3 Geräte, Material und Methoden
3.2 Material
3.2.7 Kulturmedien, Puffer und Lösungen
Alle Kulturmedien, Puffer und Lösungen wurden, wenn nicht anders angegeben, in Aqua tridest.
angesetzt. Die Einzelreagenzien sind unter 3.2.3 aufgeführt.
3.2.7.1 Zellkulturmedien und Zusätze
Die Grundmedien wurden als Trockensubstanz bezogen, in Aqua tridest. gelöst und sterilfiltriert (0,2 µm Porenweite). Um Komplementaktivität auszuschließen und eventuell vorhandene My-koplasmen abzutöten, wurde das eingesetzte fetale Kälberserum (FCS, siehe 4.2.3) bei 56°C für eine Stunde inkubiert. Da für die Untersuchungen zum Einfluss weiblicher Sexualsteroide auf bovine Leukozyten definierte steroidhormonelle Milieus erforderlich waren, wurde zur Vermei-dung störender Einflüsse das FCS einem Kohleextraktionsverfahren unterzogen (Meyer 2003).
Dazu wurde es über einen Zeitraum von 24 h mit 20 g/l Aktivkohle versetzt und bei Raumtem-peratur auf einem Rüttler inkubiert. Anschliessend wurde das Gemisch mindestens viermal ab-zentrifugiert (3000 x g, 30 Min., Raumtemperatur, ohne Bremse) bis alle Aktivkohle-Anteile rest-los entfernt waren. Zum Abschluß wurde das FCS erneut sterilfiltriert (0,2 µm) und gemeinsam mit Kulturmedien in aliquoten Teilen bei -20°C gelagert. Aufgetaute Medien wurden nicht länger als zehn Tage im Kühlschrank aufbewahrt.
3.2.7.1.1 I10F Medium (siehe 3.2.3):
- Für die Untersuchungen zu Arginase und iNOS (siehe 3.3.15) Iscove-Trockenmedium nach Herstellerangaben mit:
Fetales Kälberserum (hitzeinaktiviert) 10 % (v/v)
L-Glutamin 4 mmol
Streptomycin 10 mg
Aqua tridest. ad 1000 ml
- Für die Versuche zum Einfluss von weiblichen Sexualsteroiden auf Makrophagen und MNC (siehe 3.3.14):
Iscove-Trockenmedium nach Herstellerangaben mit:
Fetales Kälberserum (hitzeinaktiviert, steroidextrahiert) 10% (v/v)
L-Glutamin 4 mmol
Streptomycin 10 mg
Aqua tridest. ad 1000 ml 3.2.7.1.2 Progesteron-Stammlösung
Aus der Festsubstanz wurde mit Ethanol (absolut) unter Schütteln eine 0,05 mol/l Lösung herge-stellt. Nach vollkommener Lösung erfolgte ein weiterer Verdünnungsschritt mit PBS (1:1000).
Die angestrebte Konzentration der Stammlösung von 100 nmol/l wurde durch einen weiteren Verdünnungsschritt mit I10F (1:500) erreicht. Die finale Konzentration in den funktionellen Tests betrug 25 nM. Aliquote Teile wurden bei –20°C gelagert.
3.2.7.1.3 Östradiol-17-beta-Stammlösung
Aus der Festsubstanz wurde mit Ethanol (absolut) unter Schütteln eine 0,02 mol/l Lösung herge-stellt. Nach vollkommener Lösung erfolgte ein Verdünnungsschritt mit PBS (1:1000). Die
ange-strebte Konzentration der Stammlösung von 40 nmol/l wurde durch einen weiteren Verdün-nungsschritt mit I10F (1:500) erreicht. Die finale Konzentration in den funktionellen Tests be-trug 10 nmol/l. Aliquote Teile wurden bei –20°C gelagert.
3.2.7.1.4 Progesteron- und östrogenfreie Kontrolllösung
Um einer möglichen Verfälschung der Ergebnisse durch das Ethanol als Lösungsvermittler (siehe 3.2.7.1.2 und 3.2.7.1.3) vorzubeugen, wurde Ethanol (96%) im Verhältnis 1:1000 mit PBS ver-dünnt. Ein weiterer Verdünnungsschritt (1:500) folgte mit Medium (I10F). Dieses Medium wurde im Weiteren als „hormonfrei“ verwendet. Aliquote Teile wurden bei –20°C gelagert.
3.2.7.1.5 LPS-Stammlösung
Stocklösungen von LPS wurden in I10F+Strep auf die siebenfache Finalverdünnung (7 µg/ml) ein-gestellt. Diese Stocklösungen wurden in aliquoten Mengen von 100-500 µl bei -20°C gelagert.
3.2.7.1.6 Stammlösung der DNA-Motive
Das DNA-Motiv CpG 2007 (5‘-tcgtcgttgtcgttttgtcgtt-3‘) (Hartmann et al. 2000) wurde zur Stimu-lation von PMN, Gesamtleukozyten und Kokulturen aus PMN/MNC sowie PMN/MdM einge-setzt. Die Herstellung des DNA–Motivs wurde bei MWG Biotech, München in Auftrag gegeben.
Die Festsubstanz wurde in Aqua tridest. gelöst, sterilfiltriert (0,2 µm Porenweite) und mit Kultur-medium auf die achtfache der Endkonzentration verdünnt. Die finale Konzentration des in den funktionellen Tests eingesetzten CpG-Motivs betrug 2,5 µg/ml. Die Stammlösung wurden in aliquoten Teilen bei -20°C vorrätig gehalten.
3.2.7.2 Material für die Separation von Zellen
3.2.7.2.1 Lymphozytenseparationsmedium
Lymphozytenseparationsmedium (siehe 3.2.3) ist eine isotone, wässrige Lösung aus Natriumdi-atrizoat und eines hochmolekularen Zuckers mit einem Zusatz des Röntgenkontrastmittels Iso-paque. Bei 10°C besitzt das Separationsmedium eine Dichte von 1,077 g/ml. In dieser Arbeit wurde das Lymphozytenseparationsmedium unverdünnt verwendet.
3.2.7.2.2 Percoll
Bei Percoll (siehe 3.2.3) handelt es sich um ein synthetisches Sol aus Polyvinyl-Pyrolidon-beschichteten Silikatpartikeln mit einem spezifischen Gewicht von 1,130 g/ml bei 20°C. Durch Zugabe von 0,9 g NaCl pro Liter Percoll wurde die Isotonie erreicht (100%iges, isotones Per-coll). Für die Separation reiner PMN (siehe 3.3.5.1) wurde die 100%ige Stammlösung mit phy-siologischer NaCl-Lösung (0,9%ig) zu einer 70%gen Lösung verdünnt.
3.2.7.2.3 Rekombinantes humanes Interleukin-8
Interleukin-8 übt als Chemokin eine primär chemotaktische Wirkung auf neutrophile Granulozy-ten aus. Zum Einsatz kam rekombinantes humanes, lyophilisiertes Interleukin-8 (rhIL-8, 8,4 kDa, 72 Aminosäuren, siehe 3.2.3), das in PBS mit 0,1% BSA auf 1 µg/ml verdünnt und in aliquoten Teilen zu 1 ml bei –20°C eingefroren wurde. Vor Gebrauch wurde diese Lösung auf die benötig-te Endkonzentration (0,1 µg/ml) mit PBS eingesbenötig-tellt.
3.2.7.2.4 Natriumchloridlösung, 0,9%
NaCl 8,77 g
Aqua tridest. ad 1000 ml
3.2.7.2.5 Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) ohne EDTA
Die PBS-Trockensubstanz (siehe 3.2.3) wurde in Aqua tridest. gelöst. Die Bestandteile lagen in den folgenden Konzentrationen vor.
NaCl 8,0 g
KCl 1,24 g
Na2HPO4 0,2 g
KH2PO4 0,2 g
Aqua tridest. ad 1000 ml
Der Puffer hatte einen pH-Wert von 7,4. Die Lagerung erfolgte bei 4°C.
3.2.7.2.6 Phosphatpuffer, doppelt konzentriert (2 x PBS)
Zur Herstellung wurde die doppelte Menge an PBS-Trockensubstanz eingesetzt (siehe auch 3.2.7.2.5) und mit Aqua tridest. auf 1000 ml ergänzt.
3.2.7.2.7 Wasch- und Verdünnungspuffer für die Membranimmunfluoreszenz (MIF-Puffer) bovines Serumalbumin 5,0 g
Natriumazid 0,1 g
PBS ad 1000 ml
Die Lagerung erfolgte bei 4°C.
3.2.7.3 Reagenzien für die Messung der Arginase-Aktivität
3.2.7.3.1 Triton-Lysepuffer (0,1%)
Triton X-100 100 µl
Pepstatin 10 mg
Aprotinin 10 mg
Antipain 10 mg
Aqua tridest. ad 100 ml
Die Lagerung erfolgte bei Raumtemperatur.
3.2.7.3.2 Tris/HCl-Puffer (50 mmol/l)
Tris 3,03 g
Aqua tridest. ad 500 ml
Ein pH-Wert von 7,5 wurde mit 5 mol/l HCl eingestellt. Die Lagerung erfolgte bei Raumtempe-ratur.
3.2.7.3.3 Manganchlorid-Lösung (10 mmol/l)
MnCl2 0,19 g
Aqua tridest. ad 100 ml Die Lagerung erfolgte bei Raumtemperatur.
3.2.7.3.4 L-Arginin-Lösung (0,5 mol/l)
L-Arginin 10,53 g
Aqua tridest. ad 100 ml
Ein pH-Wert von 9,7 wurde mit 5 mol/l NaOH eingestellt. Aliquots wurden bei –20°C gelagert.
3.2.7.3.5 Säuregemisch
Aqua tridest. 320 ml
H3PO4 (85%) 135 ml H2SO4 (97%) 45 ml Die Lagerung erfolgte bei 4°C.
3.2.7.3.6 Isonitrosopropiophenon (ISPF)-Lösung (6%)
ISPF 3 g
Ethanol (absolut) ad 50 ml Die Lagerung erfolgte bei 4°C.
3.2.7.3.7 Harnstoff-Stammlösung (600 µg/ml)
Harnstoff 60 mg
Aqua tridest. ad 100 ml Aliquots wurden bei –20°C gelagert.
3.2.7.4 Reagenzien für die Messung der Nitrat- und Nitrit-Produktion
3.2.7.4.1 Griess-Reagenz SULF
Sulfanilamid 2 g
HCl (5%) ad 100 ml
NEDD
N-(1-Naphthyl-)Ethylen-
diamin-Dihydrochlorid 0,1 g Aqua tridest. ad 100 ml
Die Reagenzien wurden im Dunkeln bei 4°C und nicht länger als eine Woche gelagert.
3.2.7.4.2 Gesättigte VCl3-Lösung
VCl3 400 mg
HCl (1 mol/l) ad 50 ml
Nach Filtration nicht gelöster Bestandteile wurde die blaue Lösung bei 4°C unter Lichtabschluss gelagert (bis zu 2 Wochen). Bei Entfärbung wurde sie verworfen.
3.2.7.4.3 Nitrat-Stammlösung (200 µmol/l)
Nitrat 1,7 mg
Aqua tridest. ad 100 ml 3.2.7.4.4 Nitrit-Stammlösung (200 µmol/l)
Nitrit 1,38 mg
Aqua tridest. ad 100 ml
3.2.7.5 Lösungen zum Fixieren und Quantifizieren von bovinen Zellen
3.2.7.5.1 Paraformaldehydlösung zum Fixieren von Referenzzellen Paraformaldehyd 40 mg
PBS ad 1000 ml
Die Lagerung erfolgte bei 4°C.
3.2.7.5.2 Acridin-Orange-Ethidiumbromid-Lösung für die lichtmikroskopische Zellzählung Acridin-Orange 250 mg
Ethidiumbromid 250 mg
PBS ad 100 ml
Die Lagerung erfolgte bei 4°C.
3.2.7.6 Lösung für die Fixierung boviner Suspensionszellen Formol (ca. 35%) 100 ml
NaH2PO4 4 g
NA2HPO4 6,5 g
Aqua tridest. ad 1000 ml
3.2.7.7 Lösungen zur Gewinnung von RNA aus bovinen Leukozyten
3.2.7.7.1 Guanidinium-iso-thiocyanat-Lösung Guanidinium-iso-
thiocyanat 4 mmol/l
Na-N-Laurylsarkosin 0,5 % (w/v)
Na-Citrat 25 nmol/l
β-Mercaptoethanol 0,1 nmol/l
3.2.7.8 Puffer für die Gewinnung von Monozyten mittels MACS
3.2.7.8.1 Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) mit EDTA (2 mmol/l)
EDTA 292 mg
PBS ad 500 ml
Die Lagerung erfolgte bei 4°C.
3.2.7.9 Lösungen für die Durchflusszytometrie
Zur Reinigung des Gerätes wurde das Messkanalsystem nach den Messungen mit sterilfiltriertem Aqua tridest. (0,2 µm) und 1%iger Natriumhypochlorit-Lösung gespült.
3.2.7.9.1 Trägerflüssigkeit (Sheath fluid)
Als Trägerflüssigkeit für die durchflusszytometrische Messung wurde sterilfiltriertes (0,2 µm) PBS mit 0,1 mg/ml NaN3 (Natriumazid) verwendet.
3.2.7.9.2 Propidiumiodid-Stammlösung
Die Stammlösung von 100 µg/ml Propidiumiodid gelöst in Trägerflüssigkeit wurde in aliquoten Teilen bei -20°C gelagert. Zum Anfärben toter Zellen wurden der Trägerflüssigkeit entsprechen-de Teile entsprechen-der Stammlösung zugesetzt, um eine Endkonzentration von 2 µg/ml zu erreichen.
3.2.7.9.3 Acridin-Orange-Stammlösung
Eine Stammlösung von 0,5 µg/ml Acridin-Orange, gelöst in Trägerflüssigkeit (siehe 3.2.7.9.1), wurde in aliquoten Teilen bei 4°C gelagert. Vor jedem Einsatz wurde sie auf das Vorhandensein von ausgefällten Anteilen überprüft und nötigenfalls verworfen. Entspechende Teile der Stamm-lösung wurden Milchzellsuspensionen zugesetzt, um eine Endkonzentration von 2,5 pg/ml zu erreichen.