3 Geräte, Material und Methoden
5.2 Einfluss weiblicher Sexualhormone auf Makrophagen und MNC in vitro
Konzeptionelle Überlegungen
Makrophagen reagieren auf die Stimulation über Toll-like Rezeptoren (TLR) i.d.R. mit einer in-flammatorischen, Th1-dominierten Antwort (Trinchieri 1997). Dazu gehört u.a. die Bildung von pro-inflammatorischen Zytokinen, sowie die Generierung von NO (Norimatsu et al. 2003). Al-lerdings wurde für uterine Makrophagen gezeigt, dass sie während der Trächtigkeit Th2-spezifische Zytokine (z.B. IL-10) in dominanter Art und Weise produzieren (Kuroda et al. 2001).
Inwiefern Sexualsteroide – v.a. im peripartalen Zeitraum – die Th1/Th2-Balance modulieren ist nicht bekannt. Das Modell des Arginin-Stoffwechsels eignet sich zur Klärung dieser Fragestellung nicht (siehe 5.1).
Ein sehr empfindlicher Parameter zur Charakterisierung der Makrophagen-Funktionalität ist de-ren Fähigkeit nach Stimulation mit bakteriellen TLR-Liganden, ein akzeleriertes Absterben neutrophiler Granulozyten zu induzieren. Dies konnte bereits für bovine MdM und MNC gezeigt werden (Dahnke 2003). Ob diese Zellen in ihrer Fähigkeit, das Neutrophilen-Sterben zu modulie-ren, ebenfalls über Hormone beeinflusst werden, sollte in dieser Arbeit geprüft werden.
Bei den in vorausgegangenen Untersuchungen verwendeten PMN handelte es sich um Dichte-gradient-separierte Zellen. Aufgrund z.T. hoher inter- und intraindividueller Schwankungen in Anzahl und vor allem Reinheit gewonnener PMN, wurden Wege gesucht, die Zellen in hoher Reinheit zu gewinnen, um Effekte kontaminierender MNC zu minimieren. Dazu bot sich eine von Frank (2000) für das Rind etablierte In-vitro-Transmigrationstechnik an. In vivo werden PMN anhand chemoattraktiver Substanzen durch das Endothel aus den Blutgefäßen in Richtung Infektionsgeschehen gelockt (Janeway et al. 2002). In der Transmigrationskammer wandern PMN durch eine Membran in Richtung eines chemotaktischen Gradienten (rhIL-8). Die so gewonne-nen PMN wiesen eigewonne-nen sehr hohen, reproduzierbaren Reinheitsgrad auf. Der Vorteil des Einsat-zes solcher Zellen ist darin zu sehen, dass sie – wie auch in vivo – vor direktem Kontakt mit
Ge-webs-residenten Zellen bereits auf einen chemotaktischen Stimulus hin gewandert sind. Dass die so gewonnenen Zellen funktionell in vitro allerdings nicht vollständig einer Situation in vivo ent-sprechen, konnte modellhaft im Vergleich uteriner PMN mit PMN nach In-vitro-Transmigration gezeigt werden (Zerbe et al. 2003).
Das Vorhandensein spezifischer Rezeptoren ist die Vorraussetzung für die Bindung eines Hor-mons und die Vermittlung seiner genomischen Wirkung auf zellulärer Ebene (Kohtes 1998). Für bovine Leukozyten sind bisher kaum Angaben zum Vorkommen von Steroidhormonrezeptoren gemacht worden. Winters et al. (2003) konnten bspw. keinen Progesteronrezeptor und Östrogen-rezeptor-α in bovinen PMN nachweisen. Im Gegensatz dazu stehen die Ergebnisse dieser Arbeit, die zeigen, dass neben den Monozyten, den MNC und den in-vitro-gereiften Makrophagen auch die PMN eine spezifische Anfärbbarkeit des Zellkerns für den Progesteronrezeptor als auch für den Östrogenrezeptor-β aufweisen (siehe Abbildung 35). Damit kann prinzipiell die These aufge-stellt werden, dass die Zellen durch diese Hormone in ihrer Funktionalität moduliert werden können. Ein qualitativer Nachweis des Östrogenrezeptor-α konnte mittels PCR für Monozyten, MNC und MdM erbracht werden (Daten nicht gezeigt), PMN wurden nicht untersucht.
Im Rahmen der geplanten In-vitro-Experimente sollte der Einfluss hoher physiologischer Plas-ma-Konzentrationen von Progesteron und Östrogenen geprüft werden. Die Konzentrationen des Progesterons liegen während der Gravidität um ca. 15-25 nmol/l (Döcke 1994). Deshalb wurden Konzentrationen von 25 nmol/l standardmäßig während der In-vitro-Versuche einge-setzt. In einer internen Kontrolle konnte diese Konzentration im verwendeten Medium nachge-wiesen werden (Daten nicht gezeigt). Für Östradiol-17β sind unmittelbar antepartal Werte von ca. 1,8 nmol/l angegeben (Döcke 1994). Dem Zellkulturmedium wurden standardmäßig für die In-vitro-Versuche 10 nmol/l zugegeben. Als freies und damit rezeptoraktives Östradiol-17β wa-ren danach 1,72 nmol/l intern nachweisbar (Daten nicht gezeigt). Vermutlich lag die Diffewa-renz in konjugierter Form vor. Eine möglicherweise sehr viel höhere lokale Konzentration von Östradi-ol-17β im Milchdrüsengewebe (Janowski et al. 2002), als auch die Berücksichtigung einer gesamt-östrogenen Wirkung aller vorkommenden Östrogene beim Rind wurden hier vernachlässigt. Um den Einfluss endogener Sexualsteroide auszuschließen, wurden ovarektomierte Spendertiere mit nachweislich niedrigen Progesteron- und Östrogenwerten verwendet. Kontrollmessungen beleg-ten, dass die Hormonkonzentrationen in vitro über den Kultivierungszeitraum konstant blieben (Daten nicht gezeigt).
Östradiol-17β zeigt stärkere Effekte als Progesteron auf ein PAMP-vermitteltes Absterben neutrophiler Granulozyten in vitro
Zunächst wurde überprüft, inwieweit die eingesetzten Steroidhormone einen Einfluss auf die konstitutive Absterberate der PMN besitzen. Hier konnte kein Effekt für Progesteron und Östradiol-17β auf transmigrierte PMN gezeigt werden (siehe Tabelle 18). Anders verhielt es sich mit PMN, die mittels Dichtegradientenzentrifugation gewonnen wurden. Hiervon starben signifi-kant mehr PMN unter dem Einfluss von Östradiol-17β im Gegensatz zu transmigrierten (siehe Abbildung 37) PMN. Dahnke (2003) forderte für Dichtegradient-separierte PMN einen Anteil kontaminierender MNC <10 %, um MNC-vermittelte Effekte auszuschließen. Bei einer durch-schnittlichen Reinheit der PMN von 91,3 % konnten wir in hormonfreiem Medium ebenfalls keine Unterschiede zu hochreinen PMN (98,3 %) entdecken. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Östradiol-17β bereits bei einem Anteil von MNCs <10 %, Effekte auf die Vitalität neutrophiler Granulozyten ausüben kann. Eine Stimulation boviner Leukozyten mit einem CpG-Motiv im Milieu deutlich über den physiologischen Werten liegenden Dosen von Progesteron und Östra-diol-17β führte zu einem verlangsamten Absterben der anteiligen PMN (siehe Abbildung 36).
Diese Wirkung trat hochsignifikant bei hohen Dosen (5000 nmol/l Östradiol-17β) hervor, jedoch auch schwach signifikant bei Progesteron (12500 nmol/l). Für LPS als Stimulus war kein ver-gleichbarer Effekt zu sehen. Steroidhormone können in hohen Konzentrationen sog. nicht-genomische Effekte durch Interkalierung mit der Zellmembran bewirken (Schumacher 1990).
Möglicherweise wurde dadurch die endosomale Aufnahme des CpG-Motivs verhindert, so dass keine Bindung an 9 stattfand. Dies könnte in der Folge zu einer verringerten TLR-vermittelten Produktion proapoptotischer Faktoren geführt haben.
Verglichen mit den Werten, die in einer Kokultur mit MNC erzielt wurden, schien LPS bei Makrophagen einen größeren Effekt auf das Neutrophilen-Sterben zu besitzen als das eingesetzte CpG-Motiv (siehe Abbildung 39). Dies lässt vermuten, dass die beiden Zelltypen unterschiedlich mit entsprechenden Erregerrezeptoren ausgestattet sind und damit auch unterschiedlich auf ent-sprechende Reize reagieren können. Gestützt wird dies durch Beobachtungen von Werling et al.
(2004), die zeigten, dass MdMs mehr TLR-2 und TLR-4 exprimieren als Monozyten des periphe-ren Blutes.
Eine Beeinflussung durch die eingesetzten Steroidhormone auf ein MNC-vermitteltes akzelerier-tes Absterben neutrophiler Granulozyten nach Stimulation mit PAMPs blieb aus. MdM im Milieu von Östradiol-17β beschleunigten nach Stimulation mit LPS jedoch signifikant ein Absterben der neutrophilen Granulozyten. Dies zeigt, dass dieses Hormon in der Lage ist, die Reaktionsfähig-keit bestimmter Zellen auf Erregermuster zu beeinflussen. Ob dies auf der Ebene der TLR-Expressionsmodulation erfolgt oder auf der Induktion bestimmter Zytokine/Mediatoren beruht ist unklar.
Immunmodulatorische Eigenschaften von Östrogenen konnten bereits in früheren Studien fest-gestellt werden, wie die Steigerung der Phagozytosekapazität neutrophiler Granulozyten in Blut und Milch (Saad und Aström 1988), als auch der ROS-Bildung und der ungerichteten Migration (Roth et al. 1983, Hoedemaker et al. 1992). Im Wesentlichen handelte es sich hierbei um Funkti-ons-stimulierende Wirkungen. Dahnke (2003) konnte keinen zyklusabhängigen Einfluss der Spendertiere auf das MNC- und MdM-vermittelte Neutrophilen-Sterben in vitro beobachten.
Hierbei ist jedoch einschränkend anzuführen, dass diese Zellen, anschließend an ihre Gewinnung, nicht unter definierten hormonellen Bedingungen kultiviert wurden. Winters et al. (2003) konnte keinen Einfluss von Östradiol-17β und Östron auf die ROS-Bildung von PMN in vitro zeigen. In dieser Arbeit vermittelten LPS-stimulierte Makrophagen stärker den Zelltod von PMN unter Östrogen-Einfluss als im hormonfreien Medium. Angaben zur Modulation boviner Makrophagen durch Östrogene fehlen bisher. Inwieweit diese Beobachtung sich auf eine Situation in vivo über-tragen lassen, bleibt demnach spekulativ. Eine initiale Steigerung der Vitalität neutrophiler Granu-lozyten würde jedenfalls die Abwehr gegenüber eindringenden bakteriellen Erregern verbessern (Tsuchida et al. 1995). Fraglich bleibt somit, ob Östrogene in diesem Zusammenhang die Funkti-on vFunkti-on PMN, vermittelt über Makrophagen, im frühen Entzündungsgeschehen herabsetzen.
Untersuchungen in vivo konnten belegen, dass Östrogen- Applikationen das Auftreten von Mastitiden begünstigen (Zdunczyk et al. 2001). Neben dieser eigentlich immunsuppressiven Wir-kung der Östrogene könnte das beobachtete Phänomen ebenso bedeuten, dass Gewebs-residente Makrophagen als Regulativ eingesetzt werden, um Gewebeschädigungen einer unkontrolliert hohen zytotoxischen Wirkung Neutrophiler vorzubeugen.
Aufgrund der beobachteten MdM-vermittelten Effekte durch LPS und Östradiol-17β stellte sich ferner die Frage, inwieweit diese Modulation durch eine Veränderung des TLR-Expressionsmusters beeinflusst wird. Besondere Beachtung verdient hier TLR-4 als LPS-Rezeptor. Aufgrund bereits beobachteter Koregulation von TLR-4 mit TLR-2 und BNBD5 (Goldammer et al. 2004) wurden die beiden letztgenannten Faktoren mituntersucht. Die Beo-bachtung, dass TLR-2 und TLR-4 in bovinen MdM exprimiert werden (siehe Abbildung 40), deckt sich mit Angaben von Werling et al. (2004). Eine signifikante, hormonabhängige Modulati-on ihrer ExpressiModulati-on kModulati-onnte in der vorliegenden Arbeit auf mRNA-Ebene allerdings nicht gezeigt werden. Tendenziell schien die Expression unter Östrogeneinfluss jedoch leicht herabgesetzt. Da es sich bei TLRs um transmembranale Rezeptoren handelt, sollte bei zukünftiger Verfügbarkeit entsprechender Antikörper das Expressionsmuster auf Produktebene in diesem Zusammenhang untersucht werden.