Charakterisierung der entzündungsbedingten
Surfactant- und Lungenparenchymalterationen beim Schwein nach Infektion mit
Actinobacillus pleuropneumoniae
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Diana Johanna Linda Busley Hamm
Hannover 2014
Medizin und Ambulatorische Klinik, Tierärztliche Hochschule Hannover Prof. Dr. Dr. Andreas Schmiedl
Institut für Funktionelle und Angewandte Anatomie Medizinische Hochschule Hannover
1. GutachterIn: Prof. Dr. Isabel Hennig-Pauka Prof. Dr. Dr. Andreas Schmiedl
2. Gutachter: PD Dr. Christoph Baums
Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin,
Tierärztliche Hochschule Hannover
Tag der mündlichen Prüfung: 22.10.2013
In Zusammenarbeit mit dem Institut für Funktionelle und Angewandte Anatomie der Medizinischen Hochschule Hannover.
Diese Forschungsarbeit wurde dankenswerterweise von der Friedrich-Ebert-Stiftung unterstützt.
Für Jens Für Unsere Stärke
Für Johanna F. Funke Für Deinen Glauben an Bildung
ABBILDUNGSVERZEICHNIS TABELLENVERZEICHNIS
Seite
1. Übergeordnete Einleitung 15
2. Literaturübersicht 17
2.1 Anatomischer und histologischer Aufbau der Lunge beim Schwein
bzw. bei Haussäugetieren 17
2.2 Surfactant 21
2.2.1 Aufbau, Funktion und Synthese 21
2.2.2 Die Rolle des Surfactants im angeborenen Immunsystem 23
2.2.3 Surfactantdysfunktion 25
2.2.4 Die Rolle des Surfactants bei spezifischen Erkrankungen 27 des Menschen bzw. in der tierexperimentellen
Grundlagenforschung
2.3 Surfactant bei Tieren 31
2.4 Surfactant beim Schwein 33
2.5 Erkrankungen des Respirationstrakts beim Schwein 35 2.5.1 Porcine Respiratory Disease Complex (PRDC) 35
2.5.2 Porzine Pleuropneumonie 36
3. Material und Methoden 41
3.1 Surfactantcharakterisierung beim Schwein 41 3.1.1 Infektionsversuche mit Scoring im Rahmen des
FUGATO-RePoRI- Projektes 41
3.1.1.1 Versuchstiere 41
3.1.1.2 Aerosolinfektion 42
3.1.1.3 Klinische und pathomophologische
Erhebungen 42
3.1.2 Bronchoalveoläre Lavage 45
3.1.2.1 Spülmethode 45
3.1.2.2 Zytologische Untersuchung 46
3.1.2.3 Surfactantgewinnung- und aufbereitung 47 3.1.2.4 Aufbereitung der Lavageflüssigkeit für die
Elektronenmikroskopie 48
3.1.3 Elektronenmikroskopie 50
3.1.3.1 Fragestellung 50
3.1.3.2 Elektronenmikroskopische Auswertung 51 3.1.3.3 Stereologische Parameter wie 54
Volumendichte, Oberflächendichte und des Volumen-/Oberflächenverhältnis‘
3.2.1 Versuchstiere 61
3.2.2 Aerosolinfektion 61
3.2.3 Klinische, computertomographische, hämatologische und pathomorphologische Erhebungen im Rahmen der Infektionsstudien von BRAUER (2012) und
HENNIG-PAUKA et al. (2012) 61
3.2.4 Präparationstechnik 63
3.2.5 Fixierung, Einbettung und Anfertigung von
Gewebedünnschnitten 63
3.2.6 Protokoll der lichtmikroskopischen Auswertung und
Berechnung stereologischer Parameter 64 3.2.7 Auswertung der computertomographischen
Transversalschnitte von Schweinelungen 66 3.2.7.1 Punktzählverfahren im STEPanizer 66 3.2.7.2 Berechnung des funktionellen
Lungenparenchymvolumens der
Schweinelungen nach dem Cavalieri Prinzip 67 3.2.7.3 Funktionelles Volumen der Alveolarsepten 67 3.2.7.4 Funktionelle Oberfläche der Alveolarsepten 68 3.2.7.5 Funktionelles Parenchymvolumen von
pathologisch veränderter Strukturen 68 3.3 Charakterisierung von perfusionsfixiertem Lungenparenchym
beim Schwein 69
3.3.1 Versuchstiere 69
3.3.2 Versuchsablauf 69
3.3.3 Samplingverfahren der perfusionsfixierten Lungen 74 3.3.4 Aufbereitung der Proben für die lichtmikroskopische
Untersuchung 76
3.3.5 Protokoll der lichtmikroskopischen Auswertung 76 3.3.6 Berechnung der stereologischen Parameter 76
3.4 Statistik 76
3.4.1 Statistische Auswertung von vor und nach der Infektion
erhobenen Daten 76
3.4.2 Statistische Auswertung der Daten, die nach Immersions- 77 oder Perfusionsfixierung lichtmikroskopisch
erhoben wurden
Abstract 79
Background 80
Porcine respiratory disease Pulmonary surfactant
Methods 84
Housing, infection and examination of pigs Bronchoalveolar lavage
Fixation and tissue processing Stereology
Pulsating bubble surfactometry Statistical analysis
Results 91
Clinical and laboratory diagnostic findings Morphology of surfactant subtypes
Average minimal surface tension
Discussion 93
Conclusions 97
Abbreviations 97
Competing interests 97
Author’s contribution 98
Acknowledgements 98
References 98
Figure legends 107
Tables and figures 109
5. Übergreifende Diskussion 115
5.1 Alterationen im Surfactantsystem (vgl. Manuskript) 115
5.1.1 Reflexion der Ergebnisse 115
5.1.2 Reflexion der angewandten Methoden und Ausblick 122 5.2 Charakterisierung der infektionsbedingten Parenchymalterationen 124
5.2.1 Reflexion der Ergebnisse 124
5.2.2 Methodenkritik und Ausblick 127
5.3 Strukturelle Charakterisierung von porzinem, perfusionsfixiertem
Lungenparenchym 129
5.3.1 Reflexion der Ergebnisse 129
5.3.2 Methodenkritik und Ausblick 132
6. Literaturverzeichnis 133
7. Anhang 163
Anhang 1. mit Tabelle 7.1.1: „Alterationen im Surfactantsystem:
Klinik, Pathomorphologie und kulturelle Untersuchung“ 163 Anhang 2. „Stereologische Charakterisierung von immersionsfixiertem
Anhang 4. Protokoll über die Surfactant-Auswertung 180 8./9. Zusammenfassung in deutscher und englischer Sprache 181
10. Danksagung 186
A.pp. Actinobacillus pleuropneumoniae ARDS Acute Respiratory Distress Syndrome
BAL Bronchoalveoläre Lavage
BALF Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit
BMBF Bundesministerium für Bildung und Forschung
bspw. beispielsweise
CT Computertomographie
DPPC Dipalmitoylphosphatidylcholin
Σ Summe
ECP eosinophilic cationic protein
Fa. Firma
hPa Hektopascal
KGW Körpergewicht
kV Kilovolt
kPa Kilopascal
LA large aggregates
lb lamellar body
lbl lamellar body-like forms
LLS Lung Lesion Score
LSP Linienschnittpunkt
mAs Milliampèresekundenprodukt
MHz Megaherz
mlv multilamellar vesicle
ms Millisekunde
p p-Wert
P Punkt(e)
PBS Pulsating Bubble Surfactometer PEEP positive end-exspiratory pressure
PINSP pressure inspiratoric
SA small aggregates
SD standard deviation
s.o. siehe oben
SP bzw. SP- Surfactantprotein
SV Oberflächendichte
TEM Transmissionselektronenmikroskop
tm tubular myelin
u.a. unter anderem
ulv unilamellar vesicle
V/S-Ratio Volumen-/Oberflächenverhältnis
VV Volumendichte
z.B. zum Beispiel
Literaturverzeichnis
Abb. 2.1. a: Aufbau der Schweinelunge (aus WAIBL 1999, S. 268) 18 Abb. 2.1. b: Legende zur Abb. 2. 1. a (aus WAIBL 1999, S. 268) 18 Abb. 2.2: Surfactant bei belastungsinduzierten Asthma (modifiziert nach
ENHORNING et al. 2000) 28
Material und Methodik
Abb. 3.1.1: Versuchsdesign im Rahmen des FUGATO-RePoRI-Projektes,
teilweise publiziert in REINER et al. (2014) 44 Abb. 3.1.2: a.) Beispielhaft Ferkel in Neuroleptanalgesie mit
ausgebundenem Kiefer während Laryngoskopie,
wie beschrieben in KIPPER (1990) 46
b.) Beispielhaft Bronchoskopie, wie beschrieben in KIPPER
(1990) 46
Abb. 3.1.3.: Punktzählverfahren im STEPanizer© stereology tool 53
Abb. 3.1.4: PBS 58
Abb. 3.1.5: PBS schematisch (ENHORNING 1977) 58
Abb. 3.1.6: Blick durch das Okular des Pulsating Bubble SurfactometersTM 59 Abb. 3.1.7: PBS Output eines Kontrollschweines: 60 Abb. 3.3.1: Nahezu vollständig kollabierte Lunge ohne definierte Blähung 72 Abb. 3.3.2: Überblähtes Lungenparenchym durch falsche Einstellung des
Beatmungsdruckes (>40 mbar), beim späteren Sampling floss viel
Flüssigkeit von der Schnittfläche ab 72
Abb. 3.3.3: Entnommene Lungen mit definierter Blähung durch
Abklemmung der Trachea am Ende der Inspiration 73 Abb. 3.3.4: Schneidapperatur zum exakten Schneiden der Lungen (von der
Forschungswerkstatt der Medizinischen Hochschule Hannover
konstruiert) 75
Anhang
Abb. 7.2.1: Verteilung der stereologisch erarbeiteten Volumendichten bei
Kontrolltieren und infizierten Tieren am Tag der Sektion 168 Abb. 7.2.2: Oberflächendichten [1/µm] der Alveolarsepten bei Kontrolltieren
und infizierten Tieren 169
Abb.7.2.3: V/S-Ratio [µm] bei Kontrolltieren und infizierten Tieren 169 Abb.7.2.4: Vergleichende Darstellung der zytologischen Untersuchung der
BALF der Kontrolltiere und der infizierten Schweine am Tag
der Sektion 170
Abb.7.2.5: Vergleichende Darstellung der Blutwerte der Kontrolltiere und
infizierten Schweine am Tag 21. p. inf. 171 Abb. 7.2.6: Vergleichende Darstellung der stereologisch ermittelten Daten der
Kontrolltiere und infizierten Schweine am Tag 21. p. inf. 172 Abb.7.2.7: Via Stereologie ermittelte funktionelle Oberfläche der
Alveolarsepten vergleichend für Kontrolltiere und der
infizierten Schweine am Tag 21. p. inf. 173 Abb. 7.2.8: Funktionelle Parenchymvolumina pathologisch
veränderter vergleichend für die Kontrolltiere und die
infizierten Schweine am Tag 21. p. inf. 174 Abb. 7.2.9: Immersionsfixiertes Lungenparenchym eines
Kontrolltieres, HE-Färbung 175
Abb. 7.2.10: Immersionsfixiertes Lungenparenchym eines mit A.pp.-
infizierten Tieres (21 Tag p.inf.), HE-Färbung 176 Abb. 7.3.1: Verteilung der stereologisch berechneten Volumendichten von
immersionsfixiertem Lungenparenchym und
perfusionsfixiertem Lungenparenchym (schraffiert). 177 Abb. 7.3.2: Vergleich der Oberflächendichte [1/µm] zwischen
Abb. 7.3.4: Nahezu vollständig kollabierte Lunge ohne definierte
Blähung am Ende der Inspiration, Lungenparenchym eines
Kontrolltieres, HE-Färbung 179
TABELLENVERZEICHNIS
Seite Anhang
Tabelle 7.1.1: Alterationen im Surfactantsystem: Klinik, Pathomorpho-
logie und kulturelle Untersuchung 163
Tabelle 7.2.1: Stereologische und klinische Charakterisierung der
Lungenparenchymalterationen nach Infektion mit A.pp. 164 Tabelle 7.2.2 Pathomorphologische und histopathologische
Charakterisierung der Lungenparenchymalterationen
nach Infektion mit A.pp. 165
Tabelle 7.2.3: Ausgewählte Korrelationen (Lichtmikroskopie) in der
Kontrollgruppe (n=5) 166
Tabelle 7.2.4: Ausgewählte Korrelationen (Lichtmikroskopie) bei den
A.pp.- infizierten Schweinen (n=4) 167
15 1. Übergeordnete Einleitung
Erkrankungen des Respirationstraktes führen in der Schweineproduktion zu großen wirtschaftlichen Verlusten (JACKSON u. COCKCROFT 2007) und sind neben den Durchfallerkrankungen einer spanischen Studie zufolge die bedeutendste Indikation für den Einsatz von Antibiotika beim Schwein (CASAL et al. 2007).
Die Weiterentwicklung der Diagnostik und Therapie von porzinen Atemwegserkrankungen ist deshalb nicht nur aus ökonomischen Gesichtspunkten nötig, sondern auch im Sinne des Verbraucherschutzes, des Tierschutzes und der Landwirtschaft entscheidend (modifiziert nach HENNIG-PAUKA 2007).
Die Dissertation basiert auf vorausgegangenen Arbeiten, in denen a) die genetische Krankheitsresistenz verschiedener Rassen und die Bedeutung angeborener Immunitätsmechanismen bezüglich der Anfälligkeit gegenüber Actinobacillus pleuropneumoniae untersucht wurde (HÖLTIG 2009), b) bildgebende Verfahren bei dieser Erkrankung evaluiert wurden (BRAUER et al. 2012) und c) zum angeborenen Immunsystem gehörende antibakterielle Peptide im die Lungenoberfläche auskleidenden Flüssigkeitsfilm entdeckt und als Krankheitsmarker genutzt wurden (HENNIG-PAUKA et al. 2006).
Studien haben gezeigt, dass funktionelle Bestandteile des angeborenen Immunsystems, als Komponenten des Surfactantsystems, bei der Abwehr bakterieller Erreger eine wichtige Rolle spielen (LEVINE et al. 1998; GIANNONI et al.
2006; WU et al. 2003).
Somit lag es nahe, die bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit (BALF) grundlagenorientiert zu untersuchen. Hierbei wurde die BALF sowohl auf ihre biophysikalischen Eigenschaften (Oberflächenspannung) als auch ultrastrukturell (Surfactantsubtypen) anhand bestimmter morphometrischer Parameter untersucht (in Anlehnung an SCHMIEDL et al. 2003). Diese Untersuchungen fanden in Zusammenarbeit mit der Medizinischen Hochschule Hannover, Institut für Funktionelle und Angewandte Anatomie und der Klinik für Pädiatrische Pneumologie, Allergologie und Neonatologie statt.
Anhand der Infektion mit Actinobacillus pleuropneumoniae (A.pp) sollen mit dieser
16
Studie nun zwei daran anknüpfende grundlagenforschungsorientierte Fragestellungen bearbeitet werden (in Anlehnung an SCHMIEDL et al. 2003; VAN SCHAIK et al. 1997):
1. Wie stellt sich die Morphologie der Surfactantsubtypen und die biophysikalische Funktion vor und nach der Infektion dar?
2. Lassen sich entzündungsbedingte Veränderungen des Surfactants hinsichtlich seiner Morphologie und Funktion darstellen, so dass auf den Gesundheitszustand (Klinik und Pathomorphologie) des Tieres rückgeschlossen werden kann?
Die BALF könnte dann einerseits auf Erreger (vgl. GROSSE-BEILAGE et al. 2013, S.
204-206), andererseits auch auf die Qualität des oberflächenaktiven Surfactants (s.o.) untersucht werden. Langfristig wäre dies ein wichtiger Ansatz, um neue Therapieansätze und auch Vakzinierungsstrategien bezüglich ihrer Wirkung auch auf Komponenten des angeborenen Immunsystems evaluieren zu können (modifiziert nach HENNIG-PAUKA et al. 2012).
Dabei sollen die durchgeführten Untersuchungen Orientierungswerte für die Surfactantcharakterisierung beim Schwein bieten, und zwar sowohl für gesunde Tiere, als auch für Tiere mit Pneumonie.
Da das Schwein häufig als Modelltier genutzt wird (TRACHSEL et al. 2011, HOHLFELD et al. 1999 b, ROGERS et al. 2008), stellen diese Daten auch für die humanmedizinische Forschung eine Grundlage dar, um Tiermodelle für Erkrankungen des Menschen besser charakterisieren zu können. Dieselben Tiere, die zuvor zur Beantwortung anderer Fragestellungen mit A.pp. infiziert worden waren (s.o.), wurden nun auch genutzt, um in dieser Arbeit die pathogenspezifischen Alterationen im porzinen Surfactant und im Lungenparenchym zu charakterisieren.
17 2. Literaturübersicht
2.1 Anatomischer und histologischer Aufbau der Lunge beim Schwein bzw. bei Haussäugetieren
Anatomie
Grundsätzlich hat die Lunge der Haussäugetiere die Struktur eines tubuloalveolär zusammengesetzten Gangsystems, die Aufzweigung des Bronchialbaumes ist als Grundlage für die Lappengliederung tierartspezifisch gegeben (KÖNIG u. LIEBICH 2012, S. 383).
KÖNIG u. LIEBICH (2012, S. 382) beschreiben, dass beim Schwein die Anatomie der rechten Lunge (Pulmo dextra) und der linke Lunge (Pulmo sinistra) in Bezug auf die Lappengliederung verschieden ist. Die Pulmo sinistra gliedert sich in einen Lobus cranialis sinister mit je einer Pars cranialis und Pars caudalis und einen Lobus caudalis sinister. Die rechte Lunge besitzt vier Lappen: Lobus cranialis, Lobus accessorius, Lobus medius und Lobus caudalis (KÖNIG u. LIEBICH 2012, S. 382).
Des Weiteren erörtern KÖNIG u. LIEBICH (2012, S. 386) beim Schwein und beim Wiederkäuer das gesonderte Vorhandensein eines rechtsseitigen Bronchus trachealis. Dieser entspringt als selbstständiger Lappenbronchus vor der Bifurcatio tracheae aus der Trachea. Das luftleitende Bronchialsystem lässt sich bei den Haussäugetieren in Hauptbronchien (Bronchi principales) nach Aufzweigung der Trachea, Lappenbronchien (Bronchi lobares) jeweils der linken und rechten Lunge, Segmentbronchien (Bronchi segmentales) für ein umschriebenes kegelförmiges Lungensegment, Subsegmentbronchien (Bronchi subsegmentales), kleinere Bronchien (Bronchioli veri) und Endbronchiolen (Bronchioli terminales) untergliedern.
Daran anschließend besteht das respiratorische System aus Bronchioli respiratorii, Alveolargängen (Ductus alveolares), Alveolarsäckchen (Sacculi alveolares) und Lungenbläschen (Alveoli pulmonis) (KÖNIG u. LIEBICH 2012, S. 386).
Funktionell ist die Lunge bei den Haussäugetieren über den Truncus pulmonalis an das Gefäßsystem des kleinen Lungenkreislaufs angeschlossen, die nutritive Versorgung übernehmen die Arteria und Vena bronchooesophagea (KÖNIG u.
LIEBICH 2012, S. 388).
18
Arterielles, sauerstoffangereichertes Blut wird über die Venae pulmonales in die linke Vorkammer des Herzens gebracht (KÖNIG u. LIEBICH 2012, S. 388).
Abb. 2.1.a (nach WAIBL 1999, S. 268) Abb. 2.1.b (nach WAIBL 1999, S. 268)
Abb. 2.1.a: Aufbau der Schweinelunge (nach WAIBL 1999, S. 268) Abb. 2.1.b: Legende zu Abb. 2. 1.a (nach WAIBL 1999, S. 268)
Histologie
LIEBICH u. ZENGERLING (2010, S. 265-267) berichten, dass die Lunge bei den Haussäugetieren außen von einer Kapsel (Pleura visceralis) umschlossen wird, die ein einschichtiges, flaches bis isoprismatisches Epithel und eine unregelmäßig dicke Lage kollagener und elastischer Fasen enthält. Davon ausgehend laufen Bindegewebssepten zusammen mit Blutgefäßen und Nerven ins Organinnere und gliedern als beim Schwein deutlich ausgebildetes, interstitielles Bindegewebe die Lunge in Lappen und Läppchen (LIEBICH u. ZENGERLING 2010, S. 265-267).
a: Lobus cranialis b: Lobus medius c: Lobus caudalis d: Lobus accessorius
1: Incisura cardiaca pulmonis dextri bzw.
sinistri 2: Trachea
3: Bronchus principalis 4: Bronchus trachealis 5: Bronchus lobaris cranialis 6: Bronchus lobaris medius 7: Bronchus accessorius 8: Bronchus lobaris caudalis 9: 1. bzw. 3. ventraler
Segmentbronchus des Lobus‘
caudalis
10: 2. dorsaler Segmentbronchus des Lobus’ caudalis
11: weitere Segmentbronchen 12: Lymphonodi tracheobrochales
craniales
13: Lymphonodi tracheobrochales sinistri
14: Lymphonodi tracheobrochales dextri
15: Lymphonodi tracheobrochales medii
(aus WAIBL 1999, S. 268)
19
Den innerhalb der Lunge liegenden, luftleitenden Abschnitten fallen ca. 6 % des Lungenvolumens zu, den respiratorischen Abschnitten hingegen rund 85 % (LIEBICH u. ZENGERLING 2010, S. 265).
Luftleitendes System
LIEBICH u. ZENGERLING (2010, S. 267) beschreiben, dass die innere Oberfläche der Bronchien bei den Haussäugetieren von einem respiratorischen Flimmerepithel mit Becherzellen ausgekleidet wird, die Epithelhöhe wird dabei nach distal laufend kontinuierlich geringer. Die Lamina propriae mucosae ist mit gemischten Drüsen, Blut- und Lymphgefäßen, Nerven, Solitärlymphknötchen und lockerem Bindewebe (kollagene, aber vor allem elastische Fasern) ausgestattet. Sich daran anlegend folgt eine Schicht glatter Muskulatur und hyalinem Knorpelparenchym (je nach Aufzweigungsgrad Knorpelspangen bis Knorpelfragmente) (LIEBICH u.
ZENGERLING 2010, S. 267).
Im Weiteren wird von LIEBICH u. ZENGERLING (2010, S. 269) genannt, dass abschließend bei den Haussäugetieren eine bindegewebige Tunica adventitia mit Gefäßen und Nerven folgt. Das Lumen der Bronchioli wird von einem mehrreihigen, hochprismatischen Flimmerepithel ausgekleidet. Dieses wird morphologisch mit zunehmender Aufzweigung mehrreihig, isoprismatisch bis einschichtig, isoprismatisch in den Bronchioli terminales. In bevorzugt kleineren Bronchioli finden sich auch hochprismatische Zellen ohne Zilien (Clara-Zellen). Im Grundaufbau der Bronchioli sind Drüsen und knorpelige Strukturen gänzlich nicht vorhanden, eine kräftige Tunica muscularis aus mehreren Lagen vorrangig zirkulär angeordneter glatter Muskelzellen ist deutlich ausgeprägt (LIEBICH u. ZENGERLING 2010, S.
269).
Respiratorisches System
LIEBICH u. ZENGERLING (2010, S. 270) stellen dar, dass histologisch die beim Schwein selten vorkommenden Bronchioli respiratorii überwiegend den Bronchioli terminales gleichen. Die Bronchioli respiratorii sind bei den Haussäugetieren mit
20
tiefen Ausbuchtungen, ausgekleidet mit einem flachen Alveolarepithel, ausgestattet.
Aus den terminalen Bronchioli respiratorii zweigen sich bis zu zehn Alveolargänge ab (LIEBICH u. ZENGERLING 2010, S. 270).
LIEBICH u. ZENGERLING (2010, S. 270) weisen darauf hin, dass die Alveolargänge mit ihren Nischen aus einschichtigem Plattenepithel (Alveolarepithel) von außen von einem Netz aus kollagenen und vor allem elastischen Fasern umfasst werden, zusätzlich findet man glatte Muskelzellen. Durch drei- bis fünffache Aufzweigung der Alveolargänge entwickeln sich die Endabschnitte des respiratorischen Systems: die Alveolarsäckchen (Sacculi alveolares). Die Lungenbläschen (Alveoli pulmonis) kleiden die Bronchioli respiratorii, die Ductus und Sacculi alveolares als säckchenförmige Ausstülpungen aus (LIEBICH u. ZENGERLING 2010, S. 270).
Die mittels stereologischer Methoden ermittelte Anzahl der Alveolen beträgt beim Menschen ca. 480 Millionen, ein mm³ Lungenparenchym beeinhaltet folglich ca. 170 Alveolen (OCHS et al. 2004).
LIEBICH u. ZENGERLING (2010, S. 270) erörtern, dass das die Alveolen auskleidende Alveolarepithel bei den Haussäugetieren aus zwei Zelltypen:
Alveolarepithelzellen Typ I (AE I) und AE II besteht. Die AE I sind als dünne, abgeplattete Deckzellen für ca. 95 % der Innenauskleidung der Alveolaroberfläche verantwortlich. Als Bestandteil der Blut-Luftschranke liegen sie der Basalmembran an. AE II sind wesentlich größere Zellen (etwa 10-12 µm) und befinden sich als kleine Gruppen in den Alveolarnischen (LIEBICH u. ZENGERLING 2010, S. 270).
Als Charakteristikum der AE II sind die Lamellenkörper zu sehen, die dicht gepacktes phospholipidreiches Material (intrazellulärer Surfactant) enthalten (LIEBICH u.
ZENGERLING 2010, S. 271). AE II sind für die Produktion, Sekretion, Wiederaufnahme und Recycling des Surfactants verantwortlich (JOBE u. RIDER 1992).
Eine vergleichende Studie von WIRKES et al. (2010) zum intrazellulären Surfactantsystem bei verschiedenen Säugetieren (Etruskische Spitzmaus, Meerschweinchen, Mensch, Rind, Pferd, Kamel, Giraffe, Kaninchen, Hund, Ziege, Ratte und Maus) zeigt, dass das mittlere Volumen der AE II 500-600 µm3 und das
21
mittlere Volumen der Lamellenkörper je AE II 80-100 µm3 bei den meisten Spezies beträgt und nur bei der Etruskischen Spitzmaus, Meerschweinchen und beim Menschen etwas höher liegt. Das mittlere Volumen der AE II stellte sich folglich unabhängig vom Körpergewicht dar. Das Gesamtvolumen der Lamellenkörper und die Anzahl der AE II waren mit dem Körpergewicht korreliert, was eine allometrische Relation bedeutet (WIRKES et al. 2010).
Eine Zellteilung und Transformation von AE II zu AE I bei Verletzungen des Alveolarepithels ist beim Menschen möglich (WELSCH u. DELLER 2010, S. 281).
LIEBICH u. ZENGERLING (2010, S. 271) erklären, dass die benachbarte gemeinsame Wand zweier Alveolen (Septum interalveolare) beidseitig von AE I und II bedeckt wird, die Alveolarepithelzellen liegen ihrerseits einer dünnen Basalmembran auf. Zusätzlich ist subepithelial eine bindegewebige Grundlage, das Lungeninterstitium, mit dichtem Kapillarnetz vorhanden (LIEBICH u. ZENGERLING 2010, S. 271).
Zusammenfassend dient folglich als Blutluftschranke: Surfactant auf der Oberfläche der Alveolarepithelzellen, das Zytoplasma und die Basalmembran des Alveolarepithels, die Basalmembran und Zytoplasma des Endothels der Kapillarwand, das Blutplasma und die Plasmalemm der Erythrozyten (LIEBICH u.
ZENGERLING 2010, S. 271).
2.2 Surfactant
2.2.1 Aufbau, Funktion und Synthese
Das pulmonale Surfactant setzt sich aus ca. 90 % Lipiden, vor allem dem Dipalmitoyl-Phosphatidylcholin (DPPC), und ca. 10% Proteinen zusammen (COCKSHUTT u. POSSMAYER 1992, S. 340).
Zu den Proteinen zählen die Surfactantproteine (SP) A, B, C und D (COCKSHUTT u.
POSSMAYER 1992, S. 342). Die hydrophoben SP B und C haben biophysikalische Eigenschaften (COCKSHUTT u. POSSMAYER 1992, S. 343-344). Eigenschaften der Erregerabwehr sind vor allem SP A (VAN IWAARDEN et al. 1990; VAN IWAARDEN et al. 1991; VAN IWAARDEN 1992; VAN IWAARDEN et al. 1992 a) und D (VAN
22
IWAARDEN et al. 1992 b; HERBEIN u. WRIGHT 2001) zuzusprechen (ausführlich dargestellt in CROUCH und WRIGHT 2001; WRIGHT 2005).
Das sezernierte Surfactant kleidet die intraalveoläre Oberfläche komplett aus, setzt als oberflächenaktive Substanz die Oberflächenspannung an der Luft- Flüssigkeitsgrenze im Inneren der Alveolen um das fünf bis zehn-fache herab (LIEBICH u. ZENGERLING 2010, S. 271), verhindert ein Kollabieren der Alveolen (CLEMENTS 1997; ENHORNING u. HOLM 1993) und trägt somit zur alveolären Stabilität bei (CLEMENTS et al. 1961).
Dieses hochgradig oberflächenaktive Material ermöglicht zudem eine leichte Erweiterung der Alveolen während der Einatmung (GRIESE 1999).
Die Surfactanproteine werden via Transskription, Translation am rauhen endoplasmatischen Retikulum (rER) und posttranslationaler Modifikation vorwiegend am Golgi-Apparat und teilweise auch in den multivesikulären Körperchen in den AE II produziert und modifiziert (MÜHLFELD u. OCHS 2010, S. 4).
Vor der Exozytose wird der Großteil aller intrazellulärer Surfactantkomponenten in den Lamellenkörpern der AE II (OCHS 2010), die nahezu zu den Lysosomen identische, hydrolytische Eigenschaften aufweisen (HOOK u. GILMORE 1982), zusammengesetzt und gelagert (OCHS 2010). Als Unterschied zu „echten“
Lysosomen besitzen die Lamellenkörper eher eine Speicherungs- und Sekretionsfunktion als dass sie am Abbau von Strukturen beteiligt sind (WEAVER et al. 2002).
WEAVER et al. (2002) erörtern, dass die Lamellenkörper (Größe: 1-2 µm) endozytotisch bei saurem pH-Wert (5,5) aktiv sind. Die Phospholipide in den Lamellenkörpern sind dicht gepackt und in konzentrischen membranartigen Blättern angeordnet. DPPC stellt die Hauptkomponente der zweischichtigen Blätter dar (WEAVER et al. 2002), welches unter allen bekannten Phospholipiden am stärksten oberflächenaktiv ist (VELDHUIZEN et al. 1998).
OCHS (2010) beschreibt, dass ausgehend von den AE II die Exkretion mittels Exozytose in die wässrige Hypophase des Alveolarraumes erfolgt. Ein bestimmter Surfactantsubtyp, der als Lamellenkörper-ähnliche Struktur angesprochen werden kann, verbindet sich mit dem Surfactantprotein A unter Bildung eines gitterförmigen
23
Komplexes, der als Tubuläres Myelin bezeichnet wird (OCHS 2010).
Man nimmt dabei an, dass sich SP-A in die äußeren Ecken des Gitters setzt (VOORHOUT et al. 1991). Dieser Komplex ist vermutlich als Vorläufer des Surfactantfilms zu sehen, von dem ausgehend nun der eigentliche Surfactantfilm aufgebaut werden kann (HAWGOOD u. POULAIN 2001; OCHS 2010).
Sezerniertes Surfactant liegt in der Hypophase in Form von oberflächenaktiven Vorstufen und oberflächeninaktiven Abbauprodukten vor (UEDA et al. 1994; GROSS u. NARINE 1989 a). Unilamelläre Vesikel (ulv) sind als als „verbrauchte“ (GROSS u.
NARINE 1989 a) bzw. inaktive Surfactantsubtypkomponenten zu sehen, die in AE II recycelt oder abgebaut werden oder von Alveolarmakrophagen aufgenommen und abgebaut werden können (MÜHLFELD u. OCHS 2010, S. 4).
Die Surfactantsubtypen tubuläres Myelin (tb) und lamellenkörperartige Vesikel (lbl) stellen sich hingegen als aktive Surfactantkomponenten dar (OCHS 2010). Durch Dichtegradientenzentrifugation von intraalveolärem Surfactant, gewonnen aus BALF, lassen sich small aggregates (SA) und large aggregates (LA) unterscheiden (GROSS et al. 2000). SA enthalten die inaktiven Surfactantsubtypen, wie ulv (GROSS u. NARINE 1989 a; OCHS et al. 2006), und LA die aktiven Surfactantsubtypen wie lbl und tm (SCHMIEDL et al. 2003). Das Verhältnis von SA zu LA (SA/LA ratio) spiegelt die biophysikalische Aktivität des intraalveolären Surfactants wieder (OCHS 2010). So findet sich beim Ischämie/Reperfusion- induzierten Lungenschaden (OCHS 2010), Lungentransplantation (HOHLFELD et al.
1998) bzw. beim Akuten Atemnotsyndrom (VELDHUIZEN et al. 1995) eine verschlechterte biophysikalische Funktion des Surfactants im Sinne einer erhöhten SA/LA ratio.
2.2.2 Die Rolle des Surfactants im angeborenen Immunsystem
Die SP A und D gehören zu der Proteinfamilie der Kollektine, die dem angeborenen Immunsystem zugeordnet sind (MÜHLFELD u. OCHS 2010, S. 3).
Die erste Etappe der Wirtsabwehr wird durch das angeborene Immunsystem bewerkstelligt, dieses wirkt als Brücke bis die adaptive Immunreaktion greifen kann
24 (HAAGSMANN et al. 2008).
Es ist ein „phylogenetisch altes System“, das mit Keimbahn-kodierten Proteinen, wie den Lysozymen, Kollektinen und dem Komplementsystem arbeitet (WRIGHT 2004).
Zusätzlich sind noch physikalische Komponenten der Wirtsabwehr, wie die Epithelbarrieren im Respirationstrakt und die mukoziliäre Clearance, zu erwähnen (ROHMANN et al. 2011).
Als Zellfraktionen des angeborenen Immunsystems gelten Dendritische Zellen, Epithelzellen, Basophile und Eosinophile Granulozyten, Natürliche Killerzellen und Mastzellen sowie die phagozytierenden Zellen wie Neutrophile Granulozyten, Monozyten und Makrophagen (ROHMANN et al. 2011).
Da das adaptive Immunsystem bei Neugeborenen noch nicht ausgebildet ist, ist das angeborene Immunsystem besonders wertvoll (HAAGSMANN et al. 2008).
WRIGHT (2004) erklärt, dass die Kollektine eine N-terminale, kollagenartige-Region und eine C-terminale Lektin-Domäne besitzen. Die Lektin-Domäne ist für den Bindungsvorgang mit wirtsfremden Oligosacchariden auf der Oberfläche von Krankheitserregern (Bakterien und Viren) verantwortlich (WRIGHT 2004).
Dieser Vorgang ist auch als Opsonisierung bekannt, da die Aufnahme durch Phagozyten erleichtert wird (VAN IWAARDEN et al. 1991; WRIGHT 2004).
Eine Studie mit SP-A defizienten Mäusen zeigte nach einstündiger, intratrachealer Infektion mit Pseudomonas aeruginosa eine wesentlich geringere bakterielle Elimination (Phagozytose durch Makrophagen) als der Wildtyp (LEVINE et al. 1998).
WRIGHT (2004) nennt, dass in in vitro Studien die Aktivität vieler Zellen des Immunsystems durch Kollektine vermittelt wird, obwohl ein genauer Wirkmechanismus häufig nicht klar ist. Phagozytose, Chemotaxis, Zytokinregulation und die Bildung freier Sauerstoffradikale durch verschiedenste Abwehrzellen werden durch SP-A und SP-D beeinflusst (WRIGHT 2004).
Des Weiteren konnte bei SP-A und SP-D eine antimikrobielle Wirkung (Hemmung des Wachstums von bestimmten gramnegativen Bakterien) belegt werden (WU et al.
2003).
HAAGSMANN et al. (2008) erklären, dass Kollektine grundsätzlich mit zahlreichen Bakterien reagieren, wobei bei gram-negativen Bakterien die Lipopolysaccharide der
25
Membranen einen Hauptangriffspunkt darstellen. Bei gram-positiven Bakterien sind als Hauptangriffspunkte die Lipoteichonsäuren und Peptidoglykane zu nennen (HAAGSMANN et al. 2008).
GIANNONI et al. (2006) wiesen in einer Studie bei Mäusen darauf hin, dass SP-A und SP-D die Elimination von Pseudomonas aeruginosa aus dem Lungenparenchym verstärken. Dies geschieht durch eine modulierte Entzündungsreaktion und einer stimulierten Aufnahme durch Alveolarmakrophagen (GIANNONI et al. 2006).
Auch die adaptive Immunantwort (T-Lymphozyten und Dendritische Zellen) wird durch Kollektine (SP A und D) beeinflusst (WRIGHT 2004).
Des Weiteren ist auch den Surfactantlipiden eine immunologische Rolle zuzusprechen: sie verstärken Phagozytose und Erregerelimination, modifizieren die Bildung freier Radikale und Lymphozytenproliferation (WRIGHT 1997).
2.2.3 Surfactantdysfunktion
Einer der Gründe für die Entstehung einer Surfactantdysfunktion ist die Ausschwitzung von Plasmaproteinen in den Alveolarraum (SEEGER et al. 1993 a;
PARK et al. 1998; KEOUGH et al. 1988; CURRIE et al. 1998 a). Des Weiteren findet man bei pathologischen Prozessen wie Asthma von eosinophilen Granulozyten freigesetzte, zytotoxische Proteine wie das eosinophilic cationic protein (ECP) (BOUSQUET et al. 1990; HOHLFELD et al. 2004), für das auch ein deutlicher Zusammenhang zur Surfactantinaktivierung gezogen werden konnte (HOHLFELD et al. 2004).
SCHMIEDL et al. (2004) zeigten in diesem Zusammenhang, dass eine Mischung von Alveofact®, einem exogenen natürlichen bovinen Surfactant, mit ECP eine signifikante Größenreduktion der aktiven Surfactantsubtypen und einen signifikanten Anstieg der Volumenfraktion der inaktiven Surfactantsubtypen bewirkt (SCHMIEDL et al. 2004).
Diese Verschiebung von aktiven zu inaktiven Surfactant-Subtypen konnten auch in anderen Studien im Rahmen von akutem Lungenschaden und Lungentransplantation (MAITRA et al. 2002) und Akutem Atemnotsyndrom (VELDHUIZEN et al. 1995)
26 gezeigt werden.
ENHORNING (2008) erklärt, dass Plasmaproteine nur schwach hydrophob und potenziell überall im Flüssigkeitsfilm der Atemwege vorhanden sind. Sie sind bei der Exspiration nur geringgradig an den Surfactantfilm adhäriert und verhindern dennoch, dass die amphiphilen Phospholipide näher zusammen rücken, wodurch die Oberflächenspannung physiologischer Weise gesenkt werden würde (ENHORNING 2008).
In der Studie von CURRIE et al. (1998 b) mit Ozon ausgesetzten Mäusen zeigte sich eine signifikante Verschlechterung der Surfactantfunktion. Nach Entfernung der wasserlöslichen Proteine und anderer Substanzen stellte sich die Funktionalität wieder ein (CURRIE et al. 1998 b).
Eine verschlechterte Surfactantfunktion zeigte sich auch in den Versuchen von VAN SCHAIK et al. (1997) mit Mäusen, die mit dem Respiratorischen Synzytial Virus infiziert worden waren, wobei hier die eingedrungenen Proteine nicht als einzige Ursache für eine reduzierte Funktion diskutiert wurden. Es wurde auch die Hydrolyse von Surfactantbestandteilen durch Mediatoren von Entzündungszellen diskutiert (VAN SCHAIK et al. 1997).
Bei menschlichen Asthmapatienten zeigte sich ein ähnliches Bild: die BALF wies eine deutlich bessere Funktion nach Entfernung der wasserlöslichen Inhibitoren (Proteine und andere Substanzen) auf (JARJOUR u. ENHORNING 1999).
Eine Studie von WRIGHT et al. (2001) ergab nach Infektion von Mäusen mit Pneumocystis carinii erhöhte Oberflächenspannungen und erhöhte Protein- Phospholipid-Verhältnisse in der BALF (WRIGHT et al. 2001).
Bei asthmatischen Brown Norway Ratten konnte in der Studie von SCHMIEDL et al.
(2003) gezeigt werden, dass sowohl die minimale Oberflächenspannung als auch die Lungenresistance signifikant erhöht war. Des Weiteren waren die inaktiven Surfactantsubtypen stärker vertreten, was eine gesteigerte Konversion von aktiven zu inaktiven Surfactantsubtypen nahelegte. Eine Interaktion zwischen Proteinen und Konvertase oder eine Inaktivierung von SP-A wurden diskutiert. Ursächlich können dafür entzündungsbedingte proteinreiche Exsudate sein (SCHMIEDL et al. 2003).
27
2.2.4 Die Rolle des Surfactants bei spezifischen Erkrankungen des Menschen bzw. in der tierexperimentellen Grundlagenforschung Asthma (vgl. Abb. 2.2)
JARJOUR u. ENHORNING (1999) beschreiben, dass bei Patienten mit Asthma die Surfactantdysfunktion wahrscheinlich primär durch die Entzündungsreaktion, verknüpft mit dem Einströmen von Plasmaproteinen in den Alveolarraum, ausgelöst wird.
Diese Proteine schädigen massiv die oberflächenaktiven Eigenschaften des Surfactants (JARJOUR u. ENHORNING 1999). Als zukünftiger, therapeutischer Ansatz wäre die Hydrolyse dieser Proteine ohne eine Schädigung der Epithelien der Lunge anzustreben (ENHORNING 2008).
In einer Studie von HOHLFELD et al. (1999 a) kam es 24 Stunden nach der Allergenexposition von Asthmapatienten zu einem signifikanten Anstieg der eosinophilen Granulozyten, der Proteine, der SA/LA ratio und der minimalen Oberflächenspannung in der BALF. Hier wird eine stärkere Konversion der LA zu SA vermutet. Bei Asthmapatienten sind die SP-A Level reduziert, so dass eine abgeschwächte Wirkung des SP-A auf die Konversion der aktiven Surfactantsubtypen zu erwarten ist. Auch an dieser Stelle wurden ursächlich Entzündungsproteine und andere inflammatorische Produkte angenommen (HOHLFELD et al.1999 a).
Untersuchungen von ENHORNING et al. (2000) erörtern die Effekte einer verringerten Temperatur auf die Surfactantfunktion, die zusätzlich durch entzündliche Prozesse beeinflusst wird. Daraus ließe sich eine mögliche Ursachenerklärung für den erhöhten Widerstand in den Atemwegen bei Hyperventilation von Asthmapatienten bei kaltem Wetter ableiten (ENHORNING et al. 2000).
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Abb. 2.2: Surfactant bei belastungsinduziertem Asthma (Abbildung modifiziert nach ENHORNING et al. 2000), Schwarze Linien: Mechanismen, die die Atemwegsobstruktion verursachen, gestrichelte Linien: Mechanismen, die die Atemwegsobstruktion mildern (ENHORNING et al. 2000)
Atemnotsyndrom des Erwachsenen (Adult Respiratory Distress Syndrome, ARDS) bzw. tierexperimentelle Studien in diesem Rahmen
HAMM et al. (1996) subsummieren, dass beim Atemnotsyndrom des Erwachsenen verschiedenste Ätiologien beschrieben worden sind: Traumata, Verbrennungen, akute Pankreatitis; Sepsis, Pneumonie, etc. Der Gasaustausch in den Alveolen ist akut, diffus und hochgradig gestört, was sich in einem respiratorischen Versagen manifestiert. Auch bei der Pathogenese dieser Erkrankung spielen Veränderungen im Surfactantsystem eine bedeutende Rolle (HAMM et al. 1996).
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Eine Störung der Surfactantfunktion (Erhöhung der minimalen Oberflächenspannung) und eine veränderte Zusammensetzung der Phospholipide sind in verschiedenen Tiermodellen bspw. beim Hund (LIAU et al. 1987) oder bei Meerschweinchen (TAHVANAINEN und HALLMANN 1987) diskutiert worden (ausführlich dargestellt in HAMM et al. 1996).
LEWIS et al. (1994) lösten beim Schaf einen Septikämie-bedingten akuten Lungenschaden aus, der zu einer Erhöhung der SA/LA-Ratio und zu einer Reduktion der SP A, B und C führte (LEWIS et al. 1994).
Lungentransplantation/ Ischämie/Reperfusion-induzierter Lungenschaden
Der Ischämie/Reperfusion-induzierte Lungenschaden kann in schweren Fällen nach Lungentransplantation zu einem Transplantatversagen führen (DE PERROT et al.
2003), was entsprechende Mortalitäten (CHRISTIE et al. 2005) bedingt. Unter anderen Ursachen führen mechanische Ventilationen, Pneumonien, Hypotensionen und Traumata zum Ischämie/Reperfusion-induzierten Lungenschaden (DE PERROT et al. 2003).
Eine Studie von CASALS et al. (1998) belegt in Lungentransplantationsversuchen bei Hunden eine signifikant erniedrigte SP A Konzentration und erhöhte Konzentrationen von C-reaktivem Protein (ein Akute- Phase- Protein) nach Reperfusion (CASALS et al. 1998).
HOHLFELD et al. (1998) zeigten, dass die SA/LA ratio bei Patienten mit Transplantat signifikant höher und die Oberflächenaktivität signifikant niedriger war als bei gesunden Probanden. Die biophysikalischen Beeinträchtigungen des Surfactants schienen zu persistieren, was eine funktionelle Beeinträchtigung der AE II als Ursache haben könnte (HOHLFELD et al. 1998).
HAMM et al. (1996) subsummierten einen Zusammenhang zwischen der verschlechterten Funktion der AE II nach Lungentransplantationen und der Ischämiezeit. Eine Surfactantsubstitution könnte die Funktion der AE II nach Lungentransplantationen durch eine Feedbackhemmung erhalten (HAMM et al.
1996).
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Eine tierexperimentelle, transplantationsassoziierte Studie von KNUDSEN et al.
(2011) zeigte, dass nach Ischämie und Reperfusion die Lamellenkörper in den AE II zwar signifikant reduziert, aber vergrößert waren. Dies könnte auf eine gesteigerte Neusynthese oder ein verstärktes Recycling von inaktiven Surfactantkomponenten hinweisen. Eine vermehrte Exozytose von Lamellenkörpern in die Alveole wurde vermutet, die den Verlust an intraalveolärem Surfactant zu kompensieren vermochte (KNUDSEN et al. 2011).
Auch die Studie von MÜHLFELD et al. (2010) zum Ischämie/Reperfusion-induzierten Lungenschaden bei Ratten zeigte einen Anstieg der inaktiven Surfactantsubtypen nach Ischämie/Reperfusion (Ratten ohne exogene Surfactantbehandlung), jedoch nicht bei mit exogenem Surfactant behandelten Ratten. Korreliert war das Auftreten der inaktiven Surfactantsubtypen mit einer herabgesetzten Oxygenierung und einer Bildung von intra-alveolären Ödemen. Hintergrund der Studie war die Frage, in wie weit eine exogene Surfactanapplikation den endogenen Surfactantpool beeinflusst.
Die Hypothese war, dass sich eine prä-ischämische exogene Surfactantsubstitution vor allem auf die Stabilisierung und Erhöhung des aktiven, endogenen intra- alveolären Surfactantpool auswirkt. Ödembildung und Schäden an der Blut- Luftschranke könnten dadurch reduziert werden (MÜHLFELD et al. 2010).
In einer vorangegangenen Studie von MÜHLFELD et al. (2009) wurde bereits gezeigt, dass bei Ratten im Falle des durch Ischämie/Reperfusion induzierten Lungenschadens die prä-ischämische, exogene Surfactantgabe die Bildung von intraalveoläre Ödemen und den Schaden an der Blut-Luftschranke mildern könnte (MÜHLFELD et al. 2009).
Als weiterer therapeutischer Ansatz wird auch eine Kombinationstherapie aus exogenem Surfactant und Keratinozyten-Wachstumsfaktor (Palmiferin, ΔN23-KGF) im Rattenmodell in Erwägung gezogen (SADOVSKI et al. 2008; MÜHLFELD et al.
2010).
Durch Therapie mit Keratinozyten Growth Factor (Palmiferin, ΔN23-KGF) vor der Lungenexplantation kann die intraalveoläre Ödembildung nach einer Transplantation signifikant reduziert werden (SADOVSKI et al. 2008).
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In einer tierexperimentellen Studie mit Schweinen von INCI et al. (2011) diente Surfactant der Beurteilung der Qualität des Lungenparenchyms für eine Transplantation nach Herztod. Mittelfristig kann die Nutzung der Surfactantqualität als Marker möglicherweise den Spenderpool erhöhen. In dieser Studie zu Surfactantalterationen nach Herztod wurde bei Hausschweinen belegt, dass nach zwei Stunden warmer Ischämiezeit die BALF- Proteinkonzentration und die Oberflächenspannung signifikant erhöht waren und die Sauerstoffsättigung signifikant niedriger war (INCI et al. 2011).
2.3 Surfactant bei Tieren
In den Ausführungen von BERNHARD et al. (2004) wird erläutert, dass die Strömung der Luft grundsätzlich bei Säugetieren während des Atmungsvorgangs in zwei Richtungen erfolgt, wird allerdings in den peripheren Strukturen, wie bspw.
Bronchiolen und Alveolen, herabgesetzt. Kleine Partikel (<1 µm) können dadurch die Bronchiolen passieren und sich in den Alveolen absetzen, so dass eine erste Phase der Wirtsabwehr durch v.a. Alveolarmakrophagen, SP-A und (Phospholipid-) Regulatoren, wichtig ist. Beim Vogel dagegen bleibt die Luftströmung durch Parabronchen, Atria und die gaswechselnden Kapillaren konstant und kontinuierlich während der In- und Exspiration. Gewährleistet wird dies einerseits durch das konstante Öffnen und Schließen des Klappensystems zwischen Mesobronchen/Luftsäcken und Parabrochen und andererseits durch einen während der In- und Exspiration wechselnden cranio-caudalen Druckgradienten (BERNHARD et al. 2004).
BERNHARD et al. (2001 a) erklären, dass die Oberflächenspannung von Säugersurfactant sich von Vogelsurfactant beträchtlich unterscheidet. Während beim Schwein minimale Oberflächenspannungen von kleiner 5 mN/m unter dynamischer Kompression erreicht werden, sind diese bei Lungen von Enten und Hühnern aufgrund ihres tubulären Aufbaus wesentlich höher (BERNHARD et al. 2001 a).
Die Studie von BERNHARD et al. (2001 a) zeigte auch, dass der Surfactantsubtyp tm im Surfactant von Enten und Hühnern gänzlich fehlte. Des Weiteren konnten SP-A
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und SP-C im Surfactant von Enten und Hühnern nicht nachgewiesen werden, während SP-B in etwa gleichen (Huhn) oder in höheren Konzentrationen (Ente) als beim Schwein vorkamen (BERNHARD et al. 2001 a).
BERNHARD et al. (2004) erklären, dass SP-B u.a. für eine schnelle Oberflächenadsorption des Surfactant wichtig ist und daher sowohl in Säuger- als auch in Vogellungen benötigt wird. Für die geringe Oberflächenspannung in den Alveolen und einer Reintegration von Phospholipiden in den Surfactantfilm nach starker Kompression ist SP-C verantwortlich. Solche Vorgänge sind in der rigiden, tubulären Vogellunge von untergeordneter Bedeutung (BERNHARD et al. 2004).
Allerdings merkt ZENG et al. (1998) an, dass SP A in den Epithelzellen der Mesobronchien von Hühnerküken (Tag 3 nach Schlupf) nachweisbar war. In den Epithelzellen der peripheren Luftwege (inklusive Parabronchien und Luftkapillaren) konnte SP A jedoch nicht detektiert werden. Die Studie sah darin einen Hinweis, dass SP A für die Lagerung, Verarbeitung und Funktion von Surfactant in Vogellungen nicht wesentlich ist (ZENG et al. 1998).
Auf elektronenmikroskopischer Ebene stellt sich lavagierter Surfactant von Enten und Hühnern als oligo- und multilamelläre Struktur dar, während porziner Surfactant Lamellenkörper, amorphes und granuläres Material und tm aufweist (BERNHARD et al. 2001 a).
Eine kalifornisch-deutsche Studie von SPRAGG et al. (2004) berichtet, dass die BALF von Flossenfüßern signifikant höhere Phospholipidkonzentrationen und einen höheren Phosphatidylcholinanteil hat, wodurch die Reexpansion der Alveolen nach Tieftauchgängen optimiert wird. Gelelektrophoretische Messungen ergaben bei Elefantenseelöwen im Vergleich zum Menschen signifikant höhere Konzentrationen an SP-B. Zu berücksichtigen ist jedoch, dass bei Meeressäugern nur die cranialen Lungenlappen lavagiert werden konnten. Die LA Surfactantfraktion und die SP-B und -C liegen in höheren Konzentrationen bei Elefantenseelöwen und kalifornischen Seelöwen als beim Menschen vor. Die LA Fraktion trägt mit ihren aktiven Surfactantsubtypen maßgeblich zur Oberflächenspannungsreduktion bei. Die minimale Oberflächenspannung ist allerdings beim Elefantenseelöwen signifikant größer als bei anderen Flossenfüßern und beim Menschen. Erklärend könnte ein
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höherer Anteil an Neutralfetten genannt werden (SPRAGG et al. 2004).
Summa summarum lassen sich bei den verschiedenen Vertebratenspezies und während der postnatalen Entwicklung Anpassungsprozesse bezüglich der Zusammensetzung des Surfactants erkennen, die durch die anatomischen und physiologischen Begebenheiten vorgegeben werden (SPRAGG et al. 2004).
POSTLE et al. (2001) subsummierten, dass einfach ungesättigte, anionische Phospholipide ein gemeinsames Merkmal von Säugetiersurfactant sind. Untersucht wurde Surfactant vom Menschen und von verschiedenen Tierarten wie Kaninchen, Meerschweinchen und Ratten (POSTLE et al. 2001).
2.4 Surfactant beim Schwein
Die Studie von BERNHARD et al. (1997) belegt, dass Surfactant der luftleitenden Atemwege (Trachealaspirate) beim Schwein ähnliche Phospholipid- und Phosphatidylcholinkonzentrationen wie Surfactant aus BALF zeigt, was darauf hinweist, dass auch trachealer Surfactant aus den Alveolen stammt. In den porzinen Trachealaspiraten sind höhere minimale und maximale Oberflächenspannungen als in der BALF zu verzeichnen. Im Gegensatz dazu findet man in Pharyngealaspiraten menschlicher, neugeborener Säuglinge große Mengen an oberflächenaktiven Surfactants. Beim Schwein wurden die SP-B und C nicht und SP-A nur in geringen Konzentrationen im porcinen, trachealen Surfactant nachgewiesen, wobei der Gesamtproteingehalt erhöht war. Surfactant der luftleitenden Wege könnte bei der mukoziliären Clearance eine wichtige Rolle spielen. Es wird vermutet, dass reduzierte oberflächenaktive Eigenschaften bei einer pathologisch-veränderten mukoziliären Clearance mit chronisch-eitrigen Prozessen im Zusammenhang stehen (BERNHARD et al. 1997).
SOERENSEN et al. (2005) zeigten, dass bei Schweinen mit akuter und chronischer Bronchopneumonie eine höhere SP-D- Immunreaktivität im Surfactant vorkommt und dass SP-D in bronchusassoziiertem, lymphatischem Gewebe mit Dendritschen Zellen interagierte. SP-D wird daher als Schnittstelle zwischen angeborenem und erworbenem Immunsystem eingestuft (SOERENSEN et al. 2005).
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In einer umfassenden Studie von NIENHOFF (1998) wurde die BALF von Kontrollschweinen und Schweinen mit akuten Pneumoniesymptomen untersucht. Die Alkalische Phosphatase war bei den erkrankten Schweinen signifikant erhöht, die Laktatdehydrogenase und die Proteinkonzentrationen wiesen keine signifikanten Unterschiede auf (NIENHOFF 1998).
Eine deutsch-niederländische Studie von RAU et al. (2004) unterstreicht die bessere Oberflächenaktivität des Surfactants neugeborener Saugferkel im Vergleich zu älteren Schweinen.Bei den Saugferkeln konnten erhöhte Konzentrationen an SP-B, C und Phospholipiden (Phosphatidylcholin 16:0/14:0 bzw. 16:0/16:1) nachgewiesen werden. Mit zunehmendem Alter kam es zu einem Rückgang der Phosphatidylcholin- 16:0/16:0-Konzentationen. Dieses Phospholipid, DPPC, stellte unter den Surfactantphospholipiden die bedeutendste Substanz dar, die die minimale Oberflächenspannung in der Endexspiration minimiert. Eine hohe Konzentration an Arachidonsäurehaltigen-Phospholipiden im Surfactant der Saugferkel stimulierte den alveolären Eicosanoidmetabolismus. Grundsätzlich zeigte die Studie an Schweinen unterschiedlichen Alters eine Anpassung auf molekularer Ebene an die sich ändernden, respiratorischen Begebenheiten während der Lungenentwicklung (RAU et al. 2004).
Im Minipig-Modell von HOHLFELD et al. (1999 b) wiesen nach Ischämie und Reperfusion der linken Lunge Schweine ohne exogene Surfactantbehandlung eine deutlich höhere SA/LA ratio und höhere minimale Oberflächenspannungen im Surfactant auf. Reperfusionsbedingt kam es als Folge der Störung der Funktion des Kapillarendothels zu einem Einstrom von Plasmaproteinen in den Alveolarraum.
Plasmaproteine wie Albumin, Fibrinogen und Hämoglobin wurden hauptsächlich für die beeinträchtigte Surfactantfunktion verantwortlich gemacht (HOHLFELD et al.
1999 b).
Bei an Pneumonie erkrankten Schweinen in der Dissertation von DELBECK (1995) war die Anzahl der neutrophilen Granulozyten mit der Gesamtzellzahl in der BALF korreliert bzw. stieg mit dem Logarithmus der Gesamtzellzahl an. Erklärend wurde hier die stark gehäufte Invasion von neutrophilen Granulozyten aus dem Blut genannt (DELBECK 1995).
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Die Anzahl der polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten dient als sensitiver Marker zur Differenzierung von gesunden und lungenkranken Schweinen (GANTER u. HENSEL 1997).
2.5 Erkrankungen des Respirationstrakts beim Schwein
Im Jahr 2011 wurden in Deutschland rund 59,7 Millionen Schweine geschlachtet, was einer Schweinefleischerzeugung von etwa 5,6 Millionen Tonnen entspricht (STATISTISCHES BUNDESAMT 2013).
Folglich führen Erkrankungen zu massiven wirtschaftlichen Verlusten, die Verbraucherschutz und die wirtschaftliche Existenz gefährden (HENNIG-PAUKA 2007).
In einer spanischen Studie von CASAL et al. (2007) setzten rund 58 % der untersuchten Betriebe (n=62) antimikrobielle Substanzen prophylaktisch bei Mastschweinen ein. 26 % der Farmen verwendeten mindestens zwei Wirkstoffe. 92 Farmen gaben unter tierärztlicher Anleitung bei respiratorischen Symptomen Antibiotika ohne zuvor eine gesicherte Krankheitsdiagnose zu stellen (CASAL et al.
2007).
2.5.1 Porcine Respiratory Disease Complex (PRDC)
Es handelt sich um einen Erkrankungskomplex mit multiplen Infektionen des pozinen Respirationstraktes, der ca. 6-24 Wochen alte Schweine betrifft (GROSSE-BEILAGE et al. 2013, S. 235).
Stallklima (Temperaturschwankungen, hohe Luftfeuchte und Schadgaskonzentration wie bspw. Kohlenstoffdioxid, Ammoniak und Methan), Management (Hygienstatus) (Fütterung, Herdengröße, Haltungsbedingungen), Genetik und bestehende Erkrankungen beeinflussen den Erkrankungsfortschritt (WHITE 2011 a).
Genannte nicht-infektiöse Faktoren sind entscheidend für die Initialisierung der Respirationserkrankung, ihnen gegenüber steht eine Vielzahl von viralen und bakteriellen Erregern als infektiöse Agentien (OPRIESSNIG et al. 2011).
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Als virale Erreger sind das Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, das Porzine Influenzavirus (H1N1, HN2, H1N2) und in einigen Ländern auch das Porzine Herpesvirus 1 mit hoher Relevanz und bspw. das Porzine Circovirus Typ 2 mit geringerer Relevanz zu nennen (OPRIESSNIG et al. 2011). Als bakterielle Erreger mit hoher Relevanz gelten Mycoplasma hyopneumoniae, A.pp., Bordetella bronchiseptica, Actinobacillus suis und Salmonella spp. sowie Hämophilus parasuis, Trueperella pyogenes, Mycoplasma hyorhinis, Pasteurella multocida und Streptococcus suis mit eher untergeordneter Bedeutung (OPRIESSNIG et al. 2011).
Mycoplasma hyopneumoniae und das Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus nehmen aufgrund ihrer Nachweishäufigkeit im Zusammenhang mit dem PRCD eine Sonderstellung ein (THACKER et al. 1999).
Das klinische Bild ist dominiert durch Husten, angestrengter Atmung, Fieber, Anorexie, Lethargie, Nasen- und Augenausfluss, Hautverfärbungen im Bereich der Extremitäten, Gewichtsverlust, Todesfälle und letztlich verschlechterter Mastleistung (WHITE 2011 b).
2.5.2 Porzine Pleuropneumonie Verbreitung und Bedeutung
Grundsätzlich ist von einer weltweiten Verbreitung der Erkrankung auszugehen, die eine beträchtliche wirtschafliche Relevanz hat (ZIMMERMANN u. PLONAIT 2004, S.
131).
In den letzen Jahren nimmt die Infektion mit A.pp. in Betrieben mit intensiver Schweineproduktion eine zunehmende Rolle ein (HEINRITZI 2006, S. 144).
Im Jahr 1964 wurde in einer umfassenden Studie von R. Shope über die experimentelle Übertragung, Ätiologie und Pathologie der ansteckenden Lungenbrustfellseuche berichtet (SHOPE 1964).
Gemäß einer spanischen Studie lag bei etwa 27 % der Schlachtschweine eine Pleuritis vor, die gemäß Scoring-System zu ca. 50 % auf eine A.pp. Infektion zurückzuführen war (FRAILE et al. 2010).
Zunächst wurde das Bakterium als Hämophilus pleupneumoniae bezeichnet.
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Nachdem die DNA-Homologie zu Actinobacillus lignieresii bekannt wurde, wurde das Bakterium in Actinobacillus pleuropneumoniae umbenannt (GOTTSCHALK 2012, S.
653).
Die infektionsbedingte Pneumonie bringt massive wirtschaftliche Konsequenzen mit sich: eine schlechte Futterverwertung von chronisch infizierten Tieren und hohe Kosten für Arzneimittel (STRAW et al. 1985), darunter Breitspektrumantibiotika (SANFORD u. JOSEPHSON 1981) und eine erhöhte Mortalität (30- 50%) (QUINN et al. 2002, S. 133).
Ätiologie und Pathogenese
A.pp., der Erreger der ansteckenden Lungen- und Brustfellentzündung des Schweines (EWERS u. WIELER 2011, S. 229), ist ein gramnegatives, amotiles und stäbchenförmiges Bakterium (EWERS u. WIELER 2011, S. 226). Taxonomisch gehört es in die Familie der Pasteurellaceae (EWERS u. WIELER 2011, S. 221).
Die Nikotinamiddinukleotid (NAD) abhängigen Biovar-1 zugeordnete Stämme gelten als virulenter als die NAD unabhängigen Biovar-2 zugeordneten (EWERS u. WIELER 2011, S. 229).
Eine Unterteilung erfolgt anhand der Serovare, Biovare und des Vorkommens von ApX-Toxinen, es sind 15 Serovartypen bekannt (EWERS u. WIELER 2011, S. 229), alle Serovare besitzen das Apx IV Toxingen(EWERS u. WIELER 2011, S. 228). Die Serotypen (1, 5, 9, und 11) mit den Apx Toxingenen I und II und Serotyp 10 mit Apx I zeigen eine stärkere Virulenz als andere Serovartypen(EWERS u. WIELER 2011, S.
229).
Es sind zahlreiche Virulenzfaktoren, wie Exotoxine, die Ausbildung einer Kapsel, Lipopolysaccharide, Typ-4-Fimbrien und äußere Membranproteine, bekannt (EWERS u. WIELER 2011, S. 228).
Als weitere bedeutsame virulenzfördernde Eigenschaft ist die Eisengewinnung aus porzinem Hämin und Hämoglobin (ARCHAMBAULT et al. 2003), aus Hämoglobin (BÉLANGER et al. 1995) und aus Transferrin (GERLACH et al. 1992) zu nennen (ähnlich dargestellt in HENNIG-PAUKA 2007).
Für das Weiterleben nach Phagozytose in Makrophagen sind bspw. die Kohlenwasserstoffbestandteile von Kapsel und Lipopolysacchariden, die freie
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Sauerstoffradikale binden, essentiell (EWERS u. WIELER 2011, S. 230).
Kapselpolysaccharide und/oder Lipopolysaccharide sind wesentliche Faktoren für die Serumresistenz (EWERS u. WIELER 2011, S. 230).
Serotypendifferenzierung erfolgt mittels Bestimmung von Kapsel- und Lipopolysacchariden (GOTTSCHALK 2012, S. 654). Die Oligosaccharidkernregion der Lipopolysaccharide stellt einen wichtigen Adhäsionsfaktor für A.pp. an Wirtszellen dar (GOTTSCHALK 2012, S. 656).
EWERS u. WIELER (2011, S. 228) beschreiben, dass die RTX-Toxine (repetitive glyzinreiche Sequenzen) für die massive Entzündungsreaktion und den Gewebsschaden maßgeblich verantwortlich sind. Das Bakterium erzeugt je nach Serotyp bis zu vier verschiedene RTX-Toxine (Apx I-IV), die den Ca2+-abhängigen, porenbildenden, zytolytischen Proteintoxinen gramnegativer Bakterien zugeordnet werden. Apx I hat stark hämolytische und zytotoxische Eigenschaften, Apx II zeichnet sich durch schwächere hämolytische und moderat zytotoxische Eigenschaften aus.
Apx III ist nicht an der Hämolyse beteiligt, gilt aber als stark zytotoxisch. Eine schwache Hämolyse löst auch das Apx IV-Toxin aus, Zytotoxizität wurde bisher nicht getestet, was vor allem auf einer fehlenden in-vitro-Produktion zu begründen ist (EWERS u. WIELER 2011, S. 228).
EWERS u. WIELER (2011, S. 230) erörtern, dass RTX-Toxine die Funktion von Makrophagen und polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten beeinträchtigen.
Chemotaktische und phagozytotische Funktionen der Makrophagen werden bereits in sublytischen Dosen beeinflusst. Der oxidative Stoffwechsel in Makrophagen und polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten wird angeregt. ApX I und III erweisen sich in hohen Dosen hochgradig toxisch und ApXII moderat toxisch für Alveolarmakrophagen und polymorphkernige neutrophile Granulozyten (EWERS u.
WIELER 2011, S. 230).
Obwohl es zum Ausbruch der Erkrankung keiner prädisponierenden Faktoren braucht, besteht dennoch eine Verbindung von Stressfaktoren mit erhöhten Erkrankungsinzidenzen (EWERS u. WIELER 2011, S. 229).
Der Krankheitsausbruch und die Erregerverbreitung werden durch hohe Tierzahlen, ungünstiges Stallklima mit schwankenden Umgebungstemperaturen und hoher
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relativer Luftfeuchte mit ungenügender Ventilation bevorteilt (GOTTSCHALK 2012, S.
658).
Bei der Erregerverbreitung spielen Aerosole und der direkte Tierkontakt die wesentliche Rolle, wobei beim Schwein die Tonsillen den Hauptkolonisationsort darstellen (MACINNES et al. 2008).
Als Zielzellen gelten vor allem die Zellen des unteren Respirationstraktes (Zellen der terminalen Bronchioli, Alveolarepithel), die Kolonisierung des Erregers an der Eintrittspforte wird u.a. durch das Fehlschlagen der mukoziliären Clearance begünstigt (EWERS u. WIELER 2011, S. 229).
Klinik und Pathologie
Der nur für das Schwein pathogene Erreger, A.pp., löst perakute, akute, chronische und subklinische Krankheitsverläufe mit hoher Morbidität und Mortalität aus (HEINRITZI 2006, S. 144).
Meist zeigt sich die Infektion beim Schwein zwischen der 6. und 20. Lebenswoche (EWERS u. WIELER 2011, S. 230).
Die Erkrankungsschweregrade sind abhängig von der Erregermenge (SEBUNJA et al. 1983).
Die klinischen Bilder variieren stark in Abhängigkeit von der Virulenz des Bakterienstammes, der Infektionsdosis und der Abwehrlage des Schweins (EWERS u. WIELER 2011, S. 230).
WEISS u. RUDOLPH (2007, S. 66) beschreiben, dass die sich entwickelnde Pleuropneumonie im akuten Zustand durch fibrinöse, hämorrhagisch-nekrotisierende Veränderungen gekennzeichnet ist, während im chronischen Stadium adhäsive Pleuritis, Sequestration und Induration im Vordergrund stehen. Des Weiteren bildet sich eine umfangreiche adhäsive Pleuritis aus (WEISS u. RUDOLPH 2007, S. 66).
Die Läsionen sind vor allem in den dorsocaudalen Lungenbereichen lokalisiert (FRANK et al. 1992, LÓPEZ 2009, S. 502) wobei theoretisch alle Lungenlappen betroffen sein können (LÓPEZ 2009, S. 502).
Nach einer Infektion werden oft eine hohe Mortalität und Morbidität beobachtet und erkrankte, noch lebende Schweine entwickeln sich zu Kümmerern mit chronischen Lungenläsionen (MACINNES et al. 2008).
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Als Erregerreservoir gelten chronisch infizierte Trägertiere (EWERS u. WIELER 2011, S. 226). Nach der Infektion besteht ein immunologischer Schutz in Bezug auf homologe A.pp. Serotypen, eine Reinfektion mit heterologen Serotypen ist jedoch möglich (CRUIJSEN et al. 1995).
41 3. Material und Methoden
3.1 Surfactantcharakterisierung beim Schwein
3.1.1 Infektionsversuche mit Scoring im Rahmen des FUGATO-RePoRI- Projektes
3.1.1.1 Versuchstiere
Die Tiere stammten aus einem vorausgegangenen Projekt (Funktionelle GenomAnalyse im Tierischen Organismus (FUGATO) – Resistance to Porcine Respiratory Tract Infections (RePoRI). Das Projekt (FUGATO-RePoRI) wurde vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) gefördert (Förderkennzeichen: 0315129A-D).1)
Wie beschrieben in REINER et al. (2014) wurden hierzu F2 Schweine (Kreuzungstiere der Linien Deutsche Landrasse x Hampshire) verwendet, die in der Klinik für kleine Klauentiere, der Tierärztlichen Hochschule Hannover, geboren und im Alter von vier Wochen abgesetzt worden sind. Die Tierversuchsgenehmigungsnummer lautete 33.9-42502-04-05/919. Die Haltung der Ferkel fand im Rahmen der gesetzlichen Vorschriften mit standardisierter Haltung statt. Alle Ferkel sind negativ auf A.pp. spezifische Antikörper (Apx IIA nach LEINER et al. 1999 und Apx IV A nach DREYFUS et al. 2004) gestestet worden. Zudem fand eine labordiagnostische Untersuchung auf Mycoplasma hyopneumoniae und PRRSV (HerdChek®, IDEXX laboratories, Wetbrook, Maine, USA) mittels Antikörper-ELISA und auf Influenza A Virus durch Hämagglutinationshemmungstest statt, wie beschrieben in REINER et al. (2014).
1) laut persönlicher Mitteilung von Frau Dr. Doris Höltig, 16.11.2013, Hannover
42 3.1.1.2 Aerosolinfektion
Grundsätzlich kommt die Aerosolinfektion der natürlichen Infektion am nächsten und kann somit bevorzugt für Läuferschweine verwendet werden (HENNIG-PAUKA 2007). Die Ferkel wurden im Alter von sieben Wochen via Aerosolinfektion mit einem A.pp.-Stamm (Serotyp 7) infiziert (REINER et al. 2014).
Die Aerosolinfektion erfolgte wie bei HÖLTIG et al. (2009) etabliert (REINER et al.
2014).
3.1.1.3 Klinische und pathomorphologische Erhebungen
Für die Erhebung von statistisch-auswertbaren, quantitativen Daten war von HÖLTIG (2009) ein Scoring-System entwickelt worden, das eine objektive Bewertung der Erkrankungsschweregrade ermöglicht. Die Ergebnisse der klinischen, ultrasonographischen und röntgenologischen Scores waren hierbei untereinander als auch mit den Sektionsbefunden (Lung Lesion Score, LLS) positiv korreliert (p<0,0001) (HÖLTIG 2009).
Daran knüpfen die folgenden Untersuchungen im vorangegangenen FUGATO- RePoRI- Projekt an.
Vor der Infektion und sieben Tage nach der Infektion [p. Inf.] wurden alle Schweine klinisch untersucht, selbstverständlich gingen nur klinisch gesunde Tiere in den Versuch (REINER et al. 2014).
Das in HÖLTIG (2009) beschriebene klinische, ultrasonographische und röntgenologische Scoring und Lung Lesion Scoring (LLS) kamen als Basis für die Untersuchungen in REINER et al. (2014) zum Einsatz.
Der Erreger konnte kulturell reisoliert werden (REINER et al. 2014).
Die sonographische Untersuchung lieferte v.a. in Betracht auf die Pleura und das oberflächliche Lungenparenchym gut auswertbare Ergebnisse (HÖLTIG 2009).
Es kam ein 8 MHz Linearschallkopf (LOGIQ™ Book XP, Fa. GE Medical Systems, Chalfont St.Giles, Großbritannien) zum Einsatz, geschallt wurde bei lateraler Lagerung des Ferkels jeder Interkostalraum von dorsal nach ventral (HÖLTIG 2009).
