Untersuchung der Diffusion einzelner Moleküle während radikalischer Polymerisationen in Masse
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades des Doktors der Naturwissenschaften
an der Universität Konstanz Fachbereich Chemie
vorgelegt von
Beate Katharina Stempfle
Tag der mündlichen Prüfung: 19.02.2016
Arbeitsgruppe aufgenommen hat, für seine Unterstützung bei der Anfertigung dieser Arbeit und dass er immer ein offenes Ohr für meine Fragen hatte.
Prof. Andreas Zumbusch danke ich für die Finanzierung, die vielen anregenden Diskussionen im Seminar und die Übernahme des Zweitgutachtens.
Bei Prof. Rainer Winter bedanke ich mich für die Übernahme des Prüfungsvorsitzes.
Ich danke Prof. Dr. Arndt und Anna Große für die gute Kooperation, dass sie mir Materialien zur Verfügung gestellt haben und natürlich für ihre stetige Diskussionsbereitschaft.
Bei Bente Flier bedanke ich mich, dass sie meine vielen Fragen immer geduldig und sehr ausführlich beantwortet hat. Ohne Dich wäre ich nicht weit gekommen!
Franziska Rabold danke ich für ihre Hilfe im Allgemeinen und fürs Tracken im Besonderen.
Bei Maren Dill möchte ich mich für die gute Zusammenarbeit während des Polymerisationsprojekts bedanken, dafür dass wir so oft miteinander über unsere Forschung diskutiert haben und für ihre Einführung in die Benutzung eines FCS- Aufbaus.
Martin Winterhalder danke ich für seine Hilfsbereitschaft besonders bei Fragen bezüglich Optik und für das Korrekturlesen.
Simon Böhm danke ich für die Einführung in die Weitfeldmikroskopie.
Bei meinen Kooperationspartnern der AG Mecking Friederike Schütze und Benjamin Scheinhardt bedanke ich für die gute Zusammenarbeit.
Ich danke Lars Bolk für GPC- und DSC-Messungen, Marina Krumova für die Einführung am AFM.
Den Mitarbeiterpraktikanden Martin Grützke, Maximilian Urban, Stefan Schütter, Christian Häge und den Bachelorstudenten Alex Oppermann und Thomas Schmidt danke ich für ihre engagierte Mitarbeit in den verschiedenen Projekten.
Zeitschriftenbeiträge:
1) B. Stempfle, M. Dill, M. J. Winterhalder, K. Müllen, D. Wöll; Single Molecule Diffusion and Its Heterogeneity during the Bulk Radical Polymerization of Styrene and Methyl Methacrylate; Polymer Chemistry 2012, 3, 2456-2463.
2) D. Wöll, C. Kölbl, B. Stempfle, A. Karrenbauer; A novel method for automatic single molecule tracking of blinking molecules at low intensities; Physical Chemistry Chemical Physics 2013, 15, 6196.
3) B. Scheinhardt, J. Trzaskowski, M. C. Baier, B. Stempfle, A. Oppermann, D. Wöll, S.
Mecking; Anisotropic Polyethylene Nanocrystals Labeled with a Single Fluorescent Dye Molecule: Toward Monitoring of Nanoparticle Orientation;
Macromolecules 2013, 46, 7902.
4) B. Stempfle, A. Grosse, B. Ferse, K.-F. Arndt, D. Wöll; Anomalous diffusion in polymer-clay composite hydrogels probed by widefield fluorescence microscopy; Langmuir 2014, 30, 14056.
Poster:
1) B. Stempfle, M. Dorfschmid, D. Wöll; Diffusion during Radical Bulk Polymerization of Styrene and Methyl Metacrylate; European Polymer Congress 2011, Granada
2) B. Stempfle, M. Dill, D. Wöll; Single Molecule diffusion and its heterogeneity during bulk polymerisation; HRMSC Summer school, Wijk aan Zee 2012
3) B. Stempfle, D. Wöll; Diffusion of single labeled clay platelets in a temperature sensitive hydrogel observed with fluorescence microscopy; International Conference on Photochemistry, Leuven 2013
2 Grundlagen der Mikroskopie ... 5
2.1 Fluoreszenzmikroskopie ... 8
2.1.1 Grundlagen der Fluoreszenz ... 8
2.1.2 Historie der Fluoreszenzstudien an einzelnen Molekülen ... 9
2.1.3 Vorteile von Einzelmoleküluntersuchungen ... 10
2.1.4 Anforderungen an Farbstoffe für Einzelmolekülstudien ... 11
2.1.5 Probleme und Herausforderungen bei der Einzelmolekülfluoreszenz- detektion ... 13
2.2 Methoden der Fluoreszenzmikroskopie ... 16
2.2.1 Fluoreszenzanregung in der Einzelmolekül-Weitfeldmikroskopie ... 17
2.2.2 Fluoreszenzanregung mit konfokaler Beleuchtung ... 19
2.3 Einzelmolekül-Weitfeldmikroskopie zur Untersuchung von Polymeren... 21
2.4 Raman-Streuung ... 24
3 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchung von Bewegungen ... 27
3.1 Aufbau des Weitfeldmikroskops ... 27
3.2 Analyse der Bewegung einzelner Moleküle ... 29
3.3 Positionierung... 29
3.4 Ermittlung der Trajektorien aus den Positionen ... 33
3.5 Bestimmung des Diffusionskoeffizienten aus einer Trajektorie ... 34
3.5.1 Das mittlere Verschiebungsquadrat MSD ... 34
3.5.2 Analyse Trajektorienradius RT ... 37
4.4 Probenpräperation für radikalische Polymerisationen ... 47
4.5 Raman-Spektroskopie zur Umsatzbestimmung... 48
4.5.1 Referenzkurve ... 51
4.6 Zeitabhängige Entwicklung des Umsatzes der radikalischen Massepolymerisation ... 54
4.7 Farbstoffgrößenabhängige Diffusion ... 58
4.8 Verteilung der Diffusionskoeffizienten ... 63
4.9 Diskussion der Ursachen der unterschiedlichen Entwicklung der Polymerisationsverläufe ... 66
5 Nanokomposit-Hydrogele ... 76
5.1 Polymere für Nanokomposit-Hydrogele ... 76
5.2 Volumenphasenübergang ... 77
5.3 Tonpartikel ... 78
5.4 Nanokomposit-Hydrogele ... 79
5.5 Untersuchungen der Dynamik des VPÜ ... 82
5.6 Fragestellung ... 83
5.7 Markierung der Tonpartikel ... 84
5.7.1 FCS-Messungen der markierten Partikel ... 89
5.8 Herstellung des Nanokomposit-Hydrogels ... 91
5.9 Weitfeldmikroskopieuntersuchungen an Nanokomposit-Hydrogelen ... 93
5.9.1 Konzentrationsabhängiges Verhalten ... 94
5.9.2 Temperaturabhängiges Verhalten ... 95
6 Beschreibung und Evaluierung eines Tracking-Algorithmus für Einzelmoleküle . 100 6.1 Vergleich von manueller und automatischer Wegfindung ... 104
7 Analyse der Orientierung von Einzelmolekülen ... 108
7.1 Analyse von Defokussierungsmustern ... 108
7.1.3 Modifizierung des optischen Aufbaus ... 113
7.1.4 Fehlerbetrachtung zur Analyse der defokussierten Weitfeldmikroskopie115 7.1.5 Untersuchung fluoreszenzmarkierter PE-Nanopartikel ... 117
7.1.6 Diskussion ... 119
8 Experimentalteil ... 121
8.1 Standardprozedur zum Reinigen von Glasgeräten ... 121
8.2 Referenzproben für die Raman-Spektroskopie ... 121
8.3 Zur Analytik verwendete Geräte ... 122
9 Zusammenfassung... 124
9.1 Ausblick ... 128
10 Abkürzungsverzeichnis ... 130
11 Literatur ... 133
1 Einleitung
Die Mikroskopie fasziniert die Menschen dadurch, dass sie ihnen ganze Welten enthüllt, welche zu klein sind um mit dem bloßen menschlichen Auge erkannt werden zu können. Im Laufe der Zeit wurden die optischen Mikroskope immer weiter verbessert.
Dabei war die Fluoreszenzmikroskopie in ihren Anfängen nur ein Kontrastverfahren von vielen. Die Entwicklung stärkerer Lichtquellen, wie Laser und in neuerer Zeit LED- Lampen und empfindlicherer Detektoren, trug zur zunehmenden Bedeutung der Methode bei. Zudem wurden neue, selektive Markierungsmethoden, z.B. durch fluoreszierende Proteine erforscht. Damit bietet die Fluoreszenzmikroskopie gerade für Untersuchungen in biologischen Systemen den großen Vorteil, dass Zellen und ihre Bestandteile selektiv angefärbt werden können. Selbst wenn das gefärbte Objekt kleiner als die Auflösung des Mikroskops sein sollte oder nur wenige Marker vorhanden sind, können diese mit hohem Kontrast gegenüber ungefärbten Bereichen abgebildet werden.[1]
Heute ist es sogar möglich, das Fluoreszenzsignal eines einzelnen Moleküls zu beobachten. Bei der Einzelmolekülmikroskopie und -spektroskopie werden einzelne Moleküle als Sonden eingesetzt, über deren Fluoreszenzsignal Aussagen über die jeweilige Nano-Umgebung ermöglicht werden. Es wird nicht nur ein Mittelwert eines Molekülensembles erhalten. Stattdessen ergibt sich aus der Gesamtheit der Einzelwerte der untersuchten Sonden eine Verteilung. Die Form dieser Verteilung liefert jedoch deutlich mehr Informationen als ihr Mittelwert allein, z.B. über die Breite der Streuung, das Auftreten mehrerer Maxima oder ihre Symmetrie.[2, 3] Seltene Ereignisse können so einfacher erkannt werden. Dabei kann sowohl die räumliche Heterogenität eines Systems, wie auch die zeitabhängige Änderung von Einzelmolekülparametern untersucht werden. Des Weiteren ist bei Einzelmolekültechniken bei der Untersuchung zeitabhängiger Prozesse keine Synchronisation nötig.
Es gibt verschiedene Methoden, die auf Einzelmolekülfluoreszenz basieren. In der
statistisch relevante Aussage zu erhalten. Die Methode wird hauptsächlich im biologischen Kontext angewendet, doch auch für materialwissenschaftliche Fragestellungen wird sie eingesetzt.[3, 4, 5] Meistens werden Polymere untersucht, wie z.B. der Glasübergang in dünnen Filmen[6, 7, 8], die Diffusion von markierten[9, 10, 11] oder konjugierten Polymerketten[12], die Phasenseparation in Blockcopolymeren[13, 14, 15] und thermoresponsiven Systemen[16] oder die Polymerisation in Masse[17]. Sie wurde unter anderem aber auch eingesetzt um das Verhalten von Fluoreszenzsonden in anorganische Nanokanälen[18] oder die Katalyse auf Einzelmolekülniveau zu studieren.[19, 20]
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Einzelmolekül-Weitfeldmikroskopie eingesetzt, um verschiedenen Fragestellungen aus dem materialwissenschaftlichen Bereich nachzugehen. Zunächst werden in Kapitel 2 die Grundlagen der Mikroskopie und der Fluoreszenzmikroskopie eingeführt. Auf die verwendeten Einzelmolekültechniken wird in den darauf folgenden Kapiteln eingegangen. In Kapitel 3.2 wird beschrieben, wie der Diffusionskoeffizient aus den Mikroskopiedaten ermittelt wurde. Kapitel 6 beschäftigt sich mit der im Rahmen der Arbeit durchgeführten Evaluierung eines neuen Programms zur automatischen Auswertung von Trajektorien. Der Fokus der Arbeit lag jedoch in erster Linie bei der Beantwortung von materialwissenschaftlichen Fragestellungen. Deswegen werden diese Projekte in den folgenden Abschnitten ausführlicher besprochen.
Kapitel 4 beschäftigt sich mit der radikalischen Polymerisation in Masse. Obwohl dieser Prozess in der Polymerindustrie seit beinahe hundert Jahren erforscht und angewendet wird, sind die Vorgänge auf molekularer Ebene noch nicht vollständig geklärt. Ein tieferes Verständnis ist allerdings wünschenswert um die Eigenschaften eines Polymers, welche von den Reaktionsbedingungen abhängig sind, besser vorhersagen zu können. Bei niedrigen Umsätzen ist die Kinetik der Polymerisation gut verstanden, wie in Kapitel 4.1 ausgeführt wird. Bei höheren Umsätzen und zunehmender Viskosität steigt der Einfluss limitierter Diffusionsbewegung, wodurch Kettenfortpflanzungsreaktion und Kettenabbrüche beeinflusst werden. Unter gewissen Bedingungen kann es in manchen Polymerisationssystemen zu einer Selbstbeschleunigung kommen, die auch als Trommsdorff-Effekt bekannt ist. Die Selbstbeschleunigung geht mit einer Abnahme der Kettenabbruchgeschwindigkeit und einer verringerten Kettenmobilität einher. Bis heute ist der quantitative Verlauf der
Polymerisation in diesem Bereich nur schwer vorherzusagen. Ein Grund dafür ist, dass die Ursachen für die Auslösung des Trommsdorff-Effekts noch nicht komplett verstanden sind. Eine genauere Übersicht zum Stand der Forschung gibt Kapitel 4.2.
In der vorliegenden Arbeit wurde daher die radikalische Polymerisation von Styrol und Methylmethacrylat mittels Einzelmolekül-Weitfeldmikroskopie und Fluoreszenz- korrelationsspektroskopie untersucht. Dazu wurden Derivate des Farbstoffes Perylendiimid mit unterschiedlicher Größe eingesetzt. Parallel zu den Diffusionsstudien wurde der Umsatz der Reaktion durch Raman-Spektroskopie verfolgt, wie in Kapitel 4.5 beschrieben wird. So war es möglich die Entwicklung der Diffusionsgeschwindigkeit nicht nur in Abhängigkeit von der Reaktionszeit sondern auch in Abhängigkeit des Umsatzes zu beobachten. Durch den Vergleich der beiden Polymerisationssysteme konnten aufschlussreiche Einblicke in das Diffusionsverhalten während der radikalischen Polymerisation gewonnen werden. (Kapitel 4.6)
Des Weiteren wurde in Kooperation mit dem Arbeitskreis von Prof. Arndt in Dresden das Diffusionsverhalten von Tonpartikeln in Nanokomposit-Hydrogelen untersucht. Als Hydrogele werden allgemein in Wasser quellbare Polymernetzwerke bezeichnet (Kapitel 5). Neben den rein organischen Hydrogelen rückten in den letzten Jahren die Nanokomposit-Hydrogele mehr in den Fokus des Interesses. Diese bestehen aus einem wasserlöslichen Polymer und aus synthetischen Tonpartikeln. Ursprünglich wurde das Netzwerk durch in situ Polymerisation hergestellt, es ist aber auch möglich ein Nanokomposit-Hydrogel durch Mischen der drei Komponenten Wasser, Polymer und Tonpartikel zu erzeugen. Die Polymerketten adsorbieren an der Oberfläche der Tonpartikel, wodurch sich ein Netzwerk bildet. Als Polymer wird meist das thermoresponsive Poly(N-isopropylacrylamid) verwendet, welches eine untere kritische Lösungstemperatur besitzt (Kapitel 5.1). Im Nanokomposit-Hydrogel wird dann ein Volumenphasenübergang beobachtet (Kapitel 5.2), der makroskopisch mit einer Trübung des Systems einhergeht. Aus dem Volumenphasenübergang ergeben sich viele interessante Anwendungen, wie künstliche Muskeln oder Mikromaschinen. Der
interessant. Für die genannten Anwendungen ist die Dynamik des Systems während des Volumenphasenübergangs von besonderem Interesse.
Mit Hilfe der Einzelmolekül-Weitfeldmikroskopie kann der Volumenphasenübergang auch in konzentrierten Nanokomposit-Hydrogelen studiert werden. Dazu ist allerdings eine Markierung einer kleinen Fraktion der Tonpartikel mit einem Fluoreszenzfarbstoff notwendig. Die Durchführung der Markierungsreaktionen und die Analyse der markierten Tonpartikeln wird in Kapitel 5.7 beschrieben und diskutiert. Mit diesen markierten Partikeln war es möglich nach bekannter Vorschrift Hydrogele herzustellen und die Diffusion der Partikel in Abhängigkeit von der Temperatur zu verfolgen (Kapitel 5.8).
Polyethylen ist einer der weltweit am meisten produzierten Kunststoffe. Im akademischen Bereich findet vor allem die Polymerisation in wässriger Mikroemulsion zunehmend Interesse, da bei diesem Verfahren die Reaktionsbedingungen besser steuerbar sind, als bei den herkömmlichen Verfahren. So kann durch Polymerisation in Mikroemulsion z.B. hochlineares Polyethylen hergestellt werden, aus dem sich während der Polymerisation anisotrope Nanokristalle bilden. Im Hinblick auf die Entwicklung neuer Materialien ist es von Interesse, inwieweit sich die anisotrope Form der Partikel auf die Filmbildung und die Eigenschaften des Films auswirkt. Um die Untersuchung der Vorgänge während der Filmbildung zu ermöglichen, muss eine Möglichkeit gefunden werden, die räumliche Orientierung der Partikel während des Prozesses in situ verfolgen zu können. In Kapitel 7.1 wurde untersucht, ob die defokussierte Einzelmolekül-Weitfeldmikroskopie prinzipiell geeignet ist um solche Orientierungsanalysen durchzuführen.
2 Grundlagen der Mikroskopie
In dieser Arbeit wurde die Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt um die Diffusion von einzelnen Molekülen zu untersuchen. Dieses Kapitel führt zunächst die Grundlagen der (Fluoreszenz-)mikroskopie ein. In den darauffolgenden Abschnitten wird auf die Vorteile und Herausforderungen der Einzelmolekülmikroskopie und die verwendeten Methoden eingegangen.
In der herkömmlichen Mikroskopie wird die maximal erreichbare Auflösung durch das Beugungslimit bestimmt. Als ideales Bild eines fokussierten, punktförmigen Emitters erhält man ein kreisförmiges Beugungsmuster, wie in Abbildung 2-1 gezeigt. Es wird nach Sir George Biddell Airy, einem englischen Astronom, auch als Airy-Scheibe bezeichnet. Airy leitete die Intensitätsverteilung des Signals abhängig vom Radius r her.[21]
Abbildung 2-1: Airy-Scheibchen (oben) und dazugehörige optische Transferfunktion (unten); von (a) nach (c) steigt die Numerische Apertur. (Aus Davidson, M. W., Abramowitz, M., Optical Microscopy. In Encyclopedia of Imaging Science and Technology.[1] Copyright 2002 John Wiley & Sons, Inc. Reproduziert mit Erlaubnis.)
Der Radius r1 des ersten dunklen Ringes der Airy-Scheibe in der Bildebene beträgt:
Für das Sammelvermögen eines Objektivs, die Numerische Apertur NA, gilt nach Abbe[4]:
(2-2)
Hierbei ist nM der Brechungsindex des Mediums vor der Linse des Objektivs und α der halbe Öffnungswinkel. Das ist der halbe Winkel des kegelförmigen Lichtbündels welches gerade noch eingesammelt werden kann. Können höhere Winkel eingesammelt werden, verbessert sich die Auflösung, wie in Abbildung 2-1 gezeigt.
Betrachtet man zwei Fluorophore, die weit voneinander entfernt sind, können beide Airy-Scheiben separat und komplett erkannt werden. Bewegt man die Fluorophore aufeinander zu, werden die Muster sich zuerst überlagern und schließlich verschmelzen. Für die Mikroskopie ist der minimale Abstand d interessant, bei dem beide Signale gerade noch unterschieden werden können, das sogenannte Auflösungsvermögen. Es existieren verschiedene Definitionen dafür, das bekannteste Kriterium ist vermutlich das nach Lord Rayleigh. Hier gelten zwei Objekte dann noch als trennbar, wenn das Maximum des Signals des einen Scheibchens mit dem ersten Beugungsminimum des zweiten Scheibchens zusammenfällt. In dieser Definition sind die beiden Signalmaxima durch ein Minimum „getrennt“, wodurch auch das menschliche Auge die beiden Maxima noch unterscheiden kann.[4] Für dRayleigh gilt dann:
(2-3)
Damit die vom Hersteller angegebene numerische Apertur NA eines Objektivs erreicht wird, muss ein Immersionsmedium mit passendem Brechungsindex verwendet werden.
Benutzt man ein Objektiv mit einer numerischen Apertur von 1.2, so entspricht die Auflösung ungefähr der halben Wellenlänge des verwendeten Lichts d ∼ 0.5 λ.[22]
Um eine Probe optimal abzubilden und möglichst viele Details sichtbar zu machen, ist deren gleichmäßige Beleuchtung notwendig. August Köhler führte 1893 eine (heute nach ihm benannte) Beleuchtungsmethode ein, mit der eine gleichmäßige Ausleuchtung erreicht werden kann. Damalige Lampen wiesen durch ihre Glühwendel eine unregelmäßige Intensitätsverteilung auf. Mit der von Köhler entwickelten Beleuchtungsmethode können störende Artefakte durch ungleichmäßige Beleuchtung vermieden werden, wodurch der Kontrast erhöht wird.[1, 4]
Abbildung 2-2: Prinzip der Köhlerbeleuchtung.[1, 4] Die Probe wird durch parallele Lichtstrahlen beleuchtet.
Bei der in Abbildung 2-2 dargestellten Köhlerbeleuchtung befindet sich die Probe in einem Bereich in dem die Strahlenbündel die aus einem Punkt der Lampe stammen zueinander parallel verlaufen. Jeder Punkt der Lampe wird dadurch über den gesamten Bereich der Probe verteilt, daraus resultiert ein gleichmäßig erhelltes Feld.
In einer zur Probenebene korrespondierenden Ebene wird die Feldblende positioniert, mit welcher der beobachtete Bereich eingeschränkt werden kann. Die Aperturblende wird in einer Ebene, in der ein Bild der Lampe abgebildet wird, positioniert. Durch die Aperturblende können die äußeren Strahlenbündel abgeschattet werden. So kann die Lichtmenge begrenzt werden, welche auf die Probe fällt und der Kontrast angepasst werden. Die Größe des ausgeleuchteten Bereichs wird nicht verändert. Durch Schließen der Blende wird die numerische Apertur der Beleuchtung verringert.
Eine weitere Möglichkeit, eine Probe im Mikroskop auszuleuchten, ist die kritische Beleuchtung. Hier wird die Probe in einer Bildebene der Lampe positioniert. Dadurch werden eventuelle Unregelmäßigkeiten in der Intensitätsverteilung der Lampe in die Probe abgebildet. Deswegen muss bei dieser Beleuchtungsmethode eine möglichst homogene Lichtquelle verwendet werden. Bei der Verwendung von Lasern als Lichtquelle kann z.B. eine rotierende Diffusorscheibe[23] oder eine optische Glasfaser verwendet werden.[24, 25] Die optische Glasfaser wird in Schlaufen gelegt und geschüttelt, um räumliche und zeitliche Interferenzen, wie z.B. Speckles zu minimieren.
Bausinger[24] zeigte, dass 2800 Schwingungen pro Minute nötig waren um eine
Abbildung 2-3: Prinzip der kritischen Beleuchtung; im Gegensatz zur Köhlerbeleuchtung wird hier die Lichtquelle auf die Probe abgebildet.
Das Ende der optischen Faser stellt dann die eigentliche Lichtquelle dar. Das aus der Faser austretende Licht wird durch eine Linse am Faserende gesammelt. Das Bild der Faser wird über weitere Linsen verkleinert und dann über das Objektiv (entspricht der 4. Linse in Abbildung 2-3) in die Probe abgebildet.
2.1 Fluoreszenzmikroskopie
Fluoreszenzmikroskopie ist heute, aufgrund der hohen Sensitivität und der einfachen Durchführbarkeit, eine weit verbreitete Methode um biologische und materialwissenschaftliche Fragestellungen zu beantworten.
2.1.1 Grundlagen der Fluoreszenz
Wird ein Farbstoffmolekül mit Licht bestrahlt, kann es Energie aufnehmen und in einen angeregten Singulettzustand übergehen (S0 → S1, S2,…). Dieser Prozess geschieht innerhalb weniger Femtosekunden. Wie hoch die benötigte Energie bzw. Wellenlänge des Anregungslichts ist, hängt vom Abstand der Energieniveaus ab. Die beschriebenen Vorgänge werden im Jablonski-Diagramm (Abbildung 2-4) dargestellt.
Abbildung 2-4: Jablonski-Diagramm: S0, S1 = Singulett-Zustände; T1 = Triplett-Zustand; A = Absorption; IC
= innere Konversion (engl.: internal conversion); F = Fluoreszenz; nr = nicht strahlende Desaktivierung;
ISC = Interkombination (engl.: intersystem crossing); P = Phosphoreszenz
Im Grundzustand S0 sind bei Raumtemperatur höhere Schwingungszustände meist nicht besetzt. Nach der Anregung kann sich ein Molekül in einem höheren Schwingungszustand des S1 befinden. Nach dem Franck-Condon-Prinzip ist ein Übergang für den angeregten Schwingungszustand am wahrscheinlichsten, bei dem die Überlappung der Schwingungswellenfunktionen von S0 und S1 am größten ist. Durch strahlungslose Relaxation (innere Konversion) geht das Molekül in den Schwingungs- Grundzustand des S1 über. Aus diesem erfolgen neben der spontanen Fluoreszenz weitere Prozesse wie Übergänge in den Triplettzustand, Photoreaktionen oder strahlungslose Desaktivierung.
Die Lebenszeit des angeregten Schwingungszustands liegt im Pikosekundenbereich, die des elektrischen Zustands liegt dagegen im Nanosekundenbereich, d.h. die Fluoreszenz findet aus dem Schwingungs-Grundzustand des S1 statt und ist damit meist unabhängig von der Wellenlänge des eingestrahlten Lichts. Dieses Phänomen ist als „Kasha-Regel“
bekannt.
Bei diesen Desaktivierungsprozessen wird vom Molekül Energie abgegeben, deswegen ist die Energie des Fluoreszenzlichts geringer als die des eingestrahlten Lichts. Man beobachtet eine Rotverschiebung des Fluoreszenzlichts, die sogenannte Stokes- Verschiebung.
Ein konkurrierender Prozess zur Fluoreszenz ist die strahlungslose Desaktivierung. Sie wird möglich, wenn höhere Zustände mit angeregten vibratorischen oder rotatorischen Zuständen eines niedrigeren Zustands koppeln.
Des Weiteren sind Übergänge in den Triplettzustand möglich, die man als Interkombination bezeichnet. Der Prozess findet auf einer Mikrosekunden Zeitskala statt, da er eigentlich spinverboten ist. Der Übergang T1 nach S0 ist ebenfalls spinverboten. Wegen der langen Lebenszeit des T1 kommt es hauptsächlich zu strahlungslosen Desaktivierungsprozessen, wie zum Beispiel Stößen oder Reaktionen mit der Umgebung. Phosphoreszenz wird in organischen Molekülen eher selten beobachtet.[4, 26]
Fluoreszenz eines Moleküls gemessen, kann das Signal aufgrund der Stokes- Verschiebung vom Anregungslicht abgetrennt werden. Einzelmolekülfluoreszenz konnte erstmals 1990 von Orrit und Bernard an Pentacen in p-Terphenyl bei Heliumtemperaturen nachgewiesen werden.[29] Später führten verschiedene Gruppen Experimente mit Hilfe der Fluoreszenz einzelner Moleküle auch bei Raumtemperatur und in Lösung durch.[30] Nahfeldmethoden[31] wurden u.a. benutzt um das Übergangsdipolmoment einzelner, immobilisierter Fluorophore zu untersuchen.
In den 1990er Jahren wurden zunehmend konfokale[32, 33, 34] und Weitfeld-Methoden[35,
36] (weiter-)entwickelt, die eine einfache Detektion von Einzelmolekülfluoreszenz erlaubten. Ihr „Siegeszug“ wurde durch den technischen Fortschritt, wie z.B. die Entwicklung empfindlicher CCD-Kameras, Avalanchephotodioden und stabiler, kompakter Laser wesentlich erleichtert. Die Entwicklung von hochauflösenden Methoden, bei denen das Abbesche Beugungslimit umgangen wird, war ein weiterer Meilenstein.[37, 38, 39, 40, 41, 42]
Die Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie und -spektroskopie hat heute ein breites Anwendungsfeld, es konnten viele biologische und materialwissenschaftliche Prozesse untersucht und Fragen beantwortet werden.
2.1.3 Vorteile von Einzelmoleküluntersuchungen
Welche Vorteile bieten nun Untersuchungen an einzelnen Molekülen im Vergleich zum Molekülensemble? Jedes Molekül besitzt eine unterschiedliche Umgebung, welche seine Eigenschaften beeinflusst. Ein Molekül ist also eine Sonde für seine lokale Nanoumgebung. Ensemble-Methoden mitteln über eine größere Anzahl von Molekülen und messen deshalb nur einen Mittelwert. Einzelmolekülmethoden dagegen ermitteln für jedes Molekül einen individuellen Wert, weshalb man eine Verteilung der Werte erhält. So können auch kleine Populationen erfasst werden, die bei einer Ensemblemittelung den Gesamtwert kaum beeinflussen.
Neben räumlich verursachten Unterschieden von Molekülen ist es auch möglich zeitabhängige Prozesse aufzulösen.[3] So können seltene Ereignisse erfasst werden, welche besonders in inhomogenen Systemen auftreten. Bei Ensemblemessungen zeitabhängiger Prozesse ist eine Synchronisation der Moleküle nötig, z.B. wenn Änderungen der Molekülstruktur oder Interkombinationsprozesse untersucht werden.[43] Diese Synchronisation entfällt bei Einzelmolekülmessungen. Beispiele für Einzelmolekülexperimente zeigt Abbildung 2-5.
a) b) c)
Abbildung 2-5: Beispiele für Einzelmolekülexperimente a) Anregungsspektren eines Pentacenmoleküls, die nacheinander aufgenommen wurden, zeigen spektrale Sprünge (Nachdruck mit Genehmigung aus Ambrose, W. et al.,Detection and spectroscopy of single pentacene molecules in a p-terphenyl crystal by means of fluorescence excitation. JChemPhys; 1991, 95, 7150-7163.[44]. Copyright 1991, AIP Publishing LLC); b) Einzelmolekültrajektorien weisen auf zwei Molekülfraktionen hin: diffundierende und immobile (Copyright 2008 Wiley, Benutzt mit Genehmigung aus Wöll, D. et al., Radical Polymerization tracked by Single Molecule Spectroscopy. Angew. Chem., Int. Ed. 2008, 47, 783.[17]; c) Katalyse auf Einzelmolekülniveau: Farbstoffe werden von einem Substrat in ihre fluoreszierende Form umgewandelt (Copyright 2007 PNAS, reproduziert von Roeffaers, M. et al., Single-molecule fluorescence spectroscopy in (bio)catalysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007, 104 (31), 12603.[20])
Die Einzelmolekülfluoreszenz wird verwendet um Moleküleigenschaften wie Fluoreszenzlebenszeiten[45] zu untersuchen. Aber auch Prozesse wie Fluoreszenzfluktuationen z.B. verursacht durch Förster-Resonanzenergietransfer[46, 47,
48] werden an Hand von Einzelmolekülfluoreszenz studiert. Des Weiteren werden Einzelmoleküle als Sonden eingesetzt, die über Ihr Fluoreszenzsignal Auskunft über ihre Dipol-Orientierung[49], Translations- und Rotationsdiffusion[6, 50] geben. Diese Themengebiete sind in zahlreichen Übersichtsartikeln[3, 43, 51] zusammengefasst.
2.1.4 Anforderungen an Farbstoffe für Einzelmolekülstudien
Welche Anforderungen werden an Fluoreszenzfarbstoffe für Einzelmolekülanwendungen gestellt? Erwünscht ist in der Regel ein möglichst intensives Fluoreszenzsignal. Dafür sind ein hoher Absorptionsquerschnitt und eine hohe Fluoreszenzquantenausbeute nötig, das heißt die Depopulation des S1 muss bevorzugt über spontane Fluoreszenz ablaufen, mit vergleichsweise niedrigen Raten für
Bei den meisten Einzelmolekülanwendungen ist Blinken, also kurzzeitige Dunkelzustände, unerwünscht. Diese kurzen Auszustände werden z.B. durch Übergang des Moleküls in den Triplettzustand verursacht. Sie sind ein Hinweis darauf, dass das beobachtete Signal tatsächlich von einem einzelnen Molekül stammt. Charakteristisch für ein einzelnes Molekül ist auch das Bleichen in einem Schritt. Ein Molekül kann nur eine begrenzte Anzahl an Anregungszyklen durchlaufen, da es aus dem angeregten Zustand zu irreversiblen Photoreaktionen kommen kann. Diese können dazu führen, dass das Molekül zerstört wird und nicht mehr fluoresziert (s. Abbildung 2-6).
Abbildung 2-6: Zeitspuren der Fluoreszenzintensität zweier Moleküle: zu erkennen ist das Bleichen in einem Schritt. Das Molekül der rechten Zeitspur zeigt einen längeren Dunkelzustand.
Die in dieser Arbeit verwendeten Derivate der Rylen-Pigmente besitzen eine hohe (photo)chemische und thermische Stabilität, weswegen sie in verschiedenen technischen Anwendungen wie Solarzellen[52], Leuchtdioden[53], oder in optoelektronischen Anwendungen[54] eingesetzt werden. Ein weiteres wichtiges Einsatzgebiet sind Einzelmolekülfluoreszenzuntersuchungen.[52]
a) b)
Abbildung 2-7: a) Modifikationen am Perylenbis(dicarboximid)-Grundgerüst können in der bay-Region (R) und an der Imid-Gruppe (Peri-Position, R‘) vorgenommen werden. b) Substituiertes PDI, welches u.a.
in dieser Arbeit für Einzelmoleküluntersuchungen genutzt wurde.
Abbildung 2-7 a) zeigt ein Perylendiimid (PDI), der kürzeste Vertreter der Rylendiimid- Gruppe. Das Rylengrundgerüst wurde vielfach modifiziert um z.B. die photophysikalischen Eigenschaften[52], die Löslichkeit in verschiedenen Medien[55, 56, 57, 58] oder die Molekülgröße[59, 60] anzupassen.
In vielen Einzelmolekülarbeiten werden Perylendiimide eingesetzt, bei denen in der bay-Region Phenoxy-Gruppen eingeführt wurden. Diese Substituenten verhindern die Bildung von π-π-Aggregaten und schirmen den Chromophor ab. Bei so substituierten Derivaten kann eine bathochrome Verschiebung von Absorption und Fluoreszenz im Vergleich zur unsubstituierten Verbindung beobachtet werden, da die sterische Hinderung der Substituenten zu einer Verdrehung des Grundgerüsts führt.[52, 61]
Zusätzlich besitzen die Phenoxy-Gruppen einen elektronenschiebenden Charakter. Ein in dieser Arbeit verwendetes Derivat (Abbildung 2-7b)) zeigt in Toluol das S0→S1
Absorptionsmaximum bei 580 nm, das Emissionsmaximum liegt bei 610 nm. Bei einem in der bay-Region unsubstituierten PDI liegen Absorptions- und Emissionsmaximum bei deutlich niedrigeren Wellenlängen (Abs.: 525 nm; Em.: 536 nm).[52]
2.1.5 Probleme und Herausforderungen bei der Einzelmolekülfluoreszenz- detektion
Bei Einzelmolekülexperimenten ist ein hohes Signal-zu-Rauschverhältnis (SRV) besonders wichtig. Wie in Abbildung 2-8 gezeigt, gibt es verschiedene Beiträge zur gemessenen Intensität.
Abbildung 2-8: Beiträge zum gemessenen Signal: Kamera-Offset bei CCD-Detektoren, Dunkelstrom,
Für ein hohes Signal ist es nötig die vom Farbstoff ausgesendeten Photonen möglichst effizient einzusammeln. Deswegen werden Objektive benutzt, die eine hohe Numerische Apertur NA und damit eine hohe Sammeleffizienz besitzen. Objektive und sonstige Optiken sind zusätzlich beschichtet, um eine möglichst hohe Transmission zu erreichen.
Die Photonen werden dann durch empfindliche und dunkelrauscharme Detektoren (CCD-Kamera, Photomultiplier tube, o.ä.) in ein elektrisches Signal umgewandelt.[62]
Zum Detektorsignal tragen noch Kamera-Offset und Dunkelstrom bei. Das Offset ist ein konstanter Wert, der vor der Analog-zu-Digital-Wandlung zum gemessenen Signal hinzuaddiert werden kann. Da er konstant ist, wird er bei der Bestimmung des Signal- zu-Rauschverhältnis in der Regel nicht berücksichtigt. Der Dunkelstrom entsteht durch thermische Ladungstrennung in den Pixeln und ist abhängig von der Temperatur und der Belichtungszeit. Er kann durch die Verwendung gekühlter CCD-Kameras deutlich reduziert werden.
Zum Rauschen tragen Quellen wie z.B. Ausleserauschen, Streulicht und Fluoreszenz außerhalb des Fokus bei. Dieser Hintergrund kann im Aufnahmebereich ungleichmäßig intensiv sein.
Das Licht der Fluoreszenzanregung ist in der Regel deutlich intensiver wie die Fluoreszenz selbst. Durch die Verwendung einer epi-Detektion wird nur ein kleiner Teil dieses Lichts vom Mikroskopobjektiv wieder eingesammelt.[26] Durch den dichroitischen Filter findet dann noch eine Wellenlängen-abhängige Selektion des Lichts statt und nur das bathochrom verschobene Fluoreszenzlicht wird zum Detektor transmittiert.[4]
Bei der Probenpräparation ist sehr sauberes Arbeiten erforderlich, damit die Probe nicht mit fluoreszierenden oder streuenden Verunreinigungen kontaminiert wird. Bei Experimenten in Masse sollte eine niedrigere Fluorophorkonzentration gewählt werden als in dünnen Filmen um Störlicht von Molekülen außerhalb des Fokus gering zu halten.
Verschiedene Streuprozesse können zum Hintergrund beitragen. Rayleigh-Streuung, wie sie z.B. durch Staub verursacht wird, kann durch Filter zwar unterdrückt werden, allerdings nie vollständig. Raman-Streuung, z.B. durch Lösemittel, kann Signale im Wellenlängenbereich der Fluoreszenz verursachen. In konfokalen Experimenten wird deshalb ein kleines Detektionsvolumen gewählt, wodurch das Fluoreszenzsignal im Vergleich zum Raman-Signal stärker wird, wie in Abbildung 2-9 gezeigt. In wässrigen Lösungen hängt die Stärke des Raman-Signals vom Streuquerschnitt σS des Wassers
(10-28 cm²) mal der Anzahl der Moleküle in der Volumeneinheit ab. Die Raman-Streuung der Moleküle in 1 mL Wasser ist damit 1010 mal stärker als das Fluoreszenzsignal eines einzelnen Rhodamin 6G Moleküls mit einem Absorptionsquerschnitt von 4 × 10-16 cm².[26]
Deswegen wird versucht Laserwellenlänge, Farbstoff und Passband des Filters so zu kombinieren, dass keine oder wenige (intensive) Raman-Banden des Lösungsmittels im gewählten Wellenlängenbereich liegen.[26]
a) Ein Rhodamin 6G Molekül in: b)
1 cm 4.6 µm 1 µm
IF = 1.0 IRS = 1010
IF = 1.0 IRS = 1.0
IF = 1.0 IRS = 10-2 V = 1 mL V = 97 fL V = 1 fL
Abbildung 2-9: a) Intensität der Fluoreszenz IF eines Rhodamin 6G Moleküls im Vergleich zur Raman- Streuung IRS in verschieden großen Volumina (Nach Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy
[26] S. 759f) b) Vergleich der Banden eines Raman-Spektrums von Toluol (rot), angeregt bei 561 nm mit dem Fluoreszenzspektrum von Perrylendiimid (schwarz) am eingesetzten Aufbau, Intensitäten wurden zur besseren Vergleichbarkeit der Wellenlängenbereiche auf 1 normiert
Im Prinzip ist auch eine zeitliche Abgrenzung der Prozesse über einen zeitgesteuerten Aufbau mit gepulsten Lasern möglich, da die Fluoreszenz eine Lebenszeit von einigen Nanosekunden hat, während Streuprozesse quasi-instantan mit der Einstrahlung von Licht stattfinden.[63]
Zum Rauschen tragen viele verschiedene, oft nicht konstante Quellen bei. Die Intensität des Signals muss trotz der Rauschfluktuationen detektiert werden können.[4, 62] Nach Yildiz et al. wird der Fehler bei der Bestimmung einer Molekülposition geringer, wenn die Zahl der eingesammelten Photonen im Vergleich zur Hintergrund steigt.[64] Daher
(2-4)
Mit:
φF Fluoreszenzquantenausbeute σP Absorptionsquerschnitt T Integrationszeit
A beleuchtete Fläche
P0/hν Anzahl der Photonen pro Sekunde in Gebiet A Cb Hintergrund abhängig von der Anregungsleistung Nd Dunkelstromzählrate
DP Systemabhängiger Parameter
Zu DP tragen das Lichtsammelvermögen[67, 68], Verluste an Optik und Filtern und die Quantenausbeute des Detektors bei. Der Beitrag von DP liegt laut Literatur in der Regel in einem Bereich zwischen 1% - 8%.[62]
Aus dieser Formel ergibt sich, dass ein besseres SRV erzielt werden kann, je höher die Anregungsleistung ist. Dies gilt aber nur bis die Sättigungsgrenze erreicht wird. Steigt die Anregungsleistung noch weiter, können die Moleküle nicht schnell genug in den Grundzustand zurückkehren um ein neues Photon zu absorbieren. Eine Erhöhung der Laserintensität führt dann nur zu einem höheren Hintergrund.
Es existiert ein optimaler Laserintensitätsbereich im Bereich der Sättigung in dem das Fluoreszenzsignal maximal gegenüber dem linear ansteigenden Hintergrund wird. In der Praxis wird dieser Bereich durch das Photobleichen begrenzt. Denn bleicht das Molekül während der Aufnahmezeit, können weniger Photonen gesammelt werden als theoretisch möglich.[62]
In die theoretische Berechnung des SRV gehen viele Parameter ein, die oft nicht bekannt sind. In vielen Fällen ist deshalb eine empirische Abschätzung, z.B. nach Kubitschek,[69] ebenso aussagekräftig.
2.2 Methoden der Fluoreszenzmikroskopie
Es existiert eine große Bandbreite an Methoden, welche mit Einzelmolekülfluoreszenz arbeiten. Sie lassen sich in Nah- und Fernfeldmethoden einteilen. Die klassische Mikroskopie in der das Abbesche Beugungslimit gilt, ist eine Fernfeldmethode. In
Fernfeldmethoden wird entweder ein ganzer Bereich der Probe beleuchtet und beobachtet oder das Anregungslicht wird fokussiert und das Signal aus diesem Punkt dann detektiert. In den folgenden Abschnitten wird genauer auf die in dieser Arbeit verwendeten Techniken Epi-Fluoreszenz, interne Totalreflexion und Beleuchtung mit fokussiertem Laser eingegangen.
2.2.1 Fluoreszenzanregung in der Einzelmolekül-Weitfeldmikroskopie
Bei der Einzelmolekül-Weitfeldmikroskopie wird eine Fläche mit einem Durchmesser von einigen zehn Mikrometern gleichmäßig beleuchtet. Das Fluoreszenzlicht wird durch Filter vom Anregungslicht abgetrennt und auf einen zweidimensionalen Detektor, in der Regel eine EM-CCD-Kamera, abgebildet. Dadurch können immer mehrere Moleküle gleichzeitig beobachtet werden. Deswegen sind bereits mit wenigen Messungen statistische Aussagen möglich. Zudem können die Moleküle, ohne ein zwischengeschaltetes mathematisches Modell, direkt beobachtet werden. Dadurch ist es leichter Heterogenitäten und seltene Ereignisse zu detektieren. Ein Nachteil von CCD- Kameras im Vergleich zu Punktdetektoren ist jedoch ihre geringere Auslesegeschwindigkeit (Andor iXon: ~30 ms für ein 512 x 512 Pixel-Bild im Vergleich zu ~400 ps für Standard-APDs). Für die Weitfeldfluoreszenzmikroskopie wird zum Anregen der Fluoreszenz meistens eine Epi-Beleuchtung oder die Interne Totalreflexion benutzt.
2.2.1.1 Interne Totalreflexion
Trifft Licht flacher als ein kritischer Winkel γkrit auf eine Grenzfläche zwischen zwei Medien mit unterschiedlichem Brechungsindex (n1>n2) kommt es zur Totalreflexion dieses Strahls. Das Licht wird in das Medium mit höherem Brechungsindex zurückreflektiert, anstatt in das dünnere Medium gebrochen zu werden. Für γ krit gilt das Snelliussche Gesetz:
(2-5)
Abbildung 2-10: Relative Intensität des evaneszenten Felds bei z = 0 in Abhängigkeit des Einfallswinkels an einer Glas-Luft (durchgezogene Linie) bzw. einer Glas-Wasser (gestrichelte Linie) Grenzfläche, berechnet für s-polarisiertes Licht. (Aus Paige, M. et al., A Comparison of Through-the-Objective Total Internal Reflection Microscopy and Epifluorescence Microscopy for Single-Molecule Fluorescence Imaging. Single Mol. 2001, 2, 191, [70] Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Reproduziert mit Erlaubnis.)
Die Abnahme der Intensität mit zunehmender Entfernung von der Grenzfläche ist abhängig vom Einfallswinkel γ, den Brechungsindizes der Medien und der Wellenlänge des Lichts. Für grünes Licht (550 nm) an der Grenzfläche Glas (n1 = 1.51)/ Luft (n2 = 1.00) mit θkrit = 41.3° reicht das evaneszente Feld ca. 150 nm in die Probe hinein.
An der Grenzfläche Glas/Wasser (nH2O = 1.33) ist die Eindringtiefe etwas höher.[5] Durch die geringe Eindringtiefe werden nur Moleküle in einem kleinen Bereich angeregt, dadurch entsteht keine störende Hintergrundfluoreszenz von Molekülen außerhalb des Fokus. Allerdings ist so auch keine Beobachtung tiefer in der Probe möglich.
Untersuchungen zeigten, dass das Fluoreszenzsignal von zufällig orientierten Molekülen bei Beleuchtung durch interne Totalreflexion höher ist als in einer vergleichbaren epi-Anordnung.[70]
Die interne Totalreflexion wird entweder mit Hilfe eines Prismas realisiert, oder über ein Objektiv mit hoher numerischer Apertur. Bei der prismenbasierten Version wird ein Laser so in das Prisma eingekoppelt, dass es an einer Seite zur internen Totalreflexion kommt. Die Probe wird dann entweder direkt auf das Prisma, oder unter einem mit Immersionsmedium bestrichenen Deckglas aufgebracht. Ein Objektiv sammelt dann das Fluoreszenzsignal unterhalb der Probe ein.[35, 62, 71] Alternativ kann ein Objektiv mit einer hohen NA verwendet werden, auf dessen rückwärtige Bildebene ein Laserstrahl fokussiert wird.[72] Bei wässrigen Systemen wird mindestens ein Objektiv mit NA ~1.4
benötigt.[4] Wird der Strahl von der optischen Achse wegbewegt, tritt der kollimierte Strahl nicht mehr senkrecht aus dem Objektiv aus, sondern wird in einem Winkel abgestrahlt. Der genaue Winkel ist abhängig von der Entfernung des Strahls von der optischen Achse, der Position des Fokus und der NA des Objektivs.[5] Der Strahl fällt schräg auf die Probe. Wenn er den kritischen Einfallswinkel an der Grenzfläche (z.B.
Deckglas/Luft) erreicht, kommt es zur Totalreflexion, wodurch der Strahl an der Grenzfläche wieder zurückgeworfen wird. Die Fluoreszenz wird vom Objektiv eingesammelt und über den dichroitischen Strahlenteiler vom Anregungslicht abgetrennt.
2.2.2 Fluoreszenzanregung mit konfokaler Beleuchtung
Das Konzept des konfokalen Mikroskops wurde in den 1950er Jahren entwickelt, u.a.
vom Mathematiker Marvin Minsky. Er suchte nach einer Methode, um auch in sehr dichten Proben mikroskopische Aufnahmen machen zu können. Allerdings konnte die Technik sich erst in den 1980er Jahren durchsetzen, nachdem dank des technischen Fortschritts eine schnellere und empfindlichere Bildaufnahme möglich wurde.[4] Der in diesen Jahren entwickelte optische Aufbau wird auch heute noch in ähnlicher Weise verwendet, allerdings kann bei der Verwendung von Lasern als Lichtquelle auf die ursprünglich im Anregungsstrahlengang platzierte Lochblende verzichtet werden. Bei einem als „konfokal“ bezeichnetem Aufbau in der heutigen Form wird der aufgeweitete, parallele Laserstrahl in das Objektiv eingekoppelt, das den Strahl in die Probe fokussiert. Der Durchmesser des Fokus ist durch das Beugungslimit begrenzt. Bei einer Anregungswellenlänge im sichtbaren Bereich erhält man theoretisch ein Signal das im Fokus einem Durchmesser von ungefähr 300 nm aufweist. Dieses theoretische Minimum wird in der Praxis allerdings nicht erreicht. Um eine zusätzliche Begrenzung des Detektionsvolumens in Richtung der optischen Achse zu erreichen, wird eine Lochblende im Detektionsstrahlengang eingesetzt. Diese Lochblende besitzt typischerweise einen Durchmesser im Mikrometerbereich. Das Licht aus der Probe wird vom Objektiv gesammelt und von der Tubuslinse des Mikroskops fokussiert. Die
Abbildung 2-11: Anregungsbereich (grau) und Detektionsvolumen mit Durchmesser r0 in x,y – Richtung und Höhe z (grün).[4]
Das konfokale Signal kann z.B. spektroskopisch analysiert werden (Fluoreszenz-, Raman-Spektren u.a.) oder man misst die Intensität bzw. deren Fluktuation. Es werden meist Punktdetektoren wie z.B. Avalanche-Photodioden verwendet. Da diese deutlich lichtempfindlicher und schneller wie CCD-Kameras sind, können mit dieser Methode Prozesse untersucht werden, die auf einer wesentlich kürzeren Zeitskala stattfinden.
Um räumliche Informationen zu erhalten muss die Probe allerdings abgerastert werden. Dazu kann entweder die Probe über einen Piezo-Tisch bewegt werden, oder der Anregungsstrahl wird über galvanisch gesteuerte Spiegel über die Probe bewegt.
Ein Vorteil der konfokalen Mikroskopie gegenüber der Weitfeldmethode ist die bessere Auflösung in z-Richtung, welche auch dreidimensionale Aufnahmen erlaubt. Die Zeitauflösung ist in der Regel begrenzt durch die Abrasterungsgeschwindigkeit und die Zeit, die benötigt wird, um in jedem einzelnen Pixel ein ausreichend starkes Signal zu sammeln.
2.2.2.1 Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie
Die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (engl.: fluorescence correlation spectroscopy, FCS) wird vor allem verwendet um schnelle Diffusionsvorgänge in niedrigviskosen Medien zu messen. Die Methode wurde zwar schon in den 1970er Jahren entwickelt[73, 74], durchsetzen konnte sie sich aber erst mehr als zwanzig Jahre später, aufgrund des technischen Fortschritts bei Lasern und Detektoren. Durch Übertragung des Konzepts auf einen konfokalen Aufbau[75] konnte die Auflösung weiter verbessert werden. Der heute zugängliche Zeitbereich erstreckt sich von ca. 100 bis ca.
10-12 s.[76, 77] Damit sind Prozesse wie Antibunching, Rotationsdiffusion, Triplettzustand und Translations-diffusion zugänglich. Diese Vorgänge verursachen alle eine Intensitätsfluktuation des gemessenen Signals, z.B. durch Ein- und Austritt eines
Fluoreszenzfarbstoffs ins konfokale Volumen. Die Farbstoffkonzentration liegt im nanomolaren Bereich, so dass sich durchschnittlich ca. ein Molekül im Detektionsvolumen befindet. Die Selbstähnlichkeit des Signals wird durch die Autokorrelationsfunktion beschrieben. Um diese zu ermitteln wird die Intensität des Signals zum Zeitpunkt t mit der bei t + τ verglichen. Dabei nimmt die Wahrscheinlichkeit ein weiteres Signal bei steigender Wartezeit zu detektieren ab. Die Angleichung mit der Autokorrelationsfunktion ergibt dann die mittlere Dauer einer Fluktuation. Bei Diffusion kann aus diesem Wert τD der Diffusionskoeffizient D berechnet werden.
Abbildung 2-12: Autokorrelationskurve mit Zeitbereichen verschiedener Prozesse, welche mit FCS zugänglich sind. (Reproduziert aus Schwille, P.; Haustein, E. Biophysics Textbook online 2001, p. 33.
(Zugriff 08.06.2014) [78]. Copyright 2001)
FCS wurde auch in materialwissenschaftlichen Fragestellungen eingesetzt, z.B. um Diffusion in radikalischen Polymerisationen mit und ohne Vernetzer[17, 79], in Schmelzen linearer und sternförmiger Polymere[80] oder im halbverdünnten Regime[81] zu untersuchen.
2.3 Einzelmolekül-Weitfeldmikroskopie zur Untersuchung von Polymeren Die Einzelmolekül-Weitfeldmikroskopie EMWFM wird zunehmend bei
Die EMWFM hat sich besonders für Untersuchungen in situ von Systemen mit komplexer Dynamik und Struktur bewährt. Ein Beispiel sind Polymerlösungen, welche z.B. geordnete Mesophasen[13] bilden können. Ein weiteres, häufiger untersuchtes Material ist Poly-N-isopropylacrylamid (PNIPAM). Dieses wasserlösliche Polymer besitzt eine untere kritische Lösungstemperatur (LCST). Oberhalb dieser Temperatur ist es nicht mehr in Wasser löslich, wodurch eine Phasenseparation stattfindet (s.a.
Kapitel 5.1). Elliott et al.[84] untersuchten die Diffusion von Rhodamin 6G (Rh6G) in gebundenen PNIPAM-Ketten, bei Temperaturen ober- und unterhalb der LCST. Die Analyse der Trajektorien erfolgte über die Entwicklung des Trajektorienradius RT (s.a.
Kapitel 3.5.2) da diese Methode besonders geeignet ist zwischen eingeschränkt diffundierenden Molekülen und Molekülen, welche sich außerhalb der Polymerbürste befinden, zu unterscheiden. Zudem wurde die Stärke der Einschränkung analysiert. Es zeigte sich, dass bei T > LCST die Moleküle auf einen kleineren Bereich beschränkt sind, als bei T < LCST. Außerdem werden die Sprünge zwischen Bereichen eingeschränkter Diffusion größer. Tada et al.[16] untersuchten mit einem wasserlöslichen PDI-Derivat den Einfluss der Taktizität von PNIPAM auf die Phasenseparation. Die Untersuchungen mit TIR-Beleuchtung zeigten in ataktischem PNIPAM bei T < LCST eine gleichmäßige, schnelle Diffusion. Bei Erhöhung der Temperatur über LCST fand zunächst eine Phasenseparation statt und die beobachteten Signale waren weitestgehend immobilisiert. Das eher hydrophobe PDI-Derivat befindet sich dann bevorzugt in den kollabierten, polymerreichen Domänen. Überwogen die meso-Abschnitte in den PNIPAM-Ketten, konnten auch unterhalb von LCST schon immobile Sonden beobachtet werden. Somit fand also schon in diesem Temperaturbereich eine gewisse Phasentrennung statt, wodurch die im Polymer mit vielen meso-Abschnitten beschleunigte Phasenseparation bei der LCST erklärt werden kann.
Phasenseparation findet auch in nicht mischbaren Blockcopolymeren statt. Diese bilden geordnete Strukturen die zur Herstellung künstlicher Membranen, zur Katalyse, in Batterien oder in Brennstoffzellen zum Einsatz kommen können.[14] Zur Aufklärung der Mikrostruktur und deren Entstehung wurde auch EMWFM eingesetzt. So konnten Yorulmaz et al. [85] zeigen, dass sich in Polybutadien-co-Polyethylenoxid durch Selbstanordnung schlauchartige Strukturen des Polybutadienblocks ausbilden. Die beobachteten Trajektorien deuteten auf Defekte in der Struktur hin. Eine Ausrichtung solcher Strukturen kann durch gezielte Einwirkung von Lösungsmitteldämpfen erreicht
werden.[86] Studien mit Methoden wie Rasterkraftmikroskopie können in solchen Systemen keinen Einblick in das dynamische Geschehen geben. Tran-Ba et al. [15, 87, 88]
führten mehrere Studien zur Ausrichtung von Mikrodomänen unter der Einwirkung von Lösungsmitteldämpfen durch. Um diese bewerten zu können, wurde die absolute Orientierung der Einzelmolekül-Trajektorien quantitativ ausgewertet.
Des Weiteren wurde die Dynamik von Polymeren in Masse untersucht. Um die Bewegungen von Ketten in einer Polymermatrix verfolgen zu können, werden meist mit Farbstoffen markierte Polymerketten eingesetzt. Diese markierten Ketten werden z.B.
über eine Atom-Radikal-Transfer-Polymerisation (ATRP) dargestellt. Diese Methode ermöglichte es, gezielt PDI-Derivate an verschiedenen Positionen in Polymethylacrylatketten einzubauen[89]. Habuchi et al.[9] gelang es, mit PDI-Derivaten markierte Polymerringe aus Polytetrahydrofuran darzustellen und ihre Diffusion in Masse zu studieren. Sowohl im halbverdünnten System, als auch in der Schmelze wurde für die cyclischen Polymere ein von den linearen Ketten abweichendes Diffusionsverhalten beobachtet.[9, 10] Es ist auch möglich, Polymerketten nachträglich am Kettenende zu modifizieren. Chen et al. [90] konnten so mit Rh6G markierte Polyethylenoxid-Ketten darstellen. Diese wurden eingesetzt um den Massentransport während der Kristallisation in sehr dünnen Polymerfilmen zu beobachten. Auch bei längerer Äquilibrationszeit wurden immer noch einzelne mobile Ketten beobachtet.
Deren Diffusion war langsamer als die der Ketten im amorphen Polymer vor der Kristallisation, was höchstwahrscheinlich durch eine stärkere Wechselwirkung mit der Oberfläche erklärt werden kann.
Das Verhalten von adsorbierten Polymerketten ist besonders im Hinblick auf die Bildung dünner Polymerfilme und Adhäsionsvorgänge interessant. So untersuchten Skaug et al.[91] die Adsorption und Desorption fluoreszenzmarkierter Polyethylenglykol- Ketten in Lösung an einer hydrophoben Oberfläche. Die beobachtete Dynamik ließ sich eher durch einzelne Desorptionsvorgänge der ganzen Kette erklären, als durch ein Wandern einzelner Segmente auf der Oberfläche. Die Polymerketten nehmen also keine zweidimensionale Konformation auf der Oberfläche ein, wie bisher oft vermutet,
änderungen einer Polymerkette während eines Temperprozesses in PMMA-Filmen zu studieren. So konnte die Relaxation der durch Schleuderbeschichtung entstandenen Spannung in einem Polymerfilm beobachtet werden.
Die lokale Dynamik des Polymers beeinflusst auch das Verhalten von Sonden im Bereich des Glasübergangs. Als Modellsysteme dienen bei EMWFM-Studien meist dünne Filme.
Untersucht wurde der Einfluss von Faktoren wie Schleuderbeschichtung[92], Vorgeschichte der Filme[93] und besonders der Schichtdicke[94, 95, 96] meist in Abhängigkeit von der Temperatur[6] auf die Rotations- und Translationsdiffusion von freien Molekülsonden.
Neben Studien an Polymeren wird EMWFM auch in anderen materialwissenschaftlichen Fragestellungen eingesetzt, z.B. zur Untersuchung von konjugierten Polymerketten[82,
97], Flüssigkristallen[98], Festkörperkatalyse[20], übergangsmetallkatalysierten Polymerisationen[99] oder chemischer Reaktionen[19]. So konnte sich aufgrund der vielfältigen Möglichkeiten zur Aufklärung von Dynamik und Struktur auf molekularer Ebene ohne Ensemblemittelung diese Methode in den letzten Jahren etablieren.
2.4 Raman-Streuung
Die Raman-Streuung wurde 1923 von Smekal theoretisch beschrieben und 1928 von C.V. Raman, dem Namensgeber, und Landsberg und Mandelstam experimentell nachgewiesen.[100] Bei der Raman-Streuung kommt es infolge einer inelastischen Wechselwirkung der einfallenden Strahlung mit den Molekülen zu einer Energieübertragung. Aufgrund der Energieübertragung besitzt das emittierte Photon weniger Energie als zuvor. Somit ist das emittierte Licht längerwellig als das Anregungslicht, es ist Stokes-verschoben. Das Molekül wird durch die übertragene Energie in einen höheren Schwingungs-Rotationszustand angehoben. Wird hingegen Energie von einem Molekül in einem angeregten Schwingungs-Rotationszustand auf das Photon übertragen, spricht man von anti-Stokes Verschiebung. Das Molekül befindet sich dann auf einem niedrigeren Energieniveau als vor der Wechselwirkung. Diese Energieübertragung bewirkt, dass das Raman-Signal eine größere Wellenlänge als das eingestrahlte Licht aufweist.[101]
Abbildung 2-13: Schema der Streuprozesse: schwarze Pfeile: eingestrahltes Licht; gestrichelte Linien:
virtuelle Zustände a) Rayleigh-Streuung: das gestreute Licht besitzt die gleiche Wellenlänge wie das eingestrahlte; b) Stokes-Prozess: gestreutes Licht (roter Pfeil) ist zu längeren Wellenlängen verschoben als das eingestrahlte Licht; c) Anti-Stokes-Prozess: gestreutes Licht (blauer Pfeil) ist zu kürzeren Wellenlängen verschoben als das eingestrahlte Licht.
Damit Schwingungen Raman-aktiv sind, muss sich die Polarisierbarkeit des Moleküls während der Schwingung ändern. Das ist besonders für symmetrische Valenzschwingungen der Fall. Die Stärke des Dipolmoments, das durch den Laser induziert werden kann, ist von der Deformierbarkeit der Elektronenwolke eines Atoms oder einer Gruppe von Atomen abhängig. Daraus ergibt sich eine charakteristische Verschiebung der Signale unabhängig von der eingestrahlten Wellenlänge, deshalb ist die Methode zur Strukturaufklärung geeignet. Die Signale werden als Differenz zur Einstrahlwellenlänge in Wellenzahlen angegeben. Die Art der Schwingung wird zusätzlich in Kurznotation angegeben: Streckschwingungen werden mit ν symbolisiert, Deformationsschwingungen in der Ebene mit δ, Deformationsschwingungen aus der Ebene mit γ und Torsionsschwingungen mit τ.[102] Die Intensität der Signale I ist abhängig von der Einstrahlintensität des Lasers I0, der Streuwellenlänge νRaman, der Anzahl der streuenden Atome/Moleküle N und deren physikalischen Eigenschaften Cm
wie z.B. die Polarisierbarkeit: I α I0 νRaman4 N Cm
Wie in Abbildung 2-13 dargestellt, gehen die Stokes-Signale vom Grundzustand des
Fluoreszenzsignal das Stokes-Raman-Signal überlagern. Deswegen wird bei Techniken wie z.B. Coherent anti-Stokes Raman Scattering das anti-Stokes-Signal genutzt.
3 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchung von Bewegungen
Das folgende Kapitel befasst sich mit Untersuchungen von Molekülbewegungen mittels Einzelmolekülfluoreszenz-Weitfeldmikroskopie. Der erste Teil beschreibt den verwendeten optischen Aufbau. In den darauffolgenden Abschnitten wird die Auswertung der gewonnenen Daten erläutert. Zunächst wird auf die Identifizierung der Positionen der Molekülsignale und das Erstellen von Trajektorien aus diesen Positionen eingegangen. Anschließend werden zwei Methoden zur Analyse von Trajektorien beschrieben.
3.1 Aufbau des Weitfeldmikroskops
Um spektroskopische Messungen zu ermöglichen, wurde der bestehende Weitfeldfluoreszenzmikroskopie-Aufbau mit kritischer Beleuchtung[7, 103] um einen konfokalen Zweig und einen zusätzlichen Laser erweitert. Das Schema des Aufbaus ist in Abbildung 3-1 dargestellt.
Zusätzlich zum vorhandenen grünen Laser (Cobolt Jive, 561 nm, 100 mW) wurde ein roter Laser (Omicron, 658 nm, 30 mW) in den Aufbau integriert. Direkt nach den Shuttern wurden Clean-up Filter (z561/10 und z568/10, beide AHF analysentechnik AG) im Strahlengang platziert. Der Aufbau wurde so umgestellt, dass mit wenig Aufwand ein Wechsel zwischen konfokaler und Weitfeldanregung für beide Laser möglich ist. Für die konfokale Anregung werden beide Laserstrahlen durch ein Teleskop (f1 = 50 mm, f2 = 175 mm, Vergrößerung 3.5-fach) aufgeweitet. Über bewegliche Spiegel, welche in der schematischen Skizze nicht gezeigt sind, kann eine Feineinstellung erfolgen um die Strahlen entlang der optischen Achse im Mikroskop auszurichten.
Die bestehende kritische Beleuchtung für Weitfeldexperimente wurde erweitert. Der 561 nm-Laser wird über einen variierbaren Strahlaufweiter (LINOS Photonics) aufgeweitet, so dass die Linse, welche den Laserstrahl in die Faser einkoppelt vollständig ausgeleuchtet wird. Da der Strahldurchmesser des 658 nm-Lasers deutlich größer ist als der des 561 nm Lasers, wurde dieser über ein eigenes Teleskop (f1 = 50 mm, f2 = 150 mm Vergrößerung 3-fach) aufgeweitet. Es steht ein Dichroit zur Verfügung über den eine gleichzeitige Anregung, mit fokussiertem Laser und Weitfeldbeleuchtung, mit 561 nm und 658 nm möglich ist.
Im Mikroskop stehen verschiedene Strahlteiler zur Verfügung, z.B. grün (z561 RDC) und rot-grün-blau (z405/561/657RPC) (beide AHF analysentechnik AG), die Licht mit der Wellenlänge der Laser reflektieren und nur das längerwellige Fluoreszenzlicht zum Detektor transmittieren. Das Mikroskop hat zwei seitliche Ausgänge. Je nach Stellung des internen Klappspiegels kann so zwischen Weitfeld-Zweig und Spektroskopie-Zweig gewählt werden. Im Weitfeld-Zweig wird das Bild der Probe über zwei handelsübliche Fotoobjektive (Nikon) auf den CCD-Chip der Kamera (Andor iXon) abgebildet. Damit ist die resultierende Gesamtvergrößerung 304-fach. Zwischen den Objektiven ist das Licht parallel, hier wurden Notch- und Bandpassfilter (E grade 516 nm, AHF analysentechnik AG) platziert um die vorhandene Restmenge an Anregungslicht abzutrennen.
Um die Pixelgröße und die reale Vergrößerung zu bestimmen wird ein Element eines USAF-Targets auf den CCD-Chip abgebildet und die Abstände der Elemente in einem Bildverarbeitungsprogramm ausgemessen.[103] Bei dem oben beschriebenen Aufbau besaß ein Pixel eine Kantenlänge vom 53 nm womit auf dem ganzen Chip mit 512 Pixel somit ein Blickfeld von 27 x 27 µm2 abgebildet wurde.
Im Spektroskopie-Zweig wird das Emissionslicht über zwei Linsen (f1 = 50 mm;
f2 = 75 mm) auf den Spalt des Spektrographen (Shamrock mit Andor Newton CCD- Kamera) abgebildet. Direkt am Mikroskopausgang wurde ein Notchfilter (E grade 658 nm, AHF analysentechnik AG) platziert. In der Bildfeldebene nach dem Mikroskop kann zusätzlich eine Lochblende platziert werden. Diese ist mit der ersten Linse auf einem in x,y und z-Richtung verstellbaren Aufbau befestigt, über den eine Feinjustage erfolgen kann.
3.2 Analyse der Bewegung einzelner Moleküle
Der folgende Abschnitt behandelt die Schritte, die nötig sind, um den Diffusionskoeffizienten einzelner Moleküle oder Partikel in einem mit Weitfeldmikroskopie aufgenommenen Film zu bestimmen.
Im ersten Schritt werden durch Angleichen der Signale die Positionen der Moleküle oder Partikel ermittelt. Obwohl die Signale beugungslimitiert sind, kann im Falle hinreichend weit auseinander liegender Signale mit mathematischen Methoden in der x,y-Ebene eine sehr hohe, nicht beugungslimitierte Positionierungsgenauigkeit erreicht werden. Die Auflösung in z-Richtung ist dagegen deutlich geringer.
Im nächsten Schritt werden die Positionen in ihrer zeitlichen Abfolge miteinander verbunden. So entsteht die Trajektorie, aus der der Diffusionskoeffizient D ermittelt werden kann. Hier sollen zwei, in der vorliegenden Arbeit verwendete Methoden, vorgestellt werden: die Analyse des mittleren Verschiebungsquadrats und die Analyse des Trajektorienradius Rt.
3.3 Positionierung
Die Auflösung des Bilds eines fluoreszierenden Moleküls (oder nanoskopischen Partikels) ist beugungsbegrenzt (Abbildung 3-2), d.h. obwohl das Molekül nur wenige Nanometer[79] groß ist, detektiert man eine optische Transferfunktion (engl.: Point Spread Function, PSF) mit einer Halbwertsbreite im Bereich von einigen hundert Nanometern.
