3 Geräte, Material und Methoden
3.3 Methoden
3.3.13 Methoden in einem Mastitis-Infektionsmodell
3.3.13.1 Tierschutzantrag
Bei den Tierversuchen zur experimentellen Mastitis handelte es sich um ein am 12.06.03 durch die Bezirksregierung Hannover genehmigtes Versuchsvorhaben: Frühe Erreger-Wirts-Interaktionen während der Mastitis, Nr.: 509.6-42502-03/678.
3.3.13.2 Modellbedingungen und Voruntersuchung der Probanden
Die experimentell infizierten Tiere waren zweieinhalb Jahre alte Kühe der Rasse deutsche Schwarzbunte, die vorberichtlich nie an Mastitis erkrankt waren und sich in der Mitte ihrer ersten Laktation (3-5 Monate post partum) befanden. Sie wurden dreimal alle 7 Tage klinisch untersucht und Milchproben zur Analyse entnommen. Innerhalb dieses Zeitraumes mussten alle vier Euter-viertel klinisch gesund und bakteriologisch negativ sein und durften einen SCC-Wert von 100.000/ml nicht überschreiten. Die Laktationsleistung sollte zwischen 15 und 25 l/Tag betra-gen. Zur Vermeidung möglicher zyklusabhängiger Einflüsse wurden die Tiere zyklussynchroni-siert. Hierzu wurden die Probanden mit Hilfe von 2-maliger Injektion des Prostaglandin-F2α
(PGF2α)-Analogons Cloprostenol-Natriumsalz (Estrumate®, siehe 3.2.1) im Abstand von 12 Ta-gen synchronisiert und im brunstnahen Zeitraum infiziert.
3.3.13.3 Präparation der Infektionsdosis
Präparationen der für die Infektionsversuche eingesetzten E. coli- und S. aureus-Stämme wurden aus dem Milchsekret klinisch an Mastitis erkrankter Kühe (Patienten der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover) isoliert (siehe 4.2.5) und lagen kryokonserviert vor (Mikrobank-System “Cryobank™”, siehe 3.2.2). Nach dem Ausplattieren auf einem Trypton-Soja-Agar (trypticase-soy-agar, TSA, siehe 3.2.3) folgte eine Inkubation über Nacht bei 37°C. Am nächsten Tag wurden mehrere Kolonien mittels einer Öse in 10 ml Hirn-Herz-Bouillon (brain-heart-infusion-broth, BHI, siehe 3.2.3) überführt, gut durchmischt und 6 Stunden bei 37°C inku-biert. Nach erneutem eingehenden Mischen wurden 100 µl dieser Suspension in 9,99 ml Trypton-Soja-Agar (trypticase-soy-broth, TSB, siehe 3.2.3) überführt, gut durchmischt und über 18 Stun-den bei 37°C inkubiert. Um eine definierte Anzahl Kolonie-bilStun-dender Einheiten (KBE) zu erlan-gen, wurde die photometrisch bestimmte optische Dichte einer Bouillon mit der Keimzahlbe-stimmung durch das Spatelverfahren verknüpft. Dazu wurde zunächst eine Verdünnungsreihe in Zehnerschritten mit 0,9 %iger NaCl-Lösung bis zu einer Stufe von 10-8 hergestellt. 100 µl der Verdünnungsstufen 10-4 - 10-8 wurdendaraufhinalsTriplikate auf Blutagarplatten (siehe 3.2.3) mit einem Drigalski-Glasspatel ausgestrichen. Nach kurzem Antrocknen wurden die Platten bei 37°C über 24 h inkubiert. Platten, die zwischen 3 und 300 Kolonien aufwiesen, wurden ausgezählt und rechnerisch die Anzahl KBE in der Bouillion ermittelt. Diese Zahl wurde nun ins Verhältnis mit der photometrisch bestimmten optischen Dichte (OD) der ersten Verdünnungsstufe (10-1) ge-setzt. Durch wiederholt reproduzierbare Werte nach Ausplattieren konnte eine Eichkurve erstellt werden, die es ermöglichte, durch Ermittlung der optischen Dichte (OD) der ersten Verdün-nungsstufe bei einer Wellenlänge von 600 nm auf die Zahl Koloniebildender Einheiten in der Bouillon zu schliessen. Mit ihrer Hilfe wurde danach mittels Bestimmung der OD in der Bouilli-on die entsprechende BakterienkBouilli-onzentratiBouilli-on in KBE errechnet. Die angestrebte InfektiBouilli-onsdosis von 250 KBE/ml für E. coli und 5000 KBE/ml für S. aureus wurde mit entsprechenden Teilen steriler 0,9 %iger NaCl-Lösung eingestellt und durch Ausplattieren und Inkubation bei 37°C über Nacht kontrolliert.
3.3.13.4 Experimentelle Infektion einzelner Euterviertel
Nach erfolgter Milchprobenahme (siehe 3.3.13.6) und Applikation von 20 I.E. Oxytocin i.v. (sie-he 3.2.1), wurde das Euter zunächst maschinell und anschließend manuell sorgfältig ausgemolken.
Nach gründlicher Reinigung und Desinfektion der Zitzen mit in 70 %igem Ethanol (siehe 3.2)
getränkten Haushaltspapier, wurde die Infektionsdosis in einem Volumen von 2 ml mittels einer Einwegspritze und einer Zitzenkanüle in die Zitzenzisterne instilliert. Ein Zusammendrücken des Strichkanals mit zwei Fingern verhinderte ein Zurücklaufen, während die andere Hand durch dorsal gerichtetes Ausstreichen der Zitzenzisterne die instillierte Flüssigkeit in Richtung Drüsen-körper bewegte. Abschließend wurde das betroffene Euterviertel über 30 Sek. massiert. In das Kontrollviertel wurden 2 ml steriler 0,9 %iger NaCl-Lösung im gleichen Verfahren instilliert.
Tiere die mit E. coli infiziert wurden, erhielten zunächst zu Versuchsbeginn vorne rechts eine Infusion mit E. coli bei gleichzeitiger Applikation vorne links einer Placebo-Infusion mit NaCl-Lösung (Kontrollviertel). Weitere Infusionen mit E. coli folgten 12 Stunden (hinten rechts) und 18 Stunden (hinten links) nach Versuchsbeginn. Bei den Tieren, die über 24 Stunden mit S. aureus infiziert wurden, wurde analog vorgegangen. Tiere, die über 72 Stunden mit S. aureus infiziert wurden, erhielten zu Versuchsbeginn in beide rechten Viertel eine Infusion mit S. aureus, bei gleichzeitiger Placebo-Infusion vorne links (Kontrollviertel). Bei 4 von 6 Tieren wurde zwölf Stunden vor Versuchsende das verbleibende Viertel (hinten links) infiziert.
3.3.13.5 Erhebung und Beurteilung allgemeiner klinischer Parameter
Der klinische Status der Tiere wurde regelmäßig mindestens alle 12 Stunden von ummittelbar vor einer Infektion bis zum Versuchsende untersucht und dokumentiert. Dies umfasste im Einzelnen folgende Parameter: Körpertemperatur, Milchleistung, Sekretbeschaffenheit, Euterpalpationsbe-fund und Allgemeinbefinden.
Körpertemperatur: Die Körpertemperatur aller Versuchstiere wurde bereits ab 3 Wochen vor Versuchsbeginn bis zum Versuchsende alle 12 Stunden gemessen und dokumentiert. Vor Ver-suchsbeginn wurde bei keinem Versuchstier ein Wert außerhalb des physiologischen Bereichs (37,8-39,2°C) beobachtet. Zusätzlich wurde bei eingehenden Allgemeinuntersuchungen (Rosen-berger 1990) während des Versuches alle 12 Stunden Körperhaltung, Verhalten, klinischer Ge-samteindruck, Habitus, Atemfrequenz, und Pulsfrequenz festgestellt, dokumentiert und hinsicht-lich des Grades einer Störung bewertet.
Milchleistung und -beschaffenheit: Die Sekretbeschaffenheit der einzelnen Viertelanfangsge-melke und die Milchleistung wurden zu jeder Melkzeit beurteilt und ab 3 Wochen vor Versuchs-beginn bis zum Versuchsende fortlaufend dokumentiert.
Euterpalpation: Die manuelle Palpation des Eutergewebes als Hinweis auf entzündliche Verän-derungen wurde ab Versuchsbeginn jeweils am ausgemolkenen Euter zu jeder Melkzeit (alle 12 Stunden) durchgeführt. Die in Tabelle 5 dargestellte Einteilung diente dazu, den Grad der Verän-derungen in Stufen einzuteilen. Eine Veränderung des Palpationsbefundes von bspw. Grad II zu V würde 3 Stufen entsprechen.
Tabelle 5: Dokumentation des Euterpalpationsbefundes (Grunert 1990) o.B. Insgesamt feinkörnig und weich (ausgemolken)
I Insgesamt grobkörnig, aber weich
II Allgemein grobkörnig-derb mit einzelnen Knoten III Allgemein grobknotig
IV Grobknotig mit einzelnen diffusen Verhärtungen V Insgesamt diffus verhärtet
VI Akut geschwollen, vermehrt warm und schmerzhaft
Zur Objektivierung wurden die erhobenen Befunde nach einem dafür vorgesehenen Schema (siehe Tabelle 6) abschliessend beurteilt.
Tabelle 6: Punkteschema zur Feststellung der Ausprägung ausgesuchter klinischer Parameter nach experimentell induzierter Mastitis
Bewertet wurde jeweils die maximale Ausprägung einer klinischen Veränderung pro Tier während einer 24- oder 72-stündigen Versuchsdauer. 1 graduelle Abweichung vom Palpationsbefund vor der Infektion (siehe Tabelle 5)
3.3.13.6 Klinische Labordiagnostik
Das rote Blutbild und das Differentialblutbild wurde im klinischen Labor der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover angefertigt. Untersucht wurde zunächst unmit-telbar nach Aufstallung der Tiere. Des weiteren wurden die Tiere mit 24-stündiger Versuchsdauer zum Infektionszeitpunkt wie 12, 18 und 24 h post infectionem untersucht. Tiere, die über 72 h infi-ziert waren, wurden alle 12 h untersucht.
3.3.13.7 Gewinnung von Milchproben
Es wurde jedes Euterviertel der Versuchstiere unmittelbar vor der Melkzeit beprobt. Die Milch-proben wurden durch Handmelken gewonnen und umgehend ins Labor gebracht, wo sie bis zum Beginn der Zellseparation bei 4°C gelagert wurden. Der Transport der Proben erfolgte mit Kühl-elementen in einer Kühlbox.
Die ersten ca. 5 ml des Milchsekrets (Vorgemelk) wurden aus dem grob gereinigten Euterviertel in eine Schale ermolken und nach makroskopischer Begutachtung unschädlich entsorgt.
Nach trockener Reinigung des Euters und der Zitzen mit Haushaltspapier folgte eine gründliche Desinfektion besonders der Zitzenkuppe mit Haushaltspapier, das mit 70%-igem Ethylalkohol getränkt war. Anschließend wurden 10 ml Milch (Viertelanfangsgemelk, VAG) in ein steriles Probengefäß zur Bestimmung des SCC und der bakteriologischen Kontamination ermolken.
Weitere 10 ml wurden zur späteren durchflusszytometrischen Bestimmung der Zellzusammen-setzung in ein steriles 50 ml Zentrifugenröhrchen mit vorgelegten 40 ml PBS (steril, 4°C) ermol-ken.
Rektale Temperatur (°C) 37,8-39,2 39,3-40 40-41 >41
Sekret o.B.
Allgemeinbefinden o.B. Ggr. gestört Mgr. gestört Hgr. gestört
Summe der Bewertungen: 0-3 4-7 8-11 12-15
Klinische Beurteilung: Keine Verände-rungen
Nach dem darauf folgenden maschinellen Ausmelken wurden 10 ml Milch (Viertelendgemelk, VEG) in ein steriles 50 ml Zentrifugenröhrchen mit vorgelegten 40 ml PBS (steril, 4°C) ermol-ken. Die Gewinnung des VEG erfolgte zur durchflusszytometrischen Analyse möglicher Unter-schiede in der Zellzusammensetzung zwischen VAG und VEG.
3.3.13.8 Aufarbeitung und Analyse von Milchproben
Die Aufarbeitung der Milchproben erfolgte stehts auf Eis und unmittelbar nach ihrer Gewin-nung.
Für die durchflusszytometrische Analyse wurde das mit PBS verdünnte VAG (siehe oben) zentrifugiert (400 x g, 10 Min., 4°C, ohne Bremse). Anschließend wurde der abgesetzte Rahm vorsichtig entfernt und der flüssige Überstand unter Schonung des Zellpellets abgesaugt. Das Zellpellet wurde in 50 ml PBS resuspendiert und erneut abzentrifugiert (400 x g, 10 Min., 4°C, ohne Bremse). Nach Verwerfen des Überstandes wurden die Zellen in 1 ml PBS resuspendiert.
Zur durchflusszytometrischen Analyse wurden 100 µl mit ca. 2 x 106 Zellen in ein FCM-Röhrchen überführt in dem 200 µl Trägerflüssigkeit (4 µg/ml PI) und 15 µl Acridin-Orange-Lösung (siehe 3.2.7.9.3) vorgelegt waren.
Um die Anzahl nicht kernhaltiger Ereignisse bei der Erfassung zu minimieren, wurden die Pro-ben zunächst im Seitwärtsstreulicht (SSC) gegen Grünfluoreszenz (FL-1) erfasst und ein Fenster („live-gate“) auf die grün-fluoreszierenden, Acridin-Orange-positiven Ereignisse gesetzt (R1, sie-he Abbildung 3 B, C). Nach Erfassung dieser Ereignisse wurde im FL3/SSC Punktediagramm ein Fenster auf Propidiumjodid-negative Ereignisse gesetzt (R2, siehe Abbildung 3 D) und von diesen die morphologisch als Zellen erkennbaren Ereignisse in einem weiteren Fenster (R3, siehe Abbildung 3 E) identifiziert. Einzelne Zellsubpopulationen wurden im Punktediagramm FSC/SSC anhand ihrer morphologischen Charakteristika identifiziert (R4 = PMN, R5 = lymphoide Zellen, R6 = Makrophagen, Epithelzellen) und relativ quantifiziert (siehe Abbildung 3 F). Aus der Verrechnung mit der Zahl somatischer Zellen (SCC) wurden die absoluten Zahlen der einzelnen Zellpopulationen pro ml Milch ermittelt.
FSC
R3
FL-3
R2 R2
FSC
R4
R5
R6
FL-1
R1
FSC FL-1
SSCSSC
A B C
D E F
Abbildung 3: Durchflusszytometrische Bestimmung einzelner vitaler Milchzellpopulatio-nen anhand ihrer Anfärbbarkeit und Morphologie
Dargestellt sind Punktediagramme nach Erfassung von 20.000 Ereignissen im Durchflusszytometer. A:
Darstellung der Morphologie (Größe gegen Komplexität). B: (Grünfluoreszenz gegen Komplexität) R1:
Identifizierung Fluoreszenz-postiver, kernhaltiger Ereignisse. C: Erfassung der Ereignisse aus B (R1) mit einem life gate. D: (Rotfluoreszenz gegen Komplexität) Identifizierung der PI-negativen Ereignisse (vitale Zellen) in Region R2. E: (Größe gegen Komplexität) Darstellung der Zellen aus D (R2) und Identifikation morphologisch als Zellen zu identifizierender Ereignisse (R3). F: (Größe gegen Komplexität) Identifizie-rung einzelner Zellsubpopulationen. R4: neutrophile Granulozyten. R5: lymphoide Zellen. R6: „large cells“ (Makrophagen, Epithelzellen).
Zur Separation somatischer Zellen aus der Milch zur RNA-Gewinnung wurde das mit PBS-verdünnte VAG (siehe oben) zentrifugiert (250 x g, 15 Min., 4°C, ohne Bremse). Anschlies-send wurde der abgesetzte Rahm vorsichtig entfernt und der Überstand unter Schonung des Zellpellets abgesaugt. Das Zellpellet wurde in 1 ml PBS resuspendiert und in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß (1,5 ml) überführt. Nach erneutem Abzentrifugieren (250 x g, 15 Min., 4°C, ohne Bremse) wurden 750 µl des Überstandes verworfen und das Zellpellet in den verbleibenden 250 µl resuspendiert. Dazu wurden 750 µl Trizol LS Reagent® (siehe 3.2.3) pipettiert und durch Auf- und Abpipettieren gut durchmischt. Zur erleichterten Lyse der Zellen wurde anschließend mit einer 1 ml Einwegspritze die Lösung bis zum Erreichen vollkommener Transparenz durch eine aufgesetzte 0,9 mm Kanüle auf und ab gezogen. Die Proben wurden 5 Min. bei Raumtemperatur stehengelassen und anschließend bei –80°C gelagert. Die weitere Aufarbeitung und RNA-Messungen erfolgten im Forschungsinstitut für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere, Fach-bereich Molekularbiologie, Dummerstorf unter der Leitung von Prof. Dr. H. M. Seyfert.
Die mikrobiologische Untersuchung wurde freundlicherweise im mikrobiologischen Labor der Zentrumsabteilung Hygiene und Technologie der Milch des Zentrums für Lebensmittelwis-senschaften der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover unter der Leitung von Frau Dr.
Schröder durchgeführt. Nach Durchmischung der Probe wurden mit einer Einmalöse 10 µl Milch auf einer halben Blutagarplatte mit Äskulinzusatz ausgestrichen. Die Platten wurden nach 24 und 48 Stunden beurteilt. Wenn es für die Differenzierung nötig war, wurden Subkulturen einzelner Bakterienkolonien angelegt.
Die Bestimmung der somatischen Zellzahl (SCC) erfolgte mit dem Gerät Fossomatic® im Zentrum für Tiergesundheit, Milch und Lebensmittelanalytik des Ahlemer Instituts der Landwirt-schafskammer Hannover. Dazu wurde jede Probe mit Ethidiumbromid versetzt und die Zahl der Zellen/ml fluoreszenzoptisch bestimmt.
3.3.13.9 Indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF)
Die indirekte Membranimmunfluoreszenz ist ein Verfahren zum Nachweis der Expression von Oberflächenstrukturen auf Zellen. Hierbei binden spezifische Antikörper an Strukturen, die ih-rerseits von einem zweiten, Fluorochrom-markierten Antikörper erkannt werden.
Pro Vertiefung einer 96-Well-Rundbodenmikrotiterplatte wurden 2 x 105 Zellen frisch separierter oder in-vitro-kultivierter Zellen pipettiert. Platten mit kultivierten Zellen wurden 10 Min. auf Eis inkubiert um adhärente Zellen leichter herauspipettieren zu können. Die Zellen wurden zentrifu-giert (200 x g; 4 Min., 4°C) und die Überstände dekantiert. Anschließend wurden die Zellen in 175 µl MIF-Puffer (siehe 3.2.7.2.7) gewaschen: Resuspension, Zentrifugation, Abschlagen der Überstände, Resuspension des Bodensatzes. Nach Zugabe von 25 µl des verdünnten spezifischen primären Antikörpers (siehe 3.2.6) erfolgte eine 20-minütige Inkubation bei 4°C. Danach wurden die Zellen zweimal mit 175 µl MIF-Puffer gewaschen, mit 25 µl des sekundären FITC-konjugierten Ziege-anti-Maus-Antikörpers versetzt und unter Lichtabschluss bei 4°C für 20 Min.
inkubiert. Nach zweimaligem Waschen wurden die Zellen in 150 µl Trägerflüssigkeit (2 µg/ml PI) aufgenommen, in FCM-Röhrchen überführt und durchflusszytometrisch erfasst.
Da es zu unspezifischen Bindungen des sekundären Antikörpers kommen kann, wurden sowohl Konjugat- als auch Isotypkontrollen durchgeführt, bei denen den Zellen an Stelle des ersten
An-tikörpers 25 µl MIF-Puffer bzw. ein irrelevanter monoklonaler Antikörper des gleichen Isotyps wie der spezifische Primärantikörper zugesetzt wurde. Mittels der Membranimmunfluoreszenz konnten einzelne Milchzellpopulationen differenziert werden (siehe Abbildung 4).
Abbildung 4: Durchflusszytometrische Differenzierung somatischer Milchzellen
Dargestellt sind Punktediagramme (Grünfluoreszenz gegen Komplexität) nach Erfassung von 20.000 Ereignissen im Durchflusszytometer. Die in der Kontrolle (A, nur Sekundärantikörper, FITC-markiert) gekennzeichnete Zellpopulation (Ellipse) sind lymphozytäre Zellen. PMN sind durch einen hohen SSC-Wert und die Anfärbung durch den mAk Bo116 gekennzeichnet (B). Makrophagen stellen sich als CD14- und teilweise MHC-Klasse-II-positive Zellen (C, D) mit relativ großem und stark streuendem SSC dar.
3.3.13.10Gewinnung von Gewebeproben
Die Teilsektion der Versuchstiere wurde im Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover unter Leitung von Herrn PD Dr. Wohlsein durchgeführt. Die Tiere wur-den je nach Versuchsaufbau 24 oder 72 Stunwur-den nach Infektionsbeginn durch Betäubung mit Bolzenschuss und anschließendem Blutentzug getötet. Innerhalb von 15 Min. nach der Tötung wurden Eutergewebe- und Lymphknotenproben unter sterilen Kautelen gewonnen.
Für die Gewinnung von Milchdrüsengewebe wurde ein 5 x 5 x 5 cm großes Stück aus einem tiefer gelegenen Teil des Drüsengewebes ca. 10 cm dorsal der Drüsenzisterne entnommen. Nach Wechseln des Präparationsbestecks wurden hieraus ein 2 x 2 x 2 cm großes Stück zur Anferti-gung von Gewebeschnitten und ein 0,5 x 0,5 x 0,5 cm großes Stück zur RNA-Gewinnung her-auspräpariert.
D
Bo 139 B
Bo 116 A
Kontrolle C
VPM 65
S S C
Für die Gewinnung von Lymphknotengewebe wurden die Lnn. mammarii (Euterlymphknoten), als auch die Lnn. cervicales superficiales (Buglymphknoten) frei präpariert. Hier wurde ebenfalls je-weils ein 2 x 2 x 2 cm großes Stück zur Anfertigung von Gewebeschnitten und ein 0,5 x 0,5 x 0,5 cm großes Stück zur RNA-Gewinnung herauspräpariert.
Die Herstellung der Gewebeschnitte als auch die pathologisch-histologischen Untersuchungen wurden im Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durch Herrn PD Dr. Wohlsein durchgeführt. Die Proben zur RNA-Gewinnung wurden jeweils in ein 15 ml Röhrchen mit 8 ml RNAlater® (siehe 3.2.3) überführt, zweimal geschwenkt, über 24 h bei 6°C aufbewahrt und bis zur weiteren Aufarbeitung bei –80°C tiefgefroren. Die Aufarbeitung und Messungen mittels quantitativer RT-PCR (Goldammer et al. 2004) erfolgten unter der Leitung von Prof. Dr. H. M. Seyfert im Forschungsinstitut für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere, Fachbereich Molekularbiologie, Dummerstorf.