2.1 Fluoreszenzmikroskopie
2.1.1 Grundlagen der Fluoreszenz
Wird ein Farbstoffmolekül mit Licht bestrahlt, kann es Energie aufnehmen und in einen angeregten Singulettzustand übergehen (S0 → S1, S2,…). Dieser Prozess geschieht innerhalb weniger Femtosekunden. Wie hoch die benötigte Energie bzw. Wellenlänge des Anregungslichts ist, hängt vom Abstand der Energieniveaus ab. Die beschriebenen Vorgänge werden im Jablonski-Diagramm (Abbildung 2-4) dargestellt.
Abbildung 2-4: Jablonski-Diagramm: S0, S1 = Singulett-Zustände; T1 = Triplett-Zustand; A = Absorption; IC
= innere Konversion (engl.: internal conversion); F = Fluoreszenz; nr = nicht strahlende Desaktivierung;
ISC = Interkombination (engl.: intersystem crossing); P = Phosphoreszenz
Im Grundzustand S0 sind bei Raumtemperatur höhere Schwingungszustände meist nicht besetzt. Nach der Anregung kann sich ein Molekül in einem höheren Schwingungszustand des S1 befinden. Nach dem Franck-Condon-Prinzip ist ein Übergang für den angeregten Schwingungszustand am wahrscheinlichsten, bei dem die Überlappung der Schwingungswellenfunktionen von S0 und S1 am größten ist. Durch strahlungslose Relaxation (innere Konversion) geht das Molekül in den Schwingungs-Grundzustand des S1 über. Aus diesem erfolgen neben der spontanen Fluoreszenz weitere Prozesse wie Übergänge in den Triplettzustand, Photoreaktionen oder strahlungslose Desaktivierung.
Die Lebenszeit des angeregten Schwingungszustands liegt im Pikosekundenbereich, die des elektrischen Zustands liegt dagegen im Nanosekundenbereich, d.h. die Fluoreszenz findet aus dem Schwingungs-Grundzustand des S1 statt und ist damit meist unabhängig von der Wellenlänge des eingestrahlten Lichts. Dieses Phänomen ist als „Kasha-Regel“
bekannt.
Bei diesen Desaktivierungsprozessen wird vom Molekül Energie abgegeben, deswegen ist die Energie des Fluoreszenzlichts geringer als die des eingestrahlten Lichts. Man beobachtet eine Rotverschiebung des Fluoreszenzlichts, die sogenannte Stokes-Verschiebung.
Ein konkurrierender Prozess zur Fluoreszenz ist die strahlungslose Desaktivierung. Sie wird möglich, wenn höhere Zustände mit angeregten vibratorischen oder rotatorischen Zuständen eines niedrigeren Zustands koppeln.
Des Weiteren sind Übergänge in den Triplettzustand möglich, die man als Interkombination bezeichnet. Der Prozess findet auf einer Mikrosekunden Zeitskala statt, da er eigentlich spinverboten ist. Der Übergang T1 nach S0 ist ebenfalls spinverboten. Wegen der langen Lebenszeit des T1 kommt es hauptsächlich zu strahlungslosen Desaktivierungsprozessen, wie zum Beispiel Stößen oder Reaktionen mit der Umgebung. Phosphoreszenz wird in organischen Molekülen eher selten beobachtet.[4, 26]
Fluoreszenz eines Moleküls gemessen, kann das Signal aufgrund der Stokes-Verschiebung vom Anregungslicht abgetrennt werden. Einzelmolekülfluoreszenz konnte erstmals 1990 von Orrit und Bernard an Pentacen in p-Terphenyl bei Heliumtemperaturen nachgewiesen werden.[29] Später führten verschiedene Gruppen Experimente mit Hilfe der Fluoreszenz einzelner Moleküle auch bei Raumtemperatur und in Lösung durch.[30] Nahfeldmethoden[31] wurden u.a. benutzt um das Übergangsdipolmoment einzelner, immobilisierter Fluorophore zu untersuchen.
In den 1990er Jahren wurden zunehmend konfokale[32, 33, 34] und Weitfeld-Methoden[35,
36] (weiter-)entwickelt, die eine einfache Detektion von Einzelmolekülfluoreszenz erlaubten. Ihr „Siegeszug“ wurde durch den technischen Fortschritt, wie z.B. die Entwicklung empfindlicher CCD-Kameras, Avalanchephotodioden und stabiler, kompakter Laser wesentlich erleichtert. Die Entwicklung von hochauflösenden Methoden, bei denen das Abbesche Beugungslimit umgangen wird, war ein weiterer Meilenstein.[37, 38, 39, 40, 41, 42]
Die Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie und -spektroskopie hat heute ein breites Anwendungsfeld, es konnten viele biologische und materialwissenschaftliche Prozesse untersucht und Fragen beantwortet werden.
2.1.3 Vorteile von Einzelmoleküluntersuchungen
Welche Vorteile bieten nun Untersuchungen an einzelnen Molekülen im Vergleich zum Molekülensemble? Jedes Molekül besitzt eine unterschiedliche Umgebung, welche seine Eigenschaften beeinflusst. Ein Molekül ist also eine Sonde für seine lokale Nanoumgebung. Ensemble-Methoden mitteln über eine größere Anzahl von Molekülen und messen deshalb nur einen Mittelwert. Einzelmolekülmethoden dagegen ermitteln für jedes Molekül einen individuellen Wert, weshalb man eine Verteilung der Werte erhält. So können auch kleine Populationen erfasst werden, die bei einer Ensemblemittelung den Gesamtwert kaum beeinflussen.
Neben räumlich verursachten Unterschieden von Molekülen ist es auch möglich zeitabhängige Prozesse aufzulösen.[3] So können seltene Ereignisse erfasst werden, welche besonders in inhomogenen Systemen auftreten. Bei Ensemblemessungen zeitabhängiger Prozesse ist eine Synchronisation der Moleküle nötig, z.B. wenn Änderungen der Molekülstruktur oder Interkombinationsprozesse untersucht werden.[43] Diese Synchronisation entfällt bei Einzelmolekülmessungen. Beispiele für Einzelmolekülexperimente zeigt Abbildung 2-5.
a) b) c)
Abbildung 2-5: Beispiele für Einzelmolekülexperimente a) Anregungsspektren eines Pentacenmoleküls, die nacheinander aufgenommen wurden, zeigen spektrale Sprünge (Nachdruck mit Genehmigung aus Ambrose, W. et al.,Detection and spectroscopy of single pentacene molecules in a p-terphenyl crystal by means of fluorescence excitation. JChemPhys; 1991, 95, 7150-7163.[44]. Copyright 1991, AIP Publishing LLC); b) Einzelmolekültrajektorien weisen auf zwei Molekülfraktionen hin: diffundierende und immobile (Copyright 2008 Wiley, Benutzt mit Genehmigung aus Wöll, D. et al., Radical Polymerization tracked by Single Molecule Spectroscopy. Angew. Chem., Int. Ed. 2008, 47, 783.[17]; c) Katalyse auf Einzelmolekülniveau: Farbstoffe werden von einem Substrat in ihre fluoreszierende Form umgewandelt (Copyright 2007 PNAS, reproduziert von Roeffaers, M. et al., Single-molecule fluorescence spectroscopy in (bio)catalysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007, 104 (31), 12603.[20])
Die Einzelmolekülfluoreszenz wird verwendet um Moleküleigenschaften wie Fluoreszenzlebenszeiten[45] zu untersuchen. Aber auch Prozesse wie Fluoreszenzfluktuationen z.B. verursacht durch Förster-Resonanzenergietransfer[46, 47,
48] werden an Hand von Einzelmolekülfluoreszenz studiert. Des Weiteren werden Einzelmoleküle als Sonden eingesetzt, die über Ihr Fluoreszenzsignal Auskunft über ihre Dipol-Orientierung[49], Translations- und Rotationsdiffusion[6, 50] geben. Diese Themengebiete sind in zahlreichen Übersichtsartikeln[3, 43, 51] zusammengefasst.
2.1.4 Anforderungen an Farbstoffe für Einzelmolekülstudien
Welche Anforderungen werden an Fluoreszenzfarbstoffe für Einzelmolekülanwendungen gestellt? Erwünscht ist in der Regel ein möglichst intensives Fluoreszenzsignal. Dafür sind ein hoher Absorptionsquerschnitt und eine hohe Fluoreszenzquantenausbeute nötig, das heißt die Depopulation des S1 muss bevorzugt über spontane Fluoreszenz ablaufen, mit vergleichsweise niedrigen Raten für
Bei den meisten Einzelmolekülanwendungen ist Blinken, also kurzzeitige Dunkelzustände, unerwünscht. Diese kurzen Auszustände werden z.B. durch Übergang des Moleküls in den Triplettzustand verursacht. Sie sind ein Hinweis darauf, dass das beobachtete Signal tatsächlich von einem einzelnen Molekül stammt. Charakteristisch für ein einzelnes Molekül ist auch das Bleichen in einem Schritt. Ein Molekül kann nur eine begrenzte Anzahl an Anregungszyklen durchlaufen, da es aus dem angeregten Zustand zu irreversiblen Photoreaktionen kommen kann. Diese können dazu führen, dass das Molekül zerstört wird und nicht mehr fluoresziert (s. Abbildung 2-6).
Abbildung 2-6: Zeitspuren der Fluoreszenzintensität zweier Moleküle: zu erkennen ist das Bleichen in einem Schritt. Das Molekül der rechten Zeitspur zeigt einen längeren Dunkelzustand.
Die in dieser Arbeit verwendeten Derivate der Rylen-Pigmente besitzen eine hohe (photo)chemische und thermische Stabilität, weswegen sie in verschiedenen technischen Anwendungen wie Solarzellen[52], Leuchtdioden[53], oder in optoelektronischen Anwendungen[54] eingesetzt werden. Ein weiteres wichtiges Einsatzgebiet sind Einzelmolekülfluoreszenzuntersuchungen.[52]
a) b)
Abbildung 2-7: a) Modifikationen am Perylenbis(dicarboximid)-Grundgerüst können in der bay-Region (R) und an der Imid-Gruppe (Peri-Position, R‘) vorgenommen werden. b) Substituiertes PDI, welches u.a.
in dieser Arbeit für Einzelmoleküluntersuchungen genutzt wurde.
Abbildung 2-7 a) zeigt ein Perylendiimid (PDI), der kürzeste Vertreter der Rylendiimid-Gruppe. Das Rylengrundgerüst wurde vielfach modifiziert um z.B. die photophysikalischen Eigenschaften[52], die Löslichkeit in verschiedenen Medien[55, 56, 57, 58] oder die Molekülgröße[59, 60] anzupassen.
In vielen Einzelmolekülarbeiten werden Perylendiimide eingesetzt, bei denen in der bay-Region Phenoxy-Gruppen eingeführt wurden. Diese Substituenten verhindern die Bildung von π-π-Aggregaten und schirmen den Chromophor ab. Bei so substituierten Derivaten kann eine bathochrome Verschiebung von Absorption und Fluoreszenz im Vergleich zur unsubstituierten Verbindung beobachtet werden, da die sterische Hinderung der Substituenten zu einer Verdrehung des Grundgerüsts führt.[52, 61]
Zusätzlich besitzen die Phenoxy-Gruppen einen elektronenschiebenden Charakter. Ein in dieser Arbeit verwendetes Derivat (Abbildung 2-7b)) zeigt in Toluol das S0→S1
Absorptionsmaximum bei 580 nm, das Emissionsmaximum liegt bei 610 nm. Bei einem in der bay-Region unsubstituierten PDI liegen Absorptions- und Emissionsmaximum bei deutlich niedrigeren Wellenlängen (Abs.: 525 nm; Em.: 536 nm).[52]
2.1.5 Probleme und Herausforderungen bei der Einzelmolekülfluoreszenz-detektion
Bei Einzelmolekülexperimenten ist ein hohes Signal-zu-Rauschverhältnis (SRV) besonders wichtig. Wie in Abbildung 2-8 gezeigt, gibt es verschiedene Beiträge zur gemessenen Intensität.
Abbildung 2-8: Beiträge zum gemessenen Signal: Kamera-Offset bei CCD-Detektoren, Dunkelstrom,
Für ein hohes Signal ist es nötig die vom Farbstoff ausgesendeten Photonen möglichst effizient einzusammeln. Deswegen werden Objektive benutzt, die eine hohe Numerische Apertur NA und damit eine hohe Sammeleffizienz besitzen. Objektive und sonstige Optiken sind zusätzlich beschichtet, um eine möglichst hohe Transmission zu erreichen.
Die Photonen werden dann durch empfindliche und dunkelrauscharme Detektoren (CCD-Kamera, Photomultiplier tube, o.ä.) in ein elektrisches Signal umgewandelt.[62]
Zum Detektorsignal tragen noch Kamera-Offset und Dunkelstrom bei. Das Offset ist ein konstanter Wert, der vor der Analog-zu-Digital-Wandlung zum gemessenen Signal hinzuaddiert werden kann. Da er konstant ist, wird er bei der Bestimmung des Signal-zu-Rauschverhältnis in der Regel nicht berücksichtigt. Der Dunkelstrom entsteht durch thermische Ladungstrennung in den Pixeln und ist abhängig von der Temperatur und der Belichtungszeit. Er kann durch die Verwendung gekühlter CCD-Kameras deutlich reduziert werden.
Zum Rauschen tragen Quellen wie z.B. Ausleserauschen, Streulicht und Fluoreszenz außerhalb des Fokus bei. Dieser Hintergrund kann im Aufnahmebereich ungleichmäßig intensiv sein.
Das Licht der Fluoreszenzanregung ist in der Regel deutlich intensiver wie die Fluoreszenz selbst. Durch die Verwendung einer epi-Detektion wird nur ein kleiner Teil dieses Lichts vom Mikroskopobjektiv wieder eingesammelt.[26] Durch den dichroitischen Filter findet dann noch eine Wellenlängen-abhängige Selektion des Lichts statt und nur das bathochrom verschobene Fluoreszenzlicht wird zum Detektor transmittiert.[4]
Bei der Probenpräparation ist sehr sauberes Arbeiten erforderlich, damit die Probe nicht mit fluoreszierenden oder streuenden Verunreinigungen kontaminiert wird. Bei Experimenten in Masse sollte eine niedrigere Fluorophorkonzentration gewählt werden als in dünnen Filmen um Störlicht von Molekülen außerhalb des Fokus gering zu halten.
Verschiedene Streuprozesse können zum Hintergrund beitragen. Rayleigh-Streuung, wie sie z.B. durch Staub verursacht wird, kann durch Filter zwar unterdrückt werden, allerdings nie vollständig. Raman-Streuung, z.B. durch Lösemittel, kann Signale im Wellenlängenbereich der Fluoreszenz verursachen. In konfokalen Experimenten wird deshalb ein kleines Detektionsvolumen gewählt, wodurch das Fluoreszenzsignal im Vergleich zum Raman-Signal stärker wird, wie in Abbildung 2-9 gezeigt. In wässrigen Lösungen hängt die Stärke des Raman-Signals vom Streuquerschnitt σS des Wassers
(10-28 cm²) mal der Anzahl der Moleküle in der Volumeneinheit ab. Die Raman-Streuung der Moleküle in 1 mL Wasser ist damit 1010 mal stärker als das Fluoreszenzsignal eines einzelnen Rhodamin 6G Moleküls mit einem Absorptionsquerschnitt von 4 × 10-16 cm².[26]
Deswegen wird versucht Laserwellenlänge, Farbstoff und Passband des Filters so zu kombinieren, dass keine oder wenige (intensive) Raman-Banden des Lösungsmittels im gewählten Wellenlängenbereich liegen.[26]
a) Ein Rhodamin 6G Molekül in: b)
1 cm 4.6 µm 1 µm
IF = 1.0 IRS = 1010
IF = 1.0 IRS = 1.0
IF = 1.0 IRS = 10-2 V = 1 mL V = 97 fL V = 1 fL
Abbildung 2-9: a) Intensität der Fluoreszenz IF eines Rhodamin 6G Moleküls im Vergleich zur Raman-Streuung IRS in verschieden großen Volumina (Nach Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy
[26] S. 759f) b) Vergleich der Banden eines Raman-Spektrums von Toluol (rot), angeregt bei 561 nm mit dem Fluoreszenzspektrum von Perrylendiimid (schwarz) am eingesetzten Aufbau, Intensitäten wurden zur besseren Vergleichbarkeit der Wellenlängenbereiche auf 1 normiert
Im Prinzip ist auch eine zeitliche Abgrenzung der Prozesse über einen zeitgesteuerten Aufbau mit gepulsten Lasern möglich, da die Fluoreszenz eine Lebenszeit von einigen Nanosekunden hat, während Streuprozesse quasi-instantan mit der Einstrahlung von Licht stattfinden.[63]
Zum Rauschen tragen viele verschiedene, oft nicht konstante Quellen bei. Die Intensität des Signals muss trotz der Rauschfluktuationen detektiert werden können.[4, 62] Nach Yildiz et al. wird der Fehler bei der Bestimmung einer Molekülposition geringer, wenn die Zahl der eingesammelten Photonen im Vergleich zur Hintergrund steigt.[64] Daher
P0/hν Anzahl der Photonen pro Sekunde in Gebiet A Cb Hintergrund abhängig von der Anregungsleistung Nd Dunkelstromzählrate
DP Systemabhängiger Parameter
Zu DP tragen das Lichtsammelvermögen[67, 68], Verluste an Optik und Filtern und die Quantenausbeute des Detektors bei. Der Beitrag von DP liegt laut Literatur in der Regel in einem Bereich zwischen 1% - 8%.[62]
Aus dieser Formel ergibt sich, dass ein besseres SRV erzielt werden kann, je höher die Anregungsleistung ist. Dies gilt aber nur bis die Sättigungsgrenze erreicht wird. Steigt die Anregungsleistung noch weiter, können die Moleküle nicht schnell genug in den Grundzustand zurückkehren um ein neues Photon zu absorbieren. Eine Erhöhung der Laserintensität führt dann nur zu einem höheren Hintergrund.
Es existiert ein optimaler Laserintensitätsbereich im Bereich der Sättigung in dem das Fluoreszenzsignal maximal gegenüber dem linear ansteigenden Hintergrund wird. In der Praxis wird dieser Bereich durch das Photobleichen begrenzt. Denn bleicht das Molekül während der Aufnahmezeit, können weniger Photonen gesammelt werden als theoretisch möglich.[62]
In die theoretische Berechnung des SRV gehen viele Parameter ein, die oft nicht bekannt sind. In vielen Fällen ist deshalb eine empirische Abschätzung, z.B. nach Kubitschek,[69] ebenso aussagekräftig.
2.2 Methoden der Fluoreszenzmikroskopie
Es existiert eine große Bandbreite an Methoden, welche mit Einzelmolekülfluoreszenz arbeiten. Sie lassen sich in Nah- und Fernfeldmethoden einteilen. Die klassische Mikroskopie in der das Abbesche Beugungslimit gilt, ist eine Fernfeldmethode. In
Fernfeldmethoden wird entweder ein ganzer Bereich der Probe beleuchtet und beobachtet oder das Anregungslicht wird fokussiert und das Signal aus diesem Punkt dann detektiert. In den folgenden Abschnitten wird genauer auf die in dieser Arbeit verwendeten Techniken Epi-Fluoreszenz, interne Totalreflexion und Beleuchtung mit fokussiertem Laser eingegangen.
2.2.1 Fluoreszenzanregung in der Einzelmolekül-Weitfeldmikroskopie
Bei der Einzelmolekül-Weitfeldmikroskopie wird eine Fläche mit einem Durchmesser von einigen zehn Mikrometern gleichmäßig beleuchtet. Das Fluoreszenzlicht wird durch Filter vom Anregungslicht abgetrennt und auf einen zweidimensionalen Detektor, in der Regel eine EM-CCD-Kamera, abgebildet. Dadurch können immer mehrere Moleküle gleichzeitig beobachtet werden. Deswegen sind bereits mit wenigen Messungen statistische Aussagen möglich. Zudem können die Moleküle, ohne ein zwischengeschaltetes mathematisches Modell, direkt beobachtet werden. Dadurch ist es leichter Heterogenitäten und seltene Ereignisse zu detektieren. Ein Nachteil von CCD-Kameras im Vergleich zu Punktdetektoren ist jedoch ihre geringere Auslesegeschwindigkeit (Andor iXon: ~30 ms für ein 512 x 512 Pixel-Bild im Vergleich zu ~400 ps für Standard-APDs). Für die Weitfeldfluoreszenzmikroskopie wird zum Anregen der Fluoreszenz meistens eine Epi-Beleuchtung oder die Interne Totalreflexion benutzt.
2.2.1.1 Interne Totalreflexion
Trifft Licht flacher als ein kritischer Winkel γkrit auf eine Grenzfläche zwischen zwei Medien mit unterschiedlichem Brechungsindex (n1>n2) kommt es zur Totalreflexion dieses Strahls. Das Licht wird in das Medium mit höherem Brechungsindex zurückreflektiert, anstatt in das dünnere Medium gebrochen zu werden. Für γ krit gilt das Snelliussche Gesetz:
(2-5)
Abbildung 2-10: Relative Intensität des evaneszenten Felds bei z = 0 in Abhängigkeit des Einfallswinkels an einer Glas-Luft (durchgezogene Linie) bzw. einer Glas-Wasser (gestrichelte Linie) Grenzfläche, berechnet für s-polarisiertes Licht. (Aus Paige, M. et al., A Comparison of Through-the-Objective Total Internal Reflection Microscopy and Epifluorescence Microscopy for Single-Molecule Fluorescence Imaging. Single Mol. 2001, 2, 191, [70] Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Reproduziert mit Erlaubnis.)
Die Abnahme der Intensität mit zunehmender Entfernung von der Grenzfläche ist abhängig vom Einfallswinkel γ, den Brechungsindizes der Medien und der Wellenlänge des Lichts. Für grünes Licht (550 nm) an der Grenzfläche Glas (n1 = 1.51)/ Luft (n2 = 1.00) mit θkrit = 41.3° reicht das evaneszente Feld ca. 150 nm in die Probe hinein.
An der Grenzfläche Glas/Wasser (nH2O = 1.33) ist die Eindringtiefe etwas höher.[5] Durch die geringe Eindringtiefe werden nur Moleküle in einem kleinen Bereich angeregt, dadurch entsteht keine störende Hintergrundfluoreszenz von Molekülen außerhalb des Fokus. Allerdings ist so auch keine Beobachtung tiefer in der Probe möglich.
Untersuchungen zeigten, dass das Fluoreszenzsignal von zufällig orientierten Molekülen bei Beleuchtung durch interne Totalreflexion höher ist als in einer vergleichbaren epi-Anordnung.[70]
Die interne Totalreflexion wird entweder mit Hilfe eines Prismas realisiert, oder über ein Objektiv mit hoher numerischer Apertur. Bei der prismenbasierten Version wird ein Laser so in das Prisma eingekoppelt, dass es an einer Seite zur internen Totalreflexion kommt. Die Probe wird dann entweder direkt auf das Prisma, oder unter einem mit Immersionsmedium bestrichenen Deckglas aufgebracht. Ein Objektiv sammelt dann das Fluoreszenzsignal unterhalb der Probe ein.[35, 62, 71] Alternativ kann ein Objektiv mit einer hohen NA verwendet werden, auf dessen rückwärtige Bildebene ein Laserstrahl fokussiert wird.[72] Bei wässrigen Systemen wird mindestens ein Objektiv mit NA ~1.4
benötigt.[4] Wird der Strahl von der optischen Achse wegbewegt, tritt der kollimierte Strahl nicht mehr senkrecht aus dem Objektiv aus, sondern wird in einem Winkel abgestrahlt. Der genaue Winkel ist abhängig von der Entfernung des Strahls von der optischen Achse, der Position des Fokus und der NA des Objektivs.[5] Der Strahl fällt schräg auf die Probe. Wenn er den kritischen Einfallswinkel an der Grenzfläche (z.B.
Deckglas/Luft) erreicht, kommt es zur Totalreflexion, wodurch der Strahl an der Grenzfläche wieder zurückgeworfen wird. Die Fluoreszenz wird vom Objektiv eingesammelt und über den dichroitischen Strahlenteiler vom Anregungslicht abgetrennt.
2.2.2 Fluoreszenzanregung mit konfokaler Beleuchtung
Das Konzept des konfokalen Mikroskops wurde in den 1950er Jahren entwickelt, u.a.
vom Mathematiker Marvin Minsky. Er suchte nach einer Methode, um auch in sehr dichten Proben mikroskopische Aufnahmen machen zu können. Allerdings konnte die Technik sich erst in den 1980er Jahren durchsetzen, nachdem dank des technischen Fortschritts eine schnellere und empfindlichere Bildaufnahme möglich wurde.[4] Der in diesen Jahren entwickelte optische Aufbau wird auch heute noch in ähnlicher Weise verwendet, allerdings kann bei der Verwendung von Lasern als Lichtquelle auf die ursprünglich im Anregungsstrahlengang platzierte Lochblende verzichtet werden. Bei einem als „konfokal“ bezeichnetem Aufbau in der heutigen Form wird der aufgeweitete, parallele Laserstrahl in das Objektiv eingekoppelt, das den Strahl in die Probe fokussiert. Der Durchmesser des Fokus ist durch das Beugungslimit begrenzt. Bei einer Anregungswellenlänge im sichtbaren Bereich erhält man theoretisch ein Signal das im Fokus einem Durchmesser von ungefähr 300 nm aufweist. Dieses theoretische Minimum wird in der Praxis allerdings nicht erreicht. Um eine zusätzliche Begrenzung des Detektionsvolumens in Richtung der optischen Achse zu erreichen, wird eine Lochblende im Detektionsstrahlengang eingesetzt. Diese Lochblende besitzt typischerweise einen Durchmesser im Mikrometerbereich. Das Licht aus der Probe wird vom Objektiv gesammelt und von der Tubuslinse des Mikroskops fokussiert. Die
Abbildung 2-11: Anregungsbereich (grau) und Detektionsvolumen mit Durchmesser r0 in x,y – Richtung und Höhe z (grün).[4]
Das konfokale Signal kann z.B. spektroskopisch analysiert werden (Fluoreszenz-, Raman-Spektren u.a.) oder man misst die Intensität bzw. deren Fluktuation. Es werden meist Punktdetektoren wie z.B. Avalanche-Photodioden verwendet. Da diese deutlich lichtempfindlicher und schneller wie CCD-Kameras sind, können mit dieser Methode Prozesse untersucht werden, die auf einer wesentlich kürzeren Zeitskala stattfinden.
Um räumliche Informationen zu erhalten muss die Probe allerdings abgerastert werden. Dazu kann entweder die Probe über einen Piezo-Tisch bewegt werden, oder der Anregungsstrahl wird über galvanisch gesteuerte Spiegel über die Probe bewegt.
Ein Vorteil der konfokalen Mikroskopie gegenüber der Weitfeldmethode ist die bessere Auflösung in z-Richtung, welche auch dreidimensionale Aufnahmen erlaubt. Die Zeitauflösung ist in der Regel begrenzt durch die Abrasterungsgeschwindigkeit und die Zeit, die benötigt wird, um in jedem einzelnen Pixel ein ausreichend starkes Signal zu sammeln.
2.2.2.1 Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie
Die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (engl.: fluorescence correlation spectroscopy, FCS) wird vor allem verwendet um schnelle Diffusionsvorgänge in niedrigviskosen Medien zu messen. Die Methode wurde zwar schon in den 1970er Jahren entwickelt[73, 74], durchsetzen konnte sie sich aber erst mehr als zwanzig Jahre später, aufgrund des technischen Fortschritts bei Lasern und Detektoren. Durch Übertragung des Konzepts auf einen konfokalen Aufbau[75] konnte die Auflösung weiter verbessert werden. Der heute zugängliche Zeitbereich erstreckt sich von ca. 100 bis ca.
10-12 s.[76, 77] Damit sind Prozesse wie Antibunching, Rotationsdiffusion, Triplettzustand und Translations-diffusion zugänglich. Diese Vorgänge verursachen alle eine Intensitätsfluktuation des gemessenen Signals, z.B. durch Ein- und Austritt eines
Fluoreszenzfarbstoffs ins konfokale Volumen. Die Farbstoffkonzentration liegt im nanomolaren Bereich, so dass sich durchschnittlich ca. ein Molekül im Detektionsvolumen befindet. Die Selbstähnlichkeit des Signals wird durch die Autokorrelationsfunktion beschrieben. Um diese zu ermitteln wird die Intensität des Signals zum Zeitpunkt t mit der bei t + τ verglichen. Dabei nimmt die Wahrscheinlichkeit ein weiteres Signal bei steigender Wartezeit zu detektieren ab. Die Angleichung mit der Autokorrelationsfunktion ergibt dann die mittlere Dauer einer Fluktuation. Bei Diffusion kann aus diesem Wert τD der Diffusionskoeffizient D berechnet werden.
Abbildung 2-12: Autokorrelationskurve mit Zeitbereichen verschiedener Prozesse, welche mit FCS zugänglich sind. (Reproduziert aus Schwille, P.; Haustein, E. Biophysics Textbook online 2001, p. 33.
Abbildung 2-12: Autokorrelationskurve mit Zeitbereichen verschiedener Prozesse, welche mit FCS zugänglich sind. (Reproduziert aus Schwille, P.; Haustein, E. Biophysics Textbook online 2001, p. 33.