Zentrum für Infektionsmedizin Institut für Mikrobiologie
Konstruktion und Charakterisierung isogener Actinobacillus pleuropneumoniae
FrdA- und FrpB-Mutanten
INAUGURAL – DISSERTATION Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin
Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.)
Vorgelegt von
Ibrahim Mohamed Bendalla Sirat, Libyen
Hannover 2008
1. Gutachterin(nen)/Gutachter: Univ.-Prof. Dr. G.-F. Gerlach 2. Gutachterin(nen)/Gutachter: Univ.-Prof. Dr. G. Herrler
Tag der mündlichen Prüfung: 03. Nov 2008
Unterstützt durch ein Stipendium des Ministery of Education Libya sowie den SFB 587 „Immunreaktionen der Lunge bei Infektion und Allergie“
Meinen Eltern und meiner Familie
F. F. R. Buettner, I. M. Bendallah, J. T. Bosse, K. Dreckmann, J. H. E. Nash, P. R.
Langford, and G.-F. Gerlach (2008):
Analysis of the Actinobacillus pleuropneumoniae ArcA regulon identifies fumarate reductase as a determinant of virulence.
Infect. Immun. 76, 2284-2295
Abstracts:
I. Bendallah, K.Dreckmann, F.F.R. Buettner and G.-F. Gerlach (2007)
Characterization of a frd deletion mutant of Actinobacillus pleuropneumoniae.
88th Conference of Research Workers in Animal Diseases (CRWAD), 2.-4. December 2007, Chicago.
I. Bendallah, K.Dreckmann, F.F.R. Buettner and G.-F. Gerlach (2008)
Characterization of a frpB deletion mutant of Actinobacillus pleuropneumoniae.
Fachgruppentagung der DVG-Fachgruppe “Bakteriologie und Mykologie”, 25. -27.
Juni 2008, Braunschweig
1 Einleitung ...9
2 Literaturübersicht ...10
2.1 Actinobacillus pleuropneumoniae...10
2.1.1 Bedeutung und Verbreitung ...10
2.1.2 Taxonomie ...11
2.1.3 Pathogenese ...11
2.1.4 Virulenzfaktoren ...12
2.1.4.1 Adhäsion...12
2.1.4.2 Zytolysine ...13
2.1.5 Äußere-Membran-Proteine (OMP) ...15
2.1.6 Eisenaufnahme ...16
2.1.7 Andere Faktoren ...17
2.1.8 Anaerober Stoffwechsel ...17
3 Material und Methoden ...21
3.1 Bakterienkulturen...21
3.1.1 Bakterien und Plasmide ...21
3.1.1.1 Kultivierungsbedingungen ...24
3.1.1.2 Isolierung, Reinigung und Quantifizierung von Nukleinsäuren ...25
3.1.1.3 Präparation chromosomaler DNA von A. pleuropneumoniae...25
3.1.1.4 Alkalilysis-Verfahren zur Präparation von Plasmid DNA...26
3.1.1.5 DNA-Aufreinigung mit “Nucleospin-Extract”...26
3.1.2 Plasmidkonstruktion ...27
3.1.2.1 PCR für 2.1-TOPO-Cloning ...27
3.1.2.2 Restriktionsenzymverdaus...27
3.1.2.3 Auffüllen von Enden mit dem Klenow-Fragment der DNA- Polymerase...28
3.2 Agarosegelelektrophorese...28
3.3 Ligation ……… ...29
3.4 Transformation ...29
3.4.1 Herstellen von chemisch kompetenten Zellen...29
3.4.3 Elektrotransformation von Actinobacillus pleuropneumoniae...30
3.4.3.1 Herstellung elektrokompetenter Zellen. ...30
3.4.3.2 Elektrotransformation...31
3.5 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ...32
3.6 Konjugation von E. coli und A. pleuropneumoniae...33
3.6.1 Saccharose-Gegenselektion ...34
3.6.2 Southern Hybridisierung...34
3.6.3 Southern Blot ...34
3.6.4 Herstellen einer Gensonde nach der „Random-Priming“ Methode...36
3.7 Pulsfeld-Gel-Elektrophorese (PFGE)...36
3.8 Sequenzierung ...39
3.9 Fumeratreduktase Enzymtest...39
3.9.1 Bestimmung der Aktivität der Fumaratreduktase. ...39
3.10 Präparation der äußeren Membran ( integrale Membrane ) ...39
3.10.1 SDS-PAGE (Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) ...40
3.11 Versuchstiere ...41
3.11.1 Herstellen der Bakteriensuspension für die Belastung...41
3.11.2 Aerosolkammer und Infektion...42
3.11.3 Überwachung und Erhebung klinischer Parameter ...42
3.11.4 Sektion ...42
3.11.5 Bakteriologische Organuntersuchung ,, ...43
3.11.6 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay )...43
3.12 Statistik ... …44
4 Ergebnisse ...45
4.1 Konstruktion und Charakterisierung einer A. pleuropneumoniae frdA Deletionsmutante...45
4.1.1 Konstruktion des Plasmids für die Konjugation ...45
4.1.2 Konjugation und Gegenselektion zur Erstellung der isogenen A. pleuropneumoniae frdA -Mutante...47
4.1.3.2 Bestimmung der Aktivität der Fumarate Reduktase...50
4.2 Konstruktion und Charakterisierung der A. pleuropneumoniae ΔfrpB Deletionsmutante...51
4.2.1 Konstruktion des Plasmids für die Konjugation ...51
4.2.2 Konjugation und Gegenselektion zur Erstellung der isogenen A. pleuropneumoniae frpB-Mutante...53
4.2.3.1 Genetische Überprüfung von A. pleuropneumoniae ΔfrpB...54
4.2.2.1 Funktionelle Überprüfung der A. pleuropneumoniae frpB Mutante...55
4.3 Überprüfung von A. pleuropneumoniae ΔfrdA und ΔfrpB in der experimentellen Aerosolinfektion...56
5 Diskussion...59
6 Zusammenfassung ...62
7 Summary...63
8 Literaturverzeichnis...64
9 Anhang...81
9.1 Zusammensetzung von Medien, Medienzusätzen und Puffer ...81
9.1.1 Medien ...81
9.2 Lösungen und Puffer ...83
9.2.1 Plasmidpräparation ...83
9.2.2 Präparation von chromosomaler DNA von Bakterien (A. pleuropneumoniae) ...84
9.3 Restriktionsverdau...84
9.4 Gel-Elektrophorese...84
9.5 Transformation ...84
9.6 Konjugation ...85
9.7 DNA-Transfer (Southern Blot) ...85
9.8 Herstellen einer Gensonde nach der „Random-Priming“ Methode...85
9.9 Southern-Hybridisierung...86
9.12 Rohdaten...88 9.13 Abbildungenverzeichnis...89 9.14 Tabellenverzeichnis...90
A. bidest ... Aqua bidestillata
A. pleuropneumoniae ... Actinobacillus pleuropneumoniae Bp ... Basenpaare
DAPI ... Diaminopimelinsäure dATP ... Deoxyadenosintriphosphat dCTP ... Deoxycytidintriphosphat dGTP ... Deoxyguanosintriphosphat dTTP ... Desoxythymidintriphosphate DNA ... Desoxyribonukleinsäure DNase ... Desoxyribonuklease
dNTP ... Desoxynukleotidtriphosphat et al. ... Et alii
E. coli ...Escherichia coli
EDTA ... Ethylendiamin-Tetraessigsäure
ELISA ... Enzyme-linked immuno sorbent assay EIVX ... Ersatz-IsoVitalex
kbp ... Kilobasenpaare LB ... Luria- Bertani Lsg. ... Lösung
M ... molar
NaCl ... Natumchlorid
NEB ... New England Biolabs OD ... Optische Dichte OLB ... Oligo Labeling Buffer NEB ... New England Biolabs PCR ... Polymerase chain reaction PFGE... Pulsfeld-Gelelektrophorese PMSF ... Phenylmethylsulfonylfluorid
PPLO ... “Pleuropneumoniae Like Organism”
PPLO ... “Pleuropneumoniae Like Organism”
SDS ... Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel Sek ... Sekunde
Stammlsg... Stammlösung TAE ... Tris Acetat EDTA TBE ... Tris Borat EDTA TE... Tris EDTA UV ... Ultraviolet vol ... Volumen
v/v ... Volumen pro Volumen
1 Einleitung
Actinobacillus pleuropneumoniae ist ein Gram-negatives und fakultativ anaerobes Stäbchen. Es verursacht eine weltweit verbreitete Atemwegserkrankung beim Schwein. Die Erkrankung hat eine hohe Morbidität und Mortalität und kann schwere wirtschaftliche Verluste bei Schweineerzeugern verursachen. Von A.
pleuropneumoniae sind zwei Biovare bekannt; Biovar 1-zugeordnete Stämme sind NAD-abhängig und in 15 Serovaren unterteilt, Biovar 2-zugeordnete Stämme sind NAD-unabhängig und in 2 Serovaren unterteilt.
In vorangegangenen Arbeiten wurde gezeigt, dass der anaerobe Metabolismus eine wichtige Rolle bei der vollen Ausprägung der Virulenz spielt. So waren isogene Mutanten in den beiden globalen anaeroben Regulatoren HlyX (das FNR-Homolog von A. pleuropneumoniae) und ArcA im Tiermodell attenuiert. Um die molekulare Ursache für die Attenuierung der beiden Mutanten zu bestimmen, wurden das HlyX und das ArcA-Regulon bestimmt. Dabei wurde das FrpB Protein (ferric-regulated protein B) als eines der am stärksten durch HlyX positiv regulierten Proteine identifiziert. Die Auswertung des ArcA-Regulons wies darauf hin, dass unter anaeroben Bedingungen eine durch Fumaratreduktase ermöglichte Fumaratatmung bedeutsam für den Energiestoffwechsel des Erregers sein könnte.
Dies führte zu den Hypothesen, dass i) die in der ArcA-Mutante ausbleibende erhöhte Synthese von Fumarat und damit eine nicht oder nur in geringem Umfang stattfindende Fumaratatmung kausal an der Attenuierung der ArcA-Mutante und ii) die fehlende Aufregulation der FrpB-Expression kausal an der Attenuierung der HlyX- Mutante beteiligt sein könnte. Diese beiden Hypothesen sollten in der vorliegenden Arbeit durch Erstellung isogener Mutanten und ihren Einsatz im Schweineinfektionsmodell überprüft werden.
2 Literaturübersicht
2.1 Actinobacillus pleuropneumoniae 2.1.1 Bedeutung und Verbreitung
Bei der Infektion mit A. pleuropneumoniae handelt es sich um eine weltweit vorkommende Erkrankung der Schweine (MATSCHULLAT 1982, NICOLET 1992), die im Zuge der Intensivierung der Schweinehaltung immer mehr an Bedeutung gewonnen hat. Die Krankheit stellt aufgrund der hohen wirtschaftlichen Verluste, bedingt durch eine hohe Morbiditäts- und Mortalitätsrate, ein großes Gesundheitsproblem in der Schweinehaltung dar (STRAW et al. 1989).
Actinobacilus pleuropneumoniae ist ein obligat pathogener Erreger des Respirationstraktes von Schweinen (TAYLOR 1999); er kann aus Nasenhöhlen, Tonsillen und Lungen infizierter Tiere isoliert werden (DOM et al.1994). Der Erreger überlebt nicht lange in der Umwelt (FENWICK und HENRY 1994; TAYLOR 1999).
Die Actinobacilus-pleuropneumonie zeigt sich charakteristischerweise in Form einer hämorrhagisch-nekrotisierenden oder herdförmigen Pleuropneumonie mit adhäsiver Pleuritis. Klinisch treten Infektionen mit A. pleuropneumoniae als perakute, akute und chronische Verlaufsform mit allen Übergängen auf (SEBUNYA und SAUNDERS 1983). Akute Herdenerkranungen gehen häufig in enzootische Zustände über, die durch chronische Pleuritiden und Lungenläsionen charakterisiert sind (BACHMANN 1972, SEBUNYA und SAUDERS 1983, FENWICK und HENRY 1994). Die Übertragung erfolgt aerogen durch Tröpfcheninfektion bei direktem Kontakt (JENSEN et al. 1999; LECHTENBERG et al.1994). Die indirekte Übertragung durch unbelebte oder belebte Vektoren spielt in der Vebreitung der Erkrankung eine geringere Rolle (FENWICK und HENRY 1994).
Actinobacillus pleuropeumoniae zeigt eine strenge Wirts-und Gewebesspezifität; das heißt, dass das Bakterium in der Regel nur aus infizierten Schweinen und hier überwiegend aus dem Respirationstrakt isoliert wird. Als zwei auffällige Ausnahmen wurde A. pleuropneumoniae aus dem Hirnabszeß eines Rindes und aus einem Lamm mit Arthritis isoliert (GUNNARSSON et al.1977). Das letztgenannte Isolat
(ATCC 33377) wurde dabei als Typstamm für A. pleuropneumoniae Serovar 5 definiert.
2.1.2 Taxonomie
Bei A. pleuropneumoniae handelt es sich um ein Gram-negatives, fakultativ anaerobes, pleomorphes Stäbchen aus der Familie der Pasteurellaceae (MANNHEIM 1994), das erstmals vor über 40 jahren als der Erreger der kontagiösen Pleuropneumonie bei Schweinen identifiziert wurde. Von A. pleuropneumoniae wurden zwei Biotypen beschrieben, wobei der Biotyp I auf Nikotinamid- Adenindinukleotid (NAD) angewiesen ist (TAYLOR 1999). Fünfzehn Serotypen werden aufgrund der unterschiedlichen Polysaccharid-Antigene innerhalb des Biotyps I definiert (BLACKALL et al. 2002; MACLAN et al. 2004). In Deutschland treten davon vor allem die Serotypen 2, 3, 7 und 9 auf (BUNKA et al. 1990).
2.1.3 Pathogenese
Actinobacillus pleuropneumoniae besiedelt schnell das Wirtstier, zunächst durch Anheftung an epitheliale Zellen der Tonsillen und nachfolgend durch Ausbreitung in die unteren Atemwege, wodurch es zur Ausbildung klinischer Erscheinungen kommt.
Während des Wachstums geben die Erreger Vesikel von der äußeren Membran (sogenannte „blebbs“) ab, die Lipopolysaccharide (LPS), äußere Membranproteine und Zytotoxine enthalten. Neutrophile Granulozyten werden durch das LPS zur Einwanderung angeregt und dann von den Zytotoxinen zerstört ( RIOUX et al. 1997) Die dabei freigesetzten Enzyme und Zytokine führen direkt und indirekt zur Schädigung des umliegenden Gewebes. Der Gewebeschaden kann sehr schnell fortschreiten, und einige Tiere, die mit A. pleuropneumoniae infiziert sind, sterben innerhalb von 4-12 Stunden nach der Infektion. Das LPS und die Zytotoxine tragen nicht nur zur Schädigung der Wirtszellen bei, sondern sie verhindern auch eine Zerstörung der Bakterien durch Verschlechterung der Phagozytose und Induktion einer überschießenden Immunantwort ( FENWICK und OSBURN 1986).
Die Schwere der Infektion ist abhängig von der Erregerdosis und der infizierenden Serovar; allerdings gelten alle Serovare als pathogen und können Primärausbrüche
verursachen. Die Aufnahme einer geringen Dosis in Verbindung mit einem nicht supprimierten Immunsystem führt häufig zu einer latenten Infektion mit Besiedlung der Tonsillen (FENWICK und HENRY 1994). Bei Aufnahme höherer Dosen oder bei Suppression der Immunreaktion durch biotische (z. B. Virusinfektionen). oder abiotische Faktoren (z. B. Temperaturstress). führen zu klinischer Krankheit, die meistens akut verläuft aber auch perakut sein kann (FENWICK und HENRY 1994).
Perakute Infektionen manifestieren sich mit massiver Bakteriämie, Hyperthermie, Anorexie, mildem Durchfall, Zyanose und schwerer Dyspnoe. Akut infizierte Tiere zeigen Depression, Anorexie, exspiratorische Dyspnoe, Husten und Maulatmung (ROGERS et al. 1990). Tiere, die die akute Infektion überleben, bleiben häufig chronisch krank oder latent infiziert. Diese latent infizierten Tiere werden auch als
„carrier“ bezeichnet und sind die Hauptursache für die Einschleppung von Erregern in bisher nicht betroffene Bestände (FENWICK und HENRY 1994). Diese Tiere scheiden den Erreger nur intermittierend in geringen Mengen aus; daher ist ihre Erkennung schwierig und unsicher.
2.1.4 Virulenzfaktoren
Virulenzfaktoren sind als bakterielle Produkte definiert, die direkt eine Schädigung der Wirtszellen verursachen. Virulenzassoziierte Faktoren ermöglichen das Wachstum oder Überleben des Erregers im Wirt und tragen damit zu Infektion und Krankheit bei (MAHAN et al. 1996; MEKALANOS 1992). Virulenzassoziierte Faktoren können Stoffwechselenzyme oder Transportproteine sein.
2.1.4.1 Adhäsion
Adhäsion ist die Fähigkeit eines Krankheitserregers, an Wirtszelloberflächen zu haften; dies ist häufig eine Voraussetzung für die Vermehrung innerhalb des Wirtes und somit eine Grundlage für den Ausbruch der klinischen Erkrankung. Bei der Anheftung können Fimbrien, LPS und Kapselpolysaccharide eine Rolle spielen (HACKER und HEESEMANN 2000).
Die Rolle von Fimbriae für die Anheftung ist für eine Vielzahl von Krankheitserregern gut definiert (SAUER et al. 2000). Fimbrien sind auch in A. pleuropneumoniae
identifiziert worden, aber ihre Bedeutung für die Pathogenese ist noch unklar. Es wurde jedoch gezeigt, dass sie eine Rolle beim Kontakt zu primären Lungenepithelzellen spielen (BOEKEMA et al. 2004; STEVENSON et al. 2003;
UTRERA. PIJOAN 1991; ZHANG et al. 2000).
Lipopolysaccharide (LPS) bestehen aus Endotoxin (Lipid und Kernpolysaccharid) und O-Antigen (Polysaccharid-Seitenketten). Das Endotoxin ist verantwortlich für die Toxizität des LPS und wirkt durch Induktion einer starken Zytokinsekretion (BAARSCH et al. 1995). LPS soll auch eine Rolle bei der Adhäsion von A.
pleuropneumoniae spielen; so wurde gezeigt, dass Erreger mit „smooth-type“ LPS (lange Seitenketten) besser an Schweinetrachealringen haften als jene mit „rough- type“ (kurze Seitenketten; BELANGER et al. 1990). Jedoch bedarf die Rolle von LPS bei der Adhäsion weiterer Überprüfung, da umgekehrt in anderen Arbeiten gezeigt wurde, dass isogene LPS Mutanten besser an Trachealringen hafteten, als die jeweiligen Elternstämme (RIOUX et al. 1999).
Die A. pleuropneumoniae-Kapsel besteht aus nichtverzweigten Polysacchariden, die aus repetitiven Disaccharideinheiten aufgebaut sind. Sie bedeckt das ganze Bakterium und ist als solche nicht toxisch (FENWICK und OSBURN 1986; INZANA 1987). Sie schützt Bakterien vor Opsonierung und Phagozytose durch sterische Blockade der gegen somatisches Antigen gerichteten Antikörper. Dadurch sind Erreger mit dickeren Kapseln bei septikämischer Infektion virulenter als Erreger mit einer dünnen Kapsel (INZANA et al. 1988; JENSEN und BERTRAM 1986;
ROSENDAL und MACINNES 1990). Andererseits verringert die Kapsel die Adhäsion, da nicht bekapselte Stämme besser an Trachealringen haften als die bekapselten Elternstämme (RIOUX et al. 2000).
2.1.4.2 Zytolysine
Die Zytolysine von A. pleuropneumoniae gehören zur Familie der RTX-Toxine (RTX für „repeats in toxin“), die bei pathogenen gramnegativen Erregern weit verbreitet sind (WELCH 1991). Die biochemische und biophysikalische Analyse hat gezeigt, dass sie sich wiederholende, glycinreiche Sequenzen von neun Aminosäuren Länge nahe dem carboxyterminalen Ende aufweisen. RTX Toxine sind porenbildende
Proteine mit hämolytischer oder zytotoxischer Aktivität (FREY und NICOLET 1988;
GENTSCHEV et al. 2002; THOMPSON et al. 1993).
Die RTX-Toxine von A. pleuropneumoniae werden als Apx-Toxine bezeichnet (FREY et al. 1995.) und bei den verschiedenen Serovaren kommen vier verschiedene Apx- Toxine vor (ApxI bis ApxIV). Das ApxI-Toxin ist stark hämolytisch und zytotoxisch, das ApxII-Toxin ist schwach hämolytisch und mäßig zytotoxisch, das ApxIII-Toxin ist nicht hämolytisch aber stark zytotoxisch, das ApxIV-Toxin ist schwach hämolytisch.
Da das ApxIV-Toxin nur in vivo exprimiert wird (LEINER et al. 1999). basieren die Informationen über sein lytisches Verhalten auf Versuchen mit rekombinantem Protein. Die Apx-Toxine - mit der Ausnahme von ApxII - werden auf Operons kodiert, die das Aktivatorgen apxC, das Strukturgen apxA und die Transportgene apxB und apxD enthalten (FREY et al. 1994a). Im apxIV-Operon teilt nur das apxIVA-Gen Ähnlichkeiten mit Genen der anderen apx Operons (SCHALLER et al. 1999). Die Verteilung der apx Gene variiert zwischen den Serotypen. Das ApxIA Toxin wird von den Serotypen 1, 5a, 5b, 9, 10, 11, 13 und 14 exprimiert. Das apxIIA-Gen ist in allen Serotypen außer 10 und 14 vorhanden und das ApxIIIA-Toxin in den Serotypen 2, 3, 4, 6, 8 und 15 (BLACKALL et al. 2002; FREY et al. 1993b ; JANSEN et al. 1994;
KAMP et al. 1991; NIELSEN et al. 1997; SCHALLER et al. 1999). Das apxIVA-Gen ist in allen Serotypen vertreten, wird aber bei einigen Serotyp 7-Stämmen durch ein Transposon inaktiviert (BALTES et al. 2008).
Die ApxIA – IIIA-Toxine spielen eine wichtige Rolle in der A. pleuropneumoniae Infektion; so sind Mutanten, denen alle drei Toxine fehlen, apathogen (INZANA et al.
1991; PRIDEAUX et al. 1999). Außerdem resultiert die intrabronchiale Applikation von Schweinen mit Kulturüberstand oder rekombinantem ApxIA und ApxIIIA Toxin in schwerer klinischer Krankheit und Läsionen, die von den in akut infizierten Tieren beobachteten nicht ununterscheidbar sind (MAIER et al. 1996). Im Gegensatz dazu resultiert die Applikation mit rekombinantem ApxIIA-Toxin in wenig oder gar keinen klinischen Zeichen und milden Lungenläsionen (KAMP et al. 1997). Folglich scheint das ApxIIA-Toxin nur minimal zur Pathogenese beizutragen. Trotzdem können A.
pleuropneumoniae Serotyp 7-Stämme, die nur ApxIIA bilden, schwere Erkrankungen mit typischen Lungenläsionen auslösen (FREY et al. 1993b; KAMP et al. 1997). Das
ApxIVA Toxin scheint ebenfalls eine Rolle in der Pathogenese zu spielen, aber die Klärung der genauen Funktion erfordert weitere Arbeiten (SCHALLER et al. 1999).
2.1.5 Äußere-Membran-Proteine (OMP)
Von A. pleuropneumoniae sind einige Äußere-Membrane-Proteine (outer membrane proteins; OMPs) beschrieben worden. So wurden zwei eisenregulierte Membranproteine mit einem Molekulargewicht von 96-120 kDa und 79 kDa identifiziert (NIVEN et al. 1989). Diese Proteine zeigten eine Bindung an porcines Transferrin und wurden von Rekonvaleszentenseren erkannt (DENEER und POTTER 1989). Inzwischen konnte nachgewiesen werden, dass diese Proteine bei der Verwertung von Transferrin-gebundenem Eisen eine wesentliche Rolle spielen (GONZALES et al. 1990) und zudem eine protektive Immunität vermitteln können (ROSSI-CAMPOS et al 1992, WILKE et al.1997). Die für das 60 kDa – 65 kDa große TbpB Protein (GONZALES et al. 1995; entspricht TfbA, [GERLACH et al. 1992]) und das 100 kDa große TbpA-Protein (GONZALES et al.1995; entspricht TfbB [WILIKE et al. 1997],) kodierenden Gene wurden kloniert und sequenziert. Es wurde weiter bewiesen, dass die transferrinbindenden Proteine von einer polycistronischen mRNA translatiert werden (THIEDE 1998). Weitere Untersuchungen zeigten, dass das tbpAB-Operon von A. pleuropneumoniae eine von anderen Spezies abweichende Organisation aufweist. So liegt der Transkriptionstartpunkte über 1300 Basenpaare stromaufwärts des tbpB-Startkodons; auf diesen 1300 Basenpaaren befinden sich zwei weitere offene Leserahmen, die für die ExbB- und ExbD-Proteine kodieren.
Ein weiteres OMP von 42 kDa ließ sich in vitro durch Maltose-Supplementierung induzieren, kommt jedoch nicht bei allen Serotypen vor (DENEER und POTTER 1989b). Drei immunologisch dominierende Proteine der äußeren Membran von 17 kDa, 32 kDa und 42 kDa wurden mittels Rekonvaleszentenseren bei den Serovaren 1 bis 8 identifiziert (MACINNES und ROSENDAL 1987). Ebenso mittels Rekonvaleszentenseren erkannten (RAPP und ROSS 1986). unterschiedliche, zwischen 45 kDa und 67 kDa und über 94 kDa große Proteine an der Bakterienoberfläche.
Eine weiteres OMP von 40 kDa wurde erstmals von GERLACH et al. (1993) für Serotyp 1 und später für Serotyp 5 beschrieben (BUNKA et al. 1995). und als OmlA
(outer membrane lipoprotein A) bezeichnet. GRAM und AHRENS (1998). konnten die omlA-Sequenz mittels PCR in 102 Feldisolation des Biotyps 1 sowie in allen Serotyp-Referenzstämmen nachweisen .
Die OMPs können auch zur Typisierung genutzt werden. So konnten Rapp et al.
(1986) für die Serotypen 1 bis 9 sieben verschiedene Proteinmuster der äußeren Membran darstellen. Dabei zeigen Referenzstämme der Serovaren 1 und 9 sowie 2 und 6 gleiche OMP-Profile. Für die untersuchten Feldisolate der Serovaren 1, 5, und 9 konnten ähnliche, aber nicht identische OMP-Profile wie für die Referenzstämme festgestellt werden. Die OMP-Profile der Serovar-7-Feldisolate waren nicht von demjenigen des Typstammes zu unterscheiden (RAPP et al. 1986). GRAM und AHRENS (1998). verglichen die Sequenzen der omlA-Gene der unterschiedlichen Serotyp-Referenzstämme und teilten die Serovaren in vier Gruppen ein. Die erste Gruppe umfasste die Serovaren 1, 9, 11 und 12, die zweite die Serovar 2, die dritte die Serovaren 5a, 5b und 10. Die Serovaren 3, 4, 6, 7 und 8 bildeten die vierte Gruppe (GRAM und AHRENS 1998).
2.1.6 Eisenaufnahme
Die Limitierung von verwertbarem Eisen ist ein wesentlicher Verteidigungsfaktor der unspezifischen Erregerabwehr und A. pleuropneumoniae verfügt über mehrere Eisenaufnahmemechanismen, um diese Abwehr zu überwinden. Der wichtigste Mechanismus erlaubt dem Erreger, das Transferrin des Wirtes zu nutzen (GERLACH et al. 1992; GONZALEZ et al. 1995; WILKE et al. 1997). Weiterhin können Hämoglobin und Hämin gebunden und verwertet werden (ARCHAMBAULT et al.
2003; BELANGER et al. 1995; DENEER und POTTER 1989). Auch verschiedene exogene mikrobielle Siderophore können als einzige Eisenquelle verwendet werden (DIARRA et al. 1996). Die Bindung all dieser eisenhaltigen Komplexe wird von sehr spezifischen Rezeptoren in der äußeren Membran vermittelt.
Das Transferrin-Eisenaufnahmesystem wird von zwei eisenreprimierbaren Proteinen vermittelt, dem mit der äußeren Membran assoziierten Lipoprotein TbpB (60kDa) und dem integralen äußere Membranproteine TbpA (100kDa; vgl. 2.1.5). Obwohl A.
pleuropneumoniae verschiedene Eisenquellen verwenden kann, scheinen die transferrin-bindenden Proteine von besonderer Bedeutung für A. pleuropneumoniae
zu sein, da Mutanten nicht mehr kolonisieren können und keine Erkrankung mehr auslösen (BALTES et al. 2002).
2.1.7 Andere Faktoren
Das Enzym Urease wird normalerweise von A. pleuropneumoniae gebildet;
ureasenegative A. pleuropneumoniae-Isolate stellen eine sehr seltene Ausnahme dar (BLANCHARD et al. 1993). Das Enzym katalysiert die Hydrolyse des Harnstoffes, der in Ammoniak und Kohlendioxid aufgespalten wird. Ammoniak ist eine bevorzugte Stickstoffquelle für viele Bakterien und kann durch Erhöhung des pH-Wertes eine günstige Umwelt für bakterielles Wachstum herstellen. Die Urease scheint zur Fähigkeit von A. pleuropneumoniae beizutragen, die Infektion und anschließende Erkrankung auszulösen, aber ihre Relevanz ist nicht vollkommen geklärt. So ist eine ureasenegative Mutante bei niedriger infektiöser Dosis attenuiert (BOSSE und MACINNES 2000), während bei einer höheren infektiösen Dosis keine Unterschiede zwischen Mutante und Elternstamm beobachtet wurden (BALTES et al. 2001;
TASCON CABRERO et al. 1997).
Weitere virulenzassoziierte Faktoren schließen eine Protease ein, die porcines IgA spaltet und dadurch möglicherweise die Besiedlung der unteren Atemwege erleichtert (KILIAN et al. 1979; NEGRETE-ABASCAL et al. 1994). Auch eine Cu, Zn- Superoxide-Dismutase, die A. pleuropneumoniae vor reaktiven Sauerstoffradikalen in vitro schützt, wurde identifiziert; sie ist aber für die Virulenz nicht erforderlich (LANGFORD et al. 1996; SHEEHAN et al. 2000). Mehrere weitere Faktoren, die möglicherweise mit der Virulenz assoziiert sind, wurden mithilfe der „signature- tagged mutagenesis“ (STM) identifiziert (SHEEHAN et al. 2003).
2.1.8 Anaerober Stoffwechsel
Enzyme, die am anaeroben Stoffwechsel beteiligt sind, sind sogenannte „house- keeping-Gene; trotzdem scheinen sie eine Rolle bei der Ausprägung der Schwere und Persistenz von A. pleuropneumoniae-Infektionen zu spielen, da die Sauerstoffspannung in sequestriertem Gewebe verringert ist (BALTES und GERLACH 2004). Somit werden sie als virulenzassoziierte Faktoren bezeichnet.
Eine Möglichkeit der Energieerzeugung in Abwesenheit von Sauerstoff ist eine Variation der Atmung, bei der andere Elektronenakzeptoren als Sauerstoff verwendet werden. Zu diesen Elektronenakzeptoren gehören Nitrat (NO3-), dreiwertiges Eisen (Fe3+), Sulfat (SO42-), Carbonat (CO32-) und bestimmte organische Verbindungen (MADIGAN et al. 2003). In E. coli werden viele unter anaeroben Bedingungen exprimierte Gene von den globalen Regulatoren ArcA und FNR reguliert (BAUER et al., 1999) , SHAW und GUEST 1982).
Das ArcA-Protein ist Teil des ArcAB-Zweikomponentensystems. Es besteht aus einem klassischen OmpR-ähnlichen Empfängerprotein (ArcA) und einem membran- ständigen Sensorprotein (ArcB). Zusammen sind diese Proteine in der Lage, in Abhängigkeit von der Sauerstoffspannung die Expression der Proteine in verschiedenen Stoffwechselwegen zu regeln, (z. B. Enzyme des Zitronensäurezyklus, SdhCDAB, Hat, FumA, Mdh, GltA, AcnA, AcnB und den aeroben Cytochrome- Oxidase-Komplex). ArcAB ist erforderlich für die geregelte Expression einiger kataboler Gene, die für die Pyruvat Verwendung und die Zuckerfermentierung erforderlich sind (BUETTNER 2008).
In einer vorangegangenen Arbeit (BUETTNER 2008) wurde gezeigt, dass in einer A.
pleuropneumoniae-ArcA-Mutante – anders als im Wildtyp – unter anaeroben Bedingungen keine erhöhte Synthese von Fumarat erfolgt. Daraus wurde gefolgert, dass die somit nicht oder nur in geringem Umfang stattfindende Fumaratatmung kausal an der Attenuierung der ArcA-Mutante beteiligt sein könnte. Um diese Hypothese zu untermauern, war ein Ziel der vorliegenden Arbeit die Konstruktion einer isogenen Fumaratreduktasemutante und die Prüfung ihrer Virulenz im Schweineinfektionsmodell.
Das FNR („fumarate and nitrate reduction“)-Protein von E. coli ist ein ca. 30 kDa großes Protein; es enthält vier Eisen-Schwefel-Gruppen und induziert die Expression vieler Gene, wie z. B. der DMSO-Reduktase (SPIRO und GUEST 1990; UNDEN und DUCHENE 1987; WEINER et al. 1992), die am anaeroben Stoffwechsel beteiligt sind; gleichzeitig wird die Expression von Genen, die am aeroben Metabolismus beteiligt sind, unterdrückt. Escherichia coli besitzt Enzyme zur Nutzung von DMSO und anderen Substraten als Elektronenakzeptoren und wächst unter anaeroben
Bedingungen auf Minimalmedium mit Glyzerol als Kohlenstoff- und Energiequelle sowie DMSO als terminalem Elektronenakzeptor (BILOUS und WEINER 1985). Die DMSO-Reduktaseaktivität kann durch die Anwesenheit von Nitrat oder Sauerstoff unterdrückt werden. Andererseits induziert anaerobes Wachstum auf DMSO als terminalem Elektronenakzeptor die Aktivität von Nitrat, Fumarat und Trimethylamin- N-Oxid Reduktase (BILOUS und WEINER 1985). Ein Abfall des Sauerstoffspiegels, aber auch andere Faktoren wie Wachstumsphase und Kohlenstoffquelle, spielen eine wichtige Rolle bei der FNR-Expression von E. coli (SOLTES und MACINNES 1994).
Das HlyX Protein von A. pleuropneumoniae ist homolog zum FNR-Protein von E. coli (JERLSTROEM et al. 1987; MACINNES et al. 1990; WOODS und GUEST 1987).
Wie FNR enthält auch HlyX vier Eisen-Schwefel-Gruppen, die für das DNA- Bindungsvermögen des Proteins verantwortlich sind (GREEN und BALDWIN 1997).
MACINNES et al. (1990) haben die Nukleotidensequenz des hlyX-Gens analysiert und dabei einen offenen Leserahmen mit einer Länge von 720 bp identifiziert, der von Länge und Sequenz her dem des fnr-Gens entspricht. Der offene Leserahmen kodiert für ein Protein mit einer molekularen Masse von 27,1 kDa. Der Vergleich der Nukleotidsequenz von hlyX mit der von fnr zeigt, dass beide zu 65% identisch sind.
Die abgeleiteten Proteinsequenzen von FNR und HlyX sind zu 71% identisch. Vier Cysteinreste (Positionen 14, 18, 21 und 27) sind am aminoterminalen Ende von sowohl HlyX als auch FNR vorhanden. Weiterhin ist auch die Erkennungssequenz von HlyX der von FNR sehr ähnlich (15 von 18 Basen sind identisch). Die vergleichbare Aktivität von HlyX und FNR wurde auch dadurch bestätigt, dass eine FNR-Mutante mit HlyX komplementiert werden konnte (GREEN und BALDWIN 1997;
MACINNES et al. 1990). Anders als das FNR-Protein war das HlyX-Protein aber in der Lage, die Synthese einer hämolytischen Aktivität bei E. coli unter anaeroben Bedingungen zu induzieren (SOLTES und MACINNES 1994); dieses Ergebnis weist auf Unterschiede der beiden Proteine in ihrem DNA-Bindungsvermögen hin. Die Anwesenheit von HlyX oder FNR sind für das Wachstum von E. coli Δfnr auf einem Glycerol-Nitrat-Minimalmedium unter anaeroben Bedingungen essentiell. Im Gegensatz dazu werden weder HlyX noch FNR beim Wachstum auf demselben Medium mit Fumarat gebraucht (SOLTES u. MACINNES 1994).
Es wird vermutet, dass A. pleuropneumoniae ein ähnliches hierarchisches System für die Expression der Gene im sauerstoffarmen Milieu wie E. coli hat (MACINNES et al. 1990). Bisher wurde gezeigt, dass die DMSO-Reduktase und die Aspartase bei A.
pleuropneumoniae im ex vivo Modell (Zusatz von BALF zum Kulturmedium) hochreguliert sind und dass die kodierenden Gene über potentielle HlyX- Bindungsstellen verfügen (BALTES et al. 2003; JACOBSEN et al. 2005). Die Deletion des dmsA-Genes führt zur Attenuierung von A. pleuropneumoniae in der akuten Phase der Infektion (BALTES et al. 2003). Eine A. pleuropneumoniae- ΔaspAΔdmsA-Doppelmutante zeigte in Kultur reduziertes Wachstum unter anaeroben Bedingungen sowie einen milderen klinischen Verlauf nach Aerosol- Infektion als der Wildtypstamm und konnte nur selten in intakten Lungengeweben nachgewiesen werden (JACOBSEN et al. 2005). Der A. pleuropneumoniae Wildtypstamm konnte jedoch in großer Anzahl aus unverändertem Lungengeweben isoliert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass mit der DMSO-Reduktase und der Aspartase zwei mögliche Vertreter des HlyX-Regulons an Pathogenese und Persistenz beteiligt sind. Daraus lässt sich die Hypothese ableiten, dass HlyX- regulierte Gene allgemein von großer Bedeutung für die Pathogenese und Persistenz von A. pleuropneumoniae im Respirationstrakt sind. In der vorliegenden Arbeit sollte überprüft werden, ob möglicherweise die in der hlyX-negativen Mutante fehlende Aufregulation des äußeren Membranproteins frpB eine Rolle für die Attenuierung der Mutante spielt. Dazu sollte eine frpB-negative Mutante von A.
pleuropneumoniae erstellt und im Aerosolinfektionsmodell am Schwein auf ihre Virulenz hin überprüft werden.
3 Material und Methoden
Die in dieser Arbeit verwendeten Medien, Medienzusätze und Puffer sind im Anhang aufgeführt (Kapitel 9). Die benutzten Geräte, Enzyme und Chemikalien sind ebenfalls im Anhang aufgeführt
3.1 Bakterienkulturen 3.1.1 Bakterien und Plasmide
Die in der Arbeit verwendeten Bakterienstämme und Plasmide sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1: Verwendete Bakterienstämme und Plasmide für die Erstellung und Prüfung von A. pleuropneumoniae ΔfrdA
Stämme, Plasmide &
Primer Charakteristika Quelle
Stämme
A. pleuropneu-
moniae wt A. pleuropneumoniae Serotyp 7 Isolat 76 (Anderson et al., 1991) A. pleuropneu-
moniae ΔfrdA Unmarkierte frdA-negative Deletionmutante von A.
pleuropneumoniae wt vorliegende Arbeit Plasmide
p-TOPO
E. coli Klonierungsvektor für schnelles und effizientes Klonieren von Taq -Polymerase-amplifizierten PCR
Produkten
TOPO TA cloning, Invitrogen, Groningen,
NL pFrd-811 1273-bp PCR Produkt erstellt mit Primern oFrd-21 und
oFrd-22 kloniert in pCR 2.1-TOPO Vorliegende Arbeit
pFrd-820
Plasmid, das durch die Ligation des 728-bp großen BsmBI/PspoM1-Fragmentes aus pFrd-811 in pFrd-810
(geschnitten mit EcoRI und BsmBI) entstanden ist
Vorliegende Arbeit
pEMOC2
Transkonjugationsvektor auf der Grundlage von pBluescript SK mit mobRP4, Platzhalter,
Choramphenicolresistenz und transkriptioneller Fusion des omlA Promotors mit sacB Gen von Bacillus subtilis
Accession no.
AJ868288 (Baltes et al., 2003)
pEFrd-710
Plasmid, das das deletierte frdA Gen aus pFrd-820 enthält. Das frdA Gen wurde auf einem NotI /PspOMI –
Fragment aus pFrd-820 in den mit NotI/PspOMI geschnittenen pEMOC2 ligiert
Vorliegende Arbeit
pLS88 Plasmidvektor mit breitem Wirtsspektrum von Haemophilus ducreyi, Streptomycin Sulfonamid-und
Kanamycinresistenz
(Willson 1989)
pFrd-1300
Plasmid, das auf pLS88-basiert. Es trägt das PCR Product der Primer oFrd-MfeI-1 und oFrd-MfeI-2, das
das frdA–Gen enthält und (3790 bp) in den an der EcoRI–Schnittstelle eröffneten pLS88 ligiert wurde
Vorliegende Arbeit
Primer
oFrd-21
5´ ATGCGGGCCCCGGGGTTTCCACTTCTAATA;
Vorwärts-Primer mit einer internen PspOMI Schnittstelle. Er umfasst die Positionen 505-486 vor
dem frdA Startkodon.
Vorliegende Arbeit
oFrd-22
5´ ATGCCGTCTCATTCACCGCGACAACCTTCAG3´; Rückwärts-Primer mit einer internen BsmBI Schnittstelle. Er umfasst die Positionen 88-69 des frdA
Gens.
Vorliegende Arbeit
oFrd-23 5´ATGCCGTCTCATGAATTCATTTTAGATGTGGCG3´;
Vorwärts-Primer mit einer internen BsmBI Schnittstelle.
Er umfasst die Positionen 276-295 des frdA Gens.
Vorliegende Arbeit
oFrd-24
5´ ATGCGCGGCCGCGCATGGTAAAGTAATGCGG C3´; Rückwärts-Primer mit einer internen NotI- Schnittstelle. Er umfasst die Positionen 202-221 nach
dem frdA Stopkodon.
Vorliegende Arbeit
oFrd-MfeI-2 5´ ACGTACCAATTGGATTACAGTGCGATTACTGC3´;
Vorwärts-Primer, der die Positionen 478-458 vor dem frdA Startkodon umfasst
Vorliegende Arbeit oFrd-MfeI-1 5´ ACGTACCAATTGCGGGGTTTCCACTTCTAATA3´; Vorliegende
Rückwärts-Primer, der die Positionen 18-2 nach dem frdD Stopkodon umfasst.
Arbeit
oFrd-25 5´ CAATGCGAATGCGGTGGTTA3´;Vorwärts-Primer, der die Positionen 44-63 des frdA–Gens umfasst
Vorliegende Arbeit
oFrd-26 5´ CGTTTCGCCGGTTGTGATTT3´;Rückwärts-Primer, der die Positionen 660-641 des frdA – Gens umfasst
Vorliegende Arbeit
Tabelle 2: Verwendete Bakterienstämme und Plasmide für die Erstellung und Prüfung von A. pleuropneumoniae ΔfrpB
Stämme, Plasmide &
Primer
Charakteristika Quelle
Stämme A. pleuro- pneumoniae
wt
A. pleuropneumoniae Serotyp 7 Isolat 76
(Anderson et al., 1991) A. pleuro-
pneumoniae ΔfrpB
Unmarkierte frpB-negative - Deletionmutante von A.
pleuropneumoniae wt
Vorliegen- de Arbeit
Plasmide
pFtp-830
Plasmid, das durch die Ligation der Fragmente 1 und 2 (beide EraI-verdaut), anschließende Amplifikation mit Primern oFtp-1 und oFtp-4 und Klonierung in p-TOPO
konstruiert wurde.
Vorliegen- de Arbeit
pEFtp-715
Plasmid, das das deletierte frpB Gen aus pFtp-830 enthält. Das frpB Gen wurde auf einem NotI /PspOMI –
Fragment aus pFtp-830 in den mit NotI/PspOMI geschnittenen pEMOC2 ligiert.
Vorliegen- de Arbeit
pFtp-1300
Plasmid, das auf pLS88-basiert. Es trägt das PCR Product der Primer oFtp-9 und oFtp-8, das das frpB–
Gen (2342 bp) enthält und in den an der EcoRI–
Schnittstelle eröffneten pLS88 ligiert wurde.
Vorliegen- de Arbeit
Primer
oFtp-1
5´ACGTACGCGGCCGCGCGGAATGTTGTGGCGGTT T3´ Vorwärts-Primer mit einer internen NotI Schnittstelle (unterstrichen). Er umfasst die Positionen
233-253 vor dem frpB Startkodon.
Vorliegen- de Arbeit
oFtp-2
5´ ATGCCTCTTCCGCCGATACGCTGTTTATCGG3´ Rückwärts-Primer mit einer internen EarI Schnittstelle.
Er umfasst die Positionen 921-940 des frpB Gens.
vorliegende Arbeit
oFtp-3 5´ATGCCTCTTCCGGCGCCGAAGGGATTTGGTCT3´;
Vorwärts-Primer mit einer internen EarI Schnittstelle. Er umfasst die Positionen 1328-1345 des frpB Gens.
vorliegende Arbeit
oFtp-4
5´ ACGTAGGGCCCACGCTTCCGTTTCCGAATGG3´; Rückwärts-Primer mit einer internen PspoMI- Schnittstelle. Er umfasst die Positionen 362-382 nach
dem frpB Gen Stopkodon.
vorliegende Arbeit
oFtp-5 5´ GCCGGTATCGGTATAACGGA3´; Vorwärts-Primer, der die Positionen 354-374 nach dem Stopkodon des
frpB Gens umfasst.
vorliegende Arbeit
oFtp-6 5´ GCCAAACGTACGTCTTCGGT3´; Rückwärts-Primer, der die Positionen 555-575 vor dem frpB Stopkodon
umfasst.
vorliegende Arbeit
oFtp-9 5´ GGAAGCTAATCAAGCTACAC3´;Vorwärts-Primer , der die Positionen (56-76) nach dem frpB Startkodon
umfasst.
vorliegende Arbeit
oFtp-8 5´.GGAAGCTAATCAAGCTACAC 3´;Rückwärts-Primer , der die Positionen (303-323)nach dem frpB-Stopkodon
umfasst.
vorliegende Arbeit
3.1.1.1 Kultivierungsbedingungen
Escherichia coli wurde in Luria-Bertani (LB) Medium im Schüttelinkubator (Incubator Shaker Series 25, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) oder auf LB-Agar
im Brutschrank (Memmert GmbH + Co. KG, Schwalbach) bei 37°C kultiviert. Je nach Kultivierungsziel wurden Zusätze hinzugefügt.
Actinobacillus pleuropneumoniae wurde in PPLO-Medium bzw auf PPLO-Agar (jeweils supplementiert mit Ersatzisovitalex) kultiviert. Dem PPLO-Medium wurde zusätzlich Tween 80 (0,1 % v/v) zugefügt, um das Klumpen des Erregers bei der Anzucht zu verhindern.
3.1.1.2 Isolierung, Reinigung und Quantifizierung von Nukleinsäuren
Im folgenden wird die gewählte Vorgehensweise beschrieben; die Zusammensetzung der verwendeten Lösungen und Puffer zur Reinigung und Quantifizierung der DNA sind im Anhang (9.2.2) aufgeführt
3.1.1.3 Präparation chromosomaler DNA von A. pleuropneumoniae
1. PPLO-Platte beimpfen und übernacht bebrüten, Koloniematerial in 2,5 ml TE- Puffer resuspendieren.
2. 50 µl EDTA (0,5 M; Endkonzentration 10 mM), 250 µl SDS (10 %;
Endkonzentration 1%l) und 64 µl Proteinase K (20 mg/ml; Endkonzentration 500 μg/ml) wurden hinzugegeben, gemischt und 1 Stunde bei 55°C im Wasserbad inkubiert.
3. 25-50μl RNAse (10mg/ml; 100 μg/ml Endkonzentration) vor Gebrauch 10 min bei 100°C kochen, dann auf Eis stellen; Reaktion für 30 min bei 37°C
4. Phenol (250 μl) äqulibriert mit TE-Puffer wurde hinzugefügt, gemischt (vortexen) und bei -70°C über Nacht eingefroren.
5. Das Gemisch wurde bei 55°C aufgetaut und Chloroform:Isoamylalkahol (24:1)–
Gemisch (500 μl) wurde anschließend zur Trennung der Phasen dazugegeben.
6. Der Ansatz wurde bei 10.000 rpm (SA600-Rotor), bei 4°C für 5 min zentrifugiert, der Überstand wurde mit einer Plastik-Pasteurpipette entnommen und in ein neues Polypropylen-Röhrchen pipettiert.
7. Die Phenol/Chloroform Extraktion mit 500 μl (ca. 1/5 des Volumens) Chloroform:Isoamyl (24/1)-Gemisch wurde wiederholt und bei 10.000 rpm, 4°C 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Plastikröhrchen überführt.
8. Die DNA wurde mit 3M Na-Acetat pH 5,2 (250 μl, ca. 1/10 des Volumens) und Isopropanol (2,5 ml, ca. 1 Volumen) ausgefällt.
9. DNA-Fasern wurden mittels einer Pipettenspitze aufgewickelt, in 70% Ethanol für 5 min gewaschen und luftgetrocknet.
10. Die DNA wurde in 200 μl A. bidest. resuspendiert.
11. Die DNA wurde anschließend im Kühlschrank über Nacht aufbewahrt.
12. Die DNA wurde durch Elektrophorese von 1 μl der Präparation auf einem Agarosegel quantifiziert.
3.1.1.4 Alkalilysis-Verfahren zur Präparation von Plasmid DNA Drei ml Übernachtkultur (Schüttler) wurden abzentrifugiert.
1. Das Pellet wurde in 300 μl Tris-EDTA ( 50 mM Tris-HCl [pH 8,0]; 10 mM EDTA, 1 mg/ml RNAse) resuspendiert.
2. Dreihundert μl NaOH-SDS-Lösung (0,2 M NaOH, 1% [w/v] SDS) wurden hinzugegeben und bis zur Lyse der Bakterien bei Raumtemperatur (längstens 3 min) inkubiert.
3. Dreihundert μl 3,2 M K-Acetat-Puffer (pH 5,5) wurden zugegeben, die Suspension wurde gründlich gemischt und für 10 min bei 13.000 rpm zentrifugiert.
4. Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt.
5. Die Präzipitation erfolgte durch Zugabe von 600 μl eiskaltem Isopropanol bei Raumtemperatur.
6. Nach 10 min Zentrifugation bei 13.000 rpm wurde das Pellet getrocknet.
7. Das Pellet wurde in 25 μl A. dest. resuspendiert.
3.1.1.5 DNA-Aufreinigung mit “Nucleospin-Extract”
1. Das DNA Fragment wurde unter UV-Licht (280 nm) aus einem TAE-Agarosegel ausgeschnitten und gewogen.
2. 200 μl NT1-Puffer/100 mg Gel wurden zugegeben und im Wasserbad bei 55°C für 5 bis10 min bis zum vollständigen Lösen des Gels inkubiert.
3. Das aufgelöste Gel wurde auf ein Nucleospin-Säulchen geladen, bei 10.000 rpm für 1 min zentrifugiert und die Flüssigkeit verworfen.
4. 600 μl Waschpuffer wurden zugegeben und bei 13.000 rpm für 1 min zentrifugiert und das Eluat verworfen.
5. Das Säulchen wurde erneut für 5 Minuten zentrifugiert und das Eluat verworfen;
anschließend wurde es offen für etwa 10 Minuten stehen gelassen.
7. Die Kartusche wurde in ein neues ERG überführt, 25-50 μl A. bidest. wurden hinzugegeben und die an die Matrix gebundene DNA wurde durch Zentrifugieren bei 11.000 rpm für 1 min eluiert.
3.1.2 Plasmidkonstruktion 3.1.2.1 PCR für 2.1-TOPO-Cloning
1. Zu 2 μl des PCR Produktes wurden 1 μl Salzlösung, 1 μl steriles A. dest und 1 μl Vektor 2.1- TOPO hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 10 min inkubiert.
2. Fünfzig μl kompetente E. coli-Zellen wurden in ein Reaktionsgefäß pipettiert, die oben inkubierte Lösung wurde hinzugegeben und auf Eis für 10 min stehen gelassen.
3. Das Gemisch wurde anschließend im Thermoblock bei 42°C für 20 sek.
inkubiert und anschließend auf Eis gestellt.
4. Zweihundertfünfzig μl SOC-Medium (Zusammensetzung im Anhang, Kapitel 8.2) wurden nach dem Hitzeschock dazupipettiert und dann wurden die Zellen für 1 Stunde bei 37°C geschüttelt.
5. Auf LB-Platten mit Ampicillinzusatz (100 mg/ml) wurden 25 μl X-Gal Lösung (25 mg/ml [verdünnung mit 125 μl A. dest) ausplattiert.
6. Die Bakterien wurden auf Platten (Platte 1: 200 μl, Platte 2: 100 μl) fraktioniert ausplattiert und im Brutschrank bei 37°C über Nacht inkubiert.
7. Am nächsten Tag wurden die Platten überprüft und an weiβen Kolonien wurde eine PCR zum Nachweis des Inserts durchgeführt.
Die Zusammensetzung der angewendeten Puffer ist im Anhang aufgeführt (Kapitel 8.4).
3.1.2.2 Restriktionsenzymverdaus
Die Restriktionsenzymverdaus wurden in 25 μl Ansätzen (0,5 bis 1 μg DNA pro Ansatz) durchgeführt. Die DNA wurde mit A. dest., den jeweiligen
Lösung (10 mM) gemischt und bei 37°C für 2 Stunden inkubiert. Der Verdau wurde anschließend auf ein Agarosegel geladen und bewertet.
3.1.2.3 Auffüllen von Enden mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase Nach dem Restriktionsverdau mit den Enzymen BglII und XcmI wurden 0,5 μl einer dNTP-Stammlösung (je 10 mM dATP, dCTP, dTTP und dGTP) und 0,4 μl T4 – Polymerase/Klenow Fragment (Biolabs, Schwalbach Taunus, England) in den Ansatz (25 μl) gegeben und im Wasserbad (16°C) für 20 min inkubiert.
3.2 Agarosegelelektrophorese
Die als anionische Kettenmoleküle vorliegende DNA wandert in einem elektrischen Feld zur Anode. Die Laufstrecke ist innerhalb bestimmter Molmassenbereiche proportional zum Logarithmus ihrer Masse (SAMBROOK et al. 1989). Die Laufgeschwindigkeit wird auch von Molekülkonformation und von der verwendeten Gelkonzentration beeinflußt. Daher lassen sich DNA-Moleküle in einem Agarose-Gel unter der Wirkung des elektrisches Feldes nach ihrer Größe auftrennen.
Die Puffer, die Lösungen und der Marker sind im Anhang aufgeführt
1. Je nach Größe wurden die DNA-Fragmente im 0,8-1,5 %igen Gel aufgetrennt.
2. Für das Gießen eines Gels wurde die erforderliche Menge der Agarose in entsprechendem Puffer (1 x TAE/0,5 x TBE) unter Kochen gelöst, in einem 55°C Wasserbad abgekühlt und mit Ethidiumbromid (1 μl Stammlösung [10 mg/ml] pro 50 ml) versetzt.
3. Das Gel wurde in einen Gelträger gegossen
4. Nach dem Erstarren wurde der Gelträger in eine Elektrophoresekammer mit Laufpuffer eingelegt.
5. Die Proben wurden mit entsprechendem Ladepuffer versetzt und, genauso wie HindIII-verdaute λ-DNA als Größenstandard, in die Geltaschen geladen.
6. Die Spannung und die Zeit der Auftrennung wurden entsprechend Größe und Konzentration des Gels und der Größe der DNA-Fragmente eingestellt (etwa 10 V pro cm Gelbreite).
7. Nach Auftrennung wurden die DNA-Fragmente unter UV-Licht beurteilt oder mit dem Biorad MultiAnalyst-System fotografiert.
3.3 Ligation
Zur Ligation wurden Vektor (0,1 μg DNA), Insert (im Überschuss), A. dest., 2 x Ligasepuffer und T4-DNA-Ligase in einem 20 μl Ansatz gemischt und bei 16°C über Nacht inkubiert. Ein Ansatz ohne Insert und ohne Ligase sowie ein Ansatz ohne Insert und mit Ligase dienten als negative Kontrolle. Dabei wurde der 2 x Ligasepuffer auf Eis gekühlt, 10 µl wurden für Ansatz 1 entnommen, dann wurde die Ligase hinzugegeben und in die auf Eis stehenden Ansätze 2, 3 und 4 wurden jeweils 10 µl Ligase-haltiger Puffer pipettiert.
Tabelle 3: Zusammensetzung des Ligationsgemisches
Ligation 1 Ligation 2 CIP-Kontrolle Negativkontrolle
Vektor 2,5 µl 2,5 2,5 µl 2,5 µl
Insert 2,5 µl 7,5 - -
Wasser 5 - 10 10
2 x Ligasepuffer 10 µl 10 12,5 µl 12,5 µl
Ligase + + + -
3.4 Transformation
3.4.1 Herstellen von chemisch kompetenten Zellen
1. Escherichia coli DH5α wurde auf LB-Agar ausplattiert und im Brutschrank bei 37°C über Nacht bebrütet.
2. Eine Einzelkolonie wurde in 3 ml LB-Medium mit 20 mM MgCl2 angeimpft und als Standkultur bei 37°C über Nacht inkubiert.
3. 150 ml LB-Medium mit 20 mM MgCl2 (über Nacht vorgewärmt) wurden mit der Standkultur beimpft und bei starkem Schütteln bebrütet.
4. Bei OD von 0,3-0,4 wurde die Kultur auf Eis gestellt und in vorgekühlter
5. Der Überstand wurde verworfen; das nach dem Abgießen verbleibende Restmedium wurde vorsichtig mit einer Pipette entfernt.
6. Das Pellet wurde in 30 ml TFB1 (eiskalt, pH 5,8) resuspendiert und mindestens 90 min auf Eis gestellt.
7. Die Bakterien wurde bei 4°C, 4.000 x g, 10 min pelletiert, der Überstand verworfen und das Restmedium mit einer Pipette abgenommen.
8. Das Pellet wurde in 5 ml TFB2 Lösung (pH 6,5) resuspendiert und für maximal 30 min auf Eis gehalten.
9. Das Abfüllen erfolgte in vorgekühlte Eppendorfreaktionsgefäße (Aliquots ca.
250 μl/ Reaktionsgefäß) und die Aliquots wurden bei – 70°C eingefroren.
Die Zusammensetzung der angewendeten Puffer ist im Anhang aufgeführt (Kapitel 8.4).
3.4.2 Transformation von chemisch kompetenten E. coli DH5α Zellen mit Plasmiden
1. Kompetente Zellen (DH5αF’) wurden aus –70°C entnommen und auf Eis aufgetaut.
2. Zu 100 μl kompetenten Zellen wurden 10 μl Ligationsansatz gegeben.
3. Das Gemisch wurde für 1 Stunde auf Eis gestellt und anschließend im Thermoblock bei 42°C für 3 min inkubiert.
4. Nach dem Hitzeschock wurden die Ansätze für 2 min auf Eis gestellt.
5. Zweihundert μl LB-Medium wurden hinzugegeben und die Suspension wurde im Brutschrank bei 37°C für eine Stunde inkubiert.
6. Die Bakterien wurden auf ½ vorgetrocknete Agarplatte mit entsprechendem Antibiotikum ausplattiert und mit der Öse fraktioniert.
7. Die Platten wurden bei 37°C inkubiert und Kolonien nach 12 – 16 Stunden beurteilt.
3.4.3 Elektrotransformation von Actinobacillus pleuropneumoniae 3.4.3.1 Herstellung elektrokompetenter Zellen.
1. 50 ml supplementiertes PPLO-Medium wurden mit 0,1% Tween80 versetzt und mit einer Einzelkolonie beimpft und über Nacht bei 37°C mit 5% CO2 inkubiert;
250 ml supplementiertes PPLO-Medium mit 0,1 % Tween 80 wurden über Nacht bei 37% mit 5% CO2 vorgewärmt.
2. Die 250 ml Medium wurden mit 25 ml der Übernachtkultur beimpft und bei 37°C im Schüttler bis zu einer OD600 von 0,3 – 0,4 inkubiert.
3. GYTT-Medium wurde für 20-30 min zum Vorkühlen auf Eis gestellt.
4. Die Bakterien wurden bei 4°C in der vorgekühlten Zentrifuge bei 5.000 rpm für 10 min abzentrifugiert, der Überstand wurde verworfen.
5. Das Bakterienpellet wurde dreimal vorsichtig mit eiskaltem GYTT-Medium (50 ml, 30 ml, 20 ml) gewaschen und der Überstand wurde nach dem Zentrifugieren (5.000 rpm, 4°C, 10 min) jeweils mit einer Pipette abgenommen.
6. Die Bakterien wurden in einem Endvolumen von 1,5-2 ml eiskaltem GYTT aufgenommen und am selben Tag transformiert.
7. Die Reinheit der transformierten Bakterien wurde auf supplementiertem PPLO- Agar und auf Blutagar überprüft.
3.4.3.2 Elektrotransformation
1. Die Elektroporationsküvetten wurden auf Eis gestellt, supplementiertes PPLO- Medium wurde in 5% CO2 bei 37°C vorgewärmt (1 ml je Ansatz).
2. 2-5 μg (10 μl) dialysierte DNA und 200-300 μl kompetente Zellen wurden in die vorgekühlten Küvetten gegeben und 20-30 min auf Eis gestellt.
3. Der Genpulser wurde auf 2,5 KV, 25 μFD und 1000 Ω eingestellt.
4. Wassertropfen an der Außenseite der Küvette wurden vor dem Einstellen in den Gen-Pulser getrocknet und die Elektroporation wurde durchgeführt.
5. Sofort nach der Elektroporation wurde 1 ml vorgewärmtes PPLO-Medium in die Küvetten gegeben und gemischt. Der Gesamtinhalt wurde in Polypropylen- Röhrchen überführt und für 2 – 3 Stunden bei 37°C bebrütet.
6. Transformierte Zellen wurden anschließend auf Agar mit den entsprechenden Antibiotika ausplattiert und über Nacht bei 37°C, 5% CO2 inkubiert.
7. Platten wurden am nächsten Tag beurteilt
3.5 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Bei einer Polymerse-Kettenreaktion (PCR) wird ein DNA-Fragment bestimmter Länge exponentiell vervielfältigt.
Verwendete Primer sind in der Tabelle ( 1 und 2) aufgeführt.
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde wie folgende durchgeführt:
1. Der Mastermix wurde erstellt (Tabelle 4); 0,1 μl Taq-Polymerase pro Ansatz wurde zum auf Eis gekühlten Mastermix gegeben.
2. Zwanzig μl Mastermix mit Taq-Polymerase wurden in die PCR-Gefäße pipettiert.
3. Fünf μl Template (DNA oder Kolonie resuspendiert in 100 μl 0,1% TE]) wurden in PCR-Gefäße pipettiert.
4. Die PCR-Reaktionen (mit Positiv- und Negativkontrollen) wurden in den Thermocycler gestellt und das Fumarat Programm (94°C 3 min; [94°C 30 sek., 55°C 1 min, 72°C 2 min 30 sek.] x 33 Zyklen; 72°C 10 min) wurde anschließend gestartet.
5. Nach Beendigung der PCR wurden die Proben entnommen und auf Agarose Gele (1,5 %) geladen oder bei – 20°C eingefroren.
Tabelle 4: Mastermix-Zusammensetzung
Stammlösung Endkonzentration Volumen (µl)
A. bidest. - - 11
MgCl2 50 mM 1,5 mM 0,75
PCR-Puffer 10 X 1 X 2,5
dNTP 10 mM (je Nukleotid) 0,2 mM (je Nukleotid) 0,5
Vorwärts-Primer 5 pmol/µl 0,5 pmol/µl 2,5
Rückwärts-Primer 5 pmol/µl 0,5 pmol/µl 2,5
Taq-Polymerase 5 U/µl 0,5 U/Ansatz 0,1 µl
Template DNA - - 5 µl
Endvolumen 25µl
Tabelle 5:-PCR-Arbeitsprotokoll
Datum: Template: [ ] Plasmid [ ] chrom. DNA [ ] Kolonie
Primer:
Volumen und benötigte Mengen/
Ansatz:
benötigte Ansätze:
Annealingtemp.: ___ °C Elongation: ___:___ 72°C Mastermix
[ ] 25 µl [ ] 50 µl [ ] anderes:
_____ µl ____
PCR-
Puffer 10 x 2,5 µl 5 µl ___ µl ___ µl MgCl2 0, 75 µl 1,5 µl ___ µl ___ µl dNTPs 10
mM each 0,5 µl 1 µl ___ µl ___ µl Primer 1
5 pmol/µl 2,5 µl 5 µl ___ µl ___ µl Primer 2
5 pmol/µl 2,5 µl 5 µl ___ µl ___ µl H2O 11,15 µl 27,3 µl ___ µl ___ µl
Zyklen: 32 [ ] anders: ___
Proben:
Taq 0,1 µl 0, 2 µl ___ µl ___ µl Cycler:
Template 5 µl 5 µl ___ µl ___ µl Start:
3.6 Konjugation von E. coli und A. pleuropneumoniae Die verwendeten Puffer sind im Anhang aufgeführt (Kapitel 9.6)
1. Donorstamm (E. coli ß2155 mit pEMOC2-Derivat) und Rezipientenstamm (A.
pleuropneumoniae wt) wurden auf festem Nährboden über Nacht (max. 14 Stunden) kultiviert.
2. Die Kulturen wurden mit einem Wattetupfer von der Platte abgenommen, in 3 ml vorgewärmtem TNM-Puffer resuspendiert und auf eine OD600 von 2 eingestellt.
3. Nitrozellulosefilter (Durchmesser 2,5 cm; Porenweite 0,45 μm) wurden auf Whatman 3MM Filterpapier gelegt (erwärmt auf 37°C); 50 μl Donorzellen und 400 μl Rezipientenzellen wurden vorsichtig gemischt, auf die Nitrozellulose- membran aufgebracht, über die gesamte Membran verteilt, und inkubiert, bis die
4. Die noch leicht feuchten Membranen wurden auf vorgewärmtem PPLO Agar, supplementiert mit 1% EIVX, 1 mM DAPI, 10 mM MgSO4 gelegt und ca. 7 Stunden bei 37°C und 5% CO2 inkubiert; für jede Membran wurde eine PPLO- EIVX-Chloramphenicol (Cm, 5 μg/ml) Platte zum Vortrocknen in den Inkubator gelegt.
5. Die Filter wurden abgenommen, in ERG verbracht und mit ca. 650 μl PPLO Medium (supplementiert mit EIVX) durch vortexen abgewaschen.
6. Der Inhalt wurde auf eine vorgetrocknete supplementierte PPLO-EIVX-Cm- Platte aufgebracht und bei 37°C, 5% CO2 inkubiert.
7. Die Trankonjuganten wurden durch PCR überprüft.
3.6.1 Saccharose-Gegenselektion
Die verwendeten Medien sind im Anhang aufgeführt (Kapitel 9.2).
1. Eine chloramphenicolresistente Kolonie wurde morgens in 1 ml vorgewärmtem supplementiertem PPLO-Medium inokuliert und im Schüttler (37°C) für 2 Stunden (bis zum Auftreten einer leichten Trübung) inkubiert.
2. Vierhundert μl 2,5-fach konzentriertes PPLO Medium 500 μl 40% Saccharose, 100 μl steriles Pferdeserum und 10 μl EIVX wurden zugegeben.
3. Die Kultur wurde für 5-6 Stunden weiter geschüttelt. Im Anschluss wurden 50 μl von der Kultur auf einer halben supplementierten PPLO-Platte ausplattiert, über die restliche Hälfte der Platte fraktioniert und über Nacht bei 37°C im CO2- Inkubator (5 % CO2) bebrütet
3.6.2 Southern Hybridisierung
Puffer und Lösungen zum DNA-Transfer, zur Herstellung einer Gensonde und zur Southern-Hybridisierung sind im Anhang aufgeführt
3.6.3 Southern Blot
Der DNA-Transfer aus Agarose-Gelen auf eine Nylonmembran erfolgte als Kapillarblot. Zuerst wurde ein Agarose-Gel mit zur Markierung aufgelegtem Lineal unter UV-Licht fotografiert. Dann wurde das Gel mit dem folgende weiter bearbeitet:
1. Die Depurinierung wurde in Depurinierungslösung für 15 min durchgeführt
2. Die Denaturierung der DNA erfolgte in Denaturierungslösung für 1 Stunde (3 x 20 min)
3. Die Neutralisation wurde in Neutralisierungslösung für 1 Stunde (3 x 20 min) vorgenommen.
4. Der Unterbau in einer Plastikschale wurde mit 2 Lagen 3MM Filterpapier bedeckt und mit Puffer bedeckt (10 × SSC) ; das Filterpapier wurde mit Puffer bedeckt.
5. Das Gel wurde mit Unterseite nach oben auf das Filterpapier gelegt.
6. Ein genügend großes Stück Tropilon–45 Membran (rundum ca. 2 mm größer als das Gel) wurde mit A. dest. angefeuchtet und unter Vermeidung von Luftblasen aufgelegt.
7. Zwei Lagen Filterpapier (2 mm < Membran) wurden trocken aufgelegt.
8. Mehrere Lagen Papierhandtücher wurden als Saugkissen aufgelegt.
9. Ca. 500 g Gewicht wurde aufgelegt (je nach Gelgröße; das Gewicht wurde so bemessen, dass Papierhandtücher gerade eben zusammengedrückt sind).
10. Nach einer Blottingdauer von 0,5-15 Stunden wurden die Auflagen entfernt.
11. Das Gel wurde mit der Membran zusammen umgedreht, die Geltaschen (mit Bleistift) und Seiten (Ecke abgeschnitten) wurden markiert.
12. Das Gel wurde abgezogen und entsorgt.
13. Die Membran wurde 5 min in 5 x SSC geschwenkt.
14. Die Membran wurde in Papierhandtüchern getrocknet und 2 Stunden bei 90°C gebacken.
15. Die gebackene Membran wurde in A. dest. angefeuchtet und in 6 x SSC Lösung für 2 min geschwenkt.
16. Die Membran wurde eingerollt und mit ausreichend Hybrisierungspuffer (50 ml) in einer Glasröhre für ca. 2 Stunden im Hybrisierungsofen inkubiert (Prähybridisierung).
17. Die Flüssigkeit wurde abgegossen, Hybrisierungspuffer (10 ml) und 5 min gekochte Gensonde (ca. 50 μl) wurden dazugegeben, und die Membran wurde über Nacht (bei ca. 60 °C) hybridisiert.
Nach Abgießen des Hybridisierungspuffers und der Sonde wurde die Membran mit 1 x SSC + 0,5 % SDS ca. 1 Stunde (Waschpuffer 3 x gewechselt) bei 60°C gewaschen.
1. Ein alter Film wurde als Unterlage mit Frischhaltefolie überzogen; die Blots wurden darauf aufgelegt und mit Folie bedeckt.
2. Auf diese zweite Lage Frischhaltefolie wurden drei Stückchen Klebeband geklebt und mit radioaktiver Tinte Kreuze als Markierung gemacht.
3. Die Blots wurden in eine Röntgenkassette eingelegt; der Film (Kodak X-OMAT AR, Sigma, Deisenhofen) wurde direkt auf Blots gelegt; eine Verstärkerfolie wurde darauf gelegt, und der Film bei -70°C exponiert (Dauer je nach Aktivität des Blots).
3.6.4 Herstellen einer Gensonde nach der „Random-Priming“ Methode Es wurden zusammenpipettiert (für 25 µl Gesamtansatz):
5 μl OLB
1 μl acetyliertes BSA (10 mg / ml)
5 μl DNA (20 -30 ng ) vorher 5 min bei 100 °C, kurz auf Eis 10.5 μl A. dest.
1 μl T4-DNA-Polymerase (Klenow-Fragment) 2.5 μl dCTP-32*
Das Gemisch wurde übernacht bei RT inkubiert, dann wurden 100 μl STOP-Puffer hinzugefügt.
3.7 Pulsfeld-Gel-Elektrophorese (PFGE) Puffer, Lösungen und Marker sind im Anhang aufgeführt
1. Eine Platte supplementierte PPLO-Agar wurde am ersten Tag mit A.
pleuropneumoniae beimpft und im Brutschrank bei 37°C und 5 % CO2 bebrütet.
2. Das Koloniematerial wurde am zweiten Tag von der Platte abgeschwemmt und in 3 ml Pett IV Puffer resuspendiert.
3. Die Suspension wurde auf eine OD600von 0,3 eingestellt.
4. Fünf ml Bakteriensuspension in Pett IV Puffer wurden bei 4°C und 4.000 rpm für 10 min abzentrifugiert, der Überstand wurde abgegossen und das Pellet in 0,5 ml Pett IV Puffer resuspendiert und gut durch Vortexen gemischt.
5. Das Röhrchen mit Bakteriensuspension wurde auf Eis gestellt.
6. Für je 10 Blöckchen wurde 1 ml einer 1,2% igen Agarose ( Biorad # 162-0135;
Agarose Chromosomal Grade Biorad, 25 g) angefertigt und in einem 55°C Wasserbad aufbewahrt.
7. 0,5 ml warme Agarose wurde schnell in das Röhrchen mit der vorher vorgewärmten Bakteriensuspension überführt und vorsichtig gemischt.
8. Mit einer 1 ml-Pipette wurden je 100 μl der agarosehaltigen Suspension in gereinigte Gießförmchen pipettiert.
9. Die Förmchen wurden für 10 min in den Kühlschrank gestellt.
10. Nach Entfernung von überstehender Agarose von den Gießförmchen wurden je 5 Blöckchen mit umgebogenem Glas-„Pasteurhäkchen“ aus dem Gießstand gestoßen und in ein Röhrchen mit 3 ml Lysepuffer überführt
11. Die Blöckchen wurden in der Lysepufferlösung für 2 Stunden bei 37°C im Brutschrank in Schräglage ohne schütteln inkubiert.
12. Die Lyselösung wurde abgegossen, jedem Röhrchen wurden 3 ml ESP-Puffer zugegeben und über Nacht bei 55°C im Wasserbad ohne Schütteln inkubiert.
13. Der ESP-Puffer wurde abgegossen, die Blöckchen wurden mit 3 ml A. dest.
gewaschen und bei Raumtemperatur 15 min waagerecht sanft geschwenkt.
14. Das A. dest. wurde abgegossen und in jedes Röhrchen wurden 2 ml TE-PMSF- Gemisch gegeben und 30 min bei Raumtemperatur sanft geschwenkt.
15. Der TE-PMSF-Puffer wurde abgegossen, 3 ml A. dest. wurden zugegeben und die Röhrchen für 15 min bei Raumtemperatur sanft geschwenkt.
16. Das A. dest. wurde abgegossen, 3 ml TE-Puffer wurden hinzugefügt und die Röhrchen wurden für 30 min bei Raumtemperatur waagerecht geschwenkt.
17. Der TE-Puffer wurde abgegossen und frischer TE-Puffer zugegeben und 30 min bei Raumtemperatur geschwenkt.
18. Der TE-Puffer wurde abgegossen.
19. Fünf ml TE-Puffer wurden hinzugefügt und die Blöckchen über Nacht (oder länger) im Kühlschrank aufbewahrt und anschließend verdaut (Tabelle 5).
20. Die Auftrennung der Makrorestriktionsfragmente erfolgte in einem 1%-igen TBE- Agarose-Gel.
21. Zur Herstellung des Geles wurde die erforderliche Menge Agarose in 0,5 x TBE durch Aufkochen gelöst und nach Abkühlen bei 55°C in eine Flachbettapparatur mit eingesetztem PVC-Kamm zur Erzeugung der Probentaschen gegossen.
22. Der Kamm wurde nach Erstarren des Gels entfernt und die verdauten Blöckchen wurden vorsichtig in die Slots eingesetzt.
23. Eine dünne Scheibe von Lambda Ladder PFG-Marker (50 μg/ml von NEB, Schwalbach, Taunus, England) wurde als Größenstandard genutzt.
24. Befüllte Slots wurden mit erwärmter Agarose versiegelt und 15 min stehen gelassen.
25. Nach Befestigung der Umrandung in der PFGE-Kammer wurde das Gel in die Kammer gelegt.
26. Der Laufpuffer wurde vorsichtig in die Kammer gegossen.
27. Das Programm wurde anschließend bei einer Temperatur von 12°C, einem Spannungsgradienten von 6 V/cm bei eingeschlossenem Winkel von 120° auf Pulszeiten von 10 bis 20 sek. (Block I, 14 Stunden) sowie von 35 bis 70 sek.
(Block II, 12 Stunden) eingestellt.
28. Nach der Beendigung der Auftrennung wurde das Gel in Ethidiumbromidlösung (1:20.000; 25 μl Ethidiumbromid Stocklösung [10 mg/ml] auf 500 ml A. dest.) für 15 min gefärbt.
29. Das Entfärben erfolgte danach in A. dest. für 15 min.
Tabelle 6: Verdau der Blöckchen
ApaI Verdau AscI Verdau NotI Verdau
Puffer (NEB) 25 μl 25 μl 25 μl
BSA (NEB) 2,5 μl - 2,5 μl
ApaI 10 U - -
AscI - 10 U -
NotI - - 10 U
A. dest ad. 250 μl 250 μl 250 μl
Jeweils 1/3 Blöckchen wurde mit einem Enzym verdaut. Ansätze mit ApaI wurden jeweils bei 25°C und Ansätze mit AscI und NotI bei 37°C über Nacht inkubiert.
3.8 Sequenzierung
Die Nukleotidsequenzierung wurde von der Firma Seqlab (Göttingen, Deutschland) an einem ABI-PRISM-Sequenziergerät (Modell 3700) mit der Kettenabbruchmethode nach SANGER (SANGER et al. 1992) durchgeführt
3.9 Fumeratreduktase Enzymtest
3.9.1 Bestimmung der Aktivität der Fumaratreduktase.
Für den Enzym-Assay werden zusammenpipettiert: 20 μl Lösung B, 20 μl Lösung C,, 360 μl Lösung A mit 400 μl Probe oder Blank (50 mM Tris [pH 7.3]) und bei Raumtemperatur inkubiert
Die 400 μl der zusammenpipettierten Lösungen A bis C werden in UV-Küvetten überführt (UV-Küvette Mikro, #759200, Plastibrand von Brand), ins Photometer (Ultrospec III, Pharmacia) gestellt, und bei 340 nm gemessen (Lichtquelle:Tungsten).
Vierhundert μl Blank (Lösung A) oder Probe (Ganzzelllysat in Lösung A) werden zugegeben, gemischt, und die Extinktion wird über über einen Zeitraum von 6 min 1 x pro Minute gemessen.
Die verwendeten Lösungen sind
Lösung A: 50mM TrisHCl [pH 7,3], aufbewahrt bei 4°C Lösung B: 335mM Natriumfumarat
Lösung C: 4,65mM NADH
3.10 Präparation der äußeren Membran ( integrale Membrane )
1. Zellpellet von 250 ml Kultur in 2,0 ml Tris-Sacchrose-Puffer lösen (50 mM Tris [pH 8,0],. 25% Saccharose) und bei -70 C einfrieren
3. Auftauen und 0,5 ml Lysozymlösung hinzugeben (10 mg/ml in 250 mM Tris ([pH 8,0])
4. 15 min auf Eis lassen
5. 2 ml Sarcosyllösung (5%) hinzugeben ( Endkonzentation soll 2% sein)
7. Zentrifugation (ca.15.000 rpm, 4 °C) 8. Ultrazentrifugation bei 4 °C
3.10.1 SDS-PAGE (Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese)
Gießen des Gels:
1. Glasplatten im Gießstand zusammenbauen
2. Das Trenn- und Sammelgel in je einem kleinen Becherglas anrühren (bis auf APS; Ammoniumpersulfat)
3. APS muss immer frisch angesetzt werden, man benötigt eine 10 % Lösung 4. Um die Kammer nach unten abzudichten, in einem ERG 50 μl APS und 700 μl
Trenngelansatz mischen, davon je die Hälfte pro Gel mit der Pipette zwischen die Glasplatten füllen und ca. 5 min abwarten bis diese Schicht fest ist, dann APS zum Trenngel und Sammelgel geben und mischen
5. Das Trenngel gießen, bis ca. 0,5 cm unterhalb des Bodens der Wells
6. Danach vorsichtig das Sammelgel darüber gießen bis es zwischen den Glasplatten hervorquillt, dabei die Kammer möglichst waagerecht halten um zu gewährleisten, dass durch das Gießen des Sammelgels keine „Delle“ im Trenngel entsteht
7. Die Kämme einstecken. Die Kämme werden beim Einstecken etwas schräg gehalten, um Luftblasen in den Wells / Taschen zu vermeiden. Wenn Luftblasen zu sehen sind, diese vorher mit dem Kamm an die Seite drücken.
8. Das Gel nach dem Polymerisieren (ca. 1 h) in die Elektrode klemmen und in die Kammer stellen. Die innere Kammer mit Laufpuffer füllen
9. Das Gel mit den vorbereiteten Proben laden, dazu kann man das Gel schräg in die Kammer hängen
10. Die Kammer mit Laufpuffer auffüllen
11. Den Deckel auf die Kammer setzen und die Kammer anschließen Das Gel bei 150 V ca. 75 min laufen lassen
