Die Rolle der Leukozyteninfiltration im Gehirn für die Entstehung von Anfällen im Theiler Virus-Modell der Temporallappenepilepsie

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Bibliografische Informationen der Deutschen Bibliothek Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet abrufbar über

http://dnb.ddb.de

1. Auflage 2017

Printed in Germany

ISBN 978-3-86345-366-4

Verlag: DVG Service GmbH Friedrichstraße 17

35392 Gießen Tel.: 0641/24466

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Tierärztliche Hochschule Hannover

Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie Zentrum für Systemische Neurowissenschaften

Die Rolle der Leukozyteninfiltration im Gehirn für die Entstehung von

Anfällen im Theiler Virus-Modell der Temporallappenepilepsie

These

zur Erlangung des Grades eines

DOCTOR OF PHILOSOPHY (Ph.D.)

im Fachgebiet Pharmakologie

durch die

Tierärztliche Hochschule Hannover

vorgelegt von Christopher Käufer

aus Auggen (Baden)

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Supervisor: Prof. Dr. Wolfgang Löscher Betreuergruppe: Prof. Dr. Wolfgang Löscher Prof. Dr. Andreas Beineke Prof. Dr. Klaus Schughart 1. Gutachten:

Prof. Dr. Wolfgang Löscher

Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Prof. Dr. Andreas Beineke

Institut für Pathologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Prof. Dr. Klaus Schughart

Abteilung Infektionsgenetik, Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung Braunschweig

2. Gutachten:

Prof. Dr. Marco Prinz

Institut für Neuropathologie, - Neurozentrum - , Universitätsklinikum Freiburg

Datum der Disputation: 07.04.2017

Teile dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht:

Bröer S*, Hage E*, Käufer C*, Gerhauser I*, Anjum M, Li L, Baumgärtner W, Schulz TF, Löscher W (2016a) Viral mouse models of multiple sclerosis and epilepsy:

Marked differences in neuropathogenesis following infection with two naturally occur- ring variants of Theiler’s virus BeAn strain. Neurobiology of Disease 99:121–132.

(*: authors contributed equally to this work)

Bröer S, Käufer C, Haist V, Li L, Gerhauser I, Anjum M, Bankstahl M, Baumgärtner W, Löscher W (2016b) Brain inflammation, neurodegeneration and seizure develop- ment following picornavirus infection markedly differ among virus and mouse strains and substrains. Experimental Neurology 279:57–74.

Unterstützt durch ein Promotionsstipendium der Studienstiftung des Deutschen Vol- kes e.V.

Diese Arbeit wurde durch das Niedersächsische Ministerium für Wissenschaft und Kultur und die Volkswagen Stiftung im Rahmen des N.-RENNT Forschungsverbun- des finanziert.

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Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ... 1

2 Stand der Forschung ... 3

2.1 Definition Epilepsie ... 3

2.2 Ätiologie ... 4

2.2.1 Virus-bedingte Epilepsien ... 5

2.3 Epileptogenese ... 9

2.4 Behandlung, Pharmakoresistenz und Prävention von Epilepsie ... 9

2.5 Entzündung und Epilepsien ... 11

2.5.1 Mikroglia und Monozyten/Makrophagen ... 16

2.5.2 Differenzierung zwischen Mikroglia und Makrophagen sowie deren Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie ... 18

2.5.3 Cx3cr1-Reporter-Mäuse ... 21

2.5.4 Beeinflussung von Mikroglia/Makrophagen ... 23

2.6 Tiermodelle in der Epilepsieforschung ... 24

2.6.1 Das TMEV-induzierte Epilepsie-Modell ... 26

2.6.2 Theilers Murines Enzephalomyelitis Virus ... 29

3 Ziele und Arbeitshypothesen ... 31

3.1 Studie 1: Etablierung des TMEV-Modells ... 31

3.2 Studie 2: Charakterisierung der Entzündungsantwort, Neurodegeneration und Korrelation mit Anfällen ... 32

3.3 Studie 3: transgene Veränderung der Entzündungszellen ... 33

3.4 Studie 4: Vergleichende Untersuchungen zwischen BeAn-1 und BeAn-2 ... 34

4 Material und Methoden ... 35

4.1 Tiere ... 35

4.1.1 Transgene Tiere ... 36

4.2 Viren ... 37

4.3 Infektion ... 39

4.3.1 Stereotaktische Infektion ... 39

4.3.2 Frei-Hand-Infektion ... 42

4.4 Klinische Untersuchung ... 44

(6)

4.6.1 Implantation der EEG-Elektroden ... 46

4.6.2 EEG-Überwachung ... 49

4.6.3 EEG-/Videoauswertung ... 51

4.7 Histologie ... 53

4.7.1 Perfusion und histologische Bearbeitung ... 53

4.7.2 Färbungen ... 55

4.7.3 Immunhistochemie ... 56

4.7.4 Auswertung ... 57

4.7.4.1 Neurodegeneration ... 57

4.7.4.2 CD3 und CD45R ... 59

4.7.4.3 Mac3 ... 59

4.7.4.4 Rückenmarksveränderungen ... 60

4.8 Virus-Sequenzierung ... 61

4.9 Detektion und Quantifizierung von Virus-RNA ... 61

4.10 Durchflusszytometrie (FACS) ... 63

4.10.1 Isolierung der Zellen ... 64

4.10.2 Zellmessung ... 66

4.10.3 Normierung und Darstellung der Daten ... 68

4.11 Statistische Auswertung ... 69

5 Ergebnisse ... 71

5.1.1 Anfälle ... 71

5.1.1.1 BeAn-1 ... 71

5.1.1.2 BeAn-2 ... 74

5.1.1.3 DA ... 75

5.1.2 Klinisches Bild ... 79

5.2.1 Hippocampale Neurodegeneration ... 83

5.2.2 Entzündung ... 88

5.2.2.1 T-Lymphozyten ... 88

5.2.2.2 B-Lymphozyten ... 94

5.2.2.3 Aktivierte Mikroglia / Makrophagen ... 98

5.2.3 Durchflusszytometrische Untersuchungen ... 103

5.2.3.1 B6-Wildtyp-Mäuse ... 103

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5.2.3.1.1 Charakterisierung der CX3CR1-/Ly6C-Expression ... 106

5.2.3.1.2 Charakterisierung der CD86-/CD206-Expression ... 112

5.2.3.2 Cx3cr1-Reporter-Mäuse ... 117

5.2.3.2.1 Charakterisierung der CX3CR1-/Ly6C-Expression ... 123

5.2.3.2.2 Charakterisierung der CD86-/CD206-Expression ... 127

5.2.4 ROC-Analysen: Test auf Prädiktivität ... 131

5.3 Studie 3: Transgene Veränderung der Entzündungszellen ... 134

5.3.1 Ccr2-KO-Mäuse ... 134

5.3.1.1 Anfälle ... 134

5.3.1.3 Aktivierte Makrophagen/Mikroglia ... 138

5.3.2 Cx3cr1-KO-Mäuse ... 140

5.3.2.1 Anfälle ... 140

5.3.2.3 Aktivierte Makrophagen / Mikroglia ... 144

5.4.1 Virus-Sequenzierung ... 146

5.4.2 Detektierung und Quantifizierung von Virus-RNA ... 148

5.4.3 Rückenmarksveränderungen ... 149

6 Diskussion ... 153

6.1.1 Ausbleibende Anfälle nach BeAn-1-Infektion ... 153

6.1.2 Einfluss von B6-Maus-Unterstämmen bei BeAn-1-Infektion ... 154

6.1.3 Untersuchung weiterer TMEV-(Unter)Stämme auf Anfallsentwicklung ... 156

6.1.4 Einfluss von Mausunterschieden bei BeAn-2- und DA-Infektion ... 159

6.1.5 Einfluss des Applikationsortes ... 160

6.1.6 Klinische Unterschiede zwischen Virusstämmen ... 161

6.2.1 Unterschiede hippocampaler Neurodegeneration post infectionem ... 162

6.2.2 Verhalten von Zellen des erworbenen Immunsystems ... 165

6.2.3 Verhalten von Zellen des angeborenen Immunsystem ... 167

6.2.3.1 Die Rolle des angeborenen Immunsystems im TMEV-Modell ... 167

6.2.3.2 Mikroglia und Makrophagen im TMEV-Modell ... 168

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nach TMEV-Infektion ... 168

6.2.3.3 Durchflusszytometrische Untersuchungen und Charakterisierung von Mikroglia und Makrophagen nach TMEV-Infektion in B6-Wildtyp-Mäusen .... 170

6.2.3.3.1 Charakterisierung über CX3CR1-/Ly6C-Expression ... 171

6.2.3.3.2 Charakterisierung über CD86/CD206 (M1/M2) ... 171

6.2.3.4 Durchflusszytometrische Untersuchungen von Mikroglia und Makrophagen nach TMEV-Infektion in Cx3cr1-Reporter-Mäusen ... 173

6.2.3.4.1 Charakterisierung über CX3CR1-/Ly6C-Expression ... 174

6.2.3.4.2 Charakterisierung über CD86/CD206 (M1/M2) ... 174

6.2.3.5 Die Rolle von Mikroglia und Makrophagen in anderen Modellen ... 174

6.3 Studie 3: transgene Veränderung der Entzündungszellen ... 177

6.3.1 Ccr2-KO-Mäuse ... 177

6.3.2 Cx3cr1-KO-Mäuse ... 181

7 Zusammenfassung ... 189

8 Summary ... 190

9 Literaturverzeichnis ... 191

10 Tabellenverzeichnis ... 209

11 Abbildungsverzeichnis ... 210

12 Anhang ... 212

13 Danksagungen ... 221

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1 Einleitung

Epilepsien gehören zu den bedeutendsten neurologischen Erkrankungen in der Hu- man- und Veterinärmedizin und sind durch das Auftreten wiederkehrender Anfälle gekennzeichnet. Weltweit sind mehr als 50 Millionen Menschen an Epilepsie erkrankt (World Health Organisation, 2016). Hirninsulte durch Infektionen, Tumore, Schlaganfälle oder Schädel-Hirntraumata führen in vielen Fällen bei betroffenen Pa- tienten zu der Entstehung symptomatischer Epilepsien (Löscher & Brandt, 2010).

Insbesondere virale Enzephalitiden stellen dabei eine der häufigsten Ursachen für die Entstehung von Epilepsien dar (Vezzani et al., 2016a).

Während der Pathogenese von Epilepsien ("Epileptogenese") im Anschluss an Hirn- insulte kommt es zu weitreichenden Veränderungen im Gehirn, wobei Entzündun- gen, Störungen der Blut-Hirn-Schranke, neuronale Veränderungen und Degenerati- on zu den bedeutendsten gehören (Löscher et al., 2013). Bis zum heutigen Tag gibt es keine Möglichkeit, die Epileptogenese und somit die Epilepsie zu verhindern. Da die Latenzzeit zwischen Hirninsult und der Anfallsentstehung oftmals mehrere Mona- te bis Jahre dauert, besteht großer Forschungsbedarf über die in dieser Phase ab- laufenden Veränderungen. Erst hierdurch ergibt sich die Möglichkeit der Entwicklung neuer prophylaktischer und therapeutischer Behandlungsansätze.

Die Veränderungen und Mechanismen, die der Epileptogenese im Anschluss an virale Infektionen des Gehirns zugrunde liegen, sind weitgehend unbekannt (Vezzani et al., 2016a). Untersuchungen in Tiermodellen sind durch eine hohe Mortalität nach Infektion mit neurotropen viralen Erregern bei Mäusen und Ratten bisher nur einge- schränkt möglich gewesen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein vor kurzem etablier- tes Tiermodell viral-induzierter Epilepsien, das TMEV-induzierte Epilepsie-Modell (Libbey & Fujinami, 2011) (TMEV = Theilers Murines Enzephalomyelitis Virus), verwendet, um die Folgen viraler Entzündungen auf die Anfalls- und Epilepsieentste- hung näher zu untersuchen und dadurch neue Ansätze für Therapien zu finden.

Zusammenhänge zwischen Epilepsien und Entzündung wurden im vergangenen Jahrzehnt intensiv erforscht (Vezzani et al., 2011, 2016b; Vezzani, 2014). Viele an

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auf, in vielen Tiermodellen konnte Ähnliches beobachtet werden. Bei diesen Unter- suchungen schienen vor allem Entzündungszellen des angeborenen Immunsystems, insbesondere Makrophagen und Mikroglia, vermehrt im epileptischen Gehirn anwe- send bzw. aktiviert zu sein (Ravizza et al., 2008a; Zattoni et al., 2011). Ebenfalls konnte durch eine pharmakologische Beeinflussung der Mikrogliaaktivierung oder Makrophageninfiltration im TMEV-Modell das Auftreten akuter Anfälle verringert werden (Cusick et al., 2013). Aus diesem Grund wurden insbesondere diese Zellty- pen und ihre Rolle bei der Anfalls- und Epilepsieentstehung von mir untersucht.

In der ersten Studie sollte das TMEV-Modell vor Ort in unserem Labor etabliert werden. Dabei wurde das anfallsauslösende Potenzial verschiedener Virus(unter)- Stämme untersucht, da bei einem seit vielen Jahren im Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover (TiHo) verwendeten TMEV-Stamm noch nie Anfälle beobachtet wurden. In der zweiten Studie wurde die mit Anfällen und TMEV- Infektion in Verbindung stehende Entzündungsantwort und Neuropathologie näher betrachtet. Hierfür wurden zunächst histologisch die Entzündungszelleinwanderung in das Gehirn und die neuronale Degeneration untersucht. Nachfolgend wurde dann die Rolle von Mikroglia und infiltrierten Makrophagen im TMEV-Modell mittels Durch- flusszytometrie analysiert. In der dritten Studie wurde an transgenen Mäusen ge- prüft, welchen Einfluss in das Gehirn einwandernde Makrophagen oder die Aktivie- rung von Mikroglia auf das Anfallsgeschehen und die Neuropathologie haben. In der letzten Studie wurden Unterschiede zwischen einem anfallsauslösenden TMEV- Stamm und einem Stamm, welcher keine Anfälle hervorruft, untersucht.

Ziel der Ph.D.-Arbeit war, genauere Kenntnisse über die Krankheitsprozesse im Rahmen der TMEV-Infektion und die damit assoziierten Anfälle zu erlangen, um dadurch gezielt neue Ansätze für eine Antiepileptogenese, also die Verhinderung der Epilepsieentstehung, nach viralen Enzephalitiden zu entwickeln.

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2 Stand der Forschung

2.1 Definition Epilepsie

Epilepsie ist eine chronische Erkrankung des Gehirns, welche mit einer anhaltenden Prädisposition für die Entwicklung von epileptischen Anfällen einhergeht (Fisher et al., 2014; World Health Organisation, 2016). Eine gemeinhin anerkannte Definition setzt das Auftreten von mindestens zwei nicht provozierten epileptischen Anfällen, welche mehr als 24 Stunden auseinander liegen, voraus (Fisher et al., 2014). Diese wiederholt auftretenden Anfälle können sich unterschiedlich darstellen. Beispielswei- se kann es sich um sensorische oder motorische Anfälle handeln, es können Teile des Körpers (partielle Anfälle) oder der gesamte Körper (generalisierte Anfälle) betroffen sein (Scheffer et al., 2013; World Health Organisation, 2016). Der Schwere- grad von Anfällen reicht von kurzen Aufmerksamkeitsverlusten über Muskelzuckun- gen oder sensorischen Missempfindungen bis hin zu langanhaltenden und lebens- bedrohlichen Anfällen (Scheffer et al., 2016). Auch die Anfallsfrequenz kann stark variieren, wobei einige Patienten mehrmals täglich, andere nur einmal pro Jahr einen Anfall erleiden (World Health Organisation, 2016). Epileptische Anfälle entstehen durch überschießende und synchrone Entladungen von Nervenzellgruppen, die ein Ungleichgewicht zwischen hemmender und erregender neuronaler Aktivität im Ge- hirn verursachen (Wu et al., 2015). Der sogenannte Anfallsursprung (Fokus) kann in unterschiedlichen Gehirnarealen lokalisiert sein (Fisher et al., 2014). Das klinische Bild der Anfälle ist dabei unter anderem von der anatomischen Lokalisation geprägt.

Die neuronalen Verbindungswege, die an der Anfallsentstehung beteiligt sind, kennzeichnen die Ausprägung von epileptischen Anfällen und werden gemeinhin als epileptisches Netzwerk bezeichnet (McCormick & Contreras, 2001).

Zwar sind Epilepsien durch das Auftreten von epileptischen Anfällen charakterisiert, dennoch ist es wichtig, Anfälle (auch als Krampfanfälle bezeichnet) und Epilepsien getrennt zu betrachten (Fisher et al., 2014; World Health Organisation, 2016). Circa 10 % aller Menschen erleiden einen singulären Krampfanfall im Laufe ihres Lebens,

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fe können beispielsweise durch Gehirnerschütterungen, Infektionen des Zentralen Nervensystems (ZNS), Vergiftungen, hohes Fieber oder auch durch Alkoholentzug hervorgerufen werden (Scheffer et al., 2016) und werden daher als provozierte, akute oder auch symptomatische Anfälle bezeichnet. Bei Epilepsien spricht man hingegen von unprovozierten oder spontanen Anfällen. Es muss klar gestellt werden, dass akute Anfälle und die damit einhergehenden Erkrankungen einen Risikofaktor für die Entstehung von Epilepsien darstellen (Löscher & Brandt, 2010; Pitkänen et al., 2016).

Weltweit gesehen gehören Epilepsien zu den häufigsten und bedeutendsten Erkran- kungen des ZNS (Löscher et al., 2013). Der Weltgesundheitsorganisation (2016) zu- folge sind derzeit mindestens 50 Millionen Menschen an Epilepsie erkrankt. Doch nicht nur Menschen erkranken an Epilepsie: Auch diverse Tierarten wie beispielsweise Hund (Flegel, 2014; Podell et al., 2016), Katze (Schriefl et al., 2008) und Pferd (Lacombe et al., 2012) sind von dieser Krankheit betroffen. Mit einer Prävalenz zwischen 0,5 und 5,7 % (Flegel, 2014) stellt die Epilepsie beim Hund die häufigste neu- rologische Erkrankung dar.

2.2 Ätiologie

Bei bis zu 30 % der Epilepsien ist die zugrundeliegende Ursache nicht bekannt (Lö- scher, 2016). Anhand der Ätiologie lassen sich Epilepsien dennoch in verschiedene Gruppen unterteilen. In den letzten Jahren hat sich diese Einteilung fortlaufend ge- ändert. Während die Ätiologien seit 2010 in die drei Gruppen strukturell/metabolisch, genetisch, unbekannt unterteilt waren (Fisher et al., 2014), wurde diese Einteilung zugunsten eines besseren Verständnisses und einer besseren klinischen Anwend- barkeit im Jahr 2016 (Scheffer et al., 2016) in sechs Gruppen erweitert: (1) genetisch, (2) strukturell, (3) metabolisch, (4) immun, (5) infektiös und (6) unbekannt. Die- se sechs Bereiche sollen das breite Spektrum an Epilepsie-auslösenden Faktoren abdecken. Wichtig ist dabei zu wissen, dass mehrere Bereiche für eine Epilepsie zu- treffen können (Fisher et al., 2014; Scheffer et al., 2016).

Ad (1): Genetischen Epilepsien liegt eine Veränderung im Erbgut zugrunde.

Dabei muss der genaue Ort der Veränderung nicht zwingend bekannt sein. Sowohl

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de novo Mutationen, die zu einer Epilepsie führen, als auch vererbte Erkrankungen, die zu einem familiär gehäuften Auftreten führen, gehören zu dieser Gruppe (Schef- fer et al., 2013).

Ad (2): Bei strukturell bedingten Epilepsien sind Veränderungen, die zu einer Epilepsie führen, in Bildgebungsverfahren wie der Magnet-Resonanz-Tomographie sichtbar. Dazu gehören beispielsweise neoplastische Veränderungen (Hirntumoren), Missbildungen, Traumata oder Hirninfarkte (Scheffer et al., 2013).

Ad (3): Metabolische Veränderungen als Entgleisungen des Stoffwechsels können, beispielsweise durch Anhäufung neurotoxischer Neurotransmitter, zu Epi- lepsien führen. Beispiele sind Aminoazidopathien oder Porphyrien (Scheffer et al., 2013).

Ad (4): Immun-assoziierte Prozesse, beispielsweise verschiedene Autoim- munerkrankungen, werden als Ursachen für Epilepsien vermutet. Hierzu gehören beispielsweise anti-NMDA-Rezeptor-Enzephalitiden (Scheffer et al., 2013).

Ad (5): Viele infektiöse Krankheitserreger wie Viren (Herpesviren, Westnilvi- ren, etc.), Parasiten (Taenia solium, Plasmodium falciparum) und Bakterien (My- kobakterien und viele Meningitiserreger), aber auch Pilze (Candida albicans, Cryp- tococcus) können Epilepsien hervorrufen (Scheffer et al., 2013; Vezzani et al., 2016a).

Der Schwerpunkt der vorliegenden Ph.D.-Arbeit wurde auf ein Modell der Virus- bedingten Epilepsie gelegt. Daher soll hier vor allem auf Epilepsien dieser Ätiologie im Detail eingegangen werden.

2.2.1 Virus-bedingte Epilepsien

Infektionen gehören weltweit zu den wichtigsten Risikofaktoren für die Entstehung von Anfällen und Epilepsien (Vezzani et al., 2016a). Viren, Parasiten, Bakterien und Pilze können im Zuge einer Infektion des Gehirns zu akuten Krampfanfällen, und im weiteren zeitlichen Verlauf zur Entstehung einer Epilepsie führen (Vezzani et al., 2016a). Akute Anfälle treten bei bis zu 30 % aller Infektionen des ZNS in den ersten ein bis zwei Wochen als Symptome einer Entzündung auf (Vezzani et al., 2016a).

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Umkehrschluss ist ein Ausbleiben von akuten Anfällen jedoch kein Hinweis darauf, dass sich keine Epilepsie entwickeln wird (Vezzani et al., 2016a). Die spontanen An- fälle, welche eine Epilepsie kennzeichnen, treten meist erst Wochen bis Monate nach einer überstandenen Infektion des ZNS auf (Vezzani et al., 2016a).

In 4-20 % der Fälle entwickeln Überlebende einer viralen Enzephalitis eine Epilepsie (Getts et al., 2008a). Dies macht virale Infektionen des ZNS zu einer der bedeutendsten Ursachen für Epilepsien (Getts et al., 2008a; Misra et al., 2008; Libbey &

Fujinami, 2011; Theodore, 2014). Durch das endemische Vorkommen von vielen viralen Enzephalitiserregern in tropischen Ländern, welche in den meisten Fällen wirt- schaftlich schwache Drittweltländer sind, kommt es vor allem dort zu einer deutlichen Häufung an infektionsbedingten Epilepsien (Vezzani et al., 2016a). Dies ist einer der Gründe, warum circa 80 % aller an Epilepsie leidenden Patienten in Entwicklungs- und Schwellenländern leben (World Health Organisation, 2016). Außerdem trägt eine schlechtere medizinische Versorgung dazu bei, dass prädisponierende Erkran- kungen wie beispielsweise Enzephalitiden häufiger auftreten und nicht oder nicht hinreichend behandelt werden (World Health Organisation, 2016).

Derzeit sind über 100 neurotrope Viren bekannt, die - wie der Name besagt - eine Affinität zum ZNS besitzen, und eine Enzephalitis hervorrufen können (Getts et al., 2008a; Misra et al., 2008; Libbey & Fujinami, 2011; Vezzani et al., 2016a). Eine ganze Reihe dieser Viren wird mit der Entstehung einer postinfektiösen Epilepsie in Ver- bindung gebracht. Vor allem Herpesviren (Herpes Simplex Virus Typ 1 [HSV-1], Humanes Herpes Virus Typ 6 [HHV-6]) und verschiedene Arboviren (arthropod- borne virus, durch Insekten übertragende Viren; z. B. Japan Enzephalitis Virus, Westnilvirus) sind bedeutende Epilepsie-auslösende Viren (Libbey & Fujinami, 2011;

Bonello et al., 2015; Vezzani et al., 2016a). Auch bei Tieren kann es in Folge einer viralen Enzephalitis zur Entstehung einer Epilepsie kommen. Bei Hunden kann dies beispielsweise im Zuge einer Staupe-Virus-Infektion beobachtet werden (D’Intino et al., 2006; Spitzbarth et al., 2012).

Viren gelangen für gewöhnlich über systemische Infektionen in das Gehirn. Eintritts- pforten können z. B. Haut, Magen-Darm-Trakt oder Respirationstrakt sein (Getts et al., 2008a; McGavern & Kang, 2011; Vezzani et al., 2016a). Nach einer primären Vermehrung des Virus an der Eintrittspforte, kommt es zur Ausbreitung der Erreger

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in die Blutbahn, einer Virämie (Murphy et al., 1999; McGavern & Kang, 2011). Ent- weder kommt es dadurch direkt zum Befall des ZNS, oder es kommt zunächst zur systemischen Infektion, bei der viele verschiedene Organe betroffen sind, und erst sekundär zur Infektion des Gehirns (Getts et al., 2008a; McGavern & Kang, 2011;

Koyuncu et al., 2013). Hierbei gibt es prinzipiell zwei verschiedene Eintrittsmecha- nismen: (1.) Im Blut befindliche Viruspartikel werden von Gehirn-Kapillar- Endothelzellen aufgenommen, infizieren diese und werden daraufhin in das ZNS- Parenchym freigesetzt (McGavern & Kang, 2011; Koyuncu et al., 2013) oder (2.) die Viren gelangen über infizierte Entzündungszellen (Makrophagen, Lymphozyten), welche aktiv in das Gewebe einwandern, in das ZNS (McGavern & Kang, 2011;

Vezzani et al., 2016a). Manche Viren (z. B. Tollwut- oder Herpesviren) sind auch in der Lage, sich über neuronale Strukturen zu bewegen und gelangen über periphere Nerven zentripetal bis in das Gehirn oder Rückenmark (Eeg-Olofsson, 2003;

Koyuncu et al., 2013). Es kann auch durch lokale Ereignisse zu einer Infektion des Gehirns kommen. Ein direktes Trauma im Schädelbereich, eine Entzündung von Augen, Ohren oder Riechschleimhaut stellen dabei mögliche Grundlagen für eine solche Infektion dar.

Je nach Tropismus des Virus kommt es zur Infektion verschiedener Gehirnzellpopu- lationen, wobei Nervenzellen des limbischen Systems und hierbei v. a. des Hippo- campus häufige Zielzellen darstellen (Getts et al., 2008a). Unmittelbar nach dem Eindringen der Viruspartikel kommt es durch die Aktivierung so genannter Pattern- Recognition-Rezeptoren (welche Pathogen-assoziierte molekulare Muster wie z. B.

Virusbestandteile erkennen) zur Auslösung lokaler Abwehrmechanismen und dann bereits wenige Stunden post infectionem (pi) zur Aktivierung der ortsständigen im- munkompetenten Zellen (Mikroglia und Astrozyten) (Ousman & Kubes, 2012; Russo

& McGavern, 2015; Vezzani et al., 2016a). Mikroglia bekämpfen mit verschiedenen Mitteln eingedrungene Noxen: Die Produktion und Ausschüttung reaktiver Sauer- stoffspezies und Stickstoffoxid ermöglichen eine direkte Zerstörung schädlicher Zel- len und Partikel; die Phagozytose und nachfolgende intrazelluläre Verdauung von entsprechenden Zellen oder Partikeln sind ebenfalls effektive Abwehrmechanismen

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1beta [IL-1β], Interleukin-6 [IL-6]) und weiterer Signalmoleküle kommt es zu einer Forcierung der Immunantwort (Prinz & Priller, 2014). Periphere Immunzellen werden angelockt und Veränderungen der Blut-Hirn-Schranken-Permeabilität und veränderte Expression von Oberflächenproteinen auf den Kapillar-Endothelzellen ermöglichen das Einwandern verschiedener Leukozyten in das infizierte Gewebe (Ravizza et al., 2008a; Fabene et al., 2013).

Im Rahmen einer effektiven Entzündungsantwort auf die akute virale Infektion kommt es jedoch auch zu unerwünschten Reaktionen. Kollateralschäden entstehen z. B. durch freigesetzte Sauerstoffverbindungen aus Immunzellen, welche nicht nur Viren und infizierte Zellen, sondern auch gesunde Zellen des Nervensystems schä- digen. Auch die eigentliche Infektion schädigt das Gehirnparenchym: Besiedelte Nervenzellen werden entweder durch die Viren selbst (lytischer Zyklus der viralen Vermehrung) oder durch Immunzellen der angeborenen und adaptiven Immunant- wort zerstört (Dietzschold et al., 2001; Gadani et al., 2015). Dieser Nervenzellunter- gang und durch die Noxe angestoßene Neubildung entsprechender Zellen wird als wichtiger Faktor für das Auslösen einer Epileptogenese diskutiert (Parent & Murphy, 2008; Jessberger & Parent, 2015; Eyo et al., 2017). Zwar hat die adulte Neurogene- se im Anschluss an Verletzungen des Gehirns oftmals positive Effekte, dennoch scheint die Neuorganisation neuronaler Schaltkreise eine wichtige Rolle bei der Ent- stehung eines „epileptischen Netzwerks“ im Gehirn zu spielen (Parent & Murphy, 2008; Jessberger & Parent, 2015). Neben dem Zelluntergang spielen proinflammatorische Mediatoren und Entzündungszellen eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Anfällen und bei der Entwicklung von Epilepsien (siehe nachfolgendes Kapitel).

Zwar ist das Immunsystem für die Bekämpfung von Infektionen und das Überleben des Individuums unerlässlich, dennoch kann die Entzündungsantwort auch negative Auswirkungen auf den Organismus haben. Bei der Etablierung neuartiger Therapie- ansätze, welche in die Immunantwort eingreifen, um die Entstehung einer Epilepsie im Anschluss an eine Infektion zu verhindern, wandert man auf einem schmalen Grat: Einerseits soll nicht die erwünschte Bekämpfung von Infektionserregern behin- dert werden, andererseits gilt es eine überschießende oder falsch gerichtete Ent- zündungsreaktion abzuschwächen, um die Epileptogenese zu verhindern.

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2.3 Epileptogenese

Das Wort Epileptogenese (von altgriech. epilēpsis = Angriff, Überfall und genesis = Entstehung) beschreibt den Entstehungsprozess von Epilepsien (Löscher & Brandt, 2010). Dabei entwickelt sich ein ursprünglich gesundes Gehirn durch einen Insult (z. B. Trauma, Schlaganfall, Infektion) zu einem epileptischen Gehirn (Löscher &

Brandt, 2010; Ravizza et al., 2011). Es kommt hierbei zu verschiedenen Verände- rungen und Umwandlungsprozessen im Gehirn, wie beispielsweise Neurodegenera- tion, Neurogenese, Entzündung, Blut-Hirn-Schranken-Veränderungen, Gliose, neuronaler Übererregbarkeit und Veränderungen von Rezeptor- und Ionenkanalexpri- mierung (Löscher & Brandt, 2010; Vezzani et al., 2016a). Das Risiko, durch einen Insult eine Epileptogenese auszulösen, ist unterschiedlich ausgeprägt und unterliegt vielen verschiedenen Faktoren, wobei unter anderem der Schweregrad der Verlet- zung, das Alter des Patienten und genetische Prädispositionen zu berücksichtigen sind (Vezzani et al., 2016a).

Die Phase der Epileptogenese, auch als Latenzzeit bezeichnet, in der noch keine spontanen epileptischen Anfälle auftreten, beginnt mit dem zugrunde liegenden „epileptogenen Insult“ und endet mit dem ersten Auftreten von spontanen, nicht provozierten Anfällen. Diese Entwicklungszeit kann, abhängig von individuellen und insult- spezifischen Faktoren, zwischen Wochen, Monaten und Jahren dauern (White & Lö- scher, 2014).

2.4 Behandlung, Pharmakoresistenz und Prävention von Epilepsie Den Goldstandard für eine Epilepsiebehandlung stellt nach wie vor die Pharmako- therapie mit Antiepileptika dar, die auch als anti-seizure drugs (ASDs) bekannt sind (Löscher et al., 2013). Dabei gibt es derzeit mehr als 20 verfügbare Pharmaka für verschiedene Indikationen im Bereich der Epilepsiebehandlung. Hierzu gehören beispielsweise Substanzen wie Phenobarbital und Kaliumbromid, welche seit mehr als 100 Jahren bei Epilepsien angewendet werden (Löscher et al., 2013). Des Weiteren gibt es eine ganze Reihe sogenannter neuer Antiepileptika (z. B. Levetiracetam oder Topiramat), welche in den letzten Jahrzehnten für die Behandlung von Epilepsien

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Epilepsiepatienten durch eine Pharmakotherapie keine Anfallsfreiheit erreicht (Kwan et al., 2010; Varvel et al., 2015). Diese sog. Pharmakoresistenz oder auch refraktäre Epilepsie stellt Patienten, Epileptologen und das Gesundheitssystem vor schwerwie- gende Probleme und verdeutlicht die Notwendigkeit, weitere Therapiemöglichkeiten zu entwickeln.

Neben der Behandlung von epileptischen Anfällen, also der symptomatischen The- rapie der Epilepsie, gibt es keine kurativen medikamentösen Behandlungsmöglich- keiten (Löscher, 2002a, 2016). Zwar kommt es bei einigen Patienten unter einer me- dikamentösen Behandlung nach einiger Zeit zu einer Reduktion der Anfallsfrequenz oder gar zu einem Ausbleiben der Anfälle (Scheffer et al., 2016), doch sind bis zum heutigen Tage keine medikamentösen Therapien für eine Heilung von Epilepsien verfügbar.

Eine Alternativmethode zur Epilepsiebehandlung ist die chirurgische Entfernung von Gehirnarealen, die an der Anfallsentstehung oder -weiterleitung beteiligt sind (Schmidt & Löscher, 2003; Schmidt et al., 2004). Solche neurochirurgischen Eingriffe werden jedoch nur in sehr schweren Fällen der Pharmakoresistenz durchgeführt, da die Risiken und Nebenwirkungen einer solchen Operation sehr hoch sind (West et al., 2016).

Eine weitere Strategie ist das Eingreifen in die Epileptogenese, bevor spontane An- fälle auftreten (Löscher, 2016). Diese Strategie, die so genannte Antiepileptogenese, wird seit vielen Jahren intensiv an Tiermodellen und in klinischen Studien erforscht (Löscher & Brandt, 2010; White & Löscher, 2014; Löscher, 2016; Temkin et al., 2001; Trinka & Bingo, 2014). Patienten, welche durch stattgefundene Verletzungen oder Erkrankungen der Gefahr unterliegen, eine Epilepsie zu entwickeln, könnten präventiv behandelt werden, um die Epileptogenese, also die Umwandlung des ge- sunden Gehirns in ein epileptisches Gehirn, zu verhindern beziehungsweise zu un- terbrechen.

Ein weiterer, bedeutender Forschungsansatz ist die Suche nach Biomarkern für eine beginnende Epileptogenese. Laut der Weltgesundheitsorganisation sind Biomarker

„jegliche Substanzen, Strukturen oder Prozesse, welche im Körper oder dessen Ausscheidungen gemessen werden können und Aufschlüsse über den Verlauf bzw.

den Ausgang einer Erkrankung erlauben“ (2001). Ein Nachweis dieser Substanzen

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oder Veränderungen, welche krankhafte Schädigungen eines Organismus aufzeigen können, brächte die Möglichkeit, frühzeitig Risikopatienten zu identifizieren, die im Anschluss an einen Hirninsult die Entwicklung hin zu einer Epilepsie durchlaufen (Pitkänen & Engel, 2014; Pitkänen et al., 2016). Bei diesen Patienten könnte dann gezielt eine antiepileptogene Therapie durchgeführt werden.

Präventionsmaßnahmen stellen einen weiteren wichtigen Faktor für die Verhinde- rung von Epilepsien dar. Hierbei sind vor allem Vorsichtsmaßnahmen bezüglich Traumata und Infektionen wichtige Ansätze. So spielen sowohl ein adäquater Ein- satz von Präventivmaßnahmen gegen parasitäre Infestationen (Malariaprophylaxe, Vorsichtsmaßnahmen gegen Spulwurminfestationen) als auch die Vorbeugung viraler Infektionen (besonders gegen von Insekten übertragene Arboviren) eine besondere Rolle. Vor allem in Risikogebieten, in denen Krankheitserreger endemisch vorkommen, könnte auf diese Weise die Rate von Epilepsien, die in der Folge einer In- fektion entstehen, drastisch gesenkt werden (Vezzani et al., 2016a; World Health Organisation, 2016).

2.5 Entzündung und Epilepsien

Im vergangenen Jahrzehnt wurde vermehrt deutlich, dass Epilepsien bzw. Krampf- anfälle eng mit Entzündungen des Gehirns in Verbindung stehen (Vezzani et al., 2011, 2016b; Vezzani, 2014). Der Versuch, eine Kausalität zu finden – ob also Anfäl- le zu einer Entzündungsreaktion im Gehirn oder ob Entzündungsreaktionen zur Ent- stehung von Anfällen und Epilepsien führen – hat zu vielen neuen Erkenntnissen ge- führt (Vezzani et al., 2011, 2016b; Vezzani, 2014). Mittlerweile ist man sich einig, dass es keinen eindeutigen Kausalzusammenhang gibt. Entzündungen führen in vielen Fällen zur Begünstigung von epileptischen Anfällen und zur Auslösung von Epi- lepsien (Vezzani et al., 2011); ebenso kommt es durch Anfälle zum Auftreten von Entzündungsreaktionen im Gehirn (Vezzani et al., 2011). Tierexperimentelle Ver- suchsergebnisse und Ergebnisse aus humanen Studien konnten die Hypothese einer Entzündungsbeteiligung bei akuten Anfällen, der Epileptogenese und bei Epilep- sien bestätigen.

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Gehirnmaterial von an Epilepsie leidenden Patienten stellt eine wichtige Quelle für neue Erkenntnisse dar (Crespel et al., 2002; Aronica et al., 2007; Ravizza et al., 2008a). Wie bereits oben beschrieben, werden in schweren Fällen einer pharmako- resistenten Epilepsie aus therapeutischen Gründen neurochirurgische Eingriffe vor- genommen, um Gehirnareale zu entfernen, welche an der Anfallsentstehung und Weiterleitung beteiligt sind. Analysen von solchen Gehirnbereichen haben ergeben, dass in chronisch-epileptischen Gehirnregionen aktive Entzündungsreaktionen statt- finden. So finden sich aktivierte Mikroglia, Astrozyten, und in manchen Fällen auch eingewanderte Leukozyten, v. a. Makrophagen, neutrophile Granulozyten oder auch T-Lymphozyten im Gehirnparenchym solcher Patienten (Vezzani et al., 2011, 2016b). Interessant ist, dass die Anwesenheit von Entzündungszellen und entsprechenden Mediatoren unabhängig von der zugrundeliegenden Epilepsieätiologie ist, und daher Entzündungsprozesse nicht nur bei Epilepsien mit eindeutiger Immunsys- tembeteiligung, wie z. B. infektions- oder autoimmunassoziierten Epilepsien, beobachtet werden.

Anhaltspunkte aus der Klinik ermöglichen weitere Rückschlüsse über die Verbindun- gen zwischen Entzündungen, Anfällen und Epilepsien. So gibt es besondere Epilep- sieformen (v. a. pädiatrische), die zwar nicht auf gängige Antiepileptika, jedoch auf anti-entzündliche Behandlungen (z. B. Kortikosteroide, selektive COX-2 Hemmer, Immunglobuline) ansprechen (Riikonen, 2004; Wirrell et al., 2005; Wheless et al., 2007). Eine ganze Reihe von Autoimmunkrankheiten geht mit dem Auftreten von Krampfanfällen einher. Beispiele hierfür sind Multiple Sklerose, systemischer Lupus erythematodes, Vaskulitiden oder paraneoplastische Syndrome (Najjar et al., 2008).

Patienten mit Rasmussen-Enzephalitis, einer chronischen Entzündung des Gehirns, welche mit einer starken Entzündungszellinfiltration und -aktivierung und einer er- höhten Expression von Entzündungsmediatoren einhergeht, zeigen neben anderen Symptomen auch eine schwerwiegend ausgeprägte Epilepsie (Varadkar et al., 2014;

Varadkar & Cross, 2015). Bei einer weiteren Autoimmunerkrankung, der anti- NMDA -Rezeptor-Enzephalitis, kommt es ebenfalls zur Entwicklung von Krampfan- fällen (Rosenfeld & Dalmau, 2011; Peery et al., 2012).

Proinflammatorische Zytokine (z. B. Interleukin-1β [IL-1β], Intereukin-6 [IL-6] und Tumor-Nekrose-Faktor-α [TNF-α]), Moleküle der Komplementkaskade und weitere

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entzündungsassoziierte Stoffe (z. B. High-Mobility-Group-Protein B1 [HMGB1], Toll- like Rezeptor 4) sind im Gehirngewebe von Epilepsiepatienten im Vergleich zu Ge- sunden erhöht exprimiert (Vezzani et al., 2011, 2016b), und Pathway-Analysen haben diese Präsenz eines proinflammatorischen Milieus bestätigt (Vezzani et al., 2011, 2016b).

Zytokine spielen beispielsweise bei Fieberkrämpfen, der häufigsten Ursache für Krampfanfälle im Kindesalter, eine Schlüsselrolle. Durch die bei Fieber im Gehirn vermehrt auftretenden Entzündungsmediatoren (im Vordergrund steht hierbei IL-1β) wird die physiologische Krampfschwelle herabgesetzt, was zum Auftreten der Fie- berkrämpfe führen kann (Dinarello, 2004; Dubé et al., 2007). Tierexperimentell konnte nachgewiesen werden, dass IL-1β eine Schlüsselrolle bei der Entstehung dieser Fieberkrämpfe einnimmt (Dubé et al., 2007). Eine pharmakologische Hemmung dieses Interleukins mit seinem physiologischen Antagonisten IL-1RA (Interleukin-1- Rezeptorantagonist) führt zum Ausbleiben Fieber-induzierter Anfälle in Tiermodellen (Heida et al., 2009). Auch transgene Mäuse, welchen der entsprechende Entzün- dungsmediator fehlt, zeigen eine Verminderung bzw. ein Ausbleiben entsprechender Fieberkrämpfe (Dubé et al., 2005). Umgekehrt führt eine vermehrte Zuführung dieser Entzündungsmediatoren (als lokal zugeführte Substanz oder durch genetische Ver- änderung) zu einer erhöhten Anfallsneigung (Bartfai et al., 2007; Heida et al., 2009).

Ebenso können systemische Entzündungen prokonvulsive Einflüsse haben. In expe- rimentellen Arbeiten wird eine derartige Entzündung dabei vornehmlich durch Appli- kation von Zellwandbestandteilen gramnegativer Bakterien (Lipopolysaccharide [LPS]) nachgeahmt und führt zu akut und chronisch herabgesetzten Krampfschwel- len (Galic et al., 2008; Riazi et al., 2008; Auvin et al., 2009), die auf eine andauernd erhöhte ZNS-Erregbarkeit hinweisen.

Auch in verschiedenen Epilepsie-Modellen konnten Entzündungsreaktionen beobachtet werden. Bei Mäusen und Ratten, bei welchen durch elektrische Ströme oder prokonvulsive Substanzen Krampfanfälle ausgelöst wurden, kann schon wenige Stunden post iktus eine erhöhte Expression von proinflammatorischen Substanzen und eine Entzündungszellaktivierung beobachtet werden (Vezzani et al., 1999, 2002;

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ke und zur Einwanderung von Leukozyten aus dem Blut (Vezzani et al., 2011; Fabe- ne et al., 2013). Vordergründig kommt es dabei vor allem zu einer Invasion von Zel- len der angeborenen Immunantwort (Makrophagen, neutrophile Granulozyten) (Ravizza et al., 2008a; Zattoni et al., 2011; Fabene et al., 2013). Zellen der erworbenen Immunität, wie B- und T-Lymphozyten, scheinen eine untergeordnete Rolle zu spielen (Ravizza et al., 2008a).

Im weiteren Verlauf der Pathogenese von experimentell ausgelösten Epilepsien bleibt eine Entzündungsreaktion bestehen und kann sowohl im Laufe der Epilepto- genesephase (Gorter et al., 2006; Ravizza et al., 2008a; Dubé et al., 2010) als auch bei chronisch-epileptischen Labornagern in Form einer Entzündungszellpräsenz und erhöhter Expression proinflammatorischer Botenstoffe nachgewiesen werden (Ravi- zza et al., 2008a; Filibian et al., 2012). Auch bei genetischen Epilepsie-Modellen, bei denen kein externer epileptogener Insult zugefügt wird, kann eine Entzündungsant- wort beobachtet werden (Akin et al., 2011; Tegelberg et al., 2012).

Durch eine pharmakologische oder genetische Beeinflussung von Entzündungspro- zessen konnten weitere Einsichten gewonnen werden: So führt die intrazerebrale Erhöhung von proinflammatorischen Molekülen, z. B. IL-1β, IL-6 und TNF-α, durch lokale Applikation oder genetische Veränderung von Labornagern zu einer Herab- setzung der Anfallsschwelle, teilweise kommt es sogar zur Entstehung von spontanen Anfällen (Campbell et al., 1993; Vezzani et al., 1999, 2000; Samland et al., 2003; Dubé et al., 2005; Weinberg et al., 2013). Eine Hemmung entsprechender Mo- leküle führt zu einer erhöhten Krampfschwelle und zu einer verringerten Anfallsaus- prägung in verschiedenen Anfalls- und Epilepsie-Modellen (Vezzani et al., 2000, 2002; Dubé et al., 2005; Ravizza et al., 2008b; Li et al., 2013). Ebenfalls konnte ge- zeigt werden, dass eine antiinflammatorische Behandlung in Modellen der Status epilepticus (SE) -induzierten Epilepsie eine krankheitsmodifizierende Wirkung hat (Takemiya et al., 2003, 2006; Polascheck et al., 2010; Kwon et al., 2013). Zwar konnte die Entstehung der Epilepsie nicht verhindert werden, jedoch konnte die An- fallsfrequenz und -schwere herabgesetzt und die pathohistologischen Veränderun- gen im Gehirn verringert werden.

Auch in Labornagern scheinen Zellen der angeborenen Immunität, insbesondere residente Mikrogliazellen und eingewanderte Monozyten/Makrophagen, eine wichtige

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Rolle zu spielen: Diese Zellen werden vermehrt bei sehr vielen Anfalls- und Epilep- sie-Modellen im Gehirn der Versuchstiere gefunden (Fabene et al., 2008; Zattoni et al, 2011; Abraham et al., 2012; Cusick et al., 2013; Cerri et al., 2016; Varvel et al., 2016). Die experimentelle Beeinflussung der Mikroglia-Aktivierung oder der Einwan- derung von Leukozyten aus der Peripherie in das Gehirnparenchym zeigte lindernde Effekte auf die Entwicklung von akuten Anfällen und die mit Epilepsien in Verbindung stehenden neuropathologischen Veränderungen (Zattoni et al., 2011; Cusick et al., 2013; Varvel et al., 2016). Daher wurde in der vorliegenden Arbeit ein Schwerpunkt auf die Analyse der Entzündungszellinfiltration bzw. -aktivierung in einem Modell der Virus-induzierten Epilepsie gelegt. Insbesondere die Einwanderung von Monozyten bzw. Makrophagen in das Gehirn und die Aktivierung von residenten Mikrogliazellen wurde intensiv untersucht.

Es gibt verschiedene Mechanismen, durch die Entzündungen die Entstehung von Anfällen begünstigen bzw. verursachen können. Ein direkter Einfluss von aus Ent- zündungs-, Glia- und Nervenzellen freigesetzten proinflammatorischen Mediatoren auf Nervenzellen verursacht eine Erhöhung der neuronalen Erregbarkeit über eine Veränderung der Neurotransmitter-Rezeptoren. So führt beispielsweise IL-1β zu einer Phosphorylierung von NMDA-Glutamat-Rezeptoren (Viviani et al., 2007). Durch verschiedene Signalmoleküle kommt es zu einer veränderten Expression von Neu- rorezeptoren, zu Veränderungen des Rezeptor-Traffickings und der Rezeptor- Untereinheitszusammensetzung (Viviani et al., 2003; Stellwagen et al., 2005; Ba- losso et al., 2008). Außerdem kommt es zu einer erhöhten Ausschüttung des erre- genden Neurotransmitters Glutamat aus Astrozyten (Bezzi et al., 2001) und zu einer Hemmung der Glutamataufnahme aus dem Extrazellularraum (Hu et al., 2000).

Durch eine zytokinvermittelte Veränderung der Bluthirnschranken-Durchlässigkeit kommt es zu einem Anstieg von Serumalbumin und Kalium im Gehirn, welche über eine Veränderung der Ionen-Pufferbedingungen im Gehirn die Aufnahme von Glu- tamat behindern (David et al., 2009) und dadurch ebenfalls zu einer Veränderung der neuronalen Reizbarkeit führen.

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2.5.1 Mikroglia und Monozyten/Makrophagen

Mikroglia sind ein Teil der Gliazellen des Gehirns und für dessen Homöostase es- sentiell: Sie überwachen das Gehirnparenchym auf Verletzungen und Infektionen, sie kontrollieren die Funktionalität der Synapsen und sorgen für eine ungestörte Funktion der neuronalen Aktivität (Waisman et al., 2015). Kommt es zu Verletzungen oder Infektionen des ZNS, sind Mikroglia die erste Verteidigungslinie, wobei sie für das Einsetzen der Entzündungsantwort verantwortlich sind (Waisman et al., 2015).

Durch Botenstoffe werden weitere Immunzellen an den Ort der Entzündung gelockt, wobei unter anderem Makrophagen zu den ersten Zellen gehören, die aus dem Blut in das Gewebe einwandern (Prinz & Priller, 2014). Monozyten sind die im Blut zirkulierenden Makrophagen-Vorläuferzellen und werden nach der Migration aus dem Blut in Gewebe zu Makrophagen.

Für viele Jahre wurde der Ursprung von Mikroglia und den phagozytischen Zellen des angeborenen Immunsystems als identisch angesehen (Prinz & Priller, 2014;

Ginhoux et al., 2015). So wurde vermutet, dass Mikroglia, ähnlich wie Kupffer’sche Sternzellen in der Leber, Alveolarmakrophagen in der Lunge oder ortsständige Mak- rophagen in der Milz, während der embryonalen Phase als Vorläuferzellen aus der fetalen Leber, und später als Monozyten aus dem Knochenmark, in das Gehirn einwandern und dort als ortsständige Immunzellen das Gehirnparenchym vor Schäden und Infektionen schützen (Prinz & Priller, 2014; Ginhoux et al., 2015). Dieses Bild wurde in den vergangenen Jahren auf Grund von Fortschritten bei immunologischen Techniken, der Verfügbarkeit moderner transgener Labortiere und der Verbesserung von Bildgebungsverfahren weitestgehend verworfen und konkretisiert.

Mikroglia-Vorläuferzellen besiedeln das Gehirn zu einer embryologisch sehr frühen Phase (E9) zu der sich die Blut-Hirn-Schranke noch nicht formiert bzw. geschlossen hat (Kierdorf et al., 2013; Obermeier et al., 2013). Diese Vorläuferzellen entwickeln sich im Laufe der Embryo- und Fetogenese zu adulten Mikrogliazellen (Prinz & Pril- ler, 2014). Einige dieser Vorläuferzellen bleiben im Gewebe bestehen und sorgen für das ständige Vorhandensein dieser Zellen im ZNS (Prinz & Priller, 2014). Die Vor- läuferzellen stammen aus dem Dottersack, einer embryologischen Struktur die zwischen Tag E7 und E9 für die erste Produktion von Blut- und Immunzellvorläufern

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verantwortlich ist (Ginhoux et al., 2010). Dahingegen stammen Monozyten (im Blut zirkulierendend), Makrophagen (im Gewebe vorkommend) sowie deren Vorläuferzel- len (im Knochenmark) aus einer anderen Zellpopulation, welche initial aus der embryonalen Leber stammt (Ginhoux et al., 2015).

Der Grund dafür, dass Mikroglia und Monozyten/Makrophagen für viele Jahrzehnte als Zellen gleichen Ursprungs angesehen wurden, besteht darin, dass sich diese Zellen in sehr vielen Bereichen ähneln oder sogar gleichen. Beide Zelltypen sind, je nach Aktivierungszustand und dem umgebenden Gewebe, in der Lage, ihre Morpho- logie und Proteinexpression zu verändern, wodurch sich ihre Unterscheidung enorm erschwert. So weisen Mikroglia und ins Gehirn infiltrierende Makrophagen eine sehr ähnliche Morphologie auf (Perry & Teeling, 2013). Auch die Oberflächenantigene, die normalerweise für eine immunhistochemische Unterscheidung verschiedener Zelltypen verwendet werden können, gleichen sich bei diesen Zellen so sehr, dass man sie nicht ohne Weiteres zur Differenzierung heranziehen kann (Perry & Teeling, 2013; Bennett et al., 2016). Antigene, die für die Identifizierung dieser Phagozyten verwendet werden, sind beispielsweise Iba-1 („ionized calcium-binding adaptor molecule 1“) und CD11b, welche sowohl auf Mikroglia als auch auf Monozy- ten/Makrophagen vorhanden sind, oder Mac3, ein Antigen, welches auf Makropha- gen und aktivierten Mikroglia exprimiert wird. Antikörper gegen solche Strukturen können entsprechend nicht für die Unterscheidung der beiden unterschiedlichen Zellpopulationen verwendet werden und erschweren so die Erforschung über deren Einfluss auf die Krankheitsentstehung und -entwicklung. Neuen Untersuchungen zu Folge, die beispielsweise auf RNA-Expressionsanalysen unterschiedlicher Zellisolate aus unterschiedlichen Organtypen beruhen, gibt es einzelne Antigene, die spezifisch nur auf Mikroglia zu finden sind (Goldmann et al., 2013; Butovsky et al., 2014; Ben- nett et al., 2016). Diese Untersuchungen sind jedoch noch relativ neu und wurden bisher noch nicht reproduziert bzw. standardisiert.

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2.5.2 Differenzierung zwischen Mikroglia und Makrophagen sowie deren Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie

Eine etablierte Methodik, Mikroglia und Makrophagen voneinander zu unterscheiden, ist die Durchflusszytometrie mit CD45- und CD11b-Antikörpern (Becher & Antel, 1996; Stevens et al., 2002; Hickman et al., 2013). Diese Methode wurde in der vorliegenden Arbeit angewendet. Makrophagen und Mikroglia exprimierten das auf allen Leukozyten vorhandene Zelloberflächenprotein CD45 (common leucocyte antigen), jedoch exprimierten Mikroglia es nur in geringen Mengen, Makrophagen hingegen in hohen Mengen. Auf diese Weise lässt sich eine CD45^high- (hohe Expression) von einer CD45^low- (niedrige Expression) Zellpopulation differenzieren. Mit Hilfe des Mikroglia- und Makrophagen-spezifischen Antigens CD11b, können weitere Leuko- zyten ausgeschlossen werden, da diese negativ für CD11b sind, wie z. B. Lympho- zyten und neutrophile Granulozyten (siehe ).

Abb. 1: Beispiel für die Differenzierung zwischen Mikroglia und Makrophagen mittels Durch- flusszytometrie. Für die durchflusszytometrische Unterscheidung zwischen Mikroglia und Makro- phagen macht man sich die Expression von CD11b und CD45 zu Nutze. Sowohl Mikroglia als auch Makrophagen exprimieren das Oberflächenmolekül CD11b („CD11b⁺“). Sie unterscheiden sich jedoch in der Expression von CD45. Mikroglia exprimieren nur geringe Mengen dieses Antigens („CD45^low“), Makrophagen jedoch hohe Menge („CD45^high“). Andere Immunzellen (wie Lymphozyten oder natürli- che Killerzellen) exprimieren ebenfalls hohe Mengen CD45, jedoch exprimieren sie CD11b nicht („CD45^highCD11b^-“).

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Bei der Durchflusszytometrie können neben den oben aufgeführten Antigenen (CD45 und CD11b) mit weiteren Antikörpern auch weitere Antigene und deren Ex- pression bestimmt werden. Dies ist wichtig für eine nähere Charakterisierung von Zelluntergruppen und deren Phänotypen.

Mikroglia exprimieren charakteristischerweise sowohl in ruhendem als auch aktiviertem Zustand das Oberflächenprotein CX3CR1, den Rezeptor für CX3CL1 (Fraktal- kin). Da dieses Protein sehr verlässlich und in hoher Menge in diesen Zellen gebildet wird, wird es oftmals als spezifischer Marker in durchflusszytometrischen Untersu- chungen verwendet. Außerdem wird der Promotor für dieses Gen oftmals angewendet um Mikroglia gezielt zu markieren oder zu verändern. CX3CR1 ist zwar relativ spezifisch, um im Gehirn Mikroglia anzuzeigen, jedoch wird dieses nicht nur auf Mikroglia exprimiert: Auch einige Monozyten-Populationen exprimieren diesen Re- zeptor in hohen Mengen (so genannte Ly6C^-CCR2^-CX3CR1⁺-Monozyten). Monozy- ten, die im Blut zirkulierenden Vorstufen von Makrophagen, werden üblicherweise in zwei Populationen unterteilt: inflammatorische und residente Monozyten. Während residente Monozyten große Mengen CX3CR1 auf ihrer Oberfläche exprimieren, weisen sie keine oder nur geringe Mengen proinflammatorischer Marker auf. Diese werden hingegen auf inflammatorischen Monozyten exprimiert: Ly6C und CCR2 (C-C- Chemokin-Rezeptor 2) sind die bekanntesten und gebräuchlichsten Marker für diese Zelltypen. Im Gegenzug zeigen diese Zellen nur geringe Mengen CX3CR1 auf ihrer Oberfläche (sogenannte Ly6C⁺CCR2⁺CX3CR1^--Monozyten).

Die beiden Monozyten-Typen haben unterschiedliche Funktionen und zeigen unterschiedliche Verhaltensweisen: Während residente Monozyten im Blut zirkulieren und letztendlich die Gefäße verlassen, um gewebsständige Phagozyten zu unterstützen bzw. zu erneuern, haben inflammatorische Monozyten die Aufgabe, schnell zu Orten der Entzündung zu gelangen und dort Schäden zu beheben und eingedrungene Or- ganismen zu bekämpfen. Dabei dienen Oberflächenantigene wie z. B. CCR2 als Re- zeptoren für chemotaktische Signale. Zellen wandern diesen Signalen entgegen, um Orte der Schädigung oder Infektion zu erreichen und um aus dem Blut in Gewebe einzuwandern.

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Oberflächenantigenzusammensetzung: CX3CR1 wird nur noch basal exprimiert und Ly6C sowie CCR2 werden in hohen Konzentration gebildet. Entsprechend zeigen aus dem Gehirn von infizierten Tieren isolierte Zellen unterschiedliche Phänotypen:

Während Mikroglia, in ruhendem und aktiviertem Zustand zu hohen Anteilen CX3CR1 exprimieren (CX3CR1⁺Ly6C^-), können diese Zellen durch Aktivierung Anti- gene wie beispielsweise Ly6C exprimieren („inflammatorische Mikroglia“, CX3CR1⁺Ly6C⁺). Einwandernde Zellen weisen für gewöhnlich nur geringe Mengen CX3CR1 auf, wohingegen sie hohe Mengen an Ly6C und CCR2 bilden (CX3CR1^- Ly6C⁺).

Monozyten und Makrophagen werden seit vielen Jahren anhand der Expression verschiedener Oberflächenantigene oder Genprodukte und ihres biologischen Verhal- tens in unterschiedliche Phänotypen eingeteilt (Gordon & Taylor, 2005). Diese Ein- teilung ist seit vielen Jahren umstritten, da sie ursprünglich auf in vitro-Versuchen und der artifiziellen Reizung und Differenzierung von Monozyten/Makrophagen beruhen. Dennoch handelt es sich um eine etablierte Methode, diese Zelltypen zu be- schreiben, und um Rückschlüsse auf die Funktionen und Aufgaben dieser Zellen zu ziehen. Die gröbste Unterteilung ist die in M1- oder M2-Makrophagen (Gordon &

Taylor, 2005). M1-Makrophagen werden als klassisch aktivierte Zellen bezeichnet.

Sie zeigen einen proinflammatorischen Phänotyp, was sich in der Bildung von proinflammatorischen Zytokinen und einer hohen Mikroben-abtötenden Aktivität ausdrückt (Gordon & Taylor, 2005). Diese Zellen lenken die Immunreaktion in Richtung einer zellulären Immunität. M2-Makrophagen werden auch als alternativ aktivierte Zellen bezeichnet. Ihre Funktion trägt zur Gewebsreparatur und Abschwächung von Ent- zündungsreaktionen bei. Die Immunreaktion wird durch diese Zellen eher in Rich- tung einer humoralen Immunität gelenkt (Gordon & Taylor, 2005).

Mikroglia haben viele Ähnlichkeiten mit Makrophagen, jedoch gibt es auch sehr viele Unterschiede, die von ihrem Ursprung bis hin zu den physiologischen Aufgaben rei- chen (Prinz & Priller, 2014). Dennoch gibt es Versuche, diese Zellen, in Anlehnung an Monozyten/Makrophagen, anhand verschiedener Oberflächenantigene oder Genprodukte in M1- oder M2-artige Mikroglia zu kategorisieren (Boche et al., 2013b;

Jablonski et al., 2015). Entsprechend können, beispielsweise durch durchflusszytometrische Verfahren, Zellen mit charakteristischen M1- und M2-Markern unterschie-

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den werden. Typische Beispiele für diese Marker sind CD86 für M1-ähnliche Zellen (ein Protein welches bei der Co-Aktivierung der MHC-II-assoziierten Antigenpräsen- tation beteiligt ist) oder CD206 für M2-ähnliche Zellen (ein Mannose-Rezeptor) (Bo- che et al., 2013b; Jablonski et al., 2015). Diese Oberflächenantigene wurden auch in der vorliegenden Arbeit verwendet, um Makrophagen und Mikroglia aus dem Gehirn TMEV-infizierter Mäuse zu charakterisieren.

Neben der CD45/CD11b-Methode, Mikroglia von Makrophagen zu differenzieren, haben wir so genannte Cx3cr1-Reporter-Mäuse verwendet (Goldmann et al., 2013;

Gao et al., 2015), bei denen nur Mikroglia mit einem Fluoreszenzfarbstoff angefärbt sind (siehe Kapitel 2.5.3).

Die Zucht genetisch veränderter Mauslinien ist jedoch sehr aufwändig, daher wurden diese Mäuse nur für einzelne Versuche verwendet. Der Vorteil der Methode besteht darin, dass die Unterscheidung zwischen den Zellpopulationen genauer ist als die Durchflusszytometrie: Durch die Verwendung dieser transgenen Mäuse wurde bekannt, dass die zuvor verwendete CD45/CD11b-Methode einige Zellen falsch zuord- net, da Mikroglia im Zuge ihrer Aktivierung hohe CD45-Konzentrationen exprimieren können und dann entsprechend zu der CD45^highCD11b⁺ Makrophagen-Population gezählt werden (Goldmann et al., 2013, Yona et al., 2013).

2.5.3 Cx3cr1-Reporter-Mäuse

Der Zelloberflächenrezeptor CX3CR1 findet sich sowohl auf Mikroglia als auch auf Monozyten/Makrophagen. Verändert man das Genom von Mäusen insofern, dass man einen Fluoreszenzfarbstoff (tdTomato) an den genetischen Ort für die Expressi- on von Cx3cr1 einbaut und dieses Genkonstrukt mit einem molekularen „Ein- und Ausschalter“ versieht (Tamoxifen-induzierbares CreER-LoxP-System; eine an einen Östrogenrezeptor gebundene Cre-Rekombinase, welche durch das Östrogenanalo- gon Tamoxifen aktiviert wird) erhält man die Möglichkeit, diese beiden Zelltypen zu unterscheiden (siehe Abb. 1). Für die Unterscheidung zwischen Mikroglia und Mak- rophagen im Gehirn macht man sich die natürlichen Auf- und Abbauprozesse von Blutzellen zu Nutze: Monozyten zirkulieren im Blut und werden nach einigen Tagen

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ben ebenfalls nur eine kurze Lebensspanne und werden kontinuierlich durch Mo- nozyten aus dem Blut ersetzt (Parihar et al., 2010). Mikroglia bekommen hingegen keinen „Nachschub“ aus dem Knochenmark und sind sehr viel langlebiger (Ransohoff & Cardona, 2010; Tay et al., 2016). Schaltet man den molekularen Schalter an, so exprimieren alle Zellen, welche das Protein CX3CR1 exprimieren, den Fluoreszenzfarbstoff tdTomato. Zu diesem Zeitpunkt ist noch keine Differenzie- rung möglich, da sowohl Monozyten als auch Mikroglia CX3CR1 exprimieren. Wartet man einige Wochen ab (bei unseren Experimenten 6 bis 8 Wochen), so gibt es in der Peripherie keine Fluoreszenz-positiven Zellen mehr. Mikroglia sind hingegen durch ihre hohe Lebensspanne noch vorhanden und positiv gefärbt. Mit Hilfe von durchflusszytometrischen Untersuchungen lassen sich Gehirnzellen anhand der Präsenz von tdTomato sortieren und dadurch unterscheiden.

Abb. 2: Funktionsprinzip der Cx3cr1-Reporter Mäuse. Cx3cr1-CreER-Mäuse wurden mit ROSA- tdTomato-Mäusen gekreuzt. Durch die Verabreichung von Tamoxifen wird die Cre-Rekombinase aktiviert und das Stop-Codon aus dem Genkonstrukt herausgeschnitten. Da die Cre-Rekombinase nur in Zellen vorhanden ist, die Cx3cr1 exprimieren, exprimieren nur solche Zellen den Fluoreszenzfarbstoff tdTomato. In den ersten Tagen nach Aktivierung des Genkonstruktes sind sowohl kurzlebige Monozy- ten als auch langlebige Mikroglia tdTomato⁺. Nach einigen Wochen sind durch natürlichen Zellunter- gang nur noch Mikroglia positiv. Abb. zur Verfügung gestellt von Chintan Chhatbar.

Bei sonst angewendeten Methoden zur Unterscheidung von Mikroglia und Makro- phagen werden die Zelloberflächenantigene (z. B. CX3CR1, CCR2, Ly6C) untersucht. Diese Verfahrensweisen sind durch die sehr variable Expression der Antigene nicht sehr zuverlässig: Bei Monozyten, welche in das Gehirnparenchym einwandern, und Mikroglia, welche durch Noxen aktiviert werden, verändern sich die Zusammen- setzungen der Oberflächenantigene deutlich. Die infiltrierenden Makrophagen neh-

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men viele Charakteristika der residenten Mikroglia an und Mikroglia exprimieren durch die Aktivierung viele proinflammatorische Proteine, welche charakteristisch für Monozyten/Makrophagen sind. Durch die Verwendung der Cx3cr1-Reporter-Mäuse steht ein verlässliches und genaues Verfahren für die Differenzierung dieser beiden Zellpopulationen zur Verfügung, da die Expression des Fluoreszenzgens nicht von Aktivierungszuständen oder der umliegenden Gewebszusammensetzung abhängig ist.

2.5.4 Beeinflussung von Mikroglia/Makrophagen

Die Makrophageninfiltration in das Gehirn kann durch verschiedene Methoden be- einflusst werden. Eine sehr wichtige Rolle bei der Anlockung und Einwanderung dieser Zellen in das ZNS spielen der Chemokinrezeptor CCR2 und dessen Ligand CCL2. CCR2 wird auf der Zelloberfläche verschiedener Entzündungszellen, insbesondere auf Monozyten und Monozytenvorläuferzellen im Knochenmark, aber auch teilweise von verschiedenen Lymphozyten und perivaskulären Makrophagen, exprimiert (Kuziel et al., 1997; Prinz & Priller, 2010). Da verschiedene Chemokine (v.a.

CCL2), welche für die Chemotaxis von Immunzellen wichtig sind, an diesen Rezep- tor binden, spielt dieser Oberflächenrezeptor eine wichtige Rolle für die Rekrutierung von Entzündungszellen, insbesondere von Makrophagen, in entzündete Gewebe (Kuziel et al., 1997; Prinz & Priller, 2010). Die genetische Ausschaltung dieses Pro- teins erlaubt das Eingreifen in die Infiltration von Makrophagen in das Gehirn pi (Ku- ziel et al., 1997; Prinz & Priller, 2010): Die Infiltration von Makrophagen in das ZNS ist bei diesen Mäusen stark reduziert. Transgene Mäuse, denen Ccr2 fehlt, wurden in der vorliegenden Arbeit verwendet, um den Einfluss der Makrophageninfiltration näher zu untersuchen.

Eine Möglichkeit, die Aktivierung von Mikroglia im Rahmen eines Insults zu beein- flussen, ist die Modifikation des CX3CR1-Fraktalkin Signalweges, der eine wichtige Rolle bei der Neuron-Mikroglia-Kommunikation spielt. Das Fehlen von Cx3cr1, wel- ches im Gehirn v.a. in Mikroglia und in der Peripherie in verschiedenen Monozyten- Unterpopulationen vorkommt, erlaubt die genauere Untersuchung dieser durch

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se wurden in der vorliegenden Arbeit untersucht, um weitere Rückschlüsse auf die Rolle der Mikrogliaaktivierung im Rahmen der akuten Enzephalitis zu ziehen.

2.6 Tiermodelle in der Epilepsieforschung

Durch die enorme Komplexität des ZNS geht die Erforschung von chronisch- neurologischen Erkrankungen mit der Notwendigkeit des Einsatzes von Tiermodel- len einher (Löscher, 2002b, 2011, 2016). Daher gibt es eine Vielzahl unterschiedlicher Modelle zur Erforschung von Anfällen und Epilepsien (Löscher & Brandt, 2010;

Löscher, 2016). Bei den verschiedenen Arten von Tiermodellen in der Epilepsiefor- schung werden vor allem Ratten und Mäuse eingesetzt.

Modelle zur Erforschung von spontanen Anfällen bedingen, dass die untersuchten Labortiere epileptisch sind. Zwar gibt es spontan epileptische bzw. transgene Labor- nager (genetische Epilepsie), welche ohne weitere Behandlung spontane epileptische Anfälle zeigen (Pitkänen & Engel, 2014; Löscher, 2016), jedoch greift man bei den meisten Tiermodellen der Epilepsie auf eine elektrische oder chemische Stimu- lation zurück, um bei den Tieren eine erworbene Epilepsie auszulösen (Löscher, 1997, 2016). Eines der am besten etablierten Modelle ist das Kindling-Modell, bei welchem Tieren über intrazerebrale Elektroden (verschiedene Gehirnregionen kön- nen dabei als Zielgebiet verwendet werden, z. B. die Amygdala) täglich über mehrere Wochen elektrische Stimuli bis zur Auslösung eines Krampfanfalls verabreicht werden (Gorter et al., 2016; Löscher, 2016). Nach einigen Tagen bis Wochen entwickeln diese Tiere spontane Anfälle. Bei den sog. chemischen Modellen werden prokonvulsive Substanzen entweder systemisch (z. B. subkutane oder intraperitoneale Verabreichung von Pilokarpin bei Ratten oder Mäusen) oder lokal (z. B. intrahippo- kampale Verabreichung von Kainat bei Ratten oder Mäusen) verabreicht und dadurch ein SE ausgelöst (Gorter et al., 2016; Lévesque et al., 2016). Dieser schwere langanhaltende Anfall stellt einen epileptogenen Insult dar und führt nach einigen Wochen zum Entstehen von spontanen Anfällen. Ein Nachteil dieser gängigen Epi- lepsie-Modelle ist, dass sie eine geringe Augenscheinvalidität („face validity“), Prä- diktivvalidität („predictive validity“) oder Konstruktvalidität („construct validity“) auf-