P0/hν Anzahl der Photonen pro Sekunde in Gebiet A Cb Hintergrund abhängig von der Anregungsleistung Nd Dunkelstromzählrate
DP Systemabhängiger Parameter
Zu DP tragen das Lichtsammelvermögen[67, 68], Verluste an Optik und Filtern und die Quantenausbeute des Detektors bei. Der Beitrag von DP liegt laut Literatur in der Regel in einem Bereich zwischen 1% - 8%.[62]
Aus dieser Formel ergibt sich, dass ein besseres SRV erzielt werden kann, je höher die Anregungsleistung ist. Dies gilt aber nur bis die Sättigungsgrenze erreicht wird. Steigt die Anregungsleistung noch weiter, können die Moleküle nicht schnell genug in den Grundzustand zurückkehren um ein neues Photon zu absorbieren. Eine Erhöhung der Laserintensität führt dann nur zu einem höheren Hintergrund.
Es existiert ein optimaler Laserintensitätsbereich im Bereich der Sättigung in dem das Fluoreszenzsignal maximal gegenüber dem linear ansteigenden Hintergrund wird. In der Praxis wird dieser Bereich durch das Photobleichen begrenzt. Denn bleicht das Molekül während der Aufnahmezeit, können weniger Photonen gesammelt werden als theoretisch möglich.[62]
In die theoretische Berechnung des SRV gehen viele Parameter ein, die oft nicht bekannt sind. In vielen Fällen ist deshalb eine empirische Abschätzung, z.B. nach Kubitschek,[69] ebenso aussagekräftig.
2.2 Methoden der Fluoreszenzmikroskopie
Es existiert eine große Bandbreite an Methoden, welche mit Einzelmolekülfluoreszenz arbeiten. Sie lassen sich in Nah- und Fernfeldmethoden einteilen. Die klassische Mikroskopie in der das Abbesche Beugungslimit gilt, ist eine Fernfeldmethode. In
Fernfeldmethoden wird entweder ein ganzer Bereich der Probe beleuchtet und beobachtet oder das Anregungslicht wird fokussiert und das Signal aus diesem Punkt dann detektiert. In den folgenden Abschnitten wird genauer auf die in dieser Arbeit verwendeten Techniken Epi-Fluoreszenz, interne Totalreflexion und Beleuchtung mit fokussiertem Laser eingegangen.
2.2.1 Fluoreszenzanregung in der Einzelmolekül-Weitfeldmikroskopie
Bei der Einzelmolekül-Weitfeldmikroskopie wird eine Fläche mit einem Durchmesser von einigen zehn Mikrometern gleichmäßig beleuchtet. Das Fluoreszenzlicht wird durch Filter vom Anregungslicht abgetrennt und auf einen zweidimensionalen Detektor, in der Regel eine EM-CCD-Kamera, abgebildet. Dadurch können immer mehrere Moleküle gleichzeitig beobachtet werden. Deswegen sind bereits mit wenigen Messungen statistische Aussagen möglich. Zudem können die Moleküle, ohne ein zwischengeschaltetes mathematisches Modell, direkt beobachtet werden. Dadurch ist es leichter Heterogenitäten und seltene Ereignisse zu detektieren. Ein Nachteil von CCD-Kameras im Vergleich zu Punktdetektoren ist jedoch ihre geringere Auslesegeschwindigkeit (Andor iXon: ~30 ms für ein 512 x 512 Pixel-Bild im Vergleich zu ~400 ps für Standard-APDs). Für die Weitfeldfluoreszenzmikroskopie wird zum Anregen der Fluoreszenz meistens eine Epi-Beleuchtung oder die Interne Totalreflexion benutzt.
2.2.1.1 Interne Totalreflexion
Trifft Licht flacher als ein kritischer Winkel γkrit auf eine Grenzfläche zwischen zwei Medien mit unterschiedlichem Brechungsindex (n1>n2) kommt es zur Totalreflexion dieses Strahls. Das Licht wird in das Medium mit höherem Brechungsindex zurückreflektiert, anstatt in das dünnere Medium gebrochen zu werden. Für γ krit gilt das Snelliussche Gesetz:
(2-5)
Abbildung 2-10: Relative Intensität des evaneszenten Felds bei z = 0 in Abhängigkeit des Einfallswinkels an einer Glas-Luft (durchgezogene Linie) bzw. einer Glas-Wasser (gestrichelte Linie) Grenzfläche, berechnet für s-polarisiertes Licht. (Aus Paige, M. et al., A Comparison of Through-the-Objective Total Internal Reflection Microscopy and Epifluorescence Microscopy for Single-Molecule Fluorescence Imaging. Single Mol. 2001, 2, 191, [70] Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Reproduziert mit Erlaubnis.)
Die Abnahme der Intensität mit zunehmender Entfernung von der Grenzfläche ist abhängig vom Einfallswinkel γ, den Brechungsindizes der Medien und der Wellenlänge des Lichts. Für grünes Licht (550 nm) an der Grenzfläche Glas (n1 = 1.51)/ Luft (n2 = 1.00) mit θkrit = 41.3° reicht das evaneszente Feld ca. 150 nm in die Probe hinein.
An der Grenzfläche Glas/Wasser (nH2O = 1.33) ist die Eindringtiefe etwas höher.[5] Durch die geringe Eindringtiefe werden nur Moleküle in einem kleinen Bereich angeregt, dadurch entsteht keine störende Hintergrundfluoreszenz von Molekülen außerhalb des Fokus. Allerdings ist so auch keine Beobachtung tiefer in der Probe möglich.
Untersuchungen zeigten, dass das Fluoreszenzsignal von zufällig orientierten Molekülen bei Beleuchtung durch interne Totalreflexion höher ist als in einer vergleichbaren epi-Anordnung.[70]
Die interne Totalreflexion wird entweder mit Hilfe eines Prismas realisiert, oder über ein Objektiv mit hoher numerischer Apertur. Bei der prismenbasierten Version wird ein Laser so in das Prisma eingekoppelt, dass es an einer Seite zur internen Totalreflexion kommt. Die Probe wird dann entweder direkt auf das Prisma, oder unter einem mit Immersionsmedium bestrichenen Deckglas aufgebracht. Ein Objektiv sammelt dann das Fluoreszenzsignal unterhalb der Probe ein.[35, 62, 71] Alternativ kann ein Objektiv mit einer hohen NA verwendet werden, auf dessen rückwärtige Bildebene ein Laserstrahl fokussiert wird.[72] Bei wässrigen Systemen wird mindestens ein Objektiv mit NA ~1.4
benötigt.[4] Wird der Strahl von der optischen Achse wegbewegt, tritt der kollimierte Strahl nicht mehr senkrecht aus dem Objektiv aus, sondern wird in einem Winkel abgestrahlt. Der genaue Winkel ist abhängig von der Entfernung des Strahls von der optischen Achse, der Position des Fokus und der NA des Objektivs.[5] Der Strahl fällt schräg auf die Probe. Wenn er den kritischen Einfallswinkel an der Grenzfläche (z.B.
Deckglas/Luft) erreicht, kommt es zur Totalreflexion, wodurch der Strahl an der Grenzfläche wieder zurückgeworfen wird. Die Fluoreszenz wird vom Objektiv eingesammelt und über den dichroitischen Strahlenteiler vom Anregungslicht abgetrennt.
2.2.2 Fluoreszenzanregung mit konfokaler Beleuchtung
Das Konzept des konfokalen Mikroskops wurde in den 1950er Jahren entwickelt, u.a.
vom Mathematiker Marvin Minsky. Er suchte nach einer Methode, um auch in sehr dichten Proben mikroskopische Aufnahmen machen zu können. Allerdings konnte die Technik sich erst in den 1980er Jahren durchsetzen, nachdem dank des technischen Fortschritts eine schnellere und empfindlichere Bildaufnahme möglich wurde.[4] Der in diesen Jahren entwickelte optische Aufbau wird auch heute noch in ähnlicher Weise verwendet, allerdings kann bei der Verwendung von Lasern als Lichtquelle auf die ursprünglich im Anregungsstrahlengang platzierte Lochblende verzichtet werden. Bei einem als „konfokal“ bezeichnetem Aufbau in der heutigen Form wird der aufgeweitete, parallele Laserstrahl in das Objektiv eingekoppelt, das den Strahl in die Probe fokussiert. Der Durchmesser des Fokus ist durch das Beugungslimit begrenzt. Bei einer Anregungswellenlänge im sichtbaren Bereich erhält man theoretisch ein Signal das im Fokus einem Durchmesser von ungefähr 300 nm aufweist. Dieses theoretische Minimum wird in der Praxis allerdings nicht erreicht. Um eine zusätzliche Begrenzung des Detektionsvolumens in Richtung der optischen Achse zu erreichen, wird eine Lochblende im Detektionsstrahlengang eingesetzt. Diese Lochblende besitzt typischerweise einen Durchmesser im Mikrometerbereich. Das Licht aus der Probe wird vom Objektiv gesammelt und von der Tubuslinse des Mikroskops fokussiert. Die
Abbildung 2-11: Anregungsbereich (grau) und Detektionsvolumen mit Durchmesser r0 in x,y – Richtung und Höhe z (grün).[4]
Das konfokale Signal kann z.B. spektroskopisch analysiert werden (Fluoreszenz-, Raman-Spektren u.a.) oder man misst die Intensität bzw. deren Fluktuation. Es werden meist Punktdetektoren wie z.B. Avalanche-Photodioden verwendet. Da diese deutlich lichtempfindlicher und schneller wie CCD-Kameras sind, können mit dieser Methode Prozesse untersucht werden, die auf einer wesentlich kürzeren Zeitskala stattfinden.
Um räumliche Informationen zu erhalten muss die Probe allerdings abgerastert werden. Dazu kann entweder die Probe über einen Piezo-Tisch bewegt werden, oder der Anregungsstrahl wird über galvanisch gesteuerte Spiegel über die Probe bewegt.
Ein Vorteil der konfokalen Mikroskopie gegenüber der Weitfeldmethode ist die bessere Auflösung in z-Richtung, welche auch dreidimensionale Aufnahmen erlaubt. Die Zeitauflösung ist in der Regel begrenzt durch die Abrasterungsgeschwindigkeit und die Zeit, die benötigt wird, um in jedem einzelnen Pixel ein ausreichend starkes Signal zu sammeln.
2.2.2.1 Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie
Die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (engl.: fluorescence correlation spectroscopy, FCS) wird vor allem verwendet um schnelle Diffusionsvorgänge in niedrigviskosen Medien zu messen. Die Methode wurde zwar schon in den 1970er Jahren entwickelt[73, 74], durchsetzen konnte sie sich aber erst mehr als zwanzig Jahre später, aufgrund des technischen Fortschritts bei Lasern und Detektoren. Durch Übertragung des Konzepts auf einen konfokalen Aufbau[75] konnte die Auflösung weiter verbessert werden. Der heute zugängliche Zeitbereich erstreckt sich von ca. 100 bis ca.
10-12 s.[76, 77] Damit sind Prozesse wie Antibunching, Rotationsdiffusion, Triplettzustand und Translations-diffusion zugänglich. Diese Vorgänge verursachen alle eine Intensitätsfluktuation des gemessenen Signals, z.B. durch Ein- und Austritt eines
Fluoreszenzfarbstoffs ins konfokale Volumen. Die Farbstoffkonzentration liegt im nanomolaren Bereich, so dass sich durchschnittlich ca. ein Molekül im Detektionsvolumen befindet. Die Selbstähnlichkeit des Signals wird durch die Autokorrelationsfunktion beschrieben. Um diese zu ermitteln wird die Intensität des Signals zum Zeitpunkt t mit der bei t + τ verglichen. Dabei nimmt die Wahrscheinlichkeit ein weiteres Signal bei steigender Wartezeit zu detektieren ab. Die Angleichung mit der Autokorrelationsfunktion ergibt dann die mittlere Dauer einer Fluktuation. Bei Diffusion kann aus diesem Wert τD der Diffusionskoeffizient D berechnet werden.
Abbildung 2-12: Autokorrelationskurve mit Zeitbereichen verschiedener Prozesse, welche mit FCS zugänglich sind. (Reproduziert aus Schwille, P.; Haustein, E. Biophysics Textbook online 2001, p. 33.
(Zugriff 08.06.2014) [78]. Copyright 2001)
FCS wurde auch in materialwissenschaftlichen Fragestellungen eingesetzt, z.B. um Diffusion in radikalischen Polymerisationen mit und ohne Vernetzer[17, 79], in Schmelzen linearer und sternförmiger Polymere[80] oder im halbverdünnten Regime[81] zu untersuchen.
2.3 Einzelmolekül-Weitfeldmikroskopie zur Untersuchung von Polymeren