Aus der Arbeitsgruppe Immunologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
und der
Klinik für Wiederkäuer
der Ludwig-Maximilians-Universität München
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Untersuchungen zu frühen Erreger-Wirts- Interaktionen bei der Mastitis des Rindes
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines
DOKTORS DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.)
durch die Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Wolfram Petzl
aus Köln
Hannover 2005
Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. med. vet. H.-J. Schuberth Prof. Dr. med. vet. Holm Zerbe
1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. med. vet. H.-J. Schuberth 2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. M. Hoedemaker
Tag der mündlichen Prüfung: 18. November 2005
Gefördert im Rahmen des DFG-Projektes SCHU 1108/2-1/2 (Struktur boviner TOLL-like Re- zeptoren und ihre Bedeutung für die Modulation der Makrophagenaktivität bei Entzündungen
des mammären und endometrialen Gewebes beim Rind) durch Personal- und Sachmittel.
Für Nadine
Inhaltsverzeichnis
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen... 8
1 Einleitung und Zielsetzung ...11
2 Literaturübersicht ...13
2.1 Die Mastitis des Rindes ...13
2.2 Abwehrmechanismen im Euter...15
2.2.1 humorale Faktoren...15
2.2.2 zelluläre Faktoren...18
2.3 Sexualsteroide im peripartalen Zeitraum ...23
2.4 Experimentelle Mastitis-Modelle ...25
2.5 Erkennung von Erregern und deren Bestandteilen durch Komponenten des angeborenen Immunsystems ...26
2.5.1 Erregermuster ...26
2.5.2 Erregermusterrezeptoren ...28
2.5.3 Funktionelle Konsequenzen einer Toll-like-Rezeptor (TLR) vermittelten Stimulation von Makrophagen...31
3 Geräte, Material und Methoden ...33
3.1 Geräte...33
3.2 Material ...34
3.2.1 Klinikbedarf ...34
3.2.2 Laborbedarf...34
3.2.3 Reagenzien ...35
3.2.4 Versuchstiere...36
3.2.4.1 Versuchstiere im Rahmen des Mastitis-Modells ...36
3.2.4.2 Spendertiere zur Blutgewinnung ...36
3.2.5 Bakterienstämme...37
3.2.6 Verwendete Antikörper...38
3.2.6.1 Monoklonale Antikörper (Primärantikörper)...38
3.2.6.2 Konjugierte Antikörper ...38
3.2.7 Kulturmedien, Puffer und Lösungen ...39
3.2.7.1 Zellkulturmedien und Zusätze ...39
3.2.7.2 Material für die Separation von Zellen...40
3.2.7.3 Reagenzien für die Messung der Arginase-Aktivität ...41
3.2.7.4 Reagenzien für die Messung der Nitrat- und Nitrit-Produktion ...42
3.2.7.5 Lösungen zum Fixieren und Quantifizieren von bovinen Zellen...43
3.2.7.6 Lösung für die Fixierung boviner Suspensionszellen ...43
3.2.7.7 Lösungen zur Gewinnung von RNA aus bovinen Leukozyten ...43
3.2.7.8 Puffer für die Gewinnung von Monozyten mittels MACS...43
3.2.7.9 Lösungen für die Durchflusszytometrie ...43
3.3 Methoden...44
3.3.1 Gewinnung von venösem Blut ...44
3.3.2 Gewinnung von Serum aus peripherem Blut...44
3.3.3 Gewinnung boviner Leukozyten ...44
3.3.4 Gewinnung boviner mononukleärer Zellen...44
3.3.5 Gewinnung neutrophiler Granulozyten...45
3.3.5.1 Dichtegradientenzentrifugation...45
3.3.5.2 Isolierung neutrophiler Granulozyten mittels Transmigrationskammer...45
3.3.6 Gewinnung von Monozyten aus dem peripheren Blut ...46
3.3.7 Generierung von Makrophagen aus Blutmonozyten durch In-vitro-Reifung ...47
3.3.8 Durchflusszytometrie ...48
3.3.9 Herstellung von Referenzzellen ...48
3.3.10 Vitalitätsbestimmung von Zellen...49
3.3.10.1 Mikroskopische Vitalitätsbeurteilung und Quantifizierung nach Acridin- Orange/Ethidiumbromid-Färbung ...49
3.3.10.2 Beurteilung der Zellvitalität mit der Durchflusszytometrie ...49
3.3.11 Quantifizierung der Zahl vitaler Zellen mit Hilfe des Durchflusszytometers (Referenzzellmethode)...49
3.3.12 Bestimmung der Konzentration verschiedener Steroidhormone ...49
3.3.13 Methoden in einem Mastitis-Infektionsmodell...50
3.3.13.1 Tierschutzantrag ...50
3.3.13.2 Modellbedingungen und Voruntersuchung der Probanden ...50
3.3.13.3 Präparation der Infektionsdosis ...50
3.3.13.4 Experimentelle Infektion einzelner Euterviertel ...50
3.3.13.5 Erhebung und Beurteilung allgemeiner klinischer Parameter ...51
3.3.13.6 Klinische Labordiagnostik ...52
3.3.13.7 Gewinnung von Milchproben ...52
3.3.13.8 Aufarbeitung und Analyse von Milchproben...53
3.3.13.9 Indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF)...54
3.3.13.10 Gewinnung von Gewebeproben...55
3.3.14 Methoden zur Untersuchung des Einflusses von weiblichen Sexualsteroiden auf PAMP vermittelte Effekte boviner Makrophagen und mononukleärer Zellen in vitro ...56
3.3.14.1 Präparation boviner Leukozyten zur immunhistologischen Untersuchung auf Expression von Östrogen- und Progesteronrezeptoren ...56
3.3.14.2 Präparation der RNA aus bovinen Leukozyten zur Untersuchung auf Östrogenrezeptoren ...56
3.3.14.3 Präparation der RNA aus bovinen MdM zur Untersuchung auf Expression von Toll-like Rezeptoren...57
3.3.14.4 Kultivierung boviner Leukozyten in vitro ...57
3.3.14.5 Kokultivierung von Makrophagen und mononukleären Zellen mit Granulozyten in vitro...57
3.3.15 Untersuchungen zum Argininstoffwechsel boviner Makrophagen und mononukleärer Zellen ...58
3.3.15.1 Bestimmung der Arginase-Aktivität ...58
3.3.15.2 Nitrit- und Nitratbestimmung mittels Griess-Reagenz ...58
3.3.16 Statistische Verfahren...59
4 Ergebnisse ...60
4.1 Etablierung eines experimentellen Mastitis-Modells mit E. coli und S. aureus...60
4.1.1 Klinische Parameter experimentell infizierter Tiere...60
4.1.1.1 Körpertemperatur ...60
4.1.1.2 Milchleistung ...61
4.1.1.3 Allgemeine klinische Symptome ...61
4.1.1.4 Differentialblutbild...62
4.1.2 Bakteriologische Befunde ...63
4.1.3 Somatische Zellzahl der Milch (SCC) im Infektionsverlauf ...65
4.1.3.1 Veränderung des SCC im Verlauf einer experimentellen Mastitis mit E. coli...65
4.1.3.2 Veränderung des SCC im Verlauf einer experimentellen Mastitis mit S. aureus...67
4.1.3.3 Veränderungen des Differentialzellbildes im Eutersekret...69
4.1.3.4 Morphologische Veränderungen neutrophiler Granulozyten ...72
4.1.3.5 Zelluläre Zusammensetzung der Anfangs- und Endgemelke...74
4.1.4 Pathologisch-anatomische und -histologische Befunde ...76
4.1.5 Toll-like-Rezeptor- und Defensingenexpression...80
4.1.5.1 Milchdrüsengewebe...80
4.1.5.2 Lymphknoten...87
4.1.5.3 Somatische Zellen der Milch ...93
4.1.5.4 Leukozyten und Thrombozyten des Blutes...98
4.2 Einfluss weiblicher Sexualhormone auf das Makrophagen- und MNC-vermittelte Absterben neutrophiler Granulozyten in vitro ...101
4.2.1 Voruntersuchungen ...101
4.2.1.1 Untersuchungen zum Vorkommen von Östrogen- und Progesteronrezeptoren in bovinen Leukozyten...101
4.2.1.2 Östrogen- und Progesteronkonzentrationen in verwendeten Medien und Zusätzen und im Blutplasma der Spendertiere ...103
4.2.2 Einfluss verschiedener Konzentrationen von Progesteron und Östradiol- 17-β auf die Absterberate der PMN nach Stimulation der Gesamtleukozyten mit PAMPs in vitro ...103
4.2.3 MNC-vermittelte Effekte auf die Vitalität autologer PMN und deren Beeinflussung durch Progesteron und Östradiol-17β ...104
4.2.4 Makrophagenvermittelte Effekte auf die Vitalität autologer PMN und deren Beeinflussung durch Progesteron und Östradiol-17β ...107
4.2.4.1 Hormonregulation der TLR-2-, -4- und β-Defensingenxpression in bovinen in-vitro-generierten Makrophagen (MdM)...107
4.3 LPS-vermittelte Effekte auf den Arginin-Stoffwechsel von Makrophagen und mononukleären Zellen in vitro...109
5 Diskussion ...111
5.1 Der Arginin-Stoffwechsel boviner Makrophagen ...111
5.2 Einfluss weiblicher Sexualhormone auf Makrophagen und MNC in vitro ...112
5.3 Frühe Erreger-Wirts-Interaktionen nach experimenteller intramammärer Infektion ...115
5.3.1 Etablierung eines Mastitis-Infektionsmodells...115
5.3.2 Einfluss einer experimentellen Mastitis mit E. coli und S. aureus auf die Expression von Toll-like Rezeptoren und β-Defensinen ...119
6 Zusammenfassung...123
7 Summary ...126
8 Literaturverzeichnis...128
Erklärung ...167
Danksagung...168
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
Aqua tridest. Aqua tridestillata (dreifach destilliertes Wasser) µ mikro (x 10-6)
BNBD4 Bovines β-Defensin 4 BNBD5 Bovines β-Defensin 5
BSA Bovines Serumalbumin
bspw. beispielsweise
bzw. beziehungsweise
C1 Komplementkomponente C1
C1q Fragment der Komplementkomponente C1
C3b opsonisierendes Fragment der Komplementkomponente C3 CD Cluster of Differentiation
CO2 Kohlenstoffdioxid
COX Cyclooxigenase
CpG Cytosin-Phosphat-Guanosin CXCL6 Granulocyte Chemotactic Protein 2 CXCL8 Interleukin-8
DNA Desoxyribonukleinsäure E. coli Escherichia coli
EBD enteric beta-Defensin EDTA Ethylendiamintetraacetat
ERα Östrogenrezeptor-α
ERβ Östrogenrezeptor-β
et al. et alii (lateinisch: und andere)
FACScan® Fluorescence Activated Cell Scanner (Fluoreszenzaktiviertes Zellmessgerät der Firma Becton Dickinson, Heidelberg)
Fc Fragment Cristalline (kristallisierbarer Antikörperteil, carboxy-terminales Frag- ment von Immunglobulinen nach Papain-Spaltung)
FCM Flow Cytometer (Durchflusszytometer) FCS Fetal Calf Serum (Fetales Kälberserum) FITC Fluoreszeinisothiocyanat
FL-1, -2, -3 Messkanäle des Durchflusszytometers für emittierte Fluoreszenz FL-1 = Grünfluoreszenz, 530 ± 15 nm; FL-2 = Orangefluoreszenz, 585 ± 21 nm; FL-3 = Rotfluoreszenz, >650 nm)
FSC Forward Scatter (Vorwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan®
g Gramm
G-CSF Granulocyte-Colony Stimulating Factor (Granulozyten-Wachstumsfaktor) GM-CSF Granulocyte-Macrophage-Colony Stimulating Factor (Granulozyten-
Makrophagen-Wachstumsfaktor) GPI Glycosylphosphatidylinositol h hora (lateinisch: Stunde)
HSP Heat Shock Protein (Hitze-Schock Protein) i.d.R in der Regel
i.m. intra muskulär i.p. intra peritoneal
I10F+Strep Iscové-Zellkulturmedium mit L-Glutamin, Streptomycin und 10% FCS ICAM Intercellular Adhesion Molecule (interzelluläres Adhäsionsmolekül)
IFN Interferon
Ig Immunglobulin
IL Interleukin
iNOS induzierbare Stickoxid Synthetase iNOS induzierbare Stickstoffoxid Synthetase
IRF3 IFN Regulatory Factor 3 ISPF Isonitrosopropiophenon JNK c-JUN N-terminal Kinase
kg Kilogramm
l Liter
LAP Lingual Antimicrobial Peptide LBP Lipopolysaccharid-Binding Protein
LDL Low Density Lipoprotein (Lipoprotein geringer Dichte) LFA Leukozyten Funktions Antigen
Lnn. Lymphonodi (lateinisch: Lymphknoten)
LPS Lipopolysaccharid
LTA Lipoteichonsäure
LTB4 Leukotrien B4
m milli (x 10-3)
mAk monoklonale(r) Antikörper
MBL Mannose Binding Lectin (Mannose bindendes Lektin)
MdM Monocyte derived Macrophages (aus Monozyten gewonnene Makrophagen) MEC Milchdrüsenepithelzelle
MHC Major Histocompatibility Complex (Haupthistokompatibilitätskomplex)
MIF Membranimmunfluoreszenz
Min. Minute(n)
MIP Macrophage Inflammatory Protein (Makrophagen inflammatorisches Protein) MNC Mononuclear Cells (mononukleäre Zellen, hier: des Blutes)
MyD88 Myeloid Differentiation Factor 88 (myeloider Differenzierungsfaktor 88)
mRNA Messenger RNA
mU Milliunit
MW arithmetischer Mittelwert
n nano (x 10-9)
n= bei Berechnung des Mittelwertes die Anzahl der Einzelbeobachtungen
NaCl Natriumchlorid
NO Nitric Oxide (Stickstoffmonoxid)
Nr. Nummer
ODN Oligodeoxynukleotide
P Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Analyse der Ähnlichkeit zweier Datengrup- pen
PAMP Pathogen Associated Molecular Pattern (Molekulare Muster von Erregern) PbMEC Primäre bovine Milchdrüsenepithelzelle
PBS Phosphate Buffered Saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)
PD Phosphodiester
PE Phycoerythrin
PECAM Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule
Pellet Bodensatz; hier: durch Zentrifugation sedimentierte Zellen
PGE2 Progesteron E2
PGN Peptidoglycan
PI Propidiumiodid
PMN Polymorphonuclear Leukocytes (polymorphkernige neutrophile Granulozyten)
PR Progesteronrezeptor
PRR Pattern Recognition Receptor (Muster Erkennungs Rezeptor)
PS Phosphatidylserin
PT Phosphorothioat
ROS Reactive Oxigen Species (Reaktive Sauerstoffspezies)
RT Raumtemperatur
S Standardabweichung S. aureus Staphylococcus aureus
s.c. subkutan
SCC Somatic Cell Count (Somatische Zellen in der Milch) sCD 14 Soluble CD 14 (lösliches CD 14)
SEA Staphylococcus aureus Enterotoxin A
Sek. Sekunde(n)
SEM Standard Error of the Mean (Standardfehler des Mittelwertes)
sog. sogenannte(r)
spp. Spezies
SR- Scavenger-Receptor
SSC Side Scatter (Seitwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan® Th1, Th2 Bezeichnet den Phänotyp einer T-Helfer-Zelle 1 oder 2
TIR Toll Interacting Receptor
TIRAP TIR-Domain-Containing Adapter Protein TLR Toll-like-Receptor (Toll-like-Rezeptor)
TNF Tumor Necrosis Factor (Tumornekrosefaktor) TOLLIP Toll interacting Protein
TRAF6 TNF-Receptor-Associated Factor 6
TRAMP TNF-Receptor Related Apoptosis Mediating Protein TRIF TIR-domain-containing adaptor inducing IFN-β
u.a. unter anderem
uDef Universelles Defensin (integriert LAP, EBD, BNBD4, BNBD5 als auch ein BNBD5- und LAP-artiges Protein )
v.a. vor allem
v/v Volumen pro Volumen
VAG Viertelanfangsgemelk
VEG Viertelendgemelk
vgl. vergleiche
w/v Gewicht pro Volumen
x g multipliziert mit der Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/s²)
z.B. zum Beispiel
z.T. zum Teil
1 Einleitung und Zielsetzung
Die Euterentzündung (Mastitis) ist die teuerste Einzelerkrankung des Rindes in der Milchwirt- schaft (Miller et al. 1993). Die maßgeblich beteiligten Mastitiserreger sind zum einen Staphylococcus aureus (S. aureus), welcher vor allem langwierige, schwer zu therapierende, jedoch mild verlaufende Mastitiden verursacht. Im Gegensatz dazu werden akute, z.T. schwerwiegende klinische Mastiti- den häufig durch Escherichia coli (E. coli) hervorgerufen (Bannermann et al. 2004).
Der immunologische Hintergrund für die unterschiedliche Abwehrfähigkeit des Wirtes gegen- über verschiedenen Euterpathogenen ist noch weitgehend ungeklärt. Insbesondere gilt dies für sehr frühe Ereignisse und Mechanismen nach einer Infektion.
Die Erkennung eines pathogenen Erregers durch einen Wirt erfolgt durch zellständige Rezepto- ren, die charakteristische pathogene molekulare Muster (pathogen-associated molecular patterns, PAMPs) binden. Diese Rezeptorbindung führt über eine Kaskade weitergeleiteter Signale hin zur Zellaktivierung (Underhill und Ozinsky 2002). Daraus folgt letztendlich die koordinierte Expres- sion früher Abwehrsysteme und die Rekrutierung sowie Funktionsmodulation von Effektorzellen mit dem Ziel einer effektiven Keimeliminierung. Eine Hypothese für die unterschiedliche Anfäl- ligkeit von Kühen für Mastitiserreger und den unterschiedlichen Verlauf von S. aureus und E. coli- Infektionen lautete, dass die initiale Expression der Erkennungsrezeptoren unterschiedlich war oder im Verlauf einer Infektion unterschiedlich reguliert wird. Um sich der Analyse dieser Ereig- nisse mittelfristig nähern zu können, bedurfte es eines klar definierten Infektionsmodells.
Hierfür sollte in vivo ein Mastitis-Modell erstellt werden, um initiale Mechanismen während einer Euterinfektion unter standardisierten Bedingungen untersuchen zu können. Isolierte euterpatho- gene Stämme von S. aureus und E. coli wurden in bestimmten Dosen Tieren definierten Alters und Laktationsstadiums ins Euter intrazisternal appliziert. Hierzu gab es bereits eine Reihe etab- lierter Tiermodelle (u.a. Kremer et al. 1993, Pyörälä et al. 1994, Kornalijnslijper et al. 2003), je- doch galt es, verbessert im Vorfeld auf strenge, reproduzierbare Modellgrenzen zu achten. Ein- gehende, wiederholte Untersuchungen der Allgemeingesundheit, niedriger Milchzellzahlen und Freiheit von Mastitiserregern sollten gleiche Ausgangsbedingungen der Probanden schaffen. Das Tiermodell sollte weiterhin als Ausgangspunkt für prä- und postmortal gewonnene Blut-, Milch- sekret- und Gewebeproben dienen. Neben der Quantifizierung von Entzündungszellen im Sekret und deren durchflusszytometrischer Differenzierung im Infektionsverlauf sollte der analytische Schwerpunkt auf der Expressionsmessung von Rezeptoren für pathogene molekulare Muster (Toll-like Rezeptoren, TLR) und von Effektormolekülen der Abwehr am Beispiel der β- Defensine mittels quantitativer RT-PCR liegen. Unter den TLRs, von denen bei Maus und Mensch mittlerweile 11 Vertreter bekannt sind (Zhang et al. 2004) erkennen TLR-4 und TLR-2 jeweils Bestandteile Gram-negativer und Gram-positiver Bakterien. Diese Rezeptoren sollten im Vergleich zu weiteren TLRs analysiert werden, die erregerübergreifende PAMPs erkennen (TLR- 9) oder nicht im Zusammenhang mit S. aureus- oder E. coli-spezifischen PAMPs in Erscheinung treten (TLR-6, TLR-3).
Diese deskriptiven Analysen des Infektionsgeschehens wurden in einem zweiten Teil der Arbeit um funktionelle Analysen ergänzt. Hier stand ebenfalls die These einer unterschiedlich regulierten TLR-Expression im Vordergrund. Ein gehäuftes Auftreten von Mastitiden im geburtsnahen Zeit- raum lässt auf eine Dysregulation von Abwehrvorgängen in der Milchdrüse mit Beginn der Lak- tation schliessen. Makrophagen stellen wichtige Zellen für die initiale Erkennung von Erregern über TLRs und die folgende Einleitung einer Immunantwort dar (McGuire et al. 2005). Während der Gravidität produzieren die Gewebs-residenten Makrophagen vermehrt anti-inflammatorische Mediatoren. Der postpartal verstärkte Kontakt mit pathogenen Erregern erfordert jedoch ein
schnelles „Umschalten“ zu einer initial pro-inflammatorischen Immunantwort. Postuliert wurde hier ein nicht adäquates Expressionsmuster von TLRs. Es wurde zudem hypothetisiert, dass die TLR-Expression hormonell gesteuert wird, basierend auf der starken Dynamik der Sexualsteroide Progesteron und Östrogen um den Geburtstermin. Für beide Hormone wurden bereits immun- modulatorische Eigenschaften beschrieben (Wessendorf et al. 1998, Scheibl und Zerbe 2000).
Modellhaft sollten in-vitro-generierte Makrophagen bezüglich ihrer Regulierbarkeit über die ge- nannten Hormone untersucht werden. Um zu prüfen, ob nach Stimulation der generierten Zellen mit Erregermustern eine eher pro- oder anti-inflammatorische Reaktion folgt, wurde der zelluläre Arginin-Stoffwechsel analysiert. Aus dem murinen System ist bekannt, dass eine pro- inflammatorische Reaktionslage durch eine Aktivierung der induzierbaren Stickoxidsynthase (i- NOS) gekennzeichnet ist, während sich eine anti-inflammatorische Reaktionslage durch die Akti- vierung der Arginase darstellt. Ob und wie in-vitro-generierte bovine Makrophagen vergleichbar reagieren war nicht bekannt. Diese Analysen wurden ergänzt durch den Einfluss hormonell regu- lierter und PAMP-stimulierter Makrophagen auf die bei der Mastitis wesentlichen Effektorzellen, die neutrophilen Granulozyten.
Differenzierte Kenntnisse über die Expression und Regulation von TLRs im Verlauf der Mastitis des Rindes und über funktionelle Konsequenzen einer unterschiedlichen Expression für immu- nologische Effektormechanismen fehlten bisher weitestgehend.
Die vorliegende Arbeit soll zum Verständnis initialer Immunmechanismen in der Milchdrüse beitragen und damit Wege zur prophylaktischen Modulation des wirtseigenen Immunsystems aufzeigen. Mittel- bis langfristig kann dies zur Entwicklung neuer diagnostischer, therapeutischer und züchterischer Ansätze für den Krankheitskomplex Mastitis führen.
2 Literaturübersicht 2.1 Die Mastitis des Rindes
Die Entzündung der Milchdrüse (Mastitis) gilt als eine der häufigsten und kostspieligsten Erkran- kungen in Milchviehherden (Fourichon et al. 2001, Miller et al. 1993, Rajala-Schultz und Gröhn 1999): In den USA verursacht sie in der Milchindustrie jährlich wirtschaftliche Verluste von etwa 2 Milliarden US-Dollar (National Mastitis Council 1999). Pro Einzelfall einer klinischen Mastitis liegt der Milchproduktionsausfall im Durchschnitt bei ca. 375 kg (5% der Leistung einer Laktati- on) (Seegers et al. 2003). Die Behandlung von Mastitiden mit Antibiotika wird weiterhin als effek- tivstes und kostengünstigstes Konzept bewertet (Shim et al. 2004), ist jedoch wirtschaftlich und bezüglich des Verbraucherschutzes als problematisch einzuschätzen (Krabisch et al. 1999).
Bakterien sind die häufigsten Mastitiserreger, gefolgt von Hefen und Pilzen (Tolle 1975). Von Fällen akuter, klinischer Mastitiden werden am häufigsten Gram-negative Keime isoliert. Die durch Escherichia spp., Klebsiella spp. und Enterobacter spp. hervorgerufene Mastitis wird auch als „co- liforme Mastitis“ bezeichnet (Koneman et al. 1983). Weitere mastitisrelevante, Gram-negative Bakterien beim Rind sind Serratia spp., Pseudomonas spp. und Proteus spp. (Hogan und Smith 2003).
Bei allen diesen Bakterien handelt es sich um opportunistische, umweltassoziierte Mastitiserreger, die sich annähernd in der gesamten Umgebung der Tiere nachweisen lassen und wie im Falle von Escherichia coli (E. coli) der Magen-Darm-Flora zuzuordnen sind (Hogan et al. 1999).
Obwohl eine hämatogene Besiedlung des Euters möglich ist, findet eine intramammäre Infektion mit E. coli vermutlich überwiegend über das Eindringen durch den Zitzenkanal und eine Vermeh- rung im Lumen der Milchdrüse statt. Es bedarf weder einer Adhärenz am Drüsenepithel noch besonderer Virulenzfaktoren zur Manifestation einer intramammären Infektion mit E. coli (Frost et al. 1977, Opdebeeck et al. 1988). Die Eigenschaft, sich im Eutersekret zu vermehren, ist aus- reichend. Voraussetzung ist die Lactoseverwertung und das Wachstum unter nahezu anaeroben Bedingungen. Die Schwere klinischer Symptome scheint dabei mit der Höhe der Keimzahl in der Milch zu korrelieren (Hogan und Smith 2003).
Intramammäre Infektionen mit E. coli führen fast immer zu akuten Mastitiden, die meist durch einen schwerwiegenden Verlauf gekennzeichnet sind. Häufig beobachtet man eine hochgradige Störung des Allgemeinbefindens, die bis zur Septikämie und vereinzelten Todesfällen führen kann. Ebenso wie das rasche Auftreten, findet aber auch oftmals eine zügige Heilung statt (Smith und Hogan 1993). So dauert eine „Coli-Mastitis“ in der Regel während der Laktation weniger als zehn Tage (Todthunter et al. 1991) und wird durch den Einsatz von Antibiotika nicht wesentlich verkürzt (Smith et al. 1985).
Die am häufigsten durch Übertragung während des Melkvorgangs ausgelösten kuhassoziierten
„Kokken-Mastitiden“ repräsentieren etwa 80-90 % aller subklinschen Fälle (Tolle 1982). Neben Streptococcus agalactiae und Streptococcus dysgalactiae ist Staphylococcus aureus (S. aureus) ein weiterer über- aus wichtiger Mastitiserreger. Er ist der häufigste Auslöser der Mastitis beim Rind (de Haas et al.
2004) und ist neben der großen Anzahl subklinischer Fälle auch ursächlich bei mehr als 30 % der klinischen Fälle beteiligt (Pyörälä und Pyörälä 1997). S. aureus gehört zu den Gram-positiven, fa- kultativ pathogenen Bakterien, die als Kommensalen auf Haut und Schleimhäuten vorkommen, jedoch auch lebensbedrohliche Erkrankungen wie bspw. Wundinfektionen, Toxisches Schock- syndrom, Endocarditis oder Sepsis auslösen können. Die Pathogenität von S. aureus beruht auf der Wirkung verschiedener Virulenzfaktoren, die sich aus sekretorischen Produkten und struktu- rellen Komponenten ergeben (Kerro Dego et al. 2002). Sie begünstigen eine Infektion durch die Produktion antiphagozytotischer Faktoren wie dem Protein A oder einer Kapselbildung (Coster- ton et al. 1981, Baselga et al. 1994, Sutra und Poutrel 1994). Des weiteren können sie an Milchdrüsenepithelzellen haften (Almeida et al. 1996, Hensen et al. 2000), besitzen die Fähigkeit,
in Makrophagen (Hébert et al. 2000) und Epithelzellen (Lammers et al. 1999) zu überleben und produzieren eine Reihe von Exotoxinen, Superantigenen und Proteasen (Bramley et al. 1989, Cifrian et al. 1996, Larsen et al. 2000, Stephan et al. 2001, Arvidson und Tegmark 2001). Obwohl der Wirkmechanismus einzelner Virulenzfaktoren bereits bekannt ist, sind ihr Zusammenspiel und ihre Regulation bisher wenig verstanden (Novick 2003). Ein wesentlicher Bestandteil der Zellwand Gram-positiver Erreger ist die Lipoteichonsäure (LTA, lipoteichoic acid). Über sie werden, ähnlich dem Lipopolysacharid (LPS) Gram-negativer Keime, immunmodulatorische Prozesse induziert (von Aulock et al. 2003).
Im Gegensatz zur intramammären Infektion mit E. coli verlaufen die durch S. aureus hervorgeru- fenen Mastitiden meist weniger schwer, resultieren aber sehr häufig in chronischen Infektionen, die lebenslang bei dem betroffenen Individuum persistieren können (Sutra und Poutrel 1994).
Dabei kommt es nicht selten zur subklinischen Mastitis, die im Gegensatz zur klinisch manifesten Verlaufsform nicht durch eine grobsinnliche Symptomatik, jedoch durch einen bakteriologisch positiven Befund und erhöhte Milchzellzahlen (SCC, somatic cell count) gekennzeichnet ist (Ha- mann und Fehlings 2002). Betroffene Tiere stellen somit ein ständiges Erregerreservoir in der Herde dar (Robertson et al. 1994).
Man geht davon aus, dass meist das Zusammenwirken mehrerer Faktoren (v.a. mangelnde Melk- hygiene, Fütterungs- und Haltungsmängel, Stress) die Entstehung einer Mastitis begünstigt (Ha- mann und Fehlings 2002). Mastitiden treten präferentiell in der Trockenstehzeit und im periparta- len Zeitraum auf. So wurde gezeigt, dass 65% aller „coliformen Mastitiden“ (v.a. durch E. coli), die in den ersten zwei Monaten der Laktation auftreten, auf eine Infektion in der Trockenstehpe- riode zurückgehen und sich erst mit Beginn der Laktation zu klinischen Mastitiden entwickeln (Smith et al. 1985). Gründe hierfür scheinen die Steigerung verfügbarer Nährstoffe aus der Milch, als auch ein Absinken antimikrobieller Faktoren wie bspw. Laktoferrin zu sein (Todthunter et al.
1990). Von einer ähnlichen Situation wird auch bei Mastitiden durch Kuh-assoziierte, Gram- positive Erreger ausgegangen (Huszenicza et al. 2004). In Milchviehbetrieben mit gutem Mana- gement ist eine Abnahme der Inzidenz von Mastitiden durch Gram-positive Erreger zu beobach- ten, bei gleichzeitigem Anstieg Gram-negativ bedingter Infektionen (Myllys et al. 1998, Erskine 2000). Mit zunehmender Laktationsdauer nimmt die Inzidenz von „Coli-Mastitiden“ ab (Husze- nicza et al. 2004), mit zunehmendem Alter und Anzahl der Laktationen hingegen zu (Hogan und Smith 2003, Burvenich et al. 2003). Die Inzidenz der durch Gram-positive Erreger hervorgerufe- nen Mastitiden nimmt mit zunehmender Laktationszahl ab (Huszenicza et al. 2004).
Die kritische peripartale Phase ist durch massive metabolische und hormonelle Veränderungen gekennzeichnet. So wird die pathogenetische Bedeutung erhöhter Plasmaketokörperkonzentrati- onen einerseits (Suriyasathaporn et al. 1999) und die immunmodulatorische Potenz der peripartal stark veränderlichen Steroidhormone (Östrogene, Progesteron, Kortikosteroide) diskutiert (Wes- sendorf et al. 1998, Scheibl und Zerbe 2000, Zdunczyk et al. 2001). Interessanterweise ist zu beo- bachten, dass eine „Coli-Mastitis“ im peripartalen Zeitraum meist als schwere Erkrankung mit teilweise irreparablen Schäden für das betroffene Euterviertel verläuft (Vandeputte-Van Messom et al. 1993). Dagegen sind in der späteren Laktation meist moderate, oft schnell selbstheilende Verläufe zu beobachten (Hill 1991). Auch dies lässt auf einen entscheidenden Einfluss Kuh- assoziierter peripartaler Faktoren auf frühe Erreger-Wirts-Interaktionen schliessen.
2.2 Abwehrmechanismen im Euter 2.2.1 humorale Faktoren
Lösliches CD14 (sCD14)
Das membranständige, im Wesentlichen auf Monozyten und Makrophagen exprimierte CD14 (cluster of differentiation 14, siehe 2.5.2) dient als Erkennungsrezeptor für bakterielles LPS (En- dotoxin) und wird durch Proteasen als lösliches CD14 (sCD14, soluble CD14) freigesetzt. Diese lösliche Form kann in beträchtlicher Menge in Milch und Kolostrum vorkommen (Wang et al.
1997, Labeta et al. 2000, Filip et al. 2001). Lösliches CD14 erleichtert die Neutralisation von frei- en Endotoxinen und Lipoproteinen, welche durch Teilung und Absterben von Bakterien freige- setzt werden (Soler-Rodriguez et al. 2000). Wird sCD14 intramammär infundiert, unterstützt die Bindung von LPS die akute Entzündungsantwort über die Sensibilisierung und Aktivierung CD14-negativer Zellen (in der Milchdrüse die Milchdrüsenepithelzelle). So scheint sCD14 bei niedriger Endotoxinkonzentration freie Endotoxine abzufangen und die akute Entzündungsant- wort zu initiieren: Ein hierdurch hervorgerufenes frühes Einwandern neutrophiler Granulozyten (siehe 2.2.2) sorgt dafür, dass eine Immunantwort ausgelöst wird, bevor ein nennenswertes Bak- terienwachstum stattfinden kann. Von beiden Funktionen des löslichen CD14 nimmt man an, dass sie entscheidend für eine schnelle Eliminierung intramammärer Infektionen mit Gram- negativen Keimen sind und dadurch einem systemischen Schock und Agalaktie vorbeugen (Bur- ton und Erskine 2003). In neueren Studien wurde sCD14 zudem als das erste natürlich vorkom- mende lösliche Protein dargestellt, das in der Lage ist, bei isolierten B-Zellen Wachstum und Dif- ferenzierung zu induzieren (Filip et al. 2001). Es hemmt überdies die Interleukin-2- (IL-2-), Inter- feron-γ- (IFN- γ) und die IL-4-Produktion aktivierter humaner T-Zellen (Rey Nores et al. 1999).
Damit reguliert und beeinflusst sCD14 lokale, angeborene und adaptive Immunantworten. Eine therapeutische Anwendung dieser Moleküle gilt als denkbar (Burton und Erskine 2003).
Komplement
Das Komplementsystem bildet das wichtigste humorale Effektorsystem der angeborenen Immu- nität. In der Milch spielt vor allem seine direkte Aktivierung durch verschiedene mikrobielle Be- standteile eine bedeutende Rolle. Diese führt letztendlich zu einer Opsonisierung von Erreger- bestandteilen und dadurch zu einer Förderung der Phagozytoseaktivität. Das biologisch aktivste Komplementfragment in der Milch ist C5a. Dieses Fragment führt als chemotaktische Kompo- nente zu einem vermehrten intramammären Einstrom von Neutrophilen. Einzelne Kühe unter- scheiden sich erheblich in der initialen Konzentration von C5 in der Milch und demnach eben- falls in ihrer Möglichkeit, C5a im Rahmen einer initialen Entzündungsreaktion zu generieren (Rainard und Poutrel 2000). Somit scheint bei Kühen mit einer niedrigen Konzentration von C5 in der Milch das Komplementsystem von minimalem Wert für die initiale Aktivierung von Leu- kozyten zu sein (Kehrli und Harp 2001). Auch die Art der Infektion scheint beeinflussend zu wirken: so konnte nach intramammärer Infektion mit E. coli deutlich mehr C5a nachgewiesen werden als nach einer Infektion mit S. aureus (Riolet et al. 2000). Neben C5a als chemotaktischer Komponente in der Milch stellt C3b einen wichtigen Opsonisierungsfaktor für die Phagozytose von Mikroorganismen dar. Werden Pathogene mit großen Mengen solcher aktivierten Komple- ment-Komponenten opsonisiert, wird die Erkennung und Phagozytose durch Neutrophile stark gefördert (Targowski 1983, Mueller et al. 1983).
Zytokine und Chemokine
Zytokine sind biologische Botenstoffe, die Signale zwischen Zellen übermitteln. Es sind kleine, lösliche Proteine, die von einer Zelle gebildet werden und entweder die eigenen Eigenschaften, die einer benachbarten oder entfernten Zelle rezeptorvermittelt verändern. Sie werden von vielen
Zellen, nicht nur denen des Immunsystems, freigesetzt. Eine besondere Gruppe der Zytokine stellen die Chemokine dar: Sie veranlassen spezifisch Zellen, zur Quelle der Chemokinausschüt- tung zu wandern (Janeway et al. 2002).
Durch pro- und anti-inflammatorische Eigenschaften (siehe Tabelle 1) spielen sie als Immunmo- dulatoren eine große Rolle bei der Mastitisabwehr (Sordillo et al. 1991). So wiesen Untersuchun- gen im Kolostrum eine niedrige IL-2-Konzentation auf, was sowohl mit einer herabgesetzten Funktion der zellulären Abwehr als auch einer hohen Inzidenz an Mastitiden korrelierte (Sordillo und Streicher 2002). Untersuchungen zu einem möglichen therapeutischen Einsatz von IL-2 im Rahmen der Mastitisbekämpfung sind beschrieben (Daley et al. 1993). Aus der Gruppe der Ko- lonie-stimulierenden Faktoren (colony stimulating factors, CSF) konnte rekombinanter humaner Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (rhG-CSF) nach subkutaner Applikation beim Rind die Anzahl zirkulierender PMN erhöhen (Cullor et al. 1990). Rekombinanter boviner Granulozy- ten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (rbGM-CSF) hingegen zeigte nach intramam- märer Applikation keinen signifikanten Effekt auf die somatische Zellzahl, steigerte jedoch die Fähigkeit residenter PMN zur Produktion von Superoxiden (Daley et al. 1993). Während einer experimentellen Mastitis mit E. coli und S. aureus konnte eine vergleichbare Steigerung von IL-1, IFN-γ, und IL-12 im Milchsekret beobachtet werden. Eine E. coli-Mastitis induzierte zudem eine deutliche Freisetzung von TNF-α und IL-8. (Bannerman et al. 2004).
Tabelle 1: Effekte von Zytokinen und Chemokinen auf die Immunantwort im Euter (modifi- ziert nach Sordillo und Streicher 2002)
Zytokin Eigenschaft, Beobachtungen
IL-1 Akut pro-inflammatorisch; steigert die Anzahl Neutrophiler und deren phagozytierende und bakterizide Eigenschaften.
IL-2 Steigert die Proliferation mononukleärer Zellen des Euters; verbessert cytotoxische und bakterizide Lym- phozytenaktivität; erhöht die Anzahl von Plasma-Zellen; aktiviert NK-Zellen.
IL-8 Entzündungseinleitend, potent chemoattraktiv; bewirkt das Einwandern und die Induktion von endothelialen Bindungsstellen auf Neutrophilen.
G-CSF Steigert sowohl die Anzahl von Blut- und Milch-Neutrophilen als auch deren phagozytierende und bakterizide Eigenschaften; erhöht den SCC.
GM-CSF Erhöht die Anzahl an Phagozyten, steigert chemotaktische und bakterizide Eigenschaften von Neutrophilen, vergrößert cytotoxische Aktivität.
M-CSF Reguliert Differenzierung und Proliferation von Makrophagen; potent chemoattraktiv für Makrophagen.
IFN-γ Steigert phagozytierende und bakterizide Eigenschaften von Neutrophilen; steuert immunsuppres- siven Effekten in der Milch entgegen.
TNF-α Akut pro-inflammatorisch; steigert phagozytierende und bakterizide Eigenschaften von Neutrophilen, verstärkt die Expression endothelialer Adhäsionsmoleküle.
IL = Interleukin, G-CSF = Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor, GM-CSF = Granulozy- ten/Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor, M-CSF = Makrophagen-Kolonie-stimulierender Fak- tor, IFN-γ = Interferon-γ und TNF-α = Tumor Nekrose Faktor- α, SCC = somatische Zellzahl.
Antikörper
Die in der Milch vorhandenen und dominierenden Antikörperisotypen unterscheiden sich je nach Laktationsstadium. Im Kolostrum findet man eine hohe Konzentration von IgG1 und eine rela- tiv niedrige von IgA, während sich das Verhältnis in der späteren Laktation zu Gunsten von IgA verschiebt. Die Bindung von Antikörpern an Bakterien, alleine oder in Verbindung mit Kom- plementkomponenten, ist notwendig für die Opsonisierung von Pathogenen. Einigen Studien zufolge gilt IgM als ein wichtiges Opsonin für die Phagozytose durch bovine Neutrophile (Hill et al. 1983, Miller et al. 1988, Watson 1989, Hogan et al. 1992). Im Gegensatz zu IgM-Antikörpern benötigen Antikörper des Istotyps IgG2 keine Komplementbindung zur wirkungsvollen Opsoni- sierung (Colditz und Watson 1985, Rainard et al. 1988): Bovine Neutrophile exprimieren bei Einwanderung in infiziertes Gewebe verstärkt hochaffine, spezifische Fc-Rezeptoren für patho- gengebundene IgG2-Moleküle jedoch keine Fc-Rezeptoren für IgG1- oder IgA-Antikörper (Las- celles 1979, McGuire et al. 1979, Howard et al. 1980, Worku et al. 1994, Tao et al. 1995, Paape et al. 2000).
IgG1 ist der vorherrschende Antikörperisotyp in normaler Milch (Guidry et al. 1980), vermutlich, um eine passive Immunität für das Kalb zu gewährleisten. IgG1-Antikörper wie auch IgM- Antikörper neutralisieren Endotoxine, blockieren die bakterielle Kolonisation und fördern die Phagozytose durch Komplement-Bindung (Rainard und Boulard 1992, Tyler et al. 1992, Tomita et al. 1995).
Laktoferrin und Lysozym
Laktoferrin ist ein eisenbindendes Glykoprotein welches in den sekundären Granula der PMN und in biologischen Flüssigkeiten, insbesondere der Milch, vorkommt (Farnaud und Evans 2003). Es zeigt in vitro bakteriostatische Wirkung und in vivo eine Schutzfunktion gegen ver- schiedenste Mikroorganismen (van Hooijdonk et al. 2000, Kutila et al. 2003), die bei dem Spalt- produkt Laktoferricin noch stärker ausgeprägt sein sollen (Wakabayashi et al. 2003). Diese Wir- kung beruht auf einer ausgeprägten Fähigkeit zur Eisenbindung, wodurch Bakterien mit hohem Eisenstoffwechsel nicht mehr genügend Eisen zur Verfügung steht. Die höchsten Konzentratio- nen sind während der Trockenstehzeit messbar (Reiter und Oran 1967). Aber auch bei Mastitiden ist der Spiegel in der Milch erhöht (Hagiwara et al. 2003).
Lysozym ist ein Enzym, das an der Zellwand Gram-positiver und Gram-negativer Bakterien haf- tet. Durch Zerstörung der Bindungen in Bestandteilen bakterieller Zellmembranen (Mureine) wirkt es bakteriolytisch. Da es beim Rind in erheblich geringerer Konzentration als beim Men- schen vorkommt, bietet es bei ersteren vermutlich nur wenig Schutz (Sordillo und Streicher 2002).
Beta-Defensine
Defensine sind Cystein- und Arginin-reiche, weit verbreitete bakterizide und fungizide Peptide (Schroder 1999, Zasloff 2002). Sie werden in drei Unterfamilien eingeteilt: α-, β- und θ- Defensine. Bei den β-Defensinen handelt es sich um kationische, amphiphile Moleküle, die aus 38-42 Aminosäuren bestehen. Sie werden in Epithelzellen und besonders in neutrophilen Granu- lozyten synthetisiert. Ihre Wirksamkeit ist pathogenspezifisch und die Expression einer Reihe dieser Gene wird durch Pathogene induziert (Diamond et al. 1996, Diamond et al. 2000). Als Effektormoleküle der neutrophilen Granulozyten macht ihr Anteil bis zu 15 % des Gesamtei- weißgehaltes dieser Zellen aus (Boman 1995). Die Expression des Gens für β-Defensin-2 beim Menschen geschieht über Toll-like-Rezeptor-2 und -4 (siehe 2.5.2) vermittelte Nuklear Faktor- kappa B (NF-κB) -Aktivierung (Birchler et al. 2001, Vora et al. 2004). Darüber hinaus wurde ge- zeigt, dass β-Defensin-1 in der Milch der Frau in bakterizider Konzentration vorkommt (Jia et al.
2001).
Beim Rind sind bisher 16 β-Defensingene und 2 Pseudogene beschrieben (Roosen et al. 2004).
Einige davon wurden in der Milchdrüse des Rindes nachgewiesen. Bereits vor mehr als 30 Jahren wurde von einer β-Defensin-ähnlichen bakteriziden Aktivität in der Zitze des Rindes berichtet (Hibbit et al. 1971). Kürzlich konnte jedoch erstmals mittels In-situ-Hybridisierung gezeigt wer- den, dass die Milchdrüsenepithelzelle der dominierende Expressionsort für β-Defensin-5 (BNBD5) im infizierten Euter ist (Goldammer et al. 2004). Aufgrund der geringen Sauerstoff- spannung im infizierten Euterviertel gewinnen sauerstoffunabhängige Mechanismen, wie die der Defensine, zum Abtöten von Bakterien durch neutrophile Granulozyten an Bedeutung (Paape et al. 2003). Raj et al. (2000) ist die Synthese eines Defensin-Moleküls namens „Dodekapeptid“ aus bovinen neutrophilen Granulozyten gelungen, welches eine antimikrobielle Wirkung ähnlich der der natürlichen Defensine zeigt.
2.2.2 zelluläre Faktoren
LeukozytenIn der Milch klinisch gesunder Milchdrüsen sind zwischen 20.000 und 100.000 somatische Zellen (SCC) pro ml Milch nachweisbar. Die Festlegung dieser Zellzahlgrenzwerte beruht auf Untersu- chungen, in denen der Zellgehalt aus Viertelanfangsgemelken (VAG) ungeschädigter Euter von Erstkalbinnen untersucht wurde (Doggweiler und Hess 1983). Der Modalwert (Maximum der Häufigkeitsverteilung) betrug 20.000 Zellen/ml, die zweifache Standardabweichung, die in der Medizin übliche Sicherheitsgrenze der Norm, umfasste als obersten Wert 100.000 Zellen/ml.
Oberhalb eines SCC-Wertes von 100.000 Zellen pro ml Milch ändert sich die chemische Zu- sammensetzung der Milch (u.a. der Fett- und Eiweißgehalt), und es verringert sich die Milchleis- tung, was in der Summe zu erheblichen wirtschaftlichen Einbußen führt (Kitchen 1981, Hamann 1992).
Die Zellen der Milch setzen sich aus lymphoiden Zellen, Makrophagen, neutrophilen Granulozy- ten und Epithelzellen zusammen. Die Zusammensetzung ist äußerst variabel: So wurden Anteile für Makrophagen von 13% bis 95% der Gesamtleukozytenzahl beschrieben. Für Granulozyten schwanken die Werte zwischen 0% und 37% sowie für lymphoide Zellen zwischen 5% und 28 % (Paape et al. 1981, Concha 1986, Wever und Emanuelson 1989, Leitner et al. 2000). Diese erheb- lichen Schwankungen gelten ebenso für lymphozytäre Subpopulationen (B-Zellen, αβ-T-Zellen, γδ-T-Zellen) (Paape et al. 2000, Park et al. 2004) und hängen unter anderem vom Laktationssta- dium sowie der Gemelksfraktion ab (Miller et al. 1991, Östenson 1993).
Generell gehen die Meinungen bezüglich der Bedeutung initial vor Erregerkontakt in der Milch befindlicher Zellen auseinander. Ihr Vorhandensein und ihre Zusammensetzung kann als Aus- druck der Aktivität residenter Milchdrüsenepithelzellen angesehen werden, die möglicherweise über physiologische Faktoren (z.B. Hormone) gesteuert werden. Ob in der Milch befindliche Zellen an ersten immunologischen Induktionsprozessen nach Erreger-Kontakt maßgeblich teil- nehmen, ist nicht bekannt.
Milchdrüsenepithelzelle (MEC)
Die Bedeutung der MEC für die Abwehrleistung des Euters ist bisher nicht nachhaltig untersucht worden. Erst neuerdings mehren sich die Hinweise, dass den alveolaren Epithelzellen der Milch- drüse eine wesentliche Funktion bei der Infektionsabwehr zukommt. Anhand genomweiter Transkriptomanalysen wurde im murinen Milchdrüsengewebe gezeigt, dass die Abschaltung der Milchbildung während der Milchdrüseninvolution zu einer Aufregulierung einer ganzen Reihe immunrelevanter Gene führt (Stein et al. 2004, Clarkson et al. 2004). Beide Arbeiten weisen aus, dass in der Milchdrüse der Maus Gene exprimiert werden, die für verschiedene Immunglobulin- Ketten, Akute Phase Proteine, CD14, Lipopolysaccharid-Bindungsprotein (LBP) sowie für ver- schiedenste Zytokine kodieren. An primären bovinen Milchdrüsenepithelzellen (pbMEC) konnte exemplarisch gezeigt werden, dass diese nach Stimulation mit S. aureus oder LPS zur Synthese von Laktoferrin, TNF-α, Serum Amyloid A und IL-8 angeregt werden (Wellnitz und Kerr 2004).
Neben der oben bereits angesprochenen Induktion bakterizider β-Defensine (siehe 2.2.1) konnte auch eine erhöhte mRNA- Expression von TLR-2 und -4 bei der Mastitis des Rindes gezeigt werden (Goldammer et al. 2004). Es ist also bisher festzuhalten, dass die MEC ein ganzes Reper- toire immunologisch relevanter Faktoren exprimieren kann, deren Synthese durch pro- inflammatorische Faktoren stimuliert wird. Einige dieser Faktoren werden nicht systemisch, son- dern lokal begrenzt induziert, wie beispielhaft für die Mastitis-abhängige Induktion der β- Defensinsynthese im Euter gezeigt werden konnte (Yang et al. 2005).
Neutrophile Granulozyten
Unter dem Einfluss hämatopoetischer Faktoren reifen die neutrophilen Granulozyten über Zwi- schenstufen aus myeloischen Stammzellen des Knochenmarks heran und werden in den Blut- kreislauf freigesetzt (Roitt et al. 1991). Die lichtmikroskopisch neutralen (azurophilen, primären) Granula zählen gemeinsam mit dem vielgestaltigen, polymorphen Kern zu den charakteristischen morphologischen Merkmalen ausgereifter, neutrophiler Granulozyten. Andere Bezeichnungen lauten „Neutrophile“ oder „polymorphkernige Granulozyten“ (PMN, polymorphonuclear cells) (Janeway et al. 2002). Ihre primären Granula sind reich an mikrobiziden Enzymen wie Hydrola- sen, Lysozym, Myeloperoxidasen, Proteinasen, sauren Hydrolasen, Histaminase und kationischen Proteinen. Sekundäre Granula enthalten zudem noch Laktoferrin und Kollagenasen (Gemsa 1991, Klein 1991).
Während einer Infektion steigt die tägliche Produktion der Granulozyten im Knochenmark etwa um das Zehnfache. Ihre Überlebensdauer beträgt bei Mensch und Ratte etwa zwei bis drei Tage (Roitt et al. 1991, Hildebrandt 1998), kann aber durch lokal produzierte, anti-apoptotische Media- toren (Bliss et al. 1999) oder durch Einwanderung in Entzündungsgebiete verlängert werden (Watson et al. 1997). Bovine neutrophile Granulozyten sind sowohl funktionell als auch morpho- logisch denen anderer Spezies ähnlich, aber nicht identisch. Sie bilden neben den Lymphozyten die zweithäufigste Fraktion (25-45%) des Differentialblutbildes beim Rind, und ihre Halbwertzeit außerhalb des Knochenmarks beträgt durchschnittlich 8,9 Stunden (Carlson und Kaneko 1975).
Neben an den Blutgefäßen adhärenten zirkulieren ca. 100 Milliarden PMN bei einer gesunden, laktierenden Kuh im Blutgefäßsystem (Paape et al. 1979). Zusätzlich zu anderen Spezies besitzen bovine neutrophile Granulozyten eine dritte Art zytoplasmatischer Granula, die größer sind und kationische, selektiv bakterizide Proteine, wie z.B. Baktenecin (Romeo et al. 1988), Indolicin und β-Defensin enthalten (Selstedt et al. 1993). Bovinen Neutrophilen fehlt das Lysozym, eine Hauptkomponente der humanen azurophilen Granula. Im Gegensatz zu anderen Spezies besit- zen bovine Neutrophile jedoch offensichtlich Fc-Rezeptoren für IgM (Pastoret et al. 1998).
Neutrophile Granulozyten gelten als Haupteffektorzellen des angeborenen Immunsystems bei bakteriellen Infektionen der Milchdrüse (Paape et al. 2003). Hierbei kommt der Geschwindigkeit ihrer Rekrutierung, ihrer Anzahl und ihrer lokalen Überlebensdauer eine entscheidende Bedeu- tung für das Haften der Infektion und den Krankheitsverlauf zu. In-vitro-Studien konnten bele- gen, dass sich sowohl mammäre als auch uterine PMN von autologen Blut-PMN in ihrer bakteri- ziden Aktivität unterscheiden (Zerbe et al. 2000, Mehrzad et al. 2001). Als Ursache für die migra- tionsbedingten Modulationen der PMN-Charakteristika werden Interaktionen mit lokalen Makrophagen vermutet, jedoch fehlen entsprechende Studien bisher gänzlich. Aufgrund der star- ken interindividuellen Variabilität der funktionellen Kapazität von PMN aus dem Euter juveniler Rinder wurde vorgeschlagen, die phagozytische und die bakterizide Kapazität der Neutrophilen als Marker für die Resistenz gegenüber Euterinfektionen anzuwenden (Rysanek et al. 2001).
Entzündungsmediatoren (z.B. Interleukin-8, C5a, Leukotrien B4) wirken chemotaktisch auf neutrophile Granulozyten. Sie induzieren innerhalb weniger Stunden die Expression der Adhäsi- onsmoleküle E-Selektin (CD62E) und P-Selektin (CD62P) auf Endothelzellen. Wechselwirkun- gen mit dem L-Selektin der Leukozyten führen zu einer lokalen Verlangsamung der PMN im Blutstrom (Margination), sowie zu einer reversiblen Anheftung der Neutrophilen an die Gefäß- wand. IL-8 bewirkt eine Konformationsänderung der physiologischer Weise schwach bindenden
Leukozyten-Integrine LFA-1 (Leukozyten-Funktions-assoziiertes-Antigen-1, CD11a/ CD18) und CR3 (Komplementrezeptor-3, CD11b/CD18, auch MAC-1 genannt). Deren Affinität zu ihren Liganden, den interzellulären Zelladhäsionsmolekülen (ICAM-1, intercellular cell adhesion mole- cule), der Endothelzellen, wird dadurch deutlich erhöht, was eine Immobilisation der Zellen zur Folge hat. Als Verstärkung der Bindung dient das Immunglobulin ähnliche Molekül CD31 (auch PECAM, platelet endothelial cell adhesion molecule), das sowohl auf Leukozyten als auch an den Verbindungsstellen zwischen den Endothelzellen exprimiert wird (Janeway et al. 2002). So akti- vierte Neutrophile können zwischen die Endothelzellen und Blutgefäßmatrixproteine migrieren (Diapedese) und gelangen entlang eines Konzentrationsgradienten zum Entstehungsort der Ent- zündungsmediatoren.
Die durch Migration aktivierten Neutrophilen phagozytieren rezeptorvermittelt infektiöse Patho- gene und internalisieren sie in den Phagosomen. Nach Verschmelzung mit Lysosomen zu den Phagolysosomen werden mit Hilfe reaktiver Sauerstoffmetabolite und bakterizider lysosomaler Enzyme/Polypeptide die aufgenommenen Mikroorganismen inaktiviert und getötet (Djeu und Blanchard 1987, Jackson et al. 1995, Cassatella 1996, Belaaouaj et al. 1998, Burton und Erskine 2003). Einen Schutz vor der Selbstschädigung des lokalen Gewebes v.a. durch reaktive Sau- erstoffmetaboliten bieten protektive Enzyme, wie z.B. Superoxiddismutase und Katalase (Jane- way et al. 2002).
Zelltod neutrophiler Granulozyten
Je nach Bedarf der Situation in vivo kann durch unterschiedliche Mechanismen die Schädigung des Gewebes durch Hemmung der Neutrophilen verhindert oder die Aktivität der Neutrophilen verstärkt werden (Tsuchida et al. 1995). Bei akuten inflammatorischen Prozessen ist es meist von Vorteil, die Lebensdauer neutrophiler Granulozyten zu verlängern, damit bakterielle Erreger effi- zienter phagozytiert und abgetötet werden können. Später im inflammatorischen Geschehen gilt es den Influx von Neutrophilen ins Gewebe und deren Lebensdauer vor Ort zu begrenzen, um Gewebeschädigungen zu vermeiden. Ein kontrolliertes Absterben von Neutrophilen durch A- poptose kann dann eine effektive Möglichkeit sein, potentiell gewebeschädigende Zellen un- schädlich zu „entsorgen“. Somit ist die Apoptose als ein regulativer Kontrollmechanismus anzu- sehen (Fanning et al. 1999).
Die Apoptose der Neutrophilen wird größtenteils über Zytokine und Chemokine gesteuert (Tsu- chida et al. 1995). Die Induktion der Apoptose verschiedener myeloider Zelllinien durch Makrophagen und membranständiges TNF-α, jedoch nicht durch lösliches TNF-α, konnte nach- gewiesen werden (Aliprantis et al. 1996, Meszaros et al. 2002). Neutrophile sind hochempfindlich gegenüber der Induktion einer CD95-(Fas)-vermittelten Apoptose in vitro nach Stimulation mit einem Antikörper gegen Fas. Durch die konstitutive Koexpression von Fas und Fas-Ligand auf ihrer Zelloberfläche besteht darüber hinaus die Möglichkeit der autokrin induzierten Apoptose.
Durch die Inkubation mit z.B. G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α oder Dexamethason kann die Fas-vermittelte Apoptose gehemmt werden (Liles et al. 1996).
Makrophagen
Makrophagen entwickeln sich aus myeloischen Stammzellen des Knochenmarks, zirkulieren als Monozyten im Blut und wandern ins Gewebe, wo sie zu Makrophagen ausdifferenzieren (Zem- bala und Asherson 1989).
Mikroskopisch stellen sich Makrophagen als zytoplasmareiche, stark granulierte Zellen mit cha- rakteristischen Ausläufern dar und sind mit einem Durchmesser von ungefähr 20 µm deutlich größer als Granulozyten oder Lymphozyten (Hildebrandt 1998).
Als funktionell bedeutsame Struktur weist die Plasmamembran von Makrophagen MHC-Klasse- II-Moleküle auf, deren Expressionsdichte stark vom Aktivierungszustand der Zelle abhängt.
MHC-Klasse-II-Moleküle dienen der Präsentation von Antigenen und der Interaktion der
Makrophagen mit T-Helfer-Lymphozyten. Daneben exprimieren Makrophagen Komplementre- zeptoren, Fc-Rezeptoren und Adhäsionsmoleküle. Außerdem weisen Makrophagen auf ihrer Oberfläche spezielle Moleküle zur Erkennung häufig auftretender mikrobieller Bestandteile auf, die auf anderen, wirtseigenen Zellen nicht oder nur geringgradig exprimiert sind. Dazu gehören CD14, Mannose-Rezeptoren, Scavenger-Rezeptoren und Toll-like Rezeptoren (siehe 2.5.2). Die Bindung an Toll-like Rezeptoren führt nachweislich zur Aktivierung von Transkriptionsfaktoren, die wiederum die Bildung pro-inflammatorischer Zytokine unterstützen.
Makrophagen gehören zu den stark phagozytierenden Zellen. Ebenso wie PMN vermögen sie Pathogene in Phagosomen aufzunehmen und diese im Zellinneren mit Lysosomen zu fusionie- ren. Nach der Fusion können dann die Pathogene und Noxen durch Veränderung des pH- Wertes, bakterizide Enzyme, toxische Sauerstoffderivate, toxische Stickstoffoxide, antimikrobielle Peptide und Kompetitoren unschädlich gemacht werden (Diment und Stahl 1985, Janeway et al.
2002). Wie bei PMN ist die Phagozytose nicht opsonisierter Pathogene möglich, sie wird jedoch durch Opsonisierung mit Immunglobulinen oder Komplementfaktoren deutlich verstärkt.
Bovine Makrophagen bilden wie PMN im Rahmen des „respiratory burst“ toxische Sauerstoff- metaboliten (Bounous et al. 1992, Forman und Torres 2002), wenn auch in schwächerer Ausprä- gung (Ohmann und Babiuk 1984, Goff et al. 1996).
Besonders gegenüber sehr großen extrazellulären Pathogenen können Makrophagen durch die exozytotische Freisetzung der in den Lysosomen enthaltenen Faktoren zytotoxisch wirken (Jane- way et al. 2002). Bei Kontakt mit Bakterien sezernieren sie zahlreiche, vor allem pro- inflammatorische Zytokine, wie z.B. TNF-α, Makrophagen-inflammatorisches Protein (MIP), IL- 1, IL-6, IL-8, IL-12 und Transforming growth factor β (TGFβ), die zur Eigenstimulation, zur Anlockung weiterer Leukozyten, zur Aktivierung bestimmter Lymphozytensubpopulationen und auch zu systemischen Effekten wie z.B. Fieber führen (Akira und Kishimoto 1996, Janeway et al.
2002, Norimatsu et al. 2003). Ein Teil der von Makrophagen initiierten Entzündungsreaktionen resultiert in der Anlockung von PMN. So zeigen neutrophile Granulozyten gerichtete Migration zu einigen der von stimulierten Makrophagen freigesetzten Zytokine (z.B. IL-8). Dies konnte auch für bovine Makrophagen gezeigt werden (Henricks et al. 1990).
Makrophagen und das Th1/Th2-Konzept
Makrophagen oder dendritische Zellen interagieren mit Lymphozyten und können durch Aus- schüttung pro- und anti-inflammatorischer Zytokine den Charakter einer Immunantwort beein- flussen.
Auf diese Weise entwickeln sich naive T-Zellen entweder zu einer Th1-(T-Helfer-1) oder zu einer Th2-Zelle, die sich funktionell unterscheiden (Abbas et al. 1996).
Die Art und Weise, wie Makrophagen den nachfolgenden Typ der adaptiven Immunantwort oder die Dominanz eines bestimmten T-Helferzell-Phänotyps steuern, ist maßgeblich pathogenabhän- gig (Chakkalath et al. 1994, Pulendran et al. 1999, Rissoan et al. 1999). So sezernieren Makropha- gen bspw. nach dem Kontakt mit vielen mikrobiellen Produkten das pro-inflammatorische IL-12, welches als das bedeutendste Th1-induzierende Zytokin gilt (Trinchieri 1997). Die generierten Th1-Zellen schütten nun wiederum grosse Mengen IFN-γ aus, welches die Makrophagen akti- viert und weiterhin zur erhöhten IL-12-Ausschüttung veranlasst. IL-10 hemmt eine Differenzie- rung in Richtung Th1. Dieses Zytokin kann von Makrophagen aber z.B. auch Th2-Zellen sezer- niert werden (Janeway et al. 2002).
Die Entwicklung einer T-Helfer-Zelle in eine der beiden Richtungen ist nicht irreversibel. Im sogenannten Th1/Th2-Switch kann sich eine generierte Th-Zell-Population bedingt in die andere umwandeln (Perez et al. 1995, Nakamura et al. 1997). Betrachtet man dieses Phänomen vor dem Hintergrund des peripartalen Zeitraumes, so drängt sich die Frage nach einer möglichen hormo- nellen Beeinflussung einer Th1- oder Th2-Antwort auf: Progesteron, das während der Gravidität vorherrschende Sexualhormon, induziert eine erhöhte Prostaglandin E2 (PGE2)-Produktion endometrialer Zellen. Dies bewirkt in den Makrophagen eine erhöhte Interleukin-10-Produktion (Kuroda et al. 2001). Uterine Makrophagen produzieren somit weniger sog. pro-
inflammatorische, Th1-induzierende Zytokine, sondern mehr Zytokine und Mediatoren, die eine Immunantwort in Richtung Th2 polarisiert (Dealtry et al. 2000). Diese Reaktionsweise uteriner Makrophagen ist für die Aufrechterhaltung einer normalen Gravidität offensichtlich essentiell (Elovitz et al. 2003). Ob und wie nach der Geburt eine Veränderung dieser Reaktionsweise uteri- ner Makrophagen erfolgt, und ob mammäre Makrophagen in ähnlicher Art und Weise beeinflusst werden, ist bisher unbekannt.
Die Bedeutung des Arginin-Stoffwechsels bei Makrophagen
Im Rahmen der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies können Makrophagen große Mengen an to- xischem Stickoxid (NO) bilden, das schnell in weitere reaktive Stickstoffverbindungen umgesetzt wird. Die NO-Bildung wird durch die induzierbare Stickoxid Synthase (iNOS) katalysiert, die auch beim Rind nachgewiesen ist (Adler et al. 1994, Aldwell et al. 1997, Stich et al. 1998). Als Substrat dient die Aminosäure L-Arginin, welche alternativ durch das Enzym Arginase abgebaut werden kann. Es zeigte sich, dass beide genannten Enzyme einer reziproken Regulation unterlie- gen, welche möglicherweise auch beim Rind von Bedeutung für das Immunsystem ist.
Die Stickoxid-Synthase, von der drei Isoformen existieren, kann Arginin über das Zwischenpro- dukt NG-Hydroxy-L-Arginin zu Citrullin und NO verstoffwechseln. Zwei der Isoformen, die neuronale und die endotheliale Form, synthetisieren Calcium-abhängig kleine Mengen an NO, welches als Botenstoff bei vielen physiologischen Prozessen (wie z.B. Vasoregulation oder Darmperistaltik) beteiligt ist. Die induzierbare NO-Synthase, welche die dritte Isoform darstellt, wird Calcium-unabhängig durch transkriptionelle Induktion reguliert (Macmicking et al. 1997), wobei vor allem von Makrophagen große Mengen an NO über lange Zeiträume synthetisiert werden können. NO und weitere reaktive Folgeprodukte (z.B. Peroxynitrit) interagieren dann mit Proteinen, Lipiden und Nukleinsäuren und sind so an zytotoxischen, antibakteriellen und antivi- ralen Abwehrmechanismen beteiligt.
In einem alternativen Stoffwechselweg kann Arginin mittels Hydrolyse durch das in zwei Isofor- men vorliegende Enzym Arginase zu den Produkten Ornithin und Harnstoff abgebaut werden.
Aus der Aminosäure Ornithin kann durch die mitochondriell gelegene Ornithin- Aminotransferase Prolin synthetisiert werden, welches eine zentrale Komponente des Kollagens darstellt. Durch das Enzym Ornithin-Decarboxylase wird Ornithin zu den Polyaminen Putrescin, Spermidin und Spermin abgebaut, welche u.a. bei der Zellreplikation von Bedeutung sind (Tabor und Tabor 1984).
Je nach Expression der konkurrierenden Enzyme iNOS oder Arginase verschiebt sich folglich die Homöostase des Immunsystems entweder in Richtung Inflammation (Generierung reaktiver Stickstoffverbindungen durch die iNOS) oder Anti-Inflammation (Reparaturprozesse, Kollagen- synthese durch Arginase) (Bogdan 2001).
Murine Makrophagen zeigen modulationsabhängig sowohl hohe Arginase- als auch iNOS- Aktivität (Corraliza et al. 1995, Modolell et al. 1995, Munder et al. 1999). Während Lipopolysac- charid Gram-negativer Bakterien gleichzeitig beide Enzyme des Argininstoffwechsels induziert (Wang et al. 1995), findet eine selektive Induktion eines der beiden Enzyme im Rahmen zytokin- vermittelter Immunreaktionen statt: Typische Th1-Zytokine (TNF-α, IFN-γ) induzieren die Ex- pression der iNOS und hemmen die Arginase. Umgekehrt bewirken typische Th2-Zytokine (IL- 4, IL-10, IL-13) die Expression der Arginase und Hemmung der iNOS. Auch in zellulären Inter- aktionen mit polarisierten Th1-und Th2- T-Zell-Klonen zeigt sich eine ausgeprägte Polarisierung des resultierenden Arginin-Stoffwechsels muriner Makrophagen (Munder et al. 1998).
iNOS Arginase
Arginin
Ornithin + Harnstoff
Prolin
Th2-Zytokine (IL-4, IL-10, IL-13) LPS
Th1-Zytokine
(IFN- , TNF- , TNF-
LPS γ α β
Kollagen Polyamine
NO
2NO + Citrullin
NO
3(Putrescin, Spermidin, Spermin)
= agonistisch = antagonistisch
Abbildung 1: Alternative Wege des Argininstoffwechsels (modifiziert nach Doschko 2004) Die Zwischen- und Endprodukte der jeweiligen Stoffwechselwege sind ebenfalls an der dichoto- men Regulation beteiligt. So hemmt Nitrit, ein stabiles Produkt von NO, die Arginase (Boucher et al. 1994, Hrabak et al. 1996), während das Polyamin Spermin (Southan et al. 1994) und Harn- stoff (Prabhakar et al. 1997) die iNOS hemmen.
In murinen Krankheitsmodellen konnte gezeigt werden, dass die Polarisierung des Argininstoff- wechsels für den Phänotyp der Immunantwort von Bedeutung ist: Die dichotome Regulation des Argininstoffwechsels korreliert mit dem inflammatorischen Phänotyp und dem Verlauf von bspw. Wundheilung oder Sepsis (Shearer et al. 1997, Carraway et al. 1998).
Inwiefern bovine Makrophagen die Arginase exprimieren und inwieweit eine vergleichbare rezip- roke Regulation stattfindet ist bisher noch nicht bekannt. Im Vergleich zu Ziegen und Büffeln zeigen bovine PMN jedoch einen signifikant höheren Gehalt an Arginase (Sahoo et al. 1998). Die bovine iNOS wird in ihrer Aktivität scheinbar unterschiedlich zu anderen Spezies reguliert, denn im Gegensatz etwa zur murinen iNOS konnte weder die Expression des Enzyms noch seine Ak- tivität (NO-Bildung) durch homologes IFN-γ allein gesteigert werden. Dass die bovine iNOS jedoch in ihrer Expression und auch in der NO-Bildung stimuliert werden kann, ist anhand von LPS und Salmonellen (S. dublin) gezeigt worden (Adler et al. 1995, Jungi et al. 1996).
2.3 Sexualsteroide im peripartalen Zeitraum
Der peripartale Zeitraum ist gekennzeichnet durch eine starke Dynamik der weiblichen Sexual- hormone (Östrogene, Progesteron). Eine hohe Inzidenz an Mastitiden kurz nach der Abkalbung, lassen eine immunmodulatorische Wirkung dieser Hormone und eine damit verbundene patho- genetische Bedeutung vermuten.
Progesteron ist beim Rind essentiell zur Aufrechterhaltung der Gravidität und wird v.a. im Corpus luteum graviditatis aber auch in der Plazenta gebildet. Die mittleren Progesteronkonzentrationen im peripheren maternalen Blut steigen beim Rind mit der Anbildung des Trächtigkeitsgelbkörpers, erreichen maximale Werte um 38-45 nmol/ml Serum im ersten Drittel der Gravidität und weisen im mittleren und letzten Drittel der Trächtigkeit einen leichten Konzentrationsabfall auf. Der
steile antepartale Abfall auf Basalniveau erfolgt innerhalb der letzten 24-36 Stunden der Gravidi- tät (Henricks et al. 1971, Hoffmann et al. 1973, Schallenberger et al. 1985, Birgel et al. 1996).
Die wichtigsten endogenen Östrogene beim weiblichen Rind in der Reihenfolge ihrer Wirksam- keit sind Östradiol-17β, Östron und Östradiol-17α (Döcke 1994, Buddecke 1994). Während der Brunst werden sie in den reifenden Ovarfollikeln und während der Gravidität in der Plazenta und vom Trophoblasten gebildet. Es ist jedoch auch beschrieben, dass freies Östradiol-17β antepartal im Euter synthetisiert wird (Maule-Walker et al. 1983, Janowski et al. 2000). Der Zeitraum der ersten Nachweisbarkeit graviditätsspezifischer Östrogene im peripheren maternalen Blutplasma erstreckt sich vom 50.-110. Graviditätstag. Ab dem 110. Graviditätstag ist dann ein deutlicher Konzentrationsanstieg sowohl im maternalen Plasma als auch in Kot und Urin nachweisbar. Im Blutplasma handelt es sich hierbei überwiegend um konjugiertes Östron. Die Konzentration frei- er, rezeptoraktiver Östrogene nimmt dagegen erst in den letzten 20-30 Tagen ante partum zu, besonders deutlich in der letzten Woche. Sie erreichen Maximalwerte im unmittelbaren periparta- len Zeitraum, wobei freies Östron in deutlich höheren Konzentrationen vorliegt als freies Östra- diol-17β oder Östradiol-17α (Robertson und King 1975, Robertson und King 1979, Möstl et al.
1985, Hoffmann et al. 1997). Nach der Abkalbung fallen die Östrogenwerte innerhalb kurzer Zeit auf Basalniveau.
Die klassischen Wirkungen von Östrogenen und Progesteron werden durch spezifische Rezepto- ren vermittelt, welche zur Gruppe der Rezeptoren für hydrophobe Ringmoleküle gehören. Zu dieser Rezeptor-Superfamilie gehören neben den Rezeptoren für Sexualsteroide auch die Rezep- toren für Kortikoide, Schilddrüsenhormone, Vitamin D3 und Retinolsäure (Evans 1988). Nach neueren immunhistologischen Untersuchungen, befindet sich die überwiegende Mehrzahl der Östrogen- und Progesteronrezeptoren im Zellkern. Da Steroide jedoch aufgrund ihres lipophilen Charakters die Zellmembran ungehindert passieren, können sie dort an die spezifischen Rezepto- ren binden (King und Greene 1984, Renoir et al. 1990). Rezeptoren für Sexualsteroide finden sich zwar vorwiegend in den primären und sekundären Geschlechtsorganen, sie sind jedoch dar- über hinaus in einer ganzen Reihe weiterer Organe nachweisbar. Offensichtlich unterliegen je- doch nicht nur ausschließlich Zellen mit einem nachweisbaren Besatz an Rezeptoren für Sexual- steroide deren Regulation, da auch Zellen ohne entsprechende Rezeptoren ihren Funktionszu- stand in Abhängigkeit von Sexualsteroidspiegeln ändern: Dies trifft bei den Östrogenen v.a. auf bestimmte Epithelzellen zu. In diesen Fällen werden Steroid-Effekte offensichtlich durch be- nachbarte, rezeptorpositive Stromazellen über parakrine Mediatoren vermittelt (Brenner et al.
1990, Cooke et al. 1997). Neben den rezeptorvermittelten Wirkungsweisen sind auch nicht- genomische Steroidwirkungen bekannt, die sich z. B. unspezifisch bei sehr hohen Steroidhor- monkonzentrationen durch Effekte auf die Zellmembranen ergeben (Schumacher 1990). Im Eu- ter wurde ausschließlich der „klassische” Östrogenrezeptor-α (ERα) nachgewiesen (Gustafsson 1999), welcher lange Zeit als der einzige galt und dort Wachstum sowie Differenzierung vermit- telt. Ein weiterer Östrogenrezeptor (ERβ) wurde auf einem anderen Chromosom bei verschiede- nen Spezies, u.a. dem Rind, gefunden und charakterisiert (Rosenfeld et al. 1999). Der Progeste- ronrezeptor (PR) ist in seiner Struktur den Östrogenrezeptoren sehr ähnlich.
Hinsichtlich ihrer Regulation wurde in vielen der untersuchten Zielzellen und -geweben festge- stellt, dass Östrogene sowohl die Expression ihres eigenen Rezeptors (Varriale und Tata 1991, Ing und Tornesi 1997) als auch die des Progesteronrezeptors induzieren (Kraus und Katzenel- lenbogen 1993). Es wird aber auch über die Suppression des Östrogenrezeptors durch seinen Liganden berichtet (Borras et al. 1997). Das PR-Gen gilt allgemein als ER-abhängig (Savouret et al. 1991, Kraus et al. 1994), was voraussetzt, dass für rezeptorvermittelte Gestagenwirkungen zuvor ein „Östrogen-Priming” stattgefunden hat. Die Expression des Progesteronrezeptors steht jedoch nicht unter alleiniger Kontrolle von Östrogenen. Sie unterliegt einer multifaktoriellen Kontrolle, die sich aus dem Crosstalk des ER mit intrazellulären Signalübertragungswegen ergibt.
Progesteron unterdrückt im allgemeinen die Expression von Östrogenrezeptoren (Evans und Leavitt 1980) sowie die Expression seines eigenen Rezeptors durch ER-vermitteltes Hochregulie-
