine verminderte Erregervermehrung

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und -ausscheidung ebenfalls der Ausbreitung des Erregers entgegen (Reiner, 2009).

Im Endeffekt beruht eine genetische Resistenz darauf, dass sich die weniger empfänglichen Tiere auf Grund von Unterschieden in der Immunabwehr oder spezifischen, molekularen Rezeptormodifikationen in der Interaktion mit dem Erreger besser gegen diesen oder die durch ihn ausgelösten Inflammationsprozesse behaupten können (Burkard et al., 2017; Jiang et al., 2013; Lunney and Chen, 2010;

Vincent et al., 2006; Vögeli et al., 1997).

Methodisch stehen verschiedenen Möglichkeiten zur Aufdeckung dieser vom Wirt ausgehenden Unterschiede in der Interaktion mit dem Pathogen zur Verfügung. Es lassen sich funktionelle sowie positionelle Genomanalysen durchführen. Bei der funktionellen Analyse werden auf Protein- oder RNA-Ebene die Regulation und Expression verschiedener Gene überprüft und bei der positionellen Analyse aussagekräftige, unterschiedliche Genomabschnitte, sog. quantitative trait loci (QTL), identifiziert. Eine dritte Möglichkeit bietet die Gesamtgenomanalyse über Sequenzierungsverfahren (Höltig et al., 2013; Nielsen et al., 2011). Bei allen drei Methoden werden die Ergebnisse der Analyseverfahren mit ausgewählten Phänotypen (krank / gesund) assoziiert, um Aussagen über die Signifikanz von detektierten Unterschieden treffen zu können. Die Ergebnisse der verschiedenen Analyseverfahren lassen sich des Weiteren kombinieren, um eine Aussage darüber zu erhalten, ob die als signifikant identifizierten Unterschiede direkt verantwortlich sind (cis-regulierendes Element) oder ob sie lediglich Gene oder die Expression von Genen regulieren, welche in anderen Genomabschnitten lokalisiert sind (trans- regulierendes Element). Handelt es sich um trans-regulierende Elemente, lassen diese keinen direkten Rückschluss auf die tatsächlich verantwortlichen Genvariationen zu (Klausner and Harford, 1989; Wittkopp and Kalay, 2012).

Im Bereich der Atemwegsinfektionen des Schweins wurden bereits sowohl bei viralen als auch bei bakteriellen Erkrankungen Unterschiede in der Empfänglichkeit von verschiedenen Zuchtlinien vermutet und bestätigt (Halbur et al., 1998; Höltig et al.,

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gegenüber dem Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) aufwiesen (Burkard et al., 2017).

Abbildung 4: Mechanismen der natürlich-vorkommenden Krankheitsresistenz. Darstellung der Grundsätze und Auswirkungen einer absoluten und relativen Krankheitsresistenz, basierend auf einer segregierenden Population mit unterschiedlichen Schweregraden einer Erkrankung (blau = hochgradig erkrankt, grün = mittelgradig erkrankt, rosa = klinisch gesund) nach Infektion mit einem spezifischen Erreger oder Auftreten eines Trigger-Moments unter der Annahme einer ursprünglich klinisch gesunden Population (rosa Schweine) mit identischem Infektionsstatus.

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Themenkomplexe

Vor dem in der Einleitung geschilderten Hintergrund wird klar, dass immer noch viele Aspekte der Wirt-Erreger-Interaktionen im Verlauf der Infektion von Schweinen mit A. pleuropneumoniae unbekannt sind. Das Aufdecken dieser Aspekte könnte neue Ansätze für eine erfolgreiche Entwicklung neuer, effizienterer Bekämpfungsstrategien bieten, die vor allem die antibiotische Behandlung ersetzen könnten. Eine solche Entwicklung ist jedoch ohne einen tieferen Einblick in die detaillierten Abläufe der Pathogenese sowie die gegenseitige Beeinflussung von Erreger und Wirt nicht möglich. Ziel dieser Habilitationsschrift war es daher, verschiedene Aspekte der Wirt- Erreger-Interaktionen zwischen A. pleuropneumoniae und Absetz- bzw.

Läuferschweinen genauer zu untersuchen. Hierzu wurden folgende Themenkomplexe definiert:

I. Nicht-invasive Diagnostik

Vor allem im Bereich der frühen Interaktionen zwischen A. pleuropneumoniae und dem Schwein sind viele Faktoren noch nicht hinreichend bekannt. Dieses betrifft sowohl relevante Aspekte für eine erfolgreiche Kolonisation der porzinen Lunge durch den Erreger als auch frühe Inflammations- bzw.

Abwehrprozesse. Die meisten etablierten Methoden erlauben eine Beurteilung der frühen Infektion nur anhand von im Rahmen einer Sektion gewonnenen Gewebeproben. Eine Beurteilung der Interaktionen zwischen Wirt und Erreger am lebenden Tier ist mit bisher etablierten Methoden meistens nur möglich, wenn bereits systemische Reaktionen des Wirtes erfolgt sind. In einem ersten Arbeitsabschnitt sollte daher untersucht werden, ob sich die Infrarotthermographie (IRT) für die Darstellung von Entzündungsprozessen

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Themenkomplexe

Temperaturerhöhungen am Infektionsort, am lebenden Tier ohne interferierende invasive Eingriffe ermöglichen.

II. Kolonisationsverhalten von A. pleuropneumoniae

Wie in der Einleitung dargestellt, haben erste Untersuchungen darauf hingewiesen, dass vor allem die Fähigkeit des Erregers zur Adhäsion und zur Kolonisation der Lunge einen signifikanten Einfluss auf den Erkrankungsverlauf und somit die Virulenz und das Verbreitungspotential des jeweiligen Isolates haben könnte. Daher wurden im Rahmen des zweiten Themenkomplexes Untersuchungen zum Kolonisationsverhalten von A. pleuropneumoniae im Schweineorganismus durchgeführt. Hierzu wurden sowohl die Kolonisation der bisher bekannten Zielgewebe des Erregers und anderer Körperorgane unter Assoziation zur Schwere der Erkrankung als auch Unterschiede in den makroskopisch manifesten Gewebealterationen und klinischen Verläufen zwischen Serovaren mit unterschiedlicher Virulenz untersucht.

III. Mechanismen zur Abwehr einer A.-pleuropneumoniae-Infektion In diesem Themenkomplex ging es darum, vom Wirt ausgehende Einflussfaktoren auf die Schwere der Erkrankung zu untersuchen. Ein detailliertes Verständnis der zentralen Charakteristika der natürlichen wirtsbedingten Abwehrstrategien könnte neue Ansatzpunkte zur Entwicklung von Therapeutika und Eradikationsmöglichkeiten bieten. Basierend auf Studien, die Unterschiede in der Empfänglichkeit verschiedener Schweinezuchtlinien gegenüber bakteriellen Atemwegsinfektionen bestätigt hatten, wurden nicht nur zwei körpereigene Abwehrmechanismen untersucht sondern auch Expressions- und QTL-Analysen zur möglichen Identifikation von Genvarianten durchgeführt, die einer unterschiedlichen Empfänglichkeit der Tiere zugrunde liegen könnten.

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Ergebnisse – Nicht-invasive Diagnostik

Ergebnisse

I. Nicht-invasive Diagnostik

PUBLIKATION 4

Menzel A, Siewert C, Gasse H, Seifert H, Hoeltig D, Hennig-Pauka I (2015). Infrared thermography of the pig thorax: An assessment of selected regions of interest by computed tomographical and anatomical parameters. Anatomia Histologia Embryologia 44: 107 – 117.

Aktuelle Methoden zur Beurteilung des Schweregrades von Atemwegserkrankungen beim Schwein sind überwiegend invasiv, zeitaufwendig und kostenintensiv. Oftmals erlauben sie auch nur eine Diagnosestellung, wenn bereits deutliche Lungenveränderungen bei den betroffenen Tieren vorhanden sind. Die Untersuchung des Thorax von infizierten und erkrankten Schweinen mit Hilfe der Infrarotthermographie (IRT) könnte daher eine neue und sensitivere Untersuchungsmethode darstellen, die auf Grund der Temperaturveränderungen bei beginnender Inflammation auch schon frühe Entzündungsprozesse sichtbar machen könnte. Um eine Grundlage für die Interpretation von Infrarotbildern des Schweinethorax bei Atemwegserkrankungen zu schaffen, wurden in dieser Studie Referenzwerte an gesunden Schweinen ermittelt. Um geeignete Messregionen, sog.

regions of interest (ROI), zu identifizieren, wurden zunächst die Körperinnentemperatur der Tiere sowie Schichtdicken verschiedener thorakaler Gewebe in computertomographischen (CT) Untersuchungen und anhand von gefrorenen Gewebeschnitten ermittelt. Anschließend wurde ihr Einfluss auf die mittels IRT ermittelten Hauttemperaturen in verschiedenen Bereichen des Thorax

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Lungenabschnittes als Referenzmesspunkte herangezogen werden können. Beide definierten Messregionen haben einen Durchmesser von einem Zentimeter. Der ventrale Lungenabschnitt wurde definiert als der Bereich des Lungengewebes, der ventral des Ösophagus gelegen ist. In diesen Bereichen hatte vor allem die Schichtdicke des darunterliegenden Lungengewebes einen signifikanten Einfluss auf die mittels IRT gemessene Hauttemperatur (7vLr: P =0,038; 10vLl: P = 0,024). Die ermittelten Referenzwerte für lungengesunde Schweine wurden auf Grund vielfältiger Einflussfaktoren, wie z.B. Umgebungstemperatur, relative Luftfeuchtigkeit, Luftbewegungen, aber auch Körperinnentemperatur und Herzfrequenz, nicht als absolute Werte sondern als Differenzwerte zu zwei abdominalen Messregionen (Abd1 und Abd2), die das gesamte Abdomen abdecken, etabliert. Die Berechnung erfolgt anhand der folgenden beiden Formeln:

Δϑ R7vLr = ϑmaxAbd1,Abd2 – ϑmeanR7vLr

und

Δϑ R10vLl = ϑmaxAbd1,Abd2 – ϑmeanR10vLl

Da die ermittelten Messdaten nicht normal verteilt waren, wurde die Range der ermittelten Werte als Referenzbereich für die beiden Messregionen gewählt. Die Referenzwerte für die Temperaturunterschiede zwischen dem 7. ICR und der Abdominaltemperatur auf der rechten Körperseite betrugen 0,02 – 6,60°C und für die Unterschiede zwischen dem 10. ICR und der Abdominaltemperatur auf der linken Körperseite (-0,26) - 4,50°C. Bei Tieren, bei denen innerhalb der analysierten ROIs Rippenanteile vorhanden waren, waren die Temperaturdifferenzen zu den abdominalen Messwerten signifikant geringer (P = 0,011) als bei Tieren ohne Rippenanteile innerhalb der ROIs.

Fazit: In dieser Studie konnte bestätigt werden, dass die Temperatur tieferer thorakaler Gewebeschichten, vor allem der Lunge, in einigen thorakalen Regionen einen signifikanten Einfluss auf die mittels IRT gemessene Hautemperatur hat. Die vergleichende Auswertung von CT- und IRT-Untersuchungen ergab erste Referenzwerte für die thorakale IRT zur Beurteilung der Lungengesundheit beim

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Schwein basierend auf spezifische ROIs sowie spezifischen Berechnungsformeln.

Die Validierung dieser Parameter und ihre Eignung für die Anwendung unter Praxisbedingen stehen allerdings noch aus.

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PUBLIKATION 5

Menzel A, Beyerbach M, Siewert C, Gundlach M, Hoeltig D, Graage R, Seifert H, Waldmann KH, Verspohl J, Hennig-Pauka I (2014). Actinobacillus pleuropneumoniae challenge in swine: diagnostic of lung alterations by infrared thermography. BMC Veterinary Research 10: 199.

In den Untersuchungen, die diesem Manuskript zugrunde liegen, wurde geprüft, ob sich die in den ersten Untersuchungen ermittelten thorakalen ROIs sowie die daraus resultierenden Referenzdifferenzwerte für die Diagnostik der porzinen Pleuropneumonie verwenden lassen. Hierzu wurden insgesamt 60 weitere Schweine untersucht. Alle 60 Schweine wurden zu Beginn der Studie mittels klinischer und CT- Untersuchung als gesund klassifiziert und mittels ApxII-Elisa negativ auf A.

pleuropneumoniae getestet. Nach Studieneinschluss wurden 50 Schweine in einem standardisierten Infektionsmodell mit A. pleuropneumoniae Serovar 2 infiziert, wohingegen 10 Tiere als Kontrolltiere dienten und lediglich mit isotoner Kochsalzlösung mock-infiziert wurden.

Die Auswertungen ergaben, dass eine signifikante Korrelation zwischen der klinischen, der CT-Untersuchung und der pathomorphologischen Beurteilung der Lungen im Rahmen der nach der Euthanasie durchgeführten Sektion bestanden, welche als Referenzmethoden zur IRT-Untersuchung ausgewählt worden waren. Bei den infizierten Tieren reichte das Spektrum der Erkrankungsgrade von subklinischer Infektion bis hin zu schweren Lungenschäden und der Notwendigkeit der vorzeitigen Euthanasie aus Tierschutzgründen. Hinsichtlich der IRT wurde zwischen gesunden und infizierten Tieren lediglich für den Temperaturunterschied zwischen der linksseitigen thorakalen ROI auf Höhe der 10. Rippe und den linksseitigen abdominalen Messwerten während der akuten Erkrankungsphase vier Tage post infectionem (p.inf.) ein signifikanter Unterschied (P=0,001) festgestellt. In der chronischen Erkrankungsphase bis Tag 28 p.inf. konnten keinerlei signifikante Unterschiede zwischen infizierten und gesunden Tieren identifiziert werden. Die Untersuchungen zeigten jedoch auch, dass vor allem die Umgebungstemperatur, die Körperkerntemperatur und die abdominale Hautoberflächentemperatur einen hochgradig signifikanten (P = 0,01) Einfluss auf die Messergebnisse haben, so dass

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sie, ohne Korrektur der Daten bezüglich dieser Faktoren, signifikante Messunterschiede zwischen infizierten und gesunden Tieren überlagern können. Vor allem die abdominalen Messwerte stiegen hierbei konstant parallel zum Anstieg des Körpergewichtes der Tiere an. Um den Einfluss dieser Faktoren abzuschwächen, wurden Cut-off-Werte sowohl für die absoluten thorakalen Messwerte als auch für Differenzen zwischen thorakalen und abdominalen Messwerten festgelegt. Diese lagen bei 28°C für die absolute thorakale Hautoberflächentemperatur auf der rechten Körperseite und bei 2°C für den thorakal-abdominalen Differenzwert auf der linken Körperseite. Nach dieser Modifikation wurde für die rechte Körperseite eine Spezifität von 100% und eine Sensitivität von 66%, für die linke Körperseite eine Spezifität von 100% und eine Sensitivität von 32% erreicht.

Zusätzlich zu den Korrelationsanalysen zwischen den Referenzmethoden und der IRT wurden IRT-gestützt Biopsien des Lungengewebes zum Erregernachweis entnommen. Die Nachweisrate im Vergleich zur Gewebeentnahme im Rahmen der durchgeführten Sektion lagen hierbei zwischen 19 – 51%. Insgesamt konnte A. pleuropneumoniae bei IRT-gestützter Biopsieentnahme nur bei 12 von 50 infizierten Tieren nachgewiesen werden.

Fazit: Die IRT eignet sich besser zur Aufdeckung eines akuten Infektionsgeschehens als zur Diagnostik chronischer Lungenveränderungen. Die zuvor erarbeiteten ROIs konnten nur teilweise für die Diagnostik einer akuten Inflammation der Lunge, ausgelöst durch A. pleuropneumoniae, bestätigt werden. Allerdings wird die Aussagekraft der Messungen signifikant durch andere Einflussfaktoren, insbesondere durch den Einfluss der Umgebungstemperatur, eingeschränkt. Die Anwendung der IRT bei der Diagnostik der porzinen Pleuropneumonie erfordert stark standardisierte Umgebungs- und Tierfaktoren sowie das gleichzeitige Untersuchen von gleichalten infizierten und nicht-infizierten Tieren. Eine Anwendung im Feld ist daher, wenn überhaupt, nur unter starken Restriktionen bei vorselektierten Tieren möglich. Die IRT ermöglicht eine gezielte Biopsieentnahme aus der Lunge für den

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Ergebnisse – Kolonisationsverhalten von A. pleuropneumoniae

II. Kolonisationsverhalten von A. pleuropneumoniae

PUBLIKATION 6

Hoeltig D, Nietfeld F, Strutzberg-Minder K, Rohde J (2018). Evaluation of the predictive value of tonsil examination by bacteriological culture for detecting positive lung colonization status of nursery pigs exposed to Actinobacillus pleuropneumoniae by experimental aerosol infection. BMC Veterinary Research 14: 211.

Gegenstand der Studie war die Überprüfung der Aussagekraft einer bakteriologisch- kulturellen Untersuchung von Tonsillenmaterial zum Nachweis einer erfolgten A.-pleuropneumoniae-Infektion. Da die Untersuchung der Tonsillen derzeit zur Identifikation von subklinisch-infizierten Herden mit unklaren serologischen Befunden oder für den Fall, dass die Zeit zwischen dem vermuteten Expositionszeitpunkt und der Untersuchung weniger als 10 Tage beträgt, empfohlen wird, ging es vor allem darum, die Sicherheit eines negativen Befundergebnisses für die Festlegung des Infektionsstatus des Tieres zu überprüfen. Hierzu wurden von insgesamt 163 Läuferschweinen, die experimentell mit A.-pleuropneumoniae-Serovar 7 infiziert worden waren, Proben aus den Tonsillen sowie Gewebeproben aus allen sieben Lungenlappen bakteriologisch-kulturell auf A. pleuropneumoniae untersucht. Die bakteriologisch-kulturelle Untersuchung wurde gewählt, da sie, im Gegensatz zu molekulargenetischen Nachweismethoden, nicht nur den Erregernachweis sondern auch die Resistenztestung der nachgewiesenen Isolate ermöglicht.

Es konnte eine signifikante Korrelation (P=0,001) zwischen dem Grad der klinischen Erkrankung, dem Grad der Lungenalterationen, dem Grad der Re-Isolierung von A. pleuropneumoniae aus den Tonsillen sowie aus dem Lungengewebe nachgewiesen werden. Bei 74,8% der Tiere konnte der Erreger sowohl von den Tonsillen als auch aus dem Lungengewebe re-isoliert werden. Bei 7,4% der Tiere war der Erreger weder auf den Tonsillen noch im Lungengewebe nachweisbar und

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Ergebnisse – Kolonisationsverhalten von A. pleuropneumoniae

4,3% der Tiere wiesen positive Befunde in der Tonsillenuntersuchung auf, obwohl der Erreger aus der Lunge nicht isoliert werden konnte. Bei 13,5% der Tiere verlief die Untersuchung der Tonsillen negativ, während A. pleuropneumoniae im Lungengewebe nachgewiesen werden konnte. Bei diesen Tieren lagen in 36,4% der Fälle eine hochgradige Kolonisation der Lunge und in 40,9% mittel- bis hochgradige Lungenveränderungen vor. Insgesamt lag die diagnostische Sensitivität für die Detektion einer Besiedelung der Lunge mit A. pleuropneumoniae bei 84,7%, die diagnostische Spezifität bei 66,7%. Die diagnostischen Vorhersagewerte waren 94,6% (positiv) und 35,3% (negativ). Insgesamt lag die Sensitivität zur Aufdeckung eines zuvor erfolgten Erregerkontaktes bei 78,2% für die Untersuchung von Tonsillenmaterial und bei 88,0% für die Untersuchung von Lungengewebe.

Fazit: Es bestehen zwar signifikante Korrelationen zwischen der Schwere der klinischen Erkrankung, dem Ausmaß der vorliegenden Lungenveränderungen und der Re-Isolierungsrate von A. pleuropneumoniae aus Lungen- und Tonsillengwebe, jedoch ist der negative Vorhersagewert der Untersuchung von Tonsillenproben mit 35,3% relativ niedrig. Dieser Vorhersagewert gibt an, mit wieviel prozentiger Sicherheit ein negativ getestetes Tier auch wirklich negativ ist. Von einer reinen Untersuchung der Tonsillen zur Festlegung eines Infektions- bzw.

Kolonisationsstatus des Tieres ist daher abzusehen. Dieses ist von besonderer Bedeutung, da bei negativen Tonsillarbefunden durchaus eine hochgradige Kolonisation der Lunge vorliegen kann.