Fehlerbetrachtung zur Analyse der defokussierten Weitfeldmikroskopie115

oft nicht bekannt sind, wie z.B. der genaue Defokussierungsgrad, die numerische Apertur oder der genaue Brechungsindex.^{[6, 219]} Bei Experimenten in dünnen Filmen stellt zudem die Variation der Filmdicke einen Unsicherheitsfaktor dar, da beim für diese Experimente verwendeten Rasterkraftmikroskop nur Bereiche von wenigen 100 nm Kantenlänge in der nötigen Auflösung abgedeckt werden können. Dadurch wichen die im Experiment beobachteten Defokussierungsmuster von den berechneten teilweise so weit ab, dass die für die Winkelberechnungen des Programms nötigen Angleichungen fehlerhaft waren. Das Rauschen in den Aufnahmen führte zusätzlich noch zu Fehlern in der Angleichung. In solchen Fällen war die Mustererkennung des menschlichen Gehirns der automatischen Mustererkennung deutlich überlegen,

Als weiteres Problem für die Genauigkeit mit der θ bestimmt werden konnte, stellte sich das Ausmaß der Änderung der Muster heraus. Je nach gewählten Parametern ergibt sich ein Winkelbereich bei kleinen oder großen Werten für θ in dem die Musteränderung pro 10° im Vergleich zum übrigen Bereich geringer ist. In diesen Bereichen (0°-20° bzw. 70°-90°) ist der vom Programm ermittelte Winkel mit einem

simulierten Mustern (Abbildung 7-7 a)) verglichen und einem Winkelbereich zugeordnet.

a) b)

Abbildung 7-7: a) Mit einem Matlab-Programm nach Uji-i et al.^[82] simulierte Orientierungsmuster für ein Molekül in einem 10 nm dicken PS-Film (Berechnungsparameter: Schichtdicke 10 nm, nPS = 1.59, Position des Moleküls: an der Grenzfläche Polymer-Glas, NA 1.25, Vergrößerung 300x, Defokussierungslänge 1µm) b) Winkelverteilung von 123 PDI-Molekülen in einem schleuderbeschichteten und getemperten Polystyrolfilm. Mit AFM wurde eine mittlere Schichtdicke von 10 nm bestimmt. Die schwarzen Punkte geben den Wert der statistisch erwarteten Verteilung wieder.

Von 0° - 70° war eine Zuordnung der Moleküle in einen 10° umfassenden Bereich möglich. Bei Werten von θ > 70° war eine so genaue Unterscheidung nicht mehr möglich, da die Unterschiede zwischen den Mustern zu gering waren, um sie in einer realen Messung eindeutig zuzuordnen. Deswegen wurden alle Muster dieses 20°

umfassenden Bereichs zusammen als ein Bereich gezählt. In Abbildung 7-7b) wurden alle in diesem Bereich gezählten Moleküle dann gleichmäßig auf die Bereiche 70° - 80°

und 80° - 90° verteilt (dargestellt durch schraffierte Balken) um den Vergleich mit der statistisch erwarteten Verteilung zu erleichtern.

Die beobachtete Verteilung entspricht in etwa der erwarteten statistischen Verteilung, nur im Bereich von 20° - 50° sind weniger Moleküle gefunden worden, im Bereich von 60° - 70° tritt dagegen eine Häufung auf. Mögliche Ursachen könnten Fehler bei der Musterzuordnung sein, besonders im Bereich von 60° - 70°. Denkbar sind auch Fehler bei der Mustersimulation oder eine, trotz tempern, nicht komplett zufällige Orientierungsverteilung der PDI-Moleküle.^[92] Angesichts der oben diskutierten Schwierigkeiten bei der Auswertung ist das Ergebnis trotzdem zufriedenstellend. Die quasi-TIRF-Methode konnte also erfolgreich in den bestehenden Aufbau integriert werden.

7.1.5 Untersuchung fluoreszenzmarkierter PE-Nanopartikel

Für die weitfeldmikroskopischen Untersuchungen wurde eine mit deionisiertem Wasser verdünnte Lösung der PE-Nanopartikel mittels Schleuderbeschichtung auf eine Deckglasoberfläche aufgebracht. Aufnahmen mit Rasterkraftmikroskopie (engl.: atomic force microscopy, AFM) zeigten, dass die Partikel eine Höhe zwischen 12 nm und 16 nm (Abbildung 7-8) aufwiesen. Das deutet darauf hin, dass die Partikel durch die Schleuderbeschichtung flach auf der Oberfläche liegen.

Abbildung 7-8: AFM-Bild von Partikeln, welche durch Schleuderbeschichtung auf eine Deckglasoberfläche aufgebracht wurden. In a) und b) sind die jeweiligen Höhenprofile dargestellt. Nachdruck mit Erlaubnis aus Scheinhardt, B. et al., Anisotropic Polyethylene Nanocrystals Labeled with a Single Fluorescent Dye Molecule: Toward Monitoring of Nanoparticle Orientation. Macromolecules 2013, 46 (19), 7902.

Copyright 2013 American Chemical Society.

Bei den defokussierten Weitfeldmessungen wurde für die Dauer der Messungen keine Umorientierung der Sondenmoleküle beobachtet. Der Marker ist also in seiner Polymerumgebung weitgehend fixiert und ändert seine Orientierung dadurch nicht. Das ist eine Voraussetzung dafür, dass über die Orientierung des Sondenmoleküls auch Aussagen über die Orientierung des Partikels gemacht werden können.

Die Auswertung der Orientierung der im Polymerpartikel befindlichen Farbstoffsonden

In Abbildung 7-9 ist diese von Hand ermittelte Winkelverteilung der Signale aus den defokussierten Weitfeldmessungen gezeigt. Die Winkelverteilung des Polarwinkels θ der Sondenmoleküle weicht hier deutlich von der statistisch erwarteten Verteilung ab, mit einer Vorzugsorientierung im Bereich θ ≤ 30°.

a) b)

Abbildung 7-9: a) Verteilung des Winkels θ der Fluoreszenzmarker von PE-Nanopartikel auf Glas. Über 60% der Marker zeigen einen Polarwinkel kleiner 30°. Es wurden 209 Signale ausgewertet. b) Ausschnitt eines ausgewerteten WFM-Bildes auf Glas aufgeschleuderter, defokussierter Partikeln. (Intensitätsskala invertiert)

Um sicherzustellen, dass tatsächlich eine Vorzugsorientierung des PDI im Partikel besteht und es sich nicht um ein Messartefakt handelt, wurde eine Partikellösung mit einer Lösung des wasserlöslichen Polymers Polyvinylalkohol PVA (Sigma Aldrich, Mw = 86 000, 99-100% hydrolysiert) gemischt und mit Schleuderbeschichtung auf ein Deckglas aufgebracht. Es kann davon ausgegangen werden, dass die in dieser Polymermatrix gelösten Partikel zufällig orientiert sind. Die Auswertung der Defokussierungsmuster ergab tatsächlich eine Verteilung, die weitestgehend der statistisch erwarteten entsprach (Abbildung 7-10a) in blau). Damit kann ein Messartefakt ausgeschlossen und von einer tatsächlichen Vorzugsorientierung der PDI-Markermoleküle in den Partikeln ausgegangen werden.

a) b)

Abbildung 7-10: a) Verteilung des Winkels θ der Fluoreszenzmarker von PE-Nanopartikel eingebettet in einen PVA-Film in blau. Es wurden 109 Signale ausgewertet. Zum Vergleich sind die Werte der Partikel auf Glas angegeben. b) Ausschnitt eines WFM-Bilds der Fluoreszenzsignale der Marker der in PVA eingebetteten Partikel. (Intensitätsskala invertiert)

Für diesen Film musste eine neue Maske für die Auswertung simuliert werden. Der größte Unsicherheitsfaktor war dabei die stark schwankende Schichtdicke des PVA-Films. Die mit AFM ermittelte Schichtdicke schwankte zwischen 50 nm und 300 nm. Der Film wurde nicht getempert um eine Zerstörung der Partikel oder Umorientierung der Marker zu verhindern.