Einfluss einer experimentellen Mastitis mit E. coli und S. aureus auf die

Das Vorkommen mehrerer TLRs im Genom der Säuger wird dadurch erklärt, dass es dem ange-borenen Immunsystem des Wirts ermöglicht, die Art des Pathogens genauer zu identifizieren und im Folgenden eine gegenüber dem Pathogen „maßgeschneiderte“ Immunantwort zu initiieren (Underhill und Ozinsky 2002). Eine Aktivierung der TLRs kann somit zu einer Polarisierung der Immunantwort in Richtung Th1 oder Th2 führen. Eine Th1 gesteuerte Ausschüttung von Zyto-kinen und ChemoZyto-kinen ist essentiell für eine erfolgreiche Abwehr gegen eindringende Pathogene

im Euter (Dosogne et al. 2002). Eine Th2 dominierte Immunantwort führt hingegen, aufgrund einer vorangegangenen Trächtigkeit, zu einer unzureichenden Reaktion, wie sie häufig während der frühen Phase der Laktation beobachtet wird. Inwieweit TLRs im Rahmen einer experimentel-len Mastitis mit E. coli und S. aureus moduliert werden, sollte hier untersucht werden, um mehr Aufschluss über ihre Bedeutung in der Einleitung einer frühen Abwehrreaktion zu geben.

Toll-like-Rezeptor-2 und –4 als auch β-Defensine werden selektiv heraufreguliert nach einer experimen-tellen Infektion von Eutervierteln mit E. coli

Eine zentrale Beobachtung war, dass 24 h nach einer experimentellen Infektion mit E. coli die Expression der Pathogen-spezifischen Rezeptoren TLR-2 und –4 nahezu invariant in allen unter-suchten Geweben und Zellen heraufreguliert wurden (siehe Abbildung 17 und 23). Neben diesen Rezeptoren für bakterielle Strukturen wurden auch die Gene der β-Defensine mit heraufreguliert.

Von diesen antibakteriellen Peptiden wurde das β-Defensin 5 (BNBD5) und summarisch für eine Reihe verschiedener β-Defensine das universelle Defensin (uDef) untersucht.

Für weitere untersuchte TLRs mit natürlichen bakteriellen Liganden (TLR 6 und –9) konnte kei-ne signifikante Expressionssteigerung gemessen werden. Ebenfalls TLR 3, als Vertreter der TLRs für virale Strukturen, erfuhr keinerlei Modulation. Diese Beobachtungen legen nahe, dass ein Heraufregulieren von Pathogen-spezifischen Rezeptoren bei der Mastitis des Rindes selektiv und Erreger-spezifisch verläuft. Warum im Falle einer experimentellen Mastitis mit E. coli insbesonde-re der TLR-2 mitinsbesonde-reguliert wird, bleibt zunächst fraglich, da TLR-2 ein klassischer Rezeptor für Bestandteile Gram-positiver Erreger darstellt (Underhill und Ozinsky 2002). Es konnte jedoch gezeigt werden, dass TLR-2 essentiell für eine inflammatorische Antwort auf LPS einiger weniger Gram-negativer Erreger ist (Hirschfeld et al. 2001). Dies lässt Raum für Spekulationen, ob die Anwesenheit von E. coli hier über eine direkte Bindung an TLR-2 seine verstärkte Expression bedingte, oder ob es sich dabei um eine konzertierte Regulation gemeinsam mit TLR-4, dem klas-sischen PRR für LPS, handelt. Letzteres wurde bereits als Vermutung geäußert (Goldammer et al.

2004). Hier konnte ein gemeinsames Heraufregulieren von TLR-2 und TLR-4 im Euter mastiti-serkrankter Kühe beobachtet werden. Dabei handelte es sich jedoch um Tiere, über deren Krankheitsgeschichte nichts bekannt war, so dass mögliche Fremdeinflüsse nicht ausgeschlossen werden konnten. Im Weiteren ist zu erwähnen, dass in dem Zusammenhang nicht nur Tiere mit einem nachweislich positiven Befund für E. coli im Euter eine verstärkte Expression von TLR-2 und -4 zeigten: Im Gegensatz zu unseren Untersuchungen, zeigten Tiere mit nachweislicher Be-teiligung von S. aureus an einer Mastitis ebenfalls eine signifikante Steigerung von TLR-2, -4 und BNBD5. Dies lässt Spekulationen zu, dass es bei einer intramammären Infektion mit S. aureus möglicherweise erst sehr viel später zu einer Heraufregulation von besagten TLRs und Defensi-nen kommt. Unterstüzt wird dies durch die Beobachtung, dass wir nach einer 72-stündigen In-fektion mit S. aureus bereits eine signifikante Expressionssteigerung für uDef im regionalen Lymphknoten beobachten konnten (siehe Abbildung 28), während dies bei einer 24-stündigen Infektion ausblieb (siehe Abbildung 27).

Die Messung einer TLR- und Defensingenexpression in Blutzellen und somatischen Zellen der Milch war im vorliegenden Euterinfektionsmodell eine Möglichkeit, die Modulation dieser Fakto-ren im Infektionsverlauf zu messen. In den somatischen Zellen der Milch konnte gezeigt werden, dass wie im Gewebe beobachtet die Expression von TLR-2 und -4 nach experimenteller Infekti-on mit E. coli signifikant anstieg (siehe Tabelle 15). Die stark heterogenen Befunde zeigten jedoch Grenzen zum Einsatz dieser Methode auf. Ebenso für die Zellen des Blutes: Hier konnte für BNBD5 ein signifikanter Anstieg nach experimenteller Mastitis mit E. coli gezeigt werden (siehe Abbildung 34). Ein tendenzieller Anstieg für TLR-2 und –4 war aufgrund sehr hoher Standard-abweichungen nicht signifikant.

Über die Zellpopulationen, die zu einer Steigerung der TLR-Expression führen, kann bislang noch keine Aussage gemacht werden. Die bisherigen Versuche einer näheren topographischen Charakterisierung mittels In-situ-Hybridisierung im infizierten Euter waren nicht ausreichend

(Goldammer et al. 2004). Naheliegend wäre es, dass es sich vor allem um Zellen handelt, denen eine Wächterfunktion im Euter zukommt. Hier sind allen voran professionelle Antigen-Präsentierende Zellen (APC) zu nennen, wie Makrophagen und Dendritische Zellen. So konnte kürzlich der Nachweis einer Expression von TLR-2 und –4 in bovinen Monozyten, als auch aus Monozyten gereiften Makrophagen und Dendritischen Zellen erbracht werden (Werling et al.

2004). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass diese Makrophagen 8 Mal stärker TLR-2 und 1,5 Mal stärker TLR-4 exprimieren als Monozyten. Dendritische Zellen hingegen zeigten eine schwächere Expression beider Faktoren als Monozyten. Des weiteren muss auch die Immunkompetenz der Milchdrüsenepithelzelle Beachtung finden: Epithelzellen stellen oftmals Grenzgewebe dar, was einen häufigeren Kontakt mit Krankheitserregern bedingt. Toll-like-Rezeptoren sind bspw. ein wichtiger Bestandteil des angeborenen Immunsystems auf Darmepithelien (Abreu 2003). Eine TLR-2 und –4-abhängige Aktivierung der β-Defensingen-2-Expression konnte in Darmepithelien gezeigt werden (Vora et al. 2004). Renale Epithelzellen zeigten eine entzündungsbedingte He-raufregulation von TLR-2 und –4 (Wolfs et al. 2002). An primären bovinen Milchdrüsenepithel-zellen (pbMEC) konnte exemplarisch gezeigt werden, dass diese nach Stimulation mit S. aureus oder LPS zur Synthese von Laktoferrin, TNF-α, Serum Amyloid A und IL-8 angeregt werden (Wellnitz und Kerr 2004), was ihre Beteiligung an immunologischen Vorgängen im Euter unter-streicht. Auch genomweite Transkriptomanalysen im murinen Milchdrüsengewebe zeigten auf, dass die Abschaltung der Milchbildung während der Milchdrüseninvolution zu einer Aufregulie-rung einer ganzen Reihe immunrelevanter Gene führt (Stein et al. 2004, Clarkson et al. 2004).

Der Beweis einer induzierten Expression von Toll-like-Rezeptoren in Milchdrüsenepithelien während eines inflammatorischen Geschehens muss zukünftig noch erbracht werden. Für BNBD5 konnte dies bereits gezeigt werden (Goldammer et al. 2004, Strandberg et al. 2005).

Auch neutrophile Granulozyten könnten an einer Expressionssteigerung von TLRs im Euter beteiligt sein. Sie stellen eine dominierende Zellpopulation im infizierten Euter dar. Für humane PMN konnte gezeigt werden, dass sie TLR-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9 und 10 exprimieren (Hay-ashi et al. 2003). Als Effektormoleküle machen β-Defensine einen Anteil von bis zu 15 % des Gesamteiweißgehaltes der neutrophilen Granulozyten aus (Boman 1995). Die Vermutung, dass das massive Einwandern Neutrophiler Granulozyten proportional die Expressionssteigerung von TLRs und Defensinen im Milchdrüsen- und Lymphknotengewebe anhebt, kann nicht bestätigt werden. Es zeigte sich bspw. im Blut bei vorherrschender Neutropenie trotzdem eine Zunahme der Expression von TLR-2,–4 und BNBD5. Auch Tiere, die mit S. aureus über 72 h infiziert wur-den, zeigten sowohl einen massiven Einstrom an Neutrophilen in die Milch und ins Milchdrü-sengewebe resultierend in eitrigen Veränderungen im Gewebe als auch im Lymphknoten. Eine Zunahme der TLR-Expression blieb jedoch aus.

Mögliche funktionelle Konsequenzen einer TLR-Expressionssteigerung

Inwieweit eine selektive Steigerung der Toll-like-Rezeptor- und Defensingenexpression Auswir-kungen auf Mechanismen einer Abwehr im Euter hat, ist bislang nicht geklärt. Möglicherweise kann eine Veränderung des TLR-Expressionsmusters eine differentielle Immunantwort bedingen.

Somit könnte ein anderes Mediator-Spektrum erzeugt werden, welches sich funktionell auf den Phänotyp der Immunantwort auswirkt. Es handelt sich hierbei jedoch um Beobachtungen auf Expressionsebene der mRNA. Dies gibt uns Aufschluss darüber, dass im Rahmen einer experi-mentellen Mastitis, Gene aktiviert werden können, die zur Erkennung und Bekämpfung von Er-regern dienen.

Über die Bedeutung einer verstärkten, sowie verminderten Expression von TLRs ist bisher wenig bekannt. Neben einer Blockierung der Signaltransduktion gilt ein Herabregulieren der TLR-Expression als ein Mechanismus bakterieller Erreger, eine TLR-vermittelte Immunantwort zu hemmen (Alvarez 2005). Diese Mechanismen könnten möglicherweise die zunächst ausbleibende Modulation von TLRs während einer experimentellen Mastitis mit S. aureus erklären. Zwar konn-te hier nicht gezeigt werden, dass die TLR-Expression negativ beeinflusst wurde. Möglicherweise wurde jedoch eine Heraufregulation innerhalb der ersten 72 h einer Infektion gebremst.

Bekann-termaßen zeigten Tiere mit nachweislicher S. aureus-Mastitis über einen längeren Zeitraum erhöh-te Wererhöh-te für TLR-2 und –4 im Euerhöh-ter (Goldammer et al. 2004). Spekulativ bleibt bisher der Um-kehrschluss, ob eine verstärkte Expression eine verbesserte Erkennung von Pathogenen zur Fol-ge hat. Hayashi et al. (2003) konnten eine Zunahme der TLR-2- und –4-Expression nach Be-handlung mit GM-CSF in Neutrophilen Granulozyten beobachten. Eine verbesserte Reaktions-bereitschaft auf eine daraufhin folgende TLR-Stimulation konnte zumindest zu einem Teil durch die erhöhte TLR-Expression erklärt werden. Fraglich bleibt jedoch, welchen Zweck während einer experimentellen Mastitis die beobachtete Hochregulation erst nach Erregerkontakt erfüllt.

Denkbar wären protektive Mechanismen in Hinsicht auf den Verlauf der Infektion. Gelänge es dem Wirt nicht, die eingedrungenen Pathogene innerhalb kürzester Zeit zu eliminieren, so könnte der daraufhin verstärkte Rezeptorbesatz eine verstärkte Reaktion hervorbringen. Werden die Er-reger jedoch initial eliminiert, so könnte eine verstärkte, potentiell gewebeschädigende Reaktion ausbleiben.

Eine transiente Abnahme von TLR-2 und-4 nach LPS-Stimulation konnte auf Monozyten und Granulozyten gezeigt werden (Marsik et al. 2003). Anschliessend wurde die Expression von TLR-2 signifikant gesteigert. Das beim Menschen von Beeson (1947) zuerst beschriebene „LPS-Toleranz-Phänomen“ führt zu einer vorrübergehenden, kurzfristigen Sekretionshemmung pro-inflammatorischer Zytokine nach wiederholter Exposition gegenüber LPS. Versuche, dies durch eine vorrübergehende Herabregulation von TLR-4 zu erklären, waren bislang jedoch nicht erfolg-reich (Wittebole et al. 2005). Ein Heraufregulieren von TLR-2 in renalen Epithelzellen wird über IFN-γ und insbesondere TNF-α vermittelt (Wolfs et al. 2002). Die TLR-4-Expression scheint hingegen besonders durch IFN-γ verstärkt zu werden. Dies könnte Untersuchungen stützen, die aufzeigten dass eine Interferon-Behandlung die Reaktionsbereitschaft gegenüber LPS heraufsetzt (Hayes et al. 1995).

Inwieweit sowohl die Heraufregulation von TLR-2, -4 und β-Defensinen im Rahmen eine akuten E. coli-Mastitis, als auch das Ausbleiben einer Expressionszunahme dieser Faktoren bei einer durch S. aureus hervorgerufenen Mastitis für die Pathogenese entscheidend ist, wird sich dann besser klären lassen, wenn zukünftig genomweite Transkriptom- und Proteomanalysen die Fülle an regulierten Genen und Genprodukten darstellen.

6 Zusammenfassung

Wolfram Petzl

Untersuchungen zu frühen Erreger-Wirts-Interaktionen bei der Mastitis des Rindes

Die Mastitis ist die wirtschaftlich bedeutendste Einzelerkrankung in der Rinderproduktion, für die es bisher nur unbefriedigende Prophylaxe- und Therapiekonzepte gibt. Als Teil eines wissen-schaftlichen Gesamtkonzeptes trägt die vorliegende Arbeit dazu bei, Mechanismen aufzuklären, die an der Pathogenese der Mastitis beteiligt sind. Dabei stehen Ereignisse und Mechanismen im Mittelpunkt des Interesses, die in der frühen Phase der Erreger-Wirts-Interaktionen eine Rolle spielen.

Mastitiden treten vermehrt in der peripartalen Phase des Rindes auf und werden in diesem Zeit-raum oft durch die Erreger Staphylococcus aureus (S. aureus) und Escherichia coli (E. coli) hervorgeru-fen. Deshalb wurde in dieser Arbeit geprüft, ob Bestandteile der beiden Erreger (sog. PAMPs) unter dem Einfluss peripartal relevanter Sexualsteroide, die Funktionalität in-vitro-generierter Makrophagen beeinflussen. Ein sehr empfindlicher Parameter zur Charakterisierung der Funkti-onalität von Makrophagen stellt deren Eigenschaft dar, nach Stimulierung mit PAMPs, Faktoren zu sezernieren, welche zum Absterben neutrophiler Granulozyten führen.

In allen untersuchten bovinen Leukozytenpräparationen (neutrophile Granulozyten [PMN], mo-nonukleäre Leukozyten [MNC], Monozyten, in-vitro-generierte Makrophagen [MdM]) konnten immunhistologisch und oder mittels PCR sowohl der Progesteronrezeptor als auch die Östrogen-rezeptoren-α und –β nachgewiesen werden. Progesteron und Östradiol-17β führten hochdosiert zu einer signifikanten Senkung der Absterberate anteiliger PMN von einer CpG-stimulierten Ge-samtleukozytenpopulation. LPS-stimulierte MdM konnten unter dem Einfluss von Östradiol-17β ein Absterben von PMN verstärken. Während Progesteron keinen Einfluss auf die Zahl reiner, vitaler PMN nach Stimulation mit PAMPs nahm, starben tendenziell mehr PMN in Anwesenheit des Hormons, wenn Kokulturen der Zellen mit MdM und LPS oder der Kombination von LPS und einem CpG-Motiv stimuliert wurden. Östradiol-17β hingegen verstärkte hochsignifikant das LPS-induzierte, MdM-abhängige Sterben der PMN, nicht aber das durch LPS und durch das CpG-Motiv additiv induzierte Sterben. MdM exprimieren die Erregerrezeptoren TLR-2 und TLR-4 (Toll-like-Rezeptor-2, -4) sowie das bovine β-Defensin 5 (BNBD5). Im Gegensatz zu Progesteron senkte Östradiol-17β nicht signifikant die Expression aller drei mittels quantitativer PCR untersuchter Gene. Damit konnte gezeigt werden, dass Hormone die Reaktionsfähigkeit von Immunzellen auf Erregerbestandteile modulieren können.

Um zu prüfen, ob bovine Makrophagen in ihrem Immunphänotyp polarisiert sein können, wurde der Arginin-Metabolismus näher analysiert. Erstmals wurde das Enzym Arginase in bovinen MdM und MNC nachgewiesen. Eine Induktion seiner Aktivität erfolgte bereits während der Kultivierung und ließ sich durch Stimulation mit LPS nicht signifikant stei-gern. Eine abhängige Regulation konnte für bovine MdM nicht gezeigt werden: Während LPS eine signifikante Steigerung der NO-Produktion hervorrief, zeigten sich keine Korrela-tionen der Arginase-Aktivität. Während im murinen System die Regulation der alternativen Schlüsselenzyme induzierbare NO-Synthase (pro-inflammatorisch) und Arginase (anti-inflammatorisch) meist streng dichotom erfolgt, galt dies nicht für bovine Zellen. Der Ar-ginin-Metabolismus beim Rind kann daher nicht als Hinweis auf einen vorherrschenden Immunphänotyp dienen.

Ein Kernpunkt der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines Mastitis-Infektionsmodells für das Rind. Unter streng definierten Bedingungen soll damit die frühe Phase (24-72 h) einer akuten klinischen (E. coli) sowie einer subklinisch bis chronischen (S. aureus) Mastitis simuliert werden.

Die anschließende Quantifizierung von Entzündungszellen im Sekret zu unterschiedlichen Zeiten der Infektion, deren durchflusszytometrische Erfassung und Differenzierung, sowie die Messung der TLR-Expression und β-Defensingenexpression im Eutergewebe und in Lymphknoten mittels quantitativer RT-PCR sollten Mechanismen der frühen Infektionsabwehr näher charakterisieren.

Die Qualität des entwickelten Mastitismodells begründet sich einerseits im straffen Vorabscree-ning der Versuchstiere (Rasse: Holstein-Friesian, 1. Laktation, 3.-5. Laktationsmonat, Freiheit von Mastitiserregern sowie somatische Zellzahl in der Milch [SCC] <100.000 Zellen/ml über mindestens zwei Wochen vor Versuchsbeginn). Andererseits wurden während der simulierten Mastitis regelmäßig die Körpertemperatur, die Milchleistung, die Eutersekretbeschaffenheit, der Euterpalpationsbefund, das Allgemeinbefinden und das Differentialblutbild dokumentiert. Erste mit Hilfe des Modells erhobene Daten waren:

Alle mit E. coli infizierten Tiere reagierten mit Fieber innerhalb von 12 h. Bei den mit S. aureus über 24 und 72 h infizierten Tieren war keine signifikante Erhöhung der Körpertemperatur fest-zustellen. Die tägliche Milchleistung sank sowohl bei Tieren, die mit E. coli als auch mit S. aureus infiziert wurden signifikant entsprechend der Versuchszeiträume. Alle mit E. coli infizierten Tiere zeigten innerhalb des 24-stündigen Experiments geringgradige Störungen des Allgemeinbefin-dens, hochgradige Veränderungen des Eutersekretes (Flocken, Verlust des Milchcharakters) und eine hochgradige entzündliche Schwellung betroffener Euterviertel. Tiere, die mit S. aureus infi-ziert wurden, zeigten hingegen keine bis geringgradige klinische Anzeichen einer Mastitis. Im Gegensatz zu den 24-stündigen Infektionen mit S. aureus, zeigten die über 72 h infizierten Tiere i.d.R. deutlichere Symptome einer klinischen Mastitis (zunehmende Flockenbildung in der Milch bei erhaltenem Milchcharakter).

Bei allen Tieren, die mit E. coli infiziert wurden, war bereits nach 12 h eine signifikante Leukope-nie, mit Neutropenie und Lymphopenie zu beobachten. Während einer 24-stündigen Infektion mit S. aureus wurden keine signifikanten Veränderungen der Zahl zirkulierender Leukozyten beo-bachtet. Hingegen kam es bei einer 72-stündigen Infektion zu einem transienten, signifikanten Abfall der PMN 48 h post infectionem.

Sowohl E. coli als auch S. aureus konnten aus den zuvor infizierten Eutervierteln reisoliert werden.

Nach Infektion mit E. coli ließ sich ein markanter, signifikanter Anstieg des SCC bereits 12 h post infectionem feststellen. Während einer 24-stündigen Infektion mit S. aureus war eine nur schwache, jedoch signifikante SCC-Erhöhung in Versuchs- und Kontrollvierteln nachzuweisen. Bei den über 72 h dauernden Infektionen mit S. aureus war die SCC-Dynamik sehr heterogen: Bei vier Tieren war ein signifikanter SCC-Anstieg zu beobachten, bei zwei Tieren nicht.

Nach Infektion mit E. coli oder S. aureus stieg der Anteil neutrophiler Granulozyten in der Milch und blieb im weiteren Verlauf der Infektion erhöht. Es wurde eine starke positive Korrelation zwischen SCC-Wert und absoluter PMN-Zahl in der Milch gefunden. Es konnten keine signifi-kanten Unterschiede der Zusammensetzung zwischen untersuchten Viertelanfangs- und – endgemelken nachgewiesen werden.

Eine sequentielle Infektion konnte aufzeigen, dass eine vorangegangene Infektion die Reaktions-bereitschaft auf nachfolgende Infektionen beeinflusst. Eine zweite Infektion nach 12 h mit E. coli konnte keine Erhöhung der Zellzahl herbeiführen. Ein zunächst heterogener SCC-Anstieg nach Infektion mit S. aureus verursachte 60 h später eine verbesserte, einheitliche Reaktionsbereit-schaft.

Grundsätzlich konnte die Expression der TLR-2, -3, -4, -6 sowie auch boviner β-Defensine (ins-besondere des BNBD5) in allen untersuchten Eutervierteln, sowie in Euter- und Buglymphkno-ten nachgewiesen werden. Eine signifikante Hochregulation der Expression konnte für TLR-2 und –4, sowie für bovine β-Defensine nach Infektion mit E. coli in den infizierten Eutervierteln, den Euterlymphknoten und teilweise in den somatischen Zellen des Milchsekrets gezeigt werden.

S. aureus bewirkte erst nach 72-stündiger Infektion und lediglich bei den β-Defensinen eine signi-fikante Expressionssteigerung in den Euterlymphknoten beider Seiten.

Mit Hilfe des im Rahmen dieser Arbeit erstellten Mastitismodells wurden orientierte Daten zur Einschätzung der Bedeutung von Erreger-Erkennungs-Rezeptoren für frühe Erreger-Wirts-Interaktionen in der Milchdrüse erlangt. Nach Erweiterung des Untersuchungsspektrums steht damit ein Instrument zur Verfügung, das zur Klärung einer ganzen Reihe spezifischer Fragestel-lungen zur Pathogenese von Mastitiden eingesetzt werden kann. Folgeexperimente dieser Arbeit werden vor allem Problemstellungen zur Bedeutung unterschiedlich hoher Milchzellzahlen auf die frühen Erreger-Wirts-Mechanismen, die Krankheitsverläufe nach Einsatz von Erregerstäm-men mit unterschiedlichen Pathogenitätseigenschaften, aber vor allem auch molekularen Grund-lagen von Infektions- und initialen Abwehrmechanismen in der Milchdrüse anhand Transkrip-tom- und Proteomanalysen beinhalten. Erworbene Erkenntnisse werden als Grundlage zur Defi-nition neuer Parameter für das Merkmal „Eutergesundheit“ dienen. Langfristig sollen neue Kan-didatengene für die Zucht von Kühen mit verbessertem Immunschutz identifiziert und funktio-nell validiert werden.

7 Summary

Wolfram Petzl

Investigations on early host-pathogen interactions during bovine mastitis

Mastitis is the most important disease in dairy production in terms of economic impact. How-ever, concepts for prophylaxis and therapy are still unsatisfactory. This work is part of a scientific framework project and deals with mechanisms participating in the pathogenesis of mastitis. We focus especially on events and mechanisms during the early phase of the host defense.

Mastitis occurs rather frequently during the periparturient period, often due to Staphylococcus aureus or Escherichia coli infection. Thus, it was tested whether pathogen associated molecular patterns (PAMPs) of these bacterial species influence the function of in vitro generated macrophages (MdM) in the context of relevant sexual steroid hormones. The accelerated killing of cocultured neutrophilic granulocytes by secreted factors of stimulated MdM was taken as a very sensitive read-out system.

All studied leukocyte populations (polymorphonuclear neutrophils [PMN], mononuclear cells [MNC], monocytes and MdM) contained progesterone and estrogen (α, β) receptors as proven by immune-histological assessment or PCR. Progesterone and estradiol-17β, at high concentrations, significantly inhibited the induced killing of PMN in a CpG-stimulated leukocyte population.

LPS-stimulated MdM enhanced the killing of PMN under the influence of estradiol-17β. Proges-terone had no effect on the number of pure and viable PMN after PAMP stimulation. More PMN died in the presence of progesterone if cocultures of PMN and MdM were stimulated with LPS or the combination of LPS and a CpG motif. Estradiol-17β also enhanced significantly the LPS-induced, MdM-dependend killing of PMN, but not the killing induced by LPS or LPS+CpG motif. MdM expressed the pattern recognition receptors TLR-2 and TLR-4 (Toll like receptor-2, -4) and the bovine β-defensin 5 (BNBD5). In contrast to progesterone, estradiol-17β did not reduce significantly the expression of all three genes, as determined by quantitative RT-PCR. In summary, it could be shown that the tested hormones are able to modulate the response of im-mune cells to PAMPs.

A possible polarization of the immune phenotype of bovine MdM was analyzed by investigating

A possible polarization of the immune phenotype of bovine MdM was analyzed by investigating